1
WŁASNOŚCI SPEKTRALNE NUKLEOTYDÓW PIRYDYNOWYCH
(NAD
+
, NADP
+
)
OZNACZANIE AKTYWNOŚCI TRANSAMINAZY ALANINOWEJ
WSTĘP
Nukleotydy pirydynowe (NAD
+
, NADP
+
) pełnią funkcję koenzymów dehydrogenaz przeno-
sząc jony wodorkowe (2e
-
i 1H
+
) (równowaŜniki redukcyjne) między utlenianym substratem, a
redukowanym akceptorem. Częścią aktywną koenzymów jest pierścień nikotynoamidowy (Ryc. 1)
Ryc. 1. Amid kwasu nikotynowego i dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy, forma zredukowana
Przedstawiona na ryc. 2 forma przechodzących w siebie utlenionych struktur koenzymu NAD
+
(NADP
+
) ma w połoŜeniu para do atomu azotu ubogi w elektrony, dodatnio naładowany atom
węgla. W to miejsce zostaje wprowadzony jon wodorkowy, tworząc zredukowane formy NADH
(NADPH). PoniewaŜ jednocześnie uwalniany jest proton, zredukowane koenzymy nukleotydu
pirydynowego poprawnie powinny być zapisywane jako NADH + H
+
(NADPH+ H
+
).
Ryc. 2. Formy utlenione amidu kwasu nikotynowego i przyłączenie jonu wodorkowego
2
Własności spektralne utlenionych i zredukowanych form nukleotydów pirydynowych (róŜnice w
widmie absorpcyjnym) są często wykorzystywane w analityce biochemicznej, np.:
1, stosując odpowiedni substrat moŜna oznaczyć aktywność specyficznej względem niego dehy-
drogenazy na podstawie ilości zredukowanego koenzymu powstałego zgodnie z reakcją:
AH
2
+ NAD
+
⇔
A + NADH +H
+
(NADP
+
) (NADPH + H
+
)
2, stosując określoną oczyszczoną dehydrogenazę lub odpowiedni układ enzymatyczny moŜna
oznaczać małe ilości metabolitów selektywnie utlenianych lub redukowanych przez te enzymy z
równoczesnym wytworzeniem stechiometrycznych ilości zredukowanego (utlenionego) koenzy-
mu. Przykładem takich sprzęŜonych reakcji jest układ uŜywany do oznaczania ATP lub glukozy:
ATP + glukoza ⇒ ADP + glukozo-6-fosforan
glukozo-6-fosforan + NADP
+
⇒ 6-fosfoglukonolakton + NADPH +H
+
MoŜliwości szerokiego wykorzystania nukleotydów pirydynowych w analityce wynikają z ich
specyficznych właściwości:
-
zredukowane formy koenzymów wykazują absorbancję w 340 nm; nie wykazują jej formy
utlenione koenzymów
-
zredukowane formy są trwałe w środowisku alkalicznym i wykazują wówczas intensywną
fluorescencję „własną”. Formy utlenione ulegają w takich warunkach natychmiastowej destrukcji.
Zredukowane koenzymy są nietrwałe w środowisku kwaśnym, natomiast utlenione wykazują trwa-
łość w niskim pH. Właściwości te dają moŜliwość „zniszczenia”, po zakończeniu reakcji, nadmia-
ru koenzymu pozostawiając do pomiaru niezmienioną ilość trwałej w danych warunkach formy
nukleotydu – zredukowanej w środowisku alkalicznym bądź utlenionej w środowisku kwaśnym
-
zarówno zredukowana jak i utleniona postać koezymu powstałego w reakcji moŜe być
przekształcona w silnie fluoryzującą pochodną dzięki czemu moŜna go oznaczać w stęŜeniach
rzędu 10
-10
– 10
-9
M, co jest szczególnie uŜyteczne przy oznaczeniu stęŜeń metabolitów w małych
próbkach tkanek lub w pojedynczych komórkach.
3
A, WYZNACZENIE WIDMA ABSORPCYJNEGO DLA NAD
+
I NADH+H
+
Odczynniki:
•
0,05 M bufor fosforanowy pH 9,0 i pH 6,5
•
roztwór podstawowy (0,2 mM) NAD
+
w buforze fosforanowym o pH 6,5
•
roztwór podstawowy (0,2 mM) NADH + H
+
w buforze fosforanowym o pH 9,0
Wykonanie:
Dokonać pomiarów absorbancji 0,1 mM roztworu NAD
+
w zakresie widma 220-440 nm. Pomiary
wykonać w kuwetach kwarcowych względem buforu fosforanowego o pH 6,5.
Podobnych pomiarów dokonać dla 0,1 mM roztworu NADH + H
+
względem buforu o pH 9,0.
Na podstawie wykreślonego widma:
•
obliczyć teoretyczną wartość absorbancji 0,1 mM roztworu NADH + H
+
przy 340 nm wie-
dząc, Ŝe molowy współczynnik absorpcji wynosi 6220
•
określić na tej podstawie stopień czystości (%) preparatu NADH + H
+
uŜytego w doświad-
czeniu
B, WYKONANIE KRZYWEJ KALIBRACYJNEJ DLA NADH +H
+
METODĄ
SPEKTROFOTOMETRYCZNĄ
Odczynniki:
•
0,05 M bufor fosforanowy pH 9,0
•
roztwór podstawowy (0,2 mM) NADH + H
+
Wykonanie:
Z roztworu podstawowego (0,2 mM) NADH + H
+
, zawierającego 200 nmoli zredukowanego ko-
enzymu w 1 ml, przygotować 6 rozcieńczeń do końcowej objętości 2 ml. Rozcieńczone roztwory
powinny zawierać 20, 40, 60, 80, 100 i 150 nmoli NADH + H
+
w 1 ml roztworu. Do rozcieńczania
uŜywać buforu fosforanowego o pH 9,0. Dokonać pomiarów absorbancji roztworów o rosnącym
stęŜeniu NADH + H
+
w 340 nm względem buforu uŜywanego do rozcieńczeń.
•
Wykreślić krzywą wzorcową oraz obliczyć współczynnik kierunkowy.
4
C, OZNACZANIE AKTYWNOŚCI AMINOTRANSFERAZY ALANINOWEJ
Grupa α-aminowa wielu aminokwasów jest przenoszona na α-ketoglutaran w reakcji, której me-
chanizm określany jest jako mechanizm podwójnego przeniesienia (reakcje ping-pong). Cechą
wyróŜniającą ten mechanizm katalizy jest istnienie enzymu z podstawioną grupą, a więc pośred-
niej formy enzymu, który uległ czasowej modyfikacji. Tak więc, aminotransferaza alaninowa
katalizuje przeniesienie grupy aminowej z alaniny na α-ketoglutaran, a produktami reakcji są
pirogronian i glutaminian. Po związaniu alaniny do enzymu zostaje z niej usunięta grupa ami-
nową, która jest przeniesiona na fosforan pirydoksalu (PLP)(koenzym aminotransferaz i liaz), a
z aminotransferazy uwalnia się pirogronian. Drugi substrat, α-ketoglutaran, wiąŜe się do zmody-
fikowanego enzymu i przyjmuje od niego grupę aminową, a następnie zostaje uwolniony jako
produkt reakcji - glutaminian. Na ryc. 3 pokazany jest schemat reakcji podwójnego przeniesie-
nia, a na ryc. 4 mechanizm transaminacji.
Ryc. 3. Schemat reakcji podwójnego przeniesienia katalizowanej przez aminotransferazy
5
Ryc. 4. Mechanizm transaminacji
Powstający w reakcji pirogronian moŜna oznaczać ilościowo zgodnie z poniŜszą reakcją, uŜywając
oczyszczonej dehydrogenazy mleczanowej
6
Odczynniki:
•
100 mM roztwór buforu Tris-HCl, pH 8,0 zawierający 20 mM α-ketoglutaran
•
350 mM roztwór alaniny w 100 mM buforze Tris-HCl, pH 8,0
•
2,5 mM roztwór NADH + H
+
w 100 mM buforze Tris-HCl, pH 8,0
•
roztwór dehydrogenazy mleczanowej o aktywności około 1,2 jednostki w 100 µl (roztwór
przygotowany w 100 mM buforze Tris-HCl, pH 8,0
Materiał:
OdwaŜyć 1 g niedojrzałych nasion grochu (zielony groszek), przenieść do małego moździerza i
rozetrzeć, najpierw „na sucho”, a potem dodając 1 ml 100 mM buforu Tris-HCl, pH 8,0. Dobrze
roztarty materiał przenieś do probówek Eppendorfa i odwirować 5 min przy 15 000 obr./min. Do
oznaczeń uŜywać klarownego nadsączu (supernatantu) rozcieńczonego 5x buforem uŜywanym do
homogenizacji.
Wykonanie:
Do kuwety kwarcowej napipetować 500 µl 100 mM buforu Tris-HCl, pH 8,0 zawierającego 20
mM α-ketoglutaran, następnie dodać 100 µl roztworu NADH + H
+
, 100 µl dehydrogenazy mle-
czanowej i 100 µl ekstraktu tkankowego (rozcieńczonego nadsączu). Kuwetę umieścić w spektro-
fotometrze i sprawdzić stabilność układu, a następnie reakcję transaminacji zapoczątkować doda-
jąc 200 µl 350 mM roztworu alaniny. Mierzyć spadki absorbancji przy 340 nm przez około 10
min, a następnie policzyć średnią wartość ∆A/min.
•
Obliczyć aktywność aminotransferazy alaninowej wyraŜoną jako ilość nmoli pirogronianu
powstałego w reakcji enzymatycznej w ciągu 1 min.