I_okladka.indd

L A B O R A T O R I U M 5 / 2 0 0 9

L A B O R A T O R I U M

P R Z E M Y S Ł O W E

Dodatki
wzbogacające żywność

rawidłowe żywienie człowieka po-
lega na dostarczeniu wszystkich
składników odżywczych niezbęd-

nych do właściwego rozwoju, zachowania
zdrowia oraz zaspokojenia zapotrzebo-
wania organizmu na energię. Niestety
współczesny tryb życia, mniejsza aktyw-
ność fizyczna człowieka, a do tego coraz
częstsze spożywanie żywności o niższej
wartości energetycznej są przyczynami
wielu chorób cywilizacyjnych. W większo-
ści przypadków spożywa się żywność źle
zbilansowaną, bogatą w tłuszcze, białka
i cukry proste, z jednoczesnym niedobo-
rem witamin i składników mineralnych
oraz substancji bioaktywnych. Obserwuje
się zatem ciągły spadek wielkości spo-
życia niektórych witamin i składników
mineralnych.

Aby temu zapobiec, stosuje się wzbo-

gacanie żywności, zwane także fortyfi-
kacją. Zgodnie z definicją podaną przez
FAO/WHO (Codex Alimentarius 1994),
wzbogacanie żywności polega na doda-
niu do produktu spożywczego jednego
lub kilku składników odżywczych – bez
względu na to, czy występują one w nim
naturalnie, czy nie – w celach zapobie-
gawczych oraz uzupełniania niedobo-
ru tych składników w całej populacji
lub wśród określonych grup ludności.
Ze względu na zamierzony cel stosuje się
trzy podstawowe warianty wzbogacania
żywności. Pierwszy z nich to wzboga-
canie interwencyjne, wiążące się bezpo-
średnio z zapobieganiem określonym
niedoborom i ich zwalczaniem. Jest ono
realizowane w ten sposób, że składnik
wzbogacający jest dodawany w znacz-
nych ilościach. Istotną zasadą jest, aby
poziom tego wzbogacenia był ustalony
w takiej ilości, żeby przeciętna dzienna
porcja wzbogaconego produktu pokry-
wała 30-100% zalecanego spożycia da-
nego składnika. Przykładem wzbogaca-
nia interwencyjnego jest jodowanie soli

kuchennej, mające na celu zapobieganie
występowaniu wola prostego. W Polsce
tradycja stosowania tej praktyki sięga
1935 roku. W historii naszego kraju kil-
kakrotnie rezygnowano z tego działania,
lecz w wyniku przeprowadzonych badań
i dyskusji w 1997 roku wzbogacanie soli
kuchennej, przeznaczonej do bezpośred-
niego spożycia, w jod stało się ponownie
obligatoryjne na terenie całego kraju.
Kolejnym wariantem fortyfikacji żywno-
ści jest wzbogacanie wyrównawcze strat
powstałych podczas produkcji, polega-
jące na zwiększeniu wartości odżywczej
produktu spożywczego, zwane restytucją
lub rekonstrukcją. Przykładem tego typu
wzbogacenia jest m.in. dodatek tiaminy
i żelaza do mąki pszennej lub dodatek
witaminy C do soków owocowych w celu
wyrównania naturalnych różnic w róż-
nych partiach surowca i strat podczas
przechowywania (tzw. standaryzacja).
Ostatnim wariantem wzbogacania żyw-
ności jest proces polepszenia żywności
polegający na nadaniu produktom spo-
żywczym właściwości pożądanych przez
konsumenta. Polepszenie produktu po-
lega m.in. na dodawaniu następujących
składników: błonnika lub antyoksydan-
tów – w celu zmniejszenia ryzyka chorób
układu krążenia lub nowotworów; wapnia
i witaminy D – w celu zwiększenia w pro-
dukcie dostarczonego wapnia i polepsze-
nia jego biodostępności; specyficznych
aminokwasów – w żywności dla sportow-
ców. Wzbogacane produkty spożywcze
mogą nieść ze sobą różnorakie korzyści
w obszarze wpływu na zdrowie człowieka
i powodować jego lepsze samopoczucie
ze względu na dodatek witamin, składni-
ków mineralnych, włókna pokarmowego,
probiotyków, prebiotyków, synbiotyków,
niezbędnych nienasyconych kwasów
tłuszczowych, f lawonoidów i innych
substancji biologicznie aktywnych. Część
żywności wzbogacanej, ze względu na jej

STRESZCZENIE

W artykule

przedstawiono problematykę wzbogacania

żywności. Omówiono najważniejsze

metody analityczne oznaczania ilościowego

wybranych witamin i składników

mineralnych najczęściej stosowanych

jako dodatki wzbogacające żywność.

SŁOWA KLUCZOWE

wzbogacanie

żywności, analiza żywności, witaminy,

składniki mineralne

SUMMARY

The paper presents

problems of food fortiﬁ cation. The

most important methods of analytical

quantitative determination of chosen

vitamins and minerals, which are the

most often used as food enriching

additives, are discussed.

KEY WORDS

fortiﬁ cation, food

analysis, vitamins, minerals

dr Joanna Sobolewska-Zielińska

KATEDRA ANALIZY I OCENY JAKOŚCI ŻYWNOŚCI
UNIWERSYTET ROLNICZY W KRAKOWIE

– aspekt analityczny

L A B O R A T O R I U M

P R Z E M Y S Ł O W E

L A B O R A T O R I U M 5 / 2 0 0 9

udokumentowane badaniami korzystne
oddziaływanie na zdrowie człowieka,
można określić jednoznacznie mianem
żywności funkcjonalnej.

REGULACJE WARUNKUJĄCE
DODAWANIE SKŁADNIKÓW
WZBOGACAJĄCYCH

Proces wzbogacania żywności jest bar-
dzo złożony i powinien odpowiadać
określonym zasadom. Zgodnie z roz-
porządzeniem Ministra Zdrowia z dnia
19 grudnia 2002 roku w Polsce istnieją
regulacje prawne dotyczące wzbogacania
żywności. Producent jest zobligowany
wzbogacić sól przeznaczoną do spożycia
przez ludzi w jodek potasu lub jodan
potasu tak, aby 100 g soli kuchennej
zawierało 2,3 ± 0,77 mg jodu, co od-
powiada 30 ± 10 mg jodku potasu lub
39 ± 13 mg jodanu potasu w 1 kg soli
kuchennej. Obligatoryjne wzbogacanie
żywności dotyczy również wzbogacania
w witaminę A produktów tłuszczowych:
margaryny o normalnej i obniżonej za-
wartości tłuszczu, masła o obniżonej
zawartości tłuszczu oraz mieszaniny
masła i oleju. Maksymalna ilość tej wita-
miny w 100 g produktu końcowego nie
może być wyższa niż 900 mg retinolu
(3000 j.m.), przy czym 1 mg retinolu =
3,33 j.m. witaminy A. Równocześnie po-
wyższe produkty muszą być wzbogacone
w witaminę D tak, aby maksymalna ilość
cholekalcyferolu w 100 g produktu końco-
wego nie przekraczała 7,5 mg (300 j.m.),
przy czym 1 mg cholekalcyferolu =
40 j.m. witaminy D. Natomiast coraz
częściej prowadzone są również dysku-

sje na temat wprowadzenia obligatoryj-
nej fortyfikacji produktów spożywczych
kwasem foliowym.

Polska, ze względu na przynależność

do struktur Unii Europejskiej, musi
stosować się do Rozporządzenia (WE)
nr 1925/2006 Parlamentu Europejskiego
i Rady z dnia 20 grudnia 2006 r. w sprawie
dodawania do żywności witamin i skład-
ników mineralnych oraz niektórych innych
substancji. Rozporządzenie to harmo-
nizuje przepisy państw członkowskich
w zakresie wzbogacania żywności i zastę-
puje obecne polskie przepisy dotyczące
wzbogacania dobrowolnego. Wzbogaca-
nie obligatoryjne nadal pozostaje jednak
w gestii każdego państwa członkowskiego.
Zgodnie z Rozporządzeniem... do żywności
mogą być dodawane tylko te witaminy
i składniki mineralne, które wymienione
są w załączniku nr I. Rozporządzenie... rów-
nocześnie określa, w jakich formach che-
micznych mogą występować substancje
wzbogacające. Listę możliwych dodatków
wzbogacających żywność przedstawiono
w tabeli 1.

Witaminy i składniki mineralne w po-

staci przyswajalnej dla ludzkiego organi-
zmu mogą być dodawane do żywności
bez względu na to, czy znajdują się one
w danym produkcie spożywczym. W Roz-
porządzeniu... zawarto również ograni-
czenia w zakresie dodawania witamin
i składników mineralnych. Nie można
stosować tego typu dodatków wzboga-
cających żywność do nieprzetworzonych
artykułów spożywczych, w szczególności
takich jak: owoce, warzywa, mięso, drób
i ryby, oraz do napojów zawierających
ponad 1,2% objętości alkoholu. Według
rozporządzenia UE oznakowanie wartości
odżywczej produktów z dodatkiem wita-
min i składników mineralnych jest obo-
wiązkowe. Wymagana informacja powinna
zawierać elementy określone w art. 4 ust.
1 grupa 2 Dyrektywy Rady 90/496/EWG
oraz całkowite ilości witamin i składników
mineralnych obecnych w żywności po ich
dodaniu. Ponadto Rozporządzenia (WE)
nr 1924/2006 Parlamentu Europejskiego
i Rady z dnia 20 grudnia 2006 r. w sprawie
oświadczeń żywieniowych i zdrowotnych doty-
czących żywności określają zasady etykieto-
wania wyrobów zawierających witaminy
oraz składniki mineralne.

W Polsce do głównych produktów

wzbogacanych w witaminy i składniki
mineralne należą m.in.: soki i napoje bez-
alkoholowe (ok. 50% produktów wzboga-

canych), przetwory zbożowe (ok. 19%),
wyroby cukiernicze (ok. 12%), mleko
i przetwory mleczne (10%). Biorąc pod
uwagę fakt, że prawo nakłada obowiązek
etykietowania produktów spożywczych
i określenia ilości dodatków wzbogaca-
jących żywność, istnieje szereg metod
analitycznych, uniwersalnych i o węższym
zastosowaniu, pozwalających na analizę
ilościową tych substancji. Poniżej omó-
wiono niektóre z nich.

METODY OZNACZANIA
WYBRANYCH WITAMIN
ROZPUSZCZALNYCH
W TŁUSZCZACH

Każda z witamin, ze względu na inną bu-
dowę chemiczną, wymaga specyficznych
parametrów oznaczenia. Obecnie najpo-
pularniejszymi metodami oznaczania
witamin rozpuszczalnych w tłuszczach
są metody chromatografii cieczowej.
Zmydlenie jest podstawową metodą
ekstrakcji witamin A, D i E. Jedynie wi-
tamina K nie może być ekstrahowana
w środowisku alkalicznym, ze względu
na swoją niestabilność. Przed przystą-
pieniem do analizy chromatograficznej
witamin A i E przeprowadza się zmydle-
nie próbki w alkoholowym (metanolo-
wym lub etanolowym) roztworze KOH
w obecności antyoksydantu (BHT, kwasu
L-askorbinowego, pirogallolu lub hydro-
chinonu), w optymalnej temperaturze.
Zalecane jest też przeprowadzanie tego
procesu w atmosferze gazu obojętnego.
Następnie witaminy ekstrahuje się od-
powiednim rozpuszczalnikiem (heksa-
nem, chloroformem, eterem etylowym
lub naftą). W zależności od polarności
rozpuszczalnika, w przypadku, gdy fazę
ruchomą stanowi heksan, często z do-
datkiem chloroformu, 2-propanolu lub
metanolu, stosuje się kolumnę z normal-
nym układem faz (kolumna silikonowa)
lub – przy zastosowaniu metanolu bądź
jego mieszaniny z wodą, acetonitrylem,
kwasem octowym – z odwróconym ukła-
dem faz (najczęściej kolumna C

). Wi-

taminę A można oznaczyć za pomocą
wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) w odwróconym układzie faz,
stosując detektor UV przy długości fali

 = 325 nm. Detekcja może odbywać się
również z użyciem detektora fluoryme-
trycznego. Pomiaru fluorescencji doko-
nuje się przy długości fali  = 480 nm.
Metoda AOAC 992.04 opisuje oznaczenie
ilościowe all-trans-retinolu i 13-cis-retinolu

WITAMINY

SKŁADNIKI

MINERALNE

Witamina A

Wapń

Witamina D

Magnez

Witamina E

Żelazo

Witamina K

Miedź

Witamina B

Jod

Witamina B

Cynk

Niacyna

Mangan

Kwas pantotenowy

Sód

Witamina B

Potas

Kwas foliowy

Selen

Witamina B

Chrom

Biotyna

Molibden

Witamina C

Fluorek

Chlorek

Fosfor

Tabela 1. Wykaz witamin i składników mineralnych,
które mogą być dodawane do żywności
zgodnie z obowiązującymi regulacjami prawnymi

L A B O R A T O R I U M 5 / 2 0 0 9

L A B O R A T O R I U M

P R Z E M Y S Ł O W E

po roztworzeniu próbki w temperaturze
otoczenia przez 18 godzin w metanolo-
wym roztworze KOH i wyekstrahowaniu
ekstraktu przy użyciu mieszaniny eteru
dietylowego i heksanu w stosunku 15:85.
Obejmuje ona chromatografię próbki
na kolumnie silikonowej z normalnym
układem faz i mieszaniną heptan – iso-
propanol jako eluentem. Detekcja wy-
konywana jest przy długości fali  =
340 nm. Przy bardzo niskich stężeniach
można skorzystać z detektora elektroche-
micznego. Witaminę A można oznaczyć
metodą wysokosprawnej chromatografii
cieczowej (HPLC) zgodnie z normą PN-
EN 12823-1:2002.

Zmydlenie jest również pierwszym

krokiem w analizie chromatograficznej
witaminy D. SPE (solid-phase extraction) jest
najbardziej rozpowszechnioną procedurą
oczyszczania i zagęszczania zmydlonego
ekstraktu. Czasami chromatografia pre-
paratywna lub półpreparatywna HPLC
w normalnym układzie faz jest również
stosowana do oczyszczenia próbki.
Podobnie jak w przypadku witaminy
A możliwe jest zastosowanie kolumny
z normalnym lub odwróconym ukła-
dem faz. Większość opublikowanych
metod oznaczania tej witaminy sugeruje
oznaczenie w odwróconym układzie faz,
z wykorzystaniem jako fazy mobilnej me-
tanolu lub mieszaniny metanolu z wodą
lub acetonitrylem, natomiast detekcję
UV przy długości fali  = 265 nm. Wita-
mina D nie wykazuje zdolności do fluore-
scencji, dlatego też detektory fluorescen-
cyjne nie znalazły zastosowania przy jej
oznaczaniu. Witaminę D można oznaczyć
metodą wysokosprawnej chromatografii
cieczowej (HPLC) zgodnie z normą PN-
EN 12821:2002. Do oznaczania witaminy
E można zastosować te same warunki przy-
gotowania próbki i chromatografowania
jak w przypadku witaminy A.

Tokoferole można oznaczać zarówno

w normalnym, jak i odwróconym ukła-
dzie faz, przy wykorzystaniu detektora
UV i fluorescencyjnego. W przypadku
zastosowania detektora UV detekcję
przeprowadza się przy długości fali  =
290 nm, a w przypadku detektora flu-
orescencyjnego – 

= 330 nm. Meto-

da AOAC 992.03 polega na zmydlaniu,
a następnie chromatografowaniu na ko-
lumnie silikonowej z zastosowaniem fazy
mobilnej w składzie heksan : izopropanol
(99.92:0.08) z detekcją UV przy długości
fali  = 280 nm. Zgodnie z normą PN-

EN 12822:2002 oznaczenia zawartości
tokoferoli można dokonać metodą wy-
sokosprawnej chromatografii cieczowej
z detekcją fotometryczną w zakresie
UV lub fluorymetryczną.

METODY OZNACZANIA
WYBRANYCH WITAMIN
ROZPUSZCZALNYCH
W WODZIE

Witaminą rozpuszczalną w wodzie najczę-
ściej stosowaną do wzbogacania żywności
jest kwas askorbinowy (witamina C). Doda-
wana jest ona do żywności również w celach
technologicznych, m.in. jako przeciwutle-
niacz czy stabilizator. Oznaczenie witaminy
C polega na wykorzystaniu właściwości re-
dukujących kwasu L-askorbinowego, które-
go zawartość oznacza się miareczkowo lub
kolorymetrycznie. W czystych roztworach
kwas askorbinowy można oznaczać jodo-
metrycznie w środowisku kwaśnym. Najczę-
ściej stosowaną w przemyśle spożywczym
metodą oznaczania witaminy C jest metoda
Tillmansa. Polega ona na redukcji przez
kwas L-askorbinowy barwnego roztworu
2,6-dichlorofenoloindofenolu do bezbarw-
nego leukozwiązku. Wystąpienie różowego
zabarwienia w środowisku kwaśnym, wywo-
łanego przez nadmiar barwnika, świadczy
o zakończeniu reakcji. Ze względu na dużą
wrażliwość kwasu L-askorbinowego na dzia-
łanie czynników chemicznych i fizycznych
konieczne jest jego stabilizowanie przed
przystąpieniem do analizy próbki. Do eks-
trakcji i stabilizacji kwasu L-askorbinowego
używa się 2-procentowego kwasu szczawio-
wego lub 6-procentowego kwasu metafos-
forowego(V).

Należy zaznaczyć, że metoda Till-

mansa znajduje zastosowanie do pró-
bek o jasnym zabarwieniu, natomiast
do roztworów zabarwionych stosowana
jest metoda ksylenowa. Polega ona na po-

miarze spektrofotometrycznym, przy

 = 500 nm, nadmiaru barwnika (2,6-d-
ichlorofenoloindofenolu) przeniesionego
do ksylenu. Istnieje również bardziej prak-
tyczna metoda ilościowego oznaczania
kwasu L-askorbinowego w roztworach
zabarwionych poprzez miareczkowanie
potencjometryczne. Oznaczenia witaminy
C można również dokonać metodą HPLC
w odwróconym układzie faz, z detektorem
UV. Pomiaru absorbancji dokonuje się
przy długości fali  = 265 nm, wg normy
PN-EN 14130:2004.

Produkty zbożowe i artykuły spożywcze

przeznaczone zwłaszcza dla dzieci często
są wzbogacane witaminami z grupy B, naj-
częściej witaminą B

. Tiamina w środowisku

zasadowym pod wpływem heksacyjano-
żelazianu(II) potasu utlenia się ilościowo
do związku zwanego tiochromem, który
w nadfiolecie daje niebieską fluorescencję.
Oznaczenie tiaminy metodą tiochromową
utrudniają związki fluoryzujące w tych sa-
mych warunkach co tiochrom, wygaszające
fluorescencję. Tiamina, dzięki obecności
w jej cząsteczce grupy karboksylowej,
tworzy estry z wieloma kwasami, i w takiej
formie jest najczęściej oznaczana. Najwięk-
sze znaczenie mają estry tiaminy z kwasem
fosforowym(V). Pirofosforan(V) tiaminy
pod wpływem czynników utleniających
w środowisku alkalicznym przekształca się
w pirofosforan(V) tiochromu, który wyka-
zuje intensywnie niebieską fluorescencję,
wzbudzaną promieniami UV, ale – w od-
różnieniu od wolnego tiochromu – nie
rozpuszcza się w izobutanolu. Właściwość
ta umożliwia oznaczenie tiaminy wolnej
i pośrednio jej pirofosforanu(V). Pomiar
intensywności fluorescencji izobutanolo-
wego roztworu tiochromu przeprowadza
się przy długości fali świata wzbudzającego
fluorescencję  = 365 nm i długości fali
światła emitowanego przez fluoryzującą
próbę  = 436 nm. Spośród wielu metod
fizykochemicznych oznaczania tiaminy
należy wspomnieć o metodach spektrofo-
tometrycznych w ultrafiolecie przy długości
fali  = 266 nm i metodzie spektrofoto-
metrycznej opartej na wywołaniu barwnej
reakcji między tiaminą i diazowaną aminą
aromatyczną, np. p-aminoacetofenonem.
Tiaminę można również oznaczyć przy za-
stosowaniu wysokosprawnej chromatografii
cieczowej (HPLC), najczęściej w układzie faz
odwróconych z detekcją UV przy długości
fali  = 254 nm, natomiast tiaminę w formie
tiochromowej – z detekcją fluorescencyjną



wzb

= 360 nm/

= 430 nm.

zbogacanie żywności

polega na dodaniu

do produktu jednego lub

kilku składników odżywczych

w celach zapobiegawczych

oraz uzupełniania niedoboru

tych składników w całej

populacji lub wśród

określonych grup ludności.

L A B O R A T O R I U M

P R Z E M Y S Ł O W E

L A B O R A T O R I U M 5 / 2 0 0 9

METODY OZNACZANIA
WYBRANYCH SKŁADNIKÓW
MINERALNYCH

Do oznaczania składników mineralnych
stosuje się różnorodne klasyczne metody
(grawimetryczne, miareczkowe, kolory-
metryczne), lecz coraz częściej stoso-
wane są metody spektralne, m.in. ASA
(atomowa spektroskopia absorpcyjna).
Wapń można oznaczyć metodą grawime-
tryczną, która polega na przeprowadze-
niu go w szczawian wapnia za pomocą
szczawianu amonu, przesączeniu prób-
ki, a następnie spopieleniu sączka wraz
z osadem i wagowym oznaczeniu tlen-
ku wapnia. Inną klasyczną metodą jest
miareczkowanie kompleksometryczne,
polegające na reakcji wapnia z kwasem
etylenodiaminotetraoctowym (EDTA).
Detekcja punktu końcowego jest wyzna-
czana poprzez zmianę zabarwienia uży-
tego wskaźnika lub potencjometrycznie.
W metodzie tej magnez i jony fosforano-
we(V) powodują interferencje, ponieważ
przy wizualnej detekcji punktu końcowe-
go miareczkowania powodują one zmęt-
nienie. Do oznaczania wapnia i żelaza
stosowana też jest metoda miareczkowa-
nia manganometrycznego. Wapń jest wy-
trącany w postaci szczawianu, a osad jest
przemywany i rozpuszczany w gorącym
kwasie siarkowym(VI) i miareczkowany
roztworem manganianu(VI) potasu. Żela-
zo(II) jest bezpośrednio miareczkowane
roztworem KMnO

, co pozwala na łatwą

detekcję punktu końcowego, ponieważ
następuje wyraźna zmiana koloru z głę-
boko purpurowego – jony Mn(VII)
– do bladoróżowego – formy Mn(II).

Metody miareczkowe wykorzystywa-

ne są również do oznaczania chlorków
w produktach spożywczych. Są to me-
tody Mohra i Volharda. Metoda Mohra
polega na miareczkowaniu roztworu
zawierającego jony chlorkowe miano-
wanym roztworem azotanu(V) srebra
(miareczkowanie argentometryczne)
wobec jonów chromianowych(VI).
Podczas miareczkowania jako pierwszy
wytrąca się chlorek srebra, a następnie
chromian(VI) srebra, który powoduje
brunatnoczerwone zabarwienie roztwo-
ru. Natomiast metoda Volharda polega
na wytrąceniu jonów chlorkowych w śro-
dowisku kwaśnym za pomocą nadmia-
ru mianowanego roztworu azotanu(V)
srebra, a następnie odmiareczkowaniu
nadmiaru dodanego azotanu(V) srebra
za pomocą tiocyjanianu amonu lub po-

tasu w obecności ałunu żelazowo-amo-
nowego [NH

Fe(SO

)

· 12 H

O] jako

wskaźnika, aż do otrzymania różowo-
czerwonego zabarwienia roztworu.

Metody AOAC opisują również licz-

ne metody miareczkowe wykorzystujące
AgNO

z potencjometryczną detekcją

punktu końcowego, jak również z wyko-
rzystaniem elektrod jonoselektywnych.
W soli jodowanej metodą miareczkową
można oznaczyć zawartość jodu poprzez
jego utlenianie bromem, a następnie mia-
reczkowanie tiosiarczanem(VI) sodu.

Do analizy składników mineral-

nych stosuje się szeroką gamę metod
spektrofotometrycznych. Spektrofoto-
metria w świetle widzialnym znalazła
szczególne zastosowanie w oznaczaniu
zawartości fosforu w żywności. Dodatek
odczynników wanadowo-molibdeno-
wych powoduje powstanie kompleksu
fosforowanadomolibdenianu. Metoda
ta służy do oznaczania fosforu w mi-
kroilościach. Powyższą metodę zalecają
polskie normy dla skrobi (PN-EN ISO
3946:2000), soków (PN-EN 1136:2001)
oraz olejów i tłuszczów (PN-ISO 10540-
1:2005). Metoda spektrofotometryczna
oznaczania żelaza polega na pomiarze
absorbancji, przy  = 510 nm, barwne-
go kompleksu o-fenantroliny z jonami
żelaza(II) po uprzedniej redukcji jonów
Fe

chlorowodorkiem hydroksyloami-

ny przy pH = 3-4. Metoda ta znalazła
zastosowanie do oznaczania tego skład-
nika m.in. w produktach zbożowych
i mięsnych. Metody spektrofluoryme-
tryczne są wykorzystywane do oznacza-
nia selenu w żywności i w materiałach
biologicznych. Podczas mineralizacji
na mokro w kwasie solnym selen(VI)
jest redukowany do selenu(IV), a jego

oznaczenie polega na pomiarze f lu-
orescencji piazselenolu, powstałego
w reakcji z 2,3-diaminonaftalenem lub
3,3’-diaminobenzydyną. Obecnie coraz
popularniejsze i zalecane przez polskie
normy stają się metody oznaczania
składników mineralnych metodami spek-
troskopowymi, takimi jak: ASA, AES
czy ICP-MS. Do oznaczania zawartości
sodu, potasu, wapnia i magnezu w so-
kach owocowych i warzywnych zalecane
są metody spektrometrii absorpcji atomo-
wej (PN-EN 1134:1999). W artykułach
żywnościowych, zgodnie z normą PN-
EN 14627:2005, do oznaczania selenu
powinno się stosować metodę atomowej
spektrometrii absorpcyjnej z generacją
wodorków (HGAAS) po mineralizacji ci-
śnieniowej. Cynk, miedź i żelazo można
oznaczyć, wg normy PN-EN 14084:2004,
metodą atomowej spektrometrii absorp-
cyjnej po mineralizacji mikrofalowej lub
stosując wcześniej mineralizację suchą
zgodnie z normą PN-EN 14082:2004.

PODSUMOWANIE

Wzbogacanie żywności uznaje się za najbar-
dziej efektywną formę poprawienia jej ja-
kości zdrowotnej i uzupełnienia niedoboru
składników odżywczych w diecie. Dodatek
substancji wzbogacających powinien być
tak dobrany, aby utrzymać odpowiednią
homeostazę organizmu. Ze względu na ob-
szerność tematu w niniejszym artykule
przedstawiono jedynie wybrane metody
analityczne stosowane do oznaczeń ilościo-
wych witamin i składników mineralnych,
które uznano za najważniejsze i najczęściej
stosowane do wzbogacania żywności. 

Piśmiennictwo dostępne na stronie

www.laboratorium.elamed.pl

ok. 10% mleko i przetwory
mleczne

ok. 9% inne

ok. 19% przetwory
zbożowe

ok. 50% soki i napoje
bezalkoholowe

Główne produkty wzbogacane w Polsce w witaminy i składniki mineralne (% ogółu wzbogaconych produktów)

ok. 12% wyroby
cukiernicze

L A B O R A T O R I U M 6 / 2 0 0 9

L A B O R A T O R I U M

P R Z E M Y S Ł O W E

Metale ciężkie
oraz nieorganiczne jony
w herbatach zielonych

erbata (nazwa łacińska camellia
sinensis) należy do najpopular-
niejszych napojów spożywanych

na całym świecie i w rankingu tym
zajmuje drugie miejsce, tuż po wo-
dzie. Herbaty stanowią ważne źródło
substancji istotnych dla zdrowia lu-
dzi, a ich lecznicze działanie znane
jest od tysięcy lat (1). Zawierają wiele
substancji o zróżnicowanym działaniu
na organizmy żywe. Należą do nich
m.in.: polifenole, katechiny, kofeina,
aminokwasy, węglowodany, proteiny,
chlorofil, lotne związki organiczne,
nieorganiczne aniony i kationy oraz
metale ciężkie. Stanowią one również
ważne źródło antyoksydantów, takich
jak: karotenoidy, kwas askorbinowy
czy f lawonidy.

Zielona herbata jest naturalnym

i smacznym źródłem antyutleniaczy
dla naszego organizmu. Charakteryzuje
się ona wieloma właściwościami lecz-
niczymi – wzmacnia kości, zapobiega
powstawaniu nowotworów i atakom
serca. Polifenole zawarte w herbacie
są wielokrotnie bardziej skuteczne
od witaminy C i witaminy E. Na walo-
ry smakowe herbat duży wpływ ma za-
wartość związków organicznych, a więc
sposób ich przygotowania. Część z nich
jest aromatyzowana, głównie kwiatami
jaśminu i lotosu.

Z botanicznego punktu widzenia

herbata należy do rodziny kameliowa-
tych i, jak wielu członków tej rodziny,
okrywa się białymi kwiatami. Jednak
koneserów herbaty nie interesują kwiaty,
lecz liście i pąki, stanowiące surowiec
do dalszej produkcji. Krzewy herbacia-
ne są gotowe do pierwszych zbiorów
dopiero po 7 latach od momentu za-
sadzenia, a ich staranne prowadzenie

i utrzymywanie w odpowiedniej, wyso-
kiej kulturze powoduje, że mogą one
być eksploatowane nawet przez 100 lat.
Plantacje takie wymagają odpowiednich
warunków, takich jak: właściwa tempe-
ratura (15-25°C), wysoka wilgotność
(80-90%) i duże roczne opady (około
1500-2000 mm) (2).

Wydawać się może, że herbaty zie-

lona i czarna produkowane są z dwóch
różnych gatunków roślin. Nic bardziej
mylnego – jedyna różnica polega na od-
miennych metodach obróbki. Herbata
czarna, w przeciwieństwie do zielonej,
jest poddawana procesowi fermentacji.
Rys. 1 (str. 28) przedstawia schemat
produkcji zielonej herbaty.

Pomimo iż 75% herbat zielonych jest

produkowanych w Chinach, najbardziej
znanym gatunkiem tej herbaty jest ja-
pońska Sencha. Ma ona grube, długie
liście i jasnozielony napar. Jest to co-
dzienna herbata Japończyków, której
przypisuje się zapobieganie zatruciom
pokarmowym, zabijanie szkodliwych
bakterii i toksyn w organizmie, a także
wspomaganie higieny jamy ustnej.

CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA

Sporządzono wyciągi wodne 6 różnych
herbat zielonych. Były to herbaty: ja-
pońska Sencha, japońska Gen Mai Cha,
Sencha Makato, Zielony Żeń-szeń, Cey-
lon Opa oraz Daryeeling Greek. Odwa-
żono po 2 g ± 0,01 g każdej z herbat
i poddano 5-minutowemu procesowi
parzenia za pomocą wody dejonizowa-
nej. Zastosowanie wody dejonizowanej
zamiast wody z kranu miało na celu
uzyskanie wyników, które dla poszcze-
gólnych analitów powinny pochodzić
wyłącznie z ekstraktu analizowanych
herbat. Po upływie 5 minut zaparzo-

STRESZCZENIE

Chromatograﬁ a

jonowa, przeznaczona głównie do

badania wody i ścieków, znajduje

coraz częściej zastosowanie

do oznaczania nieorganicznych jonów

w innych matrycach, takich jak napoje,

np. herbata. Niniejszy artykuł zawiera

wyniki badań zawartości wybranych

nieorganicznych anionów oraz kationów,

a także wybranych metali, w 6 herbatach

zielonych dostępnych na rynku polskim.

SŁOWA KLUCZOWE

herbaty

zielone, chromatografia jonowa,

aniony, kationy, metale ciężkie

SUMMARY

Ion chromatography,

which is dedicated mostly to water and

waste water analysis, recently has been

used for the determination of inorganic

ions in other matrix samples, such as

beverages, for example teas. The results

of determination of selected inorganic

anions and cations, as well as selected

metals, in 6 green teas available on the

Polish market are described in the paper.

KEY WORDS

green tea, ion

chromatography, anions, cations, metals

mgr inż. Aleksandra Łyko
mgr inż. Sebastian Szopa
dr hab. Rajmund Michalski

INSTYTUT PODSTAW INŻYNIERII ŚRODOWISKA PAN W ZABRZU

L A B O R A T O R I U M

P R Z E M Y S Ł O W E

L A B O R A T O R I U M 6 / 2 0 0 9

na herbata została przesączona przez sączki nitrocelulozowe
o wielkości porów 0,2 μm, a następnie po ostudzeniu jej
do temperatury pokojowej zmierzono pH oraz przewodnictwo
właściwe naparów. Zostały one poddane analizie chromato-
graficznej, którą wykonano z wykorzystaniem modularnego
zestawu do chromatografii jonowej firmy Metrohm w na-
stępujących warunkach analitycznych:

Oznaczanie anionów
Kolumna analityczna

Metrosep Supp A SUPP 5-250

Eluent

3,2 mM Na

+ 1,0 mM NaHCO

Przepływ eluentu

0,7 mL/min

Objętość nastrzyku

20 μL

Detekcja konduktometryczna
Supresor MSM
Oznaczanie kationów
Kolumna

Metrosep C2 250

Eluent

2,5 mM HNO

Przepływ eluentu

0,9 ml/min

Objętość nastrzyku

100 μL

Detekcja

konduktometryczna bez supresji

Dwa przykładowe chromatogramy uzyskane podczas badań
przedstawiono na rysunkach 2 i 3 (str. 28).

Uzyskane wyniki ilościowe oznaczania wybranych nieorga-

nicznych anionów (F

, Cl

, NO

, PO

, SO

) oraz kationów

(Li

, Na

, NH

, K

, Ca

, Mg

) w ekstraktach wodnych ana-

fot

. Aleksandr

a Ł

fot

. Aleksandr

a Ł

reklama

Fot. 2. Napar z herbaty Sencha

Fot. 1. Liście japońskiej herbaty Sencha

L A B O R A T O R I U M 6 / 2 0 0 9

L A B O R A T O R I U M

P R Z E M Y S Ł O W E

JONY OZNACZANE

mg/dm



ANALIZOWANA HERBATA ZIELONA

JAPOŃSKA SENCHA

JAPOŃSKA

GEN MAI CHA

SENCHA MAKATO

ZIELONY ŻEŃSZEŃ

CEYLON OPA

DARYEELING GREEN

Aniony

14,83

2,78

6,43

10,04

17,03

15,18

6,15

4,22

6,12

5,03

9,38

5,03

0,65

0,53

1,16

0,99

0,49

12,04

5,74

6,78

11,94

13,86

23,87

18,56

8,85

10,78

14,73

16,38

15,27

Kationy

0,35

0,23

0,36

0,39

0,37

0,39

< 0,1

0,25

< 0,1

0,43

0,31

0,71

0,82

0,33

136,71

45,84

110,77

127,63

119,56

6,5

2,53

4,08

5,69

4,91

5,28

7,69

2,99

3,47

3,63

2,52

2,21

5,72

6,08

5,7

5,63

5,44

5,56

Przewodnictwo

[μS/cm]

298

194

300

371

393

377

Ilość zawiesiny [g/l]

0,055

0,023

0,043

0,048

0,050

0,039

Tabela 1. Wyniki analiz chromatograficznych zawartości nieorganicznych jonów, pH, przewodnictwa oraz zawiesiny

Rys. 1. Schemat produkcji herbaty zielonej

Rys. 2. Chromatogram anionów w naparze z zielonej japońskiej herbaty Sencha

Rys. 3. Chromatogram kationów w naparze z zielonej japońskiej herbaty Sencha

Wapń 7,69

Czas retencji [min]

Magnez 6,49

Lit 0,35

Świeżo zebrane liście zielone

Krzew herbaciany

Liście sortowane i oczyszczane

Liście pozostawione do zwiędnięcia

Zwijanie, suszenie

Ponowne palenie

Chińskie i japońskie

herbaty zielone

Japońskia sproszkowana

herbata zielona

Ponowne suszenie i ewentualne

aromatyzowanie

Proszkowanie

Cięcie na kawałeczki

Liście pieczone, palone lub poddane

działaniu pary

L A B O R A T O R I U M

P R Z E M Y S Ł O W E

L A B O R A T O R I U M 6 / 2 0 0 9

reklama

lizowanych herbat zielonych podano
w tabeli 1.

W osadzie zebranym na sączkach

wykonano badania zawartości wybra-
nych metali. Do tego celu zastosowano
jedną z technik spektrometrycznych,
która jest szczególnie użyteczna do ja-
kościowej i ilościowej analizy metali
ciężkich. Należy do metod, które po-
zwalają na szybką i niedestrukcyjną
analizę, a mierzone sygnały można
otrzymywać nawet z małej, miligra-
mowej naważki badanej próbki. W ta-
beli 2 przedstawiono wybrane wyniki
zawartości metali w zawiesinie herbat
zebranej na sączku.

PODSUMOWANIE

Herbaty są, zaraz po wodzie, najczę-
ściej spożywanym napojem, a najstarszą
z nich jest herbata zielona, pita od po-
nad 5000 lat. To najpopularniejszy
napój w krajach azjatyckich, głównie
w Chinach i Japonii. Obecnie, gdy do-
ceniamy znaczenie zdrowego odżywiania
się, zaczyna być zauważana także przez
Europejczyków. W związku z tym ważne
jest, aby lepiej poznać jej skład i właści-
wości. Na podstawie uzyskanych wyni-
ków badań można stwierdzić, że:
1. Wszystkie analizowane herbaty

zielone charakteryzują się wysoką
zawartością f luorków oraz fosfora-
nów. Dane te znajdują potwierdzenie
w literaturze (3). Z kolei zawartość
pozostałych nieorganicznych anio-
nów jest relatywnie niska.

2. W odniesieniu do zawartości nieorga-

nicznych kationów interesująca jest
bardzo niska zawartość jonów sodu
i wysoka zawartość jonów potasu. Być
może w tym tkwi jedna z tajemnic
zdrowotnych właściwości zielonych
herbat.

PIERWIASTKI OZNACZANE

W ZAWIESINIE g/kg

ANALIZOWANA HERBATA ZIELONA

JAPOŃSKA SENCHA

JAPOŃSKA

GEN MAI CHA

SENCHA MAKATO

ZIELONY ŻEŃSZEŃ

CEYLON OPA

DARYEELING GREEN

1,51

3,55

1,91

2,92

1,75

2,22

1,21

2,74

2,86

2,81

1,04

2,19

0,91

1,08

0,87

1,18

1,06

1,32

3,96

2,79

3,29

4,46

3,48

3,69

2,19

1,84

2,74

3,32

1,70

1,40

0,06

0,13

0,16

0,17

0,06

0,23

0,84

0,39

0,81

0,62

0,51

0,16

0,87

1,71

2,02

2,31

0,99

1,82

Tabela 2. Zawartość wybranych metali w osadzie z analizowanych herbat

3. Spośród podanych w tabeli 2 wyni-

ków oznaczania wybranych metali
warto zwrócić uwagę na obecność
tytanu i żelaza.

4. Uzyskane wyniki dla herbat zielo-

nych, pomimo pewnych analogii,
są jednak inne niż w tym samym
zakresie analiz dla herbat czarnych
i ziołowych (4).
Przedstawione wyniki stanowią frag-

ment większej całości, która wkrótce
powinna zostać opublikowana w między-
narodowym czasopiśmie naukowym. 

Piśmiennictwo
1. Wu Ch.D., Wei G.X.: Tea as a functional food

for oral health. „Nutr. Oral Health”, 2002,
18, 443-444.

2. www.czasnaherbate.pl.
3. Fung K.F., Zhang Z.Q., Wong J.W.C., Wong M.H.:

Fluoride contents in tea and soil from tea plantations
and the release of fluoride into tea liquor during infu-
sion. „Environ. Poll.”, 1999, 104, 197-205.

4. Michalski R.: Simultaneous determination of com-

mon inorganic anions in black and herbal tea
by suppressed ion chromatography. „Journal
of Food Quality”, 2006, 29, 607-616.

•

life science

•

badania i rozwój

•

kontrola jakości

•

kontrola procesów

Aplikacje
Sprzedaż
Serwis

L A B O R A T O R I U M 5 / 2 0 0 9

. . .

L A B O R A T O R I U M

Nowe metody stosowane
w analizie żywności

– aspekt mikrobiologiczny

ciągu ostatniej dekady obser-
wowano wzrost infekcji wywo-
łanych spożyciem produktów

żywnościowych o niedostatecznej ja-
kości. Epidemiologia tych zatruć wciąż
ewoluuje nie tylko dlatego, że populacja
stała się wyjątkowo wrażliwa, ale przede
wszystkim z powodu zmiany stylu ży-
cia, tj. jemy coraz różnorodniej – żądni
przygód kulinarnych, poświęcamy mniej
czasu na przygotowanie posiłków, korzy-
stamy z wygodnej żywności. Rozwinęły
się również nowe zagrożenia, nowe grupy
patogenów związane z rozwojem tech-
nologii produkcji żywności, procesów
przetwarzania i dystrybucji.

METODY IDENTYFIKACJI
MIKROORGANIZMÓW

Do identyfikacji mikroorganizmów wy-
korzystujemy metody, które możemy
podzielić na 3 grupy:
– metody fenotypowe – wykorzystujące

cechy fenotypowe mikroorganizmów,
które można zaobserwować pod mi-
kroskopem. Na podstawie wyglądu
zewnętrznego nie można zidentyfi-
kować bakterii ze względu na podo-
bieństwo komórek między różnymi
filogenetycznie rodzinami,

– metody biochemiczne – metody stosowa-

ne głównie w przemyśle i wykorzystujące
produkty szlaków metabolicznych cha-
rakterystyczne dla danych drobnoustro-
jów. Na podstawie analizy metabolitów
bakteryjnych jesteśmy w stanie zaklasyfi-
kować je do danej grupy, a porównując
otrzymane wyniki z wynikami w bazach
danych, często możemy precyzyjnie
określić przynależność taksonomiczną
mikroorganizmów,

– metody genetyczne – najbardziej pre-

cyzyjne techniki wykorzystujące zdoby-
cze biologii molekularnej, opierające
się głównie na materiale genetycznym
drobnoustrojów, dzięki którym moż-

liwe jest bardzo dokładne określenie
przynależności gatunkowej bakterii,
a nawet określenie ich szczepu.

PRZYCZYNY ROZWOJU
SZYBKICH TECHNIK
IDENTYFIKACJI

Rozwój nowoczesnych technik z zakre-
su mikrobiologii, immunologii, biolo-
gii, biochemii i biofizyki przyczynił się
do postępu w zakresie szybkich metod
oznaczania i charakterystyki mikroorga-
nizmów w żywności. Nowoczesne meto-
dy mikrobiologiczne są ukierunkowane
przede wszystkim na szybkie i niezawodne
wykrywanie bakterii chorobotwórczych.
W zakresie szybkiego wykrywania i iden-
tyfikacji mikroorganizmów prym wiodą
nauki z zakresu medycyny. Postępujący
rozwój metod instrumentalnych i testów
diagnostycznych oraz postęp naukowy
wykorzystuje się do ulepszenia metod
izolacji, wczesnego wykrywania, liczenia,
charakterystyki i identyfikacji mikroor-
ganizmów. Monitorowanie produkcji
żywności poprzez system HACCP (Ha-
zard Analysis Critical Control Points) oraz
kontrolę higieny w ramach GHP (Good
Hygienic Practice), GMP (Good Manufactu-
ring Practice), MRA (Microbial Risk Asses-
sment), RM (Risk Management), RC (Risk
Communication) oraz TQM (Total Quality
Management) jest skutecznym, zgodnym
z obecnymi trendami sposobem zarządza-
nia jakością i bezpieczeństwem żywności.
Systemy te wymagają jednak nowocze-
snych, a przede wszystkim szybkich i jed-
noznacznych testów oceny m.in. stanu
mikrobiologicznego maszyn i urządzeń
produkcyjnych, surowca i produktu.
Dlatego w ostatnich latach obserwuje
się szybki transfer technik wykrywania
i identyfikacji drobnoustrojów z za-
kresu medycyny klinicznej do praktyki
przemysłowej. Adaptacja metod wymaga
jednakże opracowania właściwych proce-

STRESZCZENIE

Główne

niebezpieczeństwo dla zdrowia,

a nawet życia konsumenta związane

jest z pogorszeniem jakości zdrowotnej

produktu, co wynika z obecności

i rozwoju mikroorganizmów, przede

wszystkim chorobotwórczych. Dlatego

też jednoznaczna i szybka identyﬁ kacja

zagrożeń mikrobiologicznych w surowcu,

na wszystkich etapach procesu

technologicznego i w samym produkcie

jest konieczna. W artykule przedstawiono

zestawienie głównych nurtów i technik

mikrobiologicznych stosowanych obecnie

w praktyce laboratoryjnej i przemysłowej.

SŁOWA KLUCZOWE

metody

detekcji mikroorganizmów

SUMMARY

The main hazard

to consumer’s health, or even life,

is connected with the decrease of

product’s health quality which is the

ﬁ rst of a number of consequences of

the presence and growth of pathogenic

microorganisms. Therefore unequivocal

and fast identiﬁ cation of microbiological

risks in raw material, at all stages of

production process and in ﬁ nished

product is necessary. In the paper

the review of the main trends and

microbiological techniques being used

at present in laboratory and industrial

practice has been presented.

KEY WORDS

methods of

microorganisms detection

dr inż. Kamila Goderska
dr inż. Artur Szwengiel

INSTYTUT TECHNOLOGII ŻYWNOŚCI POCHODZENIA ROŚLINNEGO
UNIWERSYTET PRZYRODNICZY W POZNANIU

. . .

L A B O R A T O R I U M

L A B O R A T O R I U M 5 / 2 0 0 9

dur analizy skomplikowanej matrycy, jaką
jest żywność, i dotyczy głównie sposobu
przygotowywania próbki.

Analiza mikrobiologiczna żywności

sprowadza się do oznaczenia ogólnej
liczby drobnoustrojów oraz stwierdzenia
obecności i poziomu patogenów. Licz-
bę drobnoustrojów oznacza się poprzez
posiewy płytkowe metodą wgłębną oraz
metodą powierzchniową. Tradycyjne
procedury są wieloetapowe, czasochłon-
ne, materiałochłonne, ponadto często
wymagają dużego doświadczenia perso-
nelu. Zaletami nowoczesnych technik
są przede wszystkim: oszczędność czasu,
możliwość oceny liczebności populacji,
identyfikacja gatunkowa oraz możliwość
zróżnicowania w obrębie gatunku.

Nowe narzędzia, jakie dają nam osią-

gnięcia naukowe w dziedzinie immuno-
logii, biologii molekularnej, biochemii,
biologii z elementami chemii, fizyki
i biofizyki, powinny być wykorzystywa-
ne w dwóch płaszczyznach w celu kom-
pleksowego zapewnienia bezpieczeństwa
zdrowotnego żywności. Z jednej strony
powinno się prowadzić badania monito-
ringowe obejmujące zakład produkcyjny.
Z drugiej strony szczegółowa wiedza o za-
chowaniu się mikroorganizmów w odpo-
wiedzi na określone warunki środowi-
ska pozwala na obiektywne określenie
wpływu procesu technologicznego oraz
warunków dystrybucji i magazynowania
na stopień skażenia mikrobiologicznego
i jego jakość; wiedzę tę, jak i procedu-
ry, powinny z kolei zakładom zapewnić
placówki naukowe.

CELE I ZAKRES
OCENY STANU
MIKROBIOLOGICZNEGO

Mikrobiologiczne badania monitoringowe
powinny zatem uwzględniać:
– mikrobiologiczną ocenę surowców,
– higienę zakładu (personelu, urządzeń

i pomieszczeń produkcyjnych),

– konfekcjonowanie, dystrybucję i trans-

port produktów oraz ich przechowy-
wanie.
Monitorowanie, w tym rutynowa

kontrola jakości i bezpieczeństwa surow-
ców oraz gotowych produktów, wymaga
posługiwania się odpowiednimi i specy-
ficznymi dla mikrobiologii wskaźnika-
mi. Wskaźniki mikrobiologiczne można
podzielić na:
– wskaźniki jakości produktu (oznacze-

nie typowych, pożądanych bądź też

nietypowych i niekorzystnych mikro-
organizmów oraz ich metabolitów,
które można szybko zidentyfikować
i oznaczyć),

– wskaźniki bezpiecznej żywności (wykry-

wanie niepożądanych i patogennych
mikroorganizmów w sposób szybki,
łatwy i pewny, np. E. coli, Enterobacter,
Klebsiella, Salmonella, Listeria monocy-
togenes, Staphylococcus aureus),

– wskaźniki matematycznego mode-

lowania wzrostu niepożądanych mi-
kroorganizmów w danym produkcie,
służące do przewidywania jakości mi-
krobiologicznej żywności (Predictive
Microbiology).

CHARAKTERYSTYKA
TECHNIK DETEKCJI

Największą uwagę skupia się obecnie
na szybkich metodach detekcji mikroor-
ganizmów i ich automatyzacji. Praktycz-
ne znaczenie mają testy biochemiczne
do identyfikacji mikroorganizmów. Naj-
bardziej znanymi testami biochemicznymi
są testy API. W zasadzie oparte są one
na prostych reakcjach chemicznych, któ-
re zachodzą w podłożach wzrostowych;
niekiedy zachodzi potrzeba dodania
do podłoża po inkubacji odpowiedniego
odczynnika. Do badań używa się także
mikrotitrera płytkowego, wykorzystujące-
go inokulację za pomocą wielopunktowej
pipety inokulacyjnej. W badaniach mi-
krobiologicznych stosowane są również
testy immunoenzymatyczne, które oparte
są na metodach ELISA. Służą one głównie
do szybkiego wykrywania drobnoustro-
jów patogennych, takich jak: Salmonella,
Listeria, Staphylococcus, E. coli 0157:H7.
Do identyfikacji pałeczek Salmonella
oraz gronkowców chorobotwórczych
stosowane są testy serologiczne, czyli te-
sty hemaglutacyjne oraz testy lateksowe.
Modyfikacją płytkowej metody oznacza-
nia liczby mikroorganizmów w produk-
tach jest Petrifilm, złożony z podwójnej
warstwy zawierającej podłoże wzrostowe
w postaci żelu rozpuszczalnego w zimnej
wodzie i tworzącego błonkę. Petrifilmy
służą do oznaczenia ogólnej liczby bak-
terii tlenowych, drożdży i pleśni oraz
E. coli. Inna metoda to zastosowanie
płytki pokrytej podłożami, w przypadku
której posiew przeprowadza się przez za-
nurzenie, pocieranie lub metodą kontak-
tową (dociskową). Wykorzystywany jest
także system płytki spiralnej, polegający
na rozprowadzeniu płynnej próbki na po-

reklama

ANALIZATOR

BAKTERII

MODEL

BACTRAC 4300

Cechy:

w pełni zautomatyzowany

pomiar

metoda

impedancyjna

z pomiarem parametrów

M i E

zastępuje

metodę

płytkową

redukuje

kilkakrotnie

czas

detekcji

mikroorganizmów

łatwa preparatyka dla analiz
ilościowych i jakościowych

redukuje

koszta

analizy i nakład pracy

wysoka wydajność

(do 64 stanowisk

pomiarowych

i powyżej, aż do 768)

upraszcza i kompletuje

dokumentację

analiz

Zastosowania:

screening

patogenów

całkowita liczba bakterii

testy

sterylności

detekcja

wzrostu

mikroorganizmów

testy

aktywności

kinetyka

wzrostu

testy

inhibitorów

analiza grzybów i pleśni

optymalizacja

składu

artykułów

spożywczych

badania

biofilmów

i wiele innych

Legislacja:
*DIN 10115/10120
+ §35 LMBG,
OeNORM,
GOSSTANDARD, AFNOR

zzzÝv|odqwÝso

inż. JÓZEF NITKA

44-172 Niewiesze k. Gliwic, ul. Pyskowicka 12

tel. 032 230 32 01, fax 032 230 33 01

e-mail: info@sylant.pl

ANALIZATOR

L A B O R A T O R I U M 5 / 2 0 0 9

. . .

L A B O R A T O R I U M

wierzchni i tworzeniu spirali Archime-
desa poprzez osadzenie smugi zawiesiny
w strumieniu próby zmniejszającym się
od środka płytki do brzegów.

Metoda Droplette polega na zmie-

szaniu rozcieńczonej próby z upłynnio-
nym podłożem agarowym w stosunku
1:9. Następnie zaszczepione podłoże
nanosi się w postaci kropelki o objętości
0,1 ml na plastikowe płytki i po skoń-
czonym czasie inkubacji liczy się mi-
krokolonie. Kolejną metodą są pomiary
turbidymetryczne. Analizator Bioscreen
jest całkowicie zautomatyzowanym syste-
mem analizy. Złożony jest z inkubatora,
wytrząsarki i automatycznego urządzenia
do jakościowego i ilościowego wykrywa-
nia mikroorganizmów. Próby lub ich roz-
cieńczenia są zaszczepiane automatycznie
w płytkach mikrotitrera. Wzrost mikroor-
ganizmów monitoruje się przez pomiar
gęstości optycznej co 10 minut.

Mikroskopia fluorescencyjna DEFT

ma szczególne znaczenie w ocenie jakości
bakteriologicznej mleka i mięsa oraz przy
produkcji piwa. Technika ta obejmuje
filtrowanie próby wstępnie traktowanej
enzymem celem lepszej filtracji próby
i separacji optycznej bakterii od otacza-
jącego tła. Oranż akrydyny barwi osiadłe
bakterie, a żywe komórki świecą na po-
marańczowo lub żółto, natomiast martwe
– na zielono. Modyfikacją tej metody jest
membrane filter microcolony fluorescent me-
thod (MMCF), stosowana do oceny ilości
drożdży i pleśni w piwie. Unieruchomione
na filtrach mikroorganizmy hoduje się
na selektywnych podłożach agarowych,
umożliwiających tworzenie się mikrokolo-

ni, które następnie barwione są oranżem
akrydyny. Niebieskie mikrokolonie liczo-
ne są w mikroskopie fluorescencyjnym
lub za pomocą analizatora.

Kolejną metodą jest pomiar aktywności

metabolicznej oparty na testach redukta-
zowych, metodzie impedymetrycznej, mi-
krokalorymetrii, cytometrii przepływowej,
biosensorach i pomiarze ilości enzymów.
Testy reduktazowe bazują na obserwacjach
zmian zachodzących w pożywkach w wy-
niku aktywności metabolicznej mikroorga-
nizmów. Enzymy bakteryjne, takie jak np.
dehydrogenaza, przenoszą atom wodoru
z substratu na barwniki typu redox, powo-
dując zmianę ich zabarwienia. Aktywność
enzymu jest zależna od liczby mikroorga-
nizmów, a miernikiem ich ilości jest czas,
w którym zajdzie zmiana zabarwienia
stosowanego barwnika redox. Stosuje się
takie barwniki, jak: błękit metylenowy,
resazuryna i chlorek tetrazoliowy.

Metoda impedymetryczna jest pomia-

rem oporności, jaką stawia podłoże dla
prądu zmiennego. Wykorzystuje się w niej
najnowszy analizator mikrobiologiczny
BacTrac. Kompleksowe składniki pożywek
(sacharydy, białka, tłuszcze) są katabolizo-
wane do naładowanych produktów meta-
bolizmu, takich jak: aminokwasy, kwasy
organiczne i inne niskocząsteczkowe me-
tabolity. Rozwój mikroorganizmów pro-
wadzi do obniżenia całkowitej impedancji
podłoża. Miernikiem detekcji mikroor-
ganizmów jest czas detekcji, po którym
następuje mierzalna zmiana impedancji
środowiska. Do określenia profilu wzro-
stu drobnoustrojów skażających próby
wykorzystywane są pomiary dwóch para-

metrów impedancyjnych próbki: M-value
(impedancja podłoża) i E-value (impe-
dancja elektrod). Mierzalna impedancja
środowiska następuje, gdy liczba bakterii
osiąga poziom 10

komórek, a drożdży

i grzybów – po osiągnięciu poziomu ok.
10

komórek. Stosując tę technikę, można

określić całkowitą liczbę mikroorganizmów,
a po zastosowaniu pożywek selektywnych
również bakterii chorobotwórczych, droż-
dży i pleśni. Technika ta znajduje zasto-
sowanie w analizie mleka, soków, jarzyn,
produktów mlecznych i przypraw. Zna-
mionuje ją szybkie testowanie aktywności
szczepionek przed ich wprowadzeniem
do procesów fermentacyjnych.

Mikrokalorymetria oparta jest na zja-

wisku wydzielania się ciepła podczas
wzrostu mikroorganizmów. Minimalny
poziom tworzenia ciepła dają próby za-
wierające ok. 1000 bakterii/ml.

Cytometria przepływowa opiera się

na pomiarze fizycznych i niekiedy che-
micznych cech komórek, które są zawie-
szone w roztworze i pojedynczo przepły-
wają przez sensory optyczne. Komórki
poruszają się w płynie o szybkości prze-
pływu od 10 m/s do 20 m/s; po oświe-
tleniu ich światłem rejestruje się liczbę
i rozmiar cząsteczek. W tej metodzie
wykorzystuje się również znakowanie
składników komórkowych, takich jak:
białka, kwasy nukleinowe, lipidy czy
antygeny powierzchniowe, za pomocą
fluorochromów. Metodę tę stosuje się
do określenia ogólnej liczby drożdży i pa-
łeczek mlekowych, coraz częściej jednak
wykorzystywana jest też do wykrywania
poszczególnych grup mikroorganizmów.

ikroskopia

fluorescencyjna DEFT

ma szczególne znaczenie

m.in. w ocenie jakości

bakteriologicznej mleka.

fot

. Shutt

erst

ock

. . .

L A B O R A T O R I U M

L A B O R A T O R I U M 5 / 2 0 0 9

Biosensory dają sygnał w odpowiedzi
na zmiany środowiskowe, reagując np.
na ciepło, światło i pH. Sensorami są róż-
nego typu elektrody.

Bakterie z rodzaju Enterobacteriaceae

wytwarzają enzym ß-D-glukuronidazę.
Jest on produkowany przez E. coli i część
szczepów z rodzaju Shigella, Salmonella
i Arizona. Pozostałe bakterie z rodziny
Enterobacteriaceae nie wytwarzają tego
enzymu. MUG jest substratem, który
pozwala dość szybko wykryć aktywność
tego enzymu. Związek ten, w wyniku
hydrolizy przez enzym glukuronidazę,
ulega rozkładowi z wydzieleniem 4-me-
tyloumbeliferolu, wykazującego niebieską
fluorescencję w świetle UV.

Kolejną metodą jest pomiar metabo-

litów pośrednich lub produktów koń-
cowych. Oznacza się np. pirogronian.
W tym celu wykorzystuje się metodę enzy-
matycznej redukcji kwasu pirogronowego
przez dehydrogenazę mleczanową.

Inną znaną metodą jest biolumine-

scencyjny pomiar ATP. Wszystkie żywe
komórki zawierają ATP – nukleotyd,
który pełni rolę magazynu energii. Stę-
żenie ATP może być mierzone w prosty
sposób w reakcji z zastosowaniem lucy-
feryny i lucyferazy. W wyniku tej reakcji
wydzielane jest światło w ilościach rów-
noważnych do ilości ATP. Stosując tę me-
todę, w ciągu 1 minuty można ocenić
stan sanitarny powierzchni.

Test LAL jest szybką metodą wykrywa-

nia endotoksyn, czyli obecności bakterii
G(-). Składają się one z kompleksów lipi-
dów i polisacharydów o różnym składzie
chemicznym. Techniki radiometryczne
są oparte na pomiarze pobierania lub
znakowania substratów lub produktów.
Najczęściej stosowane metody radio-
metryczne wykorzystują pomiar

– tworzonego przez mikroorganizmy
w wyniku metabolizowania znakowanych
izotopowo substratów, np. glukozy czy
laktozy, wprowadzonych do podłoża
hodowlanego. Szybkość czasu detekcji
jest skorelowana z początkową liczbą
mikroorganizmów w badanej próbie.
Trudność w usuwaniu odpadów izoto-
powych wyklucza tę metodę z zastoso-
wań w analizie żywności. Różnicowanie
do rodzajów możliwe jest na podstawie
analizy lotnych produktów końcowych
przy pomocy chromatografii gazowej.
Można stosować ją do bakterii z rodza-
ju Bacillus i Clostridium. W przypadku
oznaczeń dotyczących grzybów możliwa

jest charakterystyka ściany komórkowej,
która zawiera chitynę, oraz membran
cytoplazmatycznych, zawierających er-
gosterol. Poziom ergosterolu świadczy
o jakości żywności i może być oznacza-
ny za pomocą chromatografii HPLC,
chromatografii gazowej i cienkowarstwo-
wej oraz spektrometrii w ultrafiolecie
i podczerwieni.

NAJNOWOCZEŚNIEJSZE
METODY

Biologia molekularna stanowi najno-
wocześniejsze narzędzie do oznaczeń
mikrobiologicznych. Można stosować
sondy, które łączą się z określonym
mikroorganizmem, wirusem czy też
specyficznym składnikiem organizmu,
a następnie wykorzystywać detekcję
kompleksu sonda – analizowany skład-
nik. Najczęściej stosowanymi sondami
są kwasy nukleinowe do detekcji DNA
lub RNA oraz cząsteczki przeciwciał
do detekcji białek, węglowodanów lub
lipidów. Jeżeli sekwencja zasad w son-
dzie jest komplementarna do sekwen-
cji charakterystycznej dla oznaczanego
mikroorganizmu, wówczas sonda wiąże

się jedynie z DNA oznaczanego mikro-
organizmu. W oznaczeniach systemu
Gene-Trak stosowane są fluorescencyj-
nie znakowane sondy DNA, natomiast
w systemie Gene-Probe wykorzystywane
są sondy znakowane akrydynowym es-
trem. W obydwu systemach oligonukle-
otydowe sondy DNA są komplementarne
wobec charakterystycznych dla anali-
zowanego mikroorganizmu sekwencji
rybosomalnego RNA. RRNA występuje
w komórce w dużej liczbie kopii, ponie-
waż jest integralną częścią bakteryjnego
rybosomu. Analiza taka składa się z czte-
rech etapów. Lizę próbki dla bakterii
G(-) powoduje zasadowe środowisko,
a dla G(+) wspomaga się ją lizozymem.
Następnie następują hybrydyzacja, zwią-
zanie hybrydu i detekcja. Do unikalnych,
sąsiadujących ze sobą regionów tej samej
cząsteczki rRNA testowanego organizmu
dodawane się dwie sondy wykazujące
homologię. Jedna umożliwia wiązanie
hybrydu z nośnikiem dzięki połącze-
niu do jej 3’ końca poli dA, natomiast
druga służy do detekcji, gdyż do jej oby-
dwu końców przyłączone są specjalne
związki chemiczne wywołujące zmianę

reklama

L A B O R A T O R I U M 5 / 2 0 0 9

. . .

L A B O R A T O R I U M

barwy lub luminescencję. Wstawienie
do testowanej mieszaniny stałego no-
śnika zawierającego poli dT umożliwia
wychwycenie powstających wcześniej
hybrydów. Detekcja odbywa się poprzez
pomiar zmiany barwy (Gene-Trak) lub
luminescencji (Gene-Probe) wywołanych
po zanurzeniu nośnika z przyłączonym
hybrydem w specjalnych odczynnikach.
Sondy wymagają obecności 10

-10

ko-

pii charakterystycznej sekwencji DNA.
Można to pokonać poprzez powielenie
DNA charakterystycznego mikroorga-
nizmu techniką PCR. Inną metodą jest
analiza poliformizmu miejsc restrykcyj-
nych RFLP. Polega ona na wyizolowaniu
DNA z testowanego mikroorganizmu,
trawieniu odpowiednio dobranymi en-
zymami restrykcyjnymi i rozdzieleniu
ze względu na wielkość powstających
fragmentów DNA metodą elektrofore-
zy żelowej. Następnie rozdzielane frag-
menty przenoszone są na membranę
i dodawana jest chemiluminescencyjnie
znakowana, specyficzna sonda genetycz-
na. Z różnorodności sekwencji wynika
obecność miejsc restrykcyjnych lub ich
brak, a konsekwencją tego jest hybrydy-
zacja sond z fragmentami o różnej wiel-
kości. Sondy pozwalają uzyskać rozkład
prążków unikalny dla danego szczepu
mikroorganizmu.

Metody immunologiczne bazują

na zastosowaniu przeciwciał reagujących
z antygenami obecnymi na powierzch-
ni testowanego mikroorganizmu. Naj-
powszechniej stosowaną techniką jest

TECHNOLOGIA DETEKCJI

ZALETY

WADY

Hybrydyzacja „kanapkowa” (sandwich
hybridisation) – Advantages of HybriScan®

– różnicowanie żywych/martwych komórek,

minimalna interferencja z matrycą próbki,
wysoka specyficzność,

– łatwe wiązanie (hybrydyzacja),
– możliwość oznaczania wielu próbek (płytka

z 96 mikrostudzienkami),

– oznaczenia jakościowe i ilościowe,
– detekcja mikroorganizmów nie rosnących

w warunkach laboratoryjnych

– nierozróżnianie serotypu lub podgatunku,
– limitowane przeznaczenie sondy

PCR

– duża wydajność,
– czułość,
– oznaczenia ilościowe

– brak rozróżnienia między żywymi i martwymi

komórkami,

– duża interferencja z matrycą,
– inhibicja polimerazy

ELISA

– rozróżnianie serotypu lub podgatunku,
– możliwość oznaczania wielu próbek (płytka

z 96 mikrostudzienkami),

– oznaczenia jakościowe i ilościowe

– niska czułość,
– niska specyficzność, reaktywność krzyżowa,
– wolna i droga procedura

Metody konwencjonalne
(bazujące na hodowli komórek)

– relatywnie niedrogie,
– proste procedury,
– specyficzne,
– szeroko akceptowane metody

– czasochłonne (około 10 dni),
– brak detekcji mikroorganizmów nie

rosnących w warunkach laboratoryjnych,

– niska wydajność,
– wymagają dużego nakładu pracy

Tabela 1. Wady i zalety różnych technik detekcji mikroorganizmów (na podstawie Advantages of HybriScan

over other detection techniques, pobrano ze strony internetowej www.sigmaaldrich.com)

metoda immunoenzymatyczna ELISA.
Przeciwciało w stosunku do testowanego
mikroorganizmu połączone jest z enzy-
mem. Po reakcji przeciwciało – antygen
obmywany jest nadmiar przeciwciała,
a obecność organizmu może być stwier-
dzona przez dodanie odpowiedniego
substratu, zmieniającego kolor w obec-
ności enzymu. Zmiana koloru dowodzi
obecności danego organizmu. W technice
immunologicznej stosowane są latekso-
we, różnokolorowe kuleczki, specyficzne
dla poszczególnych mikroorganizmów.
Obecność testowanych organizmów
w roztworze powoduje łączenie się
ze sobą kuleczek ze względu na reakcję
przeciwciała z antygenami obecnymi
na powierzchni drobnoustrojów, co jest
widoczne w formie powstających agrega-
tów. Przeciwciała mogą być przyłączone
do kuleczek magnetycznych i wówczas
komórki testowanych organizmów będą
się z nimi łączyć. Magnes umieszczony
pod pojemnikiem z testowaną próbką
powoduje przyciąganie kuleczek wraz
z testowanymi drobnoustrojami i oczysz-
czenie roztworu. Immunomagnetyczna
separacja usuwa określone mikroorga-
nizmy i stosowana jest do usuwania
komórek Salmonella z przypraw i E. coli
0157:H7 z żywności. Jeśli przykłado-
wo przeciwciała szczepów Salmonella
połączymy z czerwonymi kuleczkami,
a z niebieskimi – przeciwciała Listeria
spp., to istnieje możliwość identyfiko-
wania obecności kilku rodzajów mikro-
organizmów.

Kolejną metodę stanowi identyfikacja

widma w podczerwieni, które jest odzwier-
ciedleniem składu chemicznego komórek
mikroorganizmów. Reprezentuje ono biał-
ka, elementy ściany komórkowej i błony
cytoplazmatycznej oraz kwasy nukleinowe.
Analiza korelacji widm umożliwia różnico-
wanie szczepów. Jednakże niektóre z obser-
wowanych prążków mogłyby już obecnie
być przypisane grupom funkcyjnym okre-
ślonych związków chemicznych struktur
komórkowych. Widma w podczerwieni
są unikalne dla poszczególnych organizmów,
więc dysponując odpowiednimi bazami
danych, można je porównać, i obliczając
współczynnik korelacji, ustalić przyna-
leżność diagnostyczną mikroorganizmu.

Szybką i wiarygodna metodą identy-

fikacji i klasyfikacji mikroorganizmów
jest spektrometria MALDI-TOF (matrix-
-assisted laser desorption/ionization-time
of flight). Współczesne systemy spektrome-
trii MALDI-TOF umożliwiają wykonanie
analizy pozwalającej na jednoznaczną
identyfikację bakterii, drożdży czy grzy-
bów w ciągu kilku minut.

Zalety i wady wybranych technik de-

tekcji mikroorganizmów przedstawiono
w tabeli 1. Wybór właściwej techniki
warunkowany jest czasem, jakim dyspo-
nuje się do momentu uzyskania wyniku,
ściśle sprecyzowanym celem i zakresem
identyfikacji, liczbą próbek oraz akcep-
towanymi kosztami analiz.



Piśmiennictwo dostępne na stronie

www.laboratorium.elamed.pl

L A B O R A T O R I U M 6 / 2 0 0 9

L A B O R A T O R I U M

P R Z E M Y S Ł O W E

Oznaczanie cyjanowodoru
w produktach spożywczych

– metody ilościowe i jakościowe

yjanowodór (kwas pruski, HCN)
jest słabym kwasem, występującym
w stanie czystym pod postacią bez-

barwnego płynu, o przyjemnym zapachu
gorzkich migdałów, wrzący już w tempe-
raturze 25,7°C. Miesza się z etanolem,
eterem i wodą w każdym stosunku. Daje
połączenia z wieloma metalami i łatwo
ulega reakcjom estryfikacji. Charaktery-
zuje się niskim progiem wyczuwalności
zapachowej (poniżej 0,005 ppm). Wszyst-
kie związki, z których jest uwalniany
w organizmie, uważane są za trujące (21).
Kwas pruski wykazuje szczególnie duże
powinowactwo do jonu Fe

i łatwo wią-

że się z żelazem hemowym, co wpływa
na zaburzenie funkcjonowania łańcucha
oddechowego. Duża jednorazowa dawka
(5-20 mg) może doprowadzić do ostre-
go zatrucia, skutkującego niedotlenie-
niem ośrodkowego układu nerwowego,
a dawka śmiertelna dla człowieka wynosi
od 30 mg do 60 mg. Bezpośrednim ob-
jawem zatrucia cyjanowodorem jest ja-
sna barwa krwi żylnej. Organizmy żywe
wchłaniają cyjanowodór przez drogi
oddechowe, skórę i układ pokarmowy.
Związek ten nie kumuluje się w organi-
zmach, dlatego nie obserwuje się zatruć
przewlekłych, jednak przy dłuższym
kontakcie z jego małymi dawkami może
dochodzić do gromadzenia się tzw. mi-
krouszkodzeń (m.in. zaburzenia pracy
układu pokarmowego i krążenia, bóle
jelitowe, osłabienie) (14).

Łatwość przenikania kwasu pruskiego

przez układ pokarmowy sprawia, iż jego
zawartość w poszczególnych produktach
spożywczych powinna być monitorowana.
W przyrodzie cyjanowodór powszechnie
występuje w postaci glikozydów cyja-
nogennych, takich jak np. amygdalina,
linamaryna czy prunazyna. Dotychczas
poznano ponad 75 różnych związków
należących do tej grupy. Występują one
głównie w produktach roślinnych: mig-

dałach, pestkach owoców (śliwy, wiśnie,
czereśnie, brzoskwinie itp.), nasionach
jabłek, owocach marakui i kiełkach fa-
soli mung (19). Potencjał cyjanogenny
wybranych produktów spożywczych
przedstawiono w tabeli 1.

Istnieje realne niebezpieczeństwo za-

trucia cyjanowodorem po spożyciu takich
produktów, jak kompoty i napoje alko-
holowe (np. nalewki, wódki gatunkowe)
sporządzane z niewydrylowanych wiśni,
czereśni czy śliwek.

Obecnie znanych jest wiele metod

oznaczania cyjanowodoru. Najogólniej
można podzielić je na jakościowe i ilo-
ściowe.

METODY JAKOŚCIOWE

Jakościowe oznaczanie cyjanków w żywno-
ści opiera się w większości na wykorzysta-
niu chromatografii bibułowej. Oznaczenie
polega na reakcji barwnej między jonami
CN

–

i wskaźnikiem, którym nasączona

jest bibuła. Intensywność powstającego
zabarwienia zależy od zastosowanego
wskaźnika, np. 4,4’-metyleno-bis(N,N-
dimetyloaniliny) czy etyloacetylooctanu
miedzi. Użycie tych wskaźników pozwala
wykryć jony CN

–

już w ilości 1 μg (21).

Również reakcja między CuS i cyjanka-
mi daje zadowalające wyniki, pozwalając
wykryć HCN o stężeniu 1-6 μg/dm

Po wystąpieniu barwnych plam spryskuje
się je roztworem dietyloditiokarbami-
nianu (1%), dzięki czemu uzyskuje się
wyraźniejsze granice plam. Zamiast CuS
można zastosować bibułę impregnowaną
Ag

CrO

. Po naniesieniu kropli analizo-

wanej substancji na pasek bibuły prze-
prowadza się powolne rozwijanie wodą
w specjalnym aparacie (21). Bardzo prostą
metodą jakościowego oznaczenia cyjano-
wodoru jest zastosowanie alkoholowego
wyciągu z żywicy gwajakowej i siarczanu
miedzi(II), które w obecności wolnego cy-
janowodoru dają niebieskie zabarwienie.

STRESZCZENIE

W pracy omówiono

szkodliwość występowania cyjanowodoru

w produktach spożywczych oraz metody

jego oznaczania. Techniki analizy HCN

podzielono na jakościowe i ilościowe.

SŁOWA KLUCZOWE

cyjanowodór, toksyczność, jakościowe

i ilościowe metody oznaczania

SUMMARY

In the paper the harmful

influence of hydrogen cyanide and

its occurrence in foodstuff have been

discussed. The detection methods and

analytical techniques of HCN have been

divided into qualitative and quantitative.

KEY WORDS

hydrogen cyanide,

toxicity, qualitative and quantitative

methods of determination

Justyna Sobusiak
dr Aleksandra Duda-Chodak
dr inż. Tomasz Tarko

KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
UNIWERSYTET ROLNICZY IM. H. KOŁŁĄTAJA W KRAKOWIE

L A B O R A T O R I U M

P R Z E M Y S Ł O W E

L A B O R A T O R I U M 6 / 2 0 0 9

Granica wykrywalności to stężenie HCN
1 μg/dm

(12).

METODY ILOŚCIOWE

Miareczkowe metody
oznaczania cyjanowodoru
Jedną z najstarszych metod miareczko-
wych zaproponował Liebig (21). Opiera
się ona na miareczkowaniu argentome-
trycznym – strącaniu jonów CN

–

za po-

mocą azotanu srebra, którego nadmiar
powoduje zmętnienie roztworu i wyzna-
cza punkt końcowy miareczkowania.

Ze względu na łatwe rozpuszczanie wtrą-
conego osadu trudno jest wyznaczyć
precyzyjnie punkt końcowy, dlatego
metodę tę wielokrotnie modyfikowano.
Jedną z modyfikacji jest metoda Dénige-
sa, która wprowadza do roztworu, jako
wskaźnik, jodek potasu i amoniak

(21).

W wyniku tej modyfikacji powstaje nie-
rozpuszczający się osad AgI:

Inną, nawet 10 razy czulszą niż po-
przednie, odmianą metody Liebiga jest
miareczkowanie w obecności ditizonu
według Archera (1). Punktem końcowym
miareczkowania jest zmiana barwy z żółto-
pomarańczowej na czerwonopurpurową.
Warunkiem przeprowadzenia tego ozna-
czenia jest zawartość wody w roztworze
mniejsza niż 20%. Przemysłowo stosowa-
ne jest miareczkowanie argentometryczne
z ałunem żelazowo-amonowym, pełnią-
cym rolę wskaźnika. Za punkt końcowy
przyjmuje się zmianę barwy z jasnokre-
mowej na ciemnopomarańczową, spowo-
dowane pojawieniem się wolnych jonów
srebra w obecności ałunu (12).

W analizie miareczkowej cyjanków

znane jest również miareczkowanie mer-
kurymetryczne. Opiera się ono na reakcji
HCN z jonami Hg

Nadmiar jonów rtęci odmiareczkowuje
się tiocyjanianem. Jako wskaźniki moż-
na stosować nitroprusydek sodowy lub
difenylokarbazon (1).

Metoda jodometryczna Schuleka opie-

ra się na reakcji cyjanków z bromem, który
usuwa się poprzez związanie jodem i od-
miareczkowanie tiosiarczanem (21).

Kolorymetryczne
i spektrofotometryczne
metody oznaczania cyjanowodoru
Metody kolorymetryczne i spektrofoto-
metryczne oparte są na reakcjach che-
micznych, w wyniku których badane jony
przeprowadzane są w barwne kompleksy,
dające się zmierzyć przy użyciu spektro-
fotometru (21). Jednym z najstarszych
kolorymetrycznych sposobów oznaczania
HCN jest metoda bazująca na syntezie
Koniga (reakcja cyjanku bromu z od-
powiednio dobraną aminą aromatyczną
i pirydyną). Cyjanek bromu utlenia piry-
dynę do aldehydu glutakonowego, który,
reagując z aminą, tworzy barwny układ.
Czułość metody zależy od rodzaju użytej
aminy (21). Aldrige zaproponował inną
metodę, wykorzystującą reakcję jonów
cyjankowych z bromem. Nadmiar bromu
zastosowanego do otrzymania cyjanku
bromu odmiareczkowuje się arsenem(III).
Następnie przeprowadza się reakcję cyjan-
ku bromu z odczynnikiem pirydynowo-
-benzydynowym i porównuje natężenie
barwy z roztworami wzorcowymi (9, 17).
Od momentu gdy odkryto rakotwórcze
właściwości benzydyny, poszukiwano jej
zamiennika. Jednym z najlepszych okazała
się p-fenylodiamina. Po przeprowadzeniu
cyjanowodoru w bromocyjan następuje
reakcja z pirydyną i p-fenylodiaminą,
po czym przeprowadza się pomiar eks-
tynkcji. Zastosowanie tej metody pozwala
wykryć już 1 mg HCN/dm

(10, 21).

Kolejną metodą jest oznaczanie zawar-

tości cyjanowodoru przez reakcję z chlo-
roaminą T i odczynnikiem -pikolinowo-
-barbiturowym. Reakcja ta daje barwny
kompleks, którego absorbancję bada się
przy długości fali  = 605 nm. Metoda
pozwala na oznaczenie zawartości cyjano-
wodoru powyżej 0,5 mg/dm

(13, 21).

Relatywnie często stosowana jest meto-

da zaproponowana przez Epsteina. Cyjan-
ki utleniane są chloroaminą T, a następnie
powstałe produkty poddaje się działaniu
pirydyny z dodatkiem 1-fenylo-3-metylo-

5-pirazolonu i 4,4’-bis(1-fenylo-3-metylo-5-
pirazolonu) i bada się absorbancję barwy
kompleksu ( = 630 nm). Czułość moż-
na zwiększyć przez ekstrakcję barwnika
z udziałem n-butanolu (2, 21).

Do oznaczenia cyjanków można wy-

korzystać także sposób Haj-Husseina.
Opiera się on na utlenieniu fenoloftaleiny
przez jony CN

–

i pomiarze intensywno-

ści czerwonego zabarwienia przy użyciu
spektrofotometru. Wodne roztwory cyjan-
ku wstrzykiwane są na strumień 0,001M
NaOH, który dodawany jest do roztworu
fenoloftaleiny i buforu węglanowego o za-
sadowym odczynie. Tak sporządzona mie-
szanina przepuszczana jest przez kolum-
nę wypełnioną siarczkiem miedziowym.
Barwę utlenionej fenoloftaleiny mierzy
się na spektrofotometrze przepływowym
i wynik porównuje ze sporządzoną wcze-
śniej krzywą wzorcową (6).

Coraz częściej do oznaczania cyjanków

zalecane jest wykorzystanie spektrometrii
(16). Metoda ta wykorzystuje przejścia
pomiędzy poziomami energetycznymi
elektronów walencyjnych. Widma czą-
steczek w tym zakresie nie pozwalają
na szczegółową analizę ich budowy, ale
dają możliwość dokładnego ilościowego
oznaczenia emitujących je substancji.
Procedura sprowadza się do odnalezie-
nia barwnego połączenia, w skład któ-
rego wchodzi oznaczany związek, wy-
znaczenia krzywej wzorcowej i pomiaru
natężenia promieniowania w badanym
roztworze (11).

Potencjometryczne metody z uwzględ-
nieniem elektrod jonoselektywnych
Metody potencjometryczne wykorzy-
stują zależność między stężeniem jonów
a potencjałem elektrycznym odpowied-
nich elektrod. Omawiane wcześniej mia-
reczkowanie argentometryczne może
być prowadzone potencjometrycznie
z zastosowaniem elektrody srebrowej,
przy zapewnieniu odpowiednich wa-
runków (pH = 11,3 i stała ilość etanolu

PRODUKT

POTENCJAŁ CYJANOGENNY mg/100 g

Brzoskwinie – nasiona

160

Len – nasiona

21-54

Migdałowiec – gorzkie nasiona

290

Morela – nasiona

40-400

Czereśnia – nasiona

ok. 100

Śliwki

ok. 6,12

Aronia – owoce

4,49

Jabłka

2,50

Tabela 1. Potencjał cyjanogenny wybranych produktów żywnościowych (19)

L A B O R A T O R I U M 6 / 2 0 0 9

L A B O R A T O R I U M

P R Z E M Y S Ł O W E

w roztworze). Elektroda z AgI, jako ma-
teriałem membrany dla cyjanków, ma za-
kres pomiarowy od 10

-6

do 10

-1

mol/dm

i pozwala na określenie zarówno cyjan-
ków wolnych, jak i związanych (15, 21).
Możliwe jest także zastosowanie potencjo-
metrii równowagowej, z wykorzystaniem
elektrody pierwszego rodzaju. Polega ono
na pomiarze zmian równowagi stężenia
jonów Ag

w roztworze KAg(CN)

, które

powodowane jest zmianami stężenia jonów
CN

–

, uwalnianych z próbki destylatu przez

utlenienie. Jony zmieniają stan równowagi
układu elektrodowego, a zmiana poten-
cjału elektrody pomiarowej jest propor-
cjonalna do stężenia cyjanków, co wynika
z równania Nernsta (5, 15).

Metody chromatograficzne
Istnieje wiele rodzajów chromatografii.
Niektóre z nich znalazły zastosowanie
w oznaczaniu cyjanowodoru. Metody
te pozwalają na uzyskanie wyników dokład-
niejszych niż metody spektrofotometrycz-
ne (20). Pierwszą wykorzystaną w tym celu
metodą była chromatografia gazowa (GC).
Można stosować ją do wydzielania cyjan-
ków z mieszanin gazowych, zawierających
O

, N

, CH

, CO

i CO, przed ich ozna-

czeniem. W nowszych metodach cyjanki
i tiocyjaniny przeprowadza się w cyjanek
bromu i wykorzystuje się chromatografię
gazową z zastosowaniem detektora wy-
chwytu elektronów. W ten sposób można
wykryć już 10

-8

g HCN (21). Inna metoda

opiera się na inkubacji próbki materiału
biologicznego z kwasem siarkowym(VI),
pobraniu wydzielonego z roztworu gazu
i wprowadzeniu go do chromatografu
gazowego. Wyniki porównuje się z krzy-
wą kalibracyjną, wyznaczaną w zakresie
od 0,025 mg/cm

do 0,1 mg/cm

(20).

Znane jest także zastosowanie detektora
azotu w celu oznaczenia spadku zawar-
tości cyjanowodoru w dojrzewających
cytrusach. W tym celu usuwa się gazowy
cyjanowodór z miazgi owocowej i przy
pomocy aparatu sorpcyjnego przekazuje
się go na kolumnę chromatografu gazo-
wego wypełnionego Porapakiem Q (8).
Do oznaczania ilościowego cyjanowodoru
w produktach spożywczych można wy-
korzystać wysokosprawną chromatografię
cieczową (HPLC). Technika ta umożli-
wia wykrycie cyjanków w stężeniu kilku
mikrogramów w 1 dm

(18). Ilościowe

oznaczenie cyjanowodoru metodą wy-
sokosprawnej chromatografii cieczowej
zostało wykorzystane podczas badania

nasion lnu, zawierają-
cych glikozydy cyja-
nogenne. Do analizy
używano kolumny
jonowymiennej i de-
tektora elektrochemicz-
nego (4).

Inne metody ilościowe
Istnieją również metody nie nale-
żące do wyżej wymienionych grup. Jedną
z nich jest wykorzystanie izotopu rtęci

203

Hg. Do roztworu cyjanków dodaje

się zawiesinę zawierającą znaczoną rtęć
w postaci Hg(IO

)

i roztwór KIO

. Na-

stępuje reakcja, w wyniku której tworzy się

203

Hg(CN)

. Do pomiaru aktywności po-

wstałego związku wykorzystuje się cieczowy
licznik promieniotwórczy (21). Drugim
izotopem, który może być wykorzystany
w tego typu oznaczeniach, jest

110

Ag w AgI.

Badany roztwór cyjanku przepuszcza się
przez kolumnę wypełnioną znaczonym
jodkiem, gdzie zachodzi reakcja, w wy-
niku której powstaje

110

Ag(CN)

. Aktyw-

ność znaczonego srebra w przesączonym
roztworze bada się za pomocą wnękowe-
go licznika scyntylacyjnego z kryształu
NaI. Jest to metoda szybka, czuła i o du-
żej powtarzalności (21). Wykorzystanie
absorpcyjnej spektrometrii atomowej
(AAS) pozwala na pośrednie oznaczenie
cyjanków. Opracowana metoda opiera
się na zastosowaniu miedzi w kompleksie
CN-Cu w stosunku 3:1, a jej czułość wy-
nosi ok. 2 · 10

-5

mol/dm

(3, 7).

WNIOSKI

Metody wykorzystywane do oznaczania
cyjanowodoru różnią się znacząco mię-
dzy sobą, zarówno pod względem zasad,
na których się opierają, jak i czułości, po-
wtarzalności, szybkości i stopnia trudności
wykonania pomiaru. Różnice te pozwalają
na wybór najkorzystniejszego w danym
przypadku sposobu analizy. Metody

miareczkowe należą do najmniej

dokładnych. Opierają się na obser-

wacji zmiany barwy lub powstawania
osadu w trakcie miareczkowania. Łatwo
o popełnienie w nich błędu spowodowa-
nego nieczułością ludzkiego oka oraz roz-
puszczaniem się powstających w wyniku
miareczkowania kompleksów. Ich zaleta-
mi są prostota wykonania oraz to, że nie
wymagają zastosowania drogiej aparatury.
Doskonale nadają się do wstępnego ozna-
czenia zawartości HCN w badanych prób-
kach. Miareczkowanie potencjometryczne
eliminuje błędy popełniane przy ustala-
niu punktu końcowego miareczkowania,
umożliwiając analizę nawet w mętnych
i pierwotnie zabarwionych roztworach.
Metody kolorymetryczne i spektrofoto-
metryczne są dokładniejsze i czulsze niż
miareczkowe. Nadają się do oznaczania
niskich stężeń cyjanowodoru. Ich wadami
są konieczność posiadania aparatury oraz
fakt, iż w metodach tych często stosowa-
ne są toksyczne odczynniki. Dodatkowo
do wykonania analizy konieczne jest spo-
rządzenie krzywej wzorcowej. Chromato-
grafia daje dokładne i powtarzalne wyniki.
Analizy te wymagają jednak zastosowania
kosztownego sprzętu oraz posiadania od-
powiednich umiejętności i doświadczenia
do ich obsługi. Inne metody stosowane
są stosunkowo rzadko i mają małe zna-
czenie dla przemysłu spożywczego. Wiążą
się z dużymi, w porównaniu do opisanych
wcześniej sposobów, kosztami.



Piśmiennictwo dostępne na stronie
www.laboratorium.elamed.pl.

stnieje realne

niebezpieczeństwo

zatrucia cyjanowodorem po

spożyciu takich produktów,

jak kompoty i napoje

alkoholowe sporządzane

z niewydrylowanych wiśni,

czereśni czy śliwek.

fot

. Shutt

erst

ock

Przeciwutleniacze są to substancje przedłużające trwałość środków
spożywczych poprzez zabezpieczenie ich przed rozkładem, takim jak
jełczenie i zmiana barwy, spowodowanym przez utlenianie. Konieczność
stosowania przeciwutleniaczy wynika z dużej podatności niektórych
produktów żywnościowych na utlenianie. Produkty nietłuszczowe ulegają
utlenieniu najczęściej przy udziale enzymów (oksydaz) znajdujących się
w surowcu (ciemnienie owoców, brunatnienie mięsa). Tym niekorzyst-
nym zjawiskom można zapobiegać, stosując termiczną dezaktywację
enzymów (blanszowanie owoców i warzyw). Oksydatywne jełczenie
tłuszczów w znacznym stopniu pogarsza cechy sensoryczne, a także
wartość odżywczą żywności. Wskutek rozrywania łańcuchów węglowych
powstają niskocząsteczkowe produkty, takie jak: węglowodory, aldehydy,
ketony, kwasy, estry, laktony, alkohole i etery. Charakterystyczny zapach
zjełczałego tłuszczu lub produktu żywnościowego zawierającego lipidy
wynika głównie z obecności w nim krótkołańcuchowych aldehydów
oraz powstających z nich kwasów. Przy daleko posuniętych zmianach
oksydacyjnych tłuszczów mogą powstawać również różne substancje
toksyczne, w tym wolne rodniki. Produkty utleniania lipidów mogą
niszczyć biologicznie czynne białka, działać mutagennie na kwasy
tłuszczowe oraz destrukcyjnie na karotenoidy i witaminę A. Utlenianie
lipidów prowadzi również do obniżenia zawartości niezbędnych niena-
syconych kwasów tłuszczowych (NNKT) i tokoferoli. Jełczeniu może
podlegać także żywność o stosunkowo niewielkiej zawartości tłuszczu,
ale dobrze rozwiniętej powierzchni (np. mąka).

Główną przyczyną niepożądanych zmian w wielu produktach spożyw-

czych są przemiany nienasyconych substancji tłuszczowych spowodowa-
ne utlenianiem. Przemiany te mogą zachodzić z udziałem lub bez udziału
enzymów. Utlenianie substancji tłuszczowych może przebiegać w dwóch
różnych kierunkach i według różnych mechanizmów, prowadzących do
nieco innych produktów reakcji. Jednym z kierunków reakcji utleniania
jest autooksydacja, która jest rodnikową reakcją łańcuchową. Zapocząt-
kowanie reakcji odbywa się poprzez oderwanie wodoru i utworzenie
węglowego rodnika alkilowego, który, reagując z tlenem, tworzy rodnik
nadtlenkowy. Utworzony rodnik nadtlenkowy reaguje z nienasyconym
lipidem, tworząc wodoronadtlenek oraz nowy rodnik lipidowy, który
w reakcji z tlenem tworzy nowy rodnik nadtlenkowy itd. Ta łańcucho-
wa reakcja może być zakończona na skutek rekombinacji rodników

z wytworzeniem nierodnikowych produktów. Problem autooksydacji
dotyczy w największym stopniu nienasyconych kwasów tłuszczowych,
a szybkość tej reakcji wzrasta wraz ze wzrostem stopnia nienasycenia.
Ze względu na niestabilność produktów pośrednich, złożony wpływ
katalizatorów i przeciwutleniaczy oraz jednoczesne odbywanie się reakcji
według innych mechanizmów, autooksydacja jest procesem skompliko-
wanym i nie w pełni poznanym. Drugim mechanizmem oksydacji jest
fotoutlenianie, obejmujące reakcje alkenu z tlenem w obecności światła
i odpowiedniego sensybilizatora, który przekształca tlen w jego bardziej
reaktywny stan singletowy. W tym stanie tlen przyłącza się do jednego
z węgli olefinowych podwójnego wiązania bez wytwarzania rodnika.
Reakcji tej towarzyszy migracja podwójnego wiązania i zmiana jego
konformacji cis w trans. Reakcja fotoutleniania jest znacznie szybsza niż
autooksydacji. Fotoutlenianie może być również przyczyną zainicjowa-
nia autooksydacji wskutek rodnikowego rozpadu wodoronadtlenków.
Procesy utleniania mogą być przyspieszane przez energię cieplną,
promieniowanie o dużej energii, katalityczne działanie metali ciężkich
oraz aktywność enzymatyczną. Działanie przeciwutleniaczy, zarówno
tych naturalnie występujących w żywności, jak i celowo dodawanych,
może być związane z bezpośrednim przerywaniem łańcuchowych reakcji
rodnikowych lub działaniem pośrednim poprzez wiązanie tlenu oraz
substancji katalizujących procesy utleniania.

Stosowanie przeciwutleniaczy jako dodatków do żywności reguluje

Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 23 kwietnia 2004 roku w spra-
wie dozwolonych substancji dodatkowych i substancji pomagających
w przetwarzaniu (Dz.U. nr 94, poz. 933) z późniejszymi zmianami
(Dz.U. 2005, nr 79, poz. 693). W tabeli 1 (s. 31) zestawiono przeciw-
utleniacze stosowane jako dodatki do żywności, ich symbole według
systemu oznaczeń UE, wartości akceptowanego dziennego pobrania
oraz maksymalne dopuszczalne dawki.

Charakterystyka
wybranych przeciwutleniaczy

Kwas askorbinowy (E 300) i jego sole (E 301 i E 302)

Kwas askorbinowy jest otrzymywany syntetycznie z sorbitolu na drodze
uwodornienia D(+)-glukozy. Jest łatwo rozpuszczalny w wodzie i podat-
ny na utlenianie podczas procesów technologicznych. W roztworach

dr inż. Lesław Juszczak

Katedra Analizy i Oceny Jakości Żywności, Akademia Rolnicza w Krakowie

Streszczenie
Przeciwutleniacze są to substancje przedłużające trwałość środ-
ków spożywczych poprzez zabezpieczenie ich przed rozkładem
spowodowanym utlenianiem. Konieczność ich stosowania wynika
z dużej podatności niektórych produktów żywnościowych na re-
akcje utleniania. W artykule przedstawiono wybrane właściwości
naturalnych i syntetycznych przeciwutleniaczy stosowanych jako
dodatki do żywności. Omówiono również wybrane metody anali-
tyczne stosowane przy ich oznaczaniu.

Summary
Antioxidants are the substances extending food stability by pro-
tecting them from disintegration caused by oxidation. Necessities
of using them result from the high susceptibility of some food
products to oxidation. The article presents some properties of
the natural and synthetic antioxidants used as food additives.
The selected analytical methods applied during their analysis
are also discussed.

Słowa kluczowe
dodatki do żywności, przeciwutleniacze, metody analityczne

Key words
food additives, antioxidants, methods of analysis

Przeciwutleniacze

jako dodatki do żywności oraz metody ich oznaczania

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

/2007

wodnych łatwo ulega utlenieniu do kwasu dehydroaskorbinowego,
szczególnie w obecności jonów żelaza i miedzi, a także pod wpływem
światła i enzymów. Pełni rolę przeciwutleniacza, regulatora kwasowości
oraz stabilizatora. Utleniając się, usuwa tlen rozpuszczony i wolny
ze środowiska oraz może redukować niektóre utlenione związki (np.
chinony do fenoli). Wykazuje ochronne działanie w krótkich okre-
sach, natomiast w podwyższonej temperaturze może niekorzystnie
wpływać na inne składniki żywności. Jako substancja silnie redukująca
utrwala naturalną barwę wielu surowców i produktów. Sprzyja także
zachowaniu stabilnej barwy mięsa. Chroni produkty żywnościowe,
a szczególnie rozdrobnione owoce i warzywa oraz napoje i soki, przed
oksydatywnym zbrunatnieniem. Zwiększa trwałość i zapobiega jełcze-
niu tłuszczów i substancji smakowych w produktach nietłuszczowych
(mąka, przetwory zbożowe, proszek mleczny, napoje, soki, mrożonki
i konserwy). Pozwala na ograniczenie dodatku azotanów(III) poprzez
znaczne przyspieszenie procesu peklowania mięsa. Jest również stosowa-
ny w piekarstwie jako polepszacz pieczywa. Znajduje także zastosowanie
jako czynnik ograniczający korozję opakowań metalowych. W orga-
nizmie człowieka pełni szereg ważnych funkcji biologicznych, stąd
jego dodatek wzbogaca żywność, produkty dietetyczne i odżywki dla
dzieci. Sole sodu i wapnia kwasu askorbinowego dzięki wolniejszemu
reagowaniu z azotanami(III) są stosowane w mieszankach peklujących.
Działają również jako inhibitory tworzenia się nitrozoamin w peklo-
wanym mięsie i jego przetworach.

Estry kwasów tłuszczowych i kwasu askorbinowego (E 304)

Do najważniejszych estrów kwasów tłuszczowych i kwasu askorbino-
wego należą palmitynian askorbylu (E 304(i)) oraz stearynian askor-
bylu (E 304(ii)). Stosowane są jako przeciwutleniacze i stabilizatory.
Wykazują silny synergizm z innymi przeciwutleniaczami, szczególnie
z tokoferolami. W przeciwieństwie do kwasu askorbinowego dobrze
rozpuszczają się w tłuszczach, co pozwala na ich stosowanie w pro-
duktach tłuszczowych nie poddawanych obróbce termicznej. Wykazują
również działanie emulgujące, a także zdolność kompleksowania ślado-
wych ilości metali. Stosowane są w produkcji suszu ziemniaczanego,
nadzień zawierających tłuszcz, przetworów mięsnych i drobiowych,
proszku mlecznego oraz odżywek dla dzieci.

Kwas izoaskorbinowy (E 315) i izoaskorbinian sodu (E 316)

Utleniają się szybciej niż kwas askorbinowy. Stosuje się je w celu ogra-
niczenia zmian barwy przetworów owocowych oraz mięsa. Znacznie
przyspieszają proces peklowania mięsa, ograniczając również dodatek
azotanów(III).

Tokoferole

Tokoferole otrzymywane są z kondensatów olejów pochodzących z za-
rodków nasion soi, kukurydzy, ryżu i bawełny lub syntetycznie. Dobrze
rozpuszczają się w tłuszczach i rozpuszczalnikach organicznych. Są
odporne na działanie zasad i kwasów, a także światła. Łatwo ulegają
utlenianiu. Funkcję fizjologiczną jako witamina E pełni głównie α-toko-
ferol. Ze względu na mniejszą efektywność oraz wyższą cenę tokoferole
naturalne mają ograniczone zastosowanie w praktyce przemysłowej.
Duże znacznie i zastosowanie jako czynniki przeciwutleniające mają
syntetycznie otrzymane γ- i δ-tokoferol.

Mieszanina tokoferoli (E 306)

Otrzymywana jest z surowców naturalnych na drodze destylacji próż-
niowej. Jest łatwo rozpuszczalna w olejach i tłuszczach oraz w etanolu.
Wykazuje działanie ochronne w stosunku do wielonienasyconych

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

/2007

kwasów tłuszczowych. Chroni również przed utlenianiem witaminę A.
Stosowana jest w odżywkach dla dzieci i preparatach dietetycznych,
a także w przemyśle farmaceutycznym. Tokoferole budzą najmniej
zastrzeżeń zdrowotnych spośród wszystkich przeciwutleniaczy stoso-
wanych jako dodatki do żywności.

α-tokoferol (E 307)

Jest otrzymywany syntetycznie przez kondensację 2,3,5-trimetylo-hy-
drochinonu z fitolem, izofitolem lub halogenkami fitalu. Używany jest
jako przeciwutleniacz oraz składnik odżywczy. Do witaminizowania
żywności stosowany jest w postaci bursztynianów i octanów. Chroni
wielonienasycone kwasy tłuszczowe oraz witaminę A.

γ-tokoferol (E 308) i δ-tokoferol (E 309)

Otrzymywane są syntetycznie jako produkty identyczne z naturalnymi.
Stosowane są jako przeciwutleniacze w produkcji olejów roślinnych,
tłuszczów jadalnych (piekarniczych i kuchennych), koncentratów zup
i sosów, przetworów ziemniaczanych, mas cukierniczych, gum do
żucia, aromatów owocowych oraz granulowanej herbaty. δ-tokoferol
wykazuje największą aktywność przeciwutleniającą spośród wszystkich
tokoferoli.

Galusan propylu (E 310), galusan oktylu (E 311),
galusan dodecylu (E 312)

Galusan propylu jest estrem n-propylowym kwasu 3,4,5-trihydrok-
sybenzoesowego, otrzymanym na drodze estryfikacji kwasu galu-
sowego alkoholem propylowym. Trudno rozpuszcza się w olejach
i tłuszczach, a znacznie lepiej w wodzie i etanolu, co znacznie
ogranicza jego zastosowanie w produktach tłuszczowych. Wykazuje
również ograniczoną stabilność termiczną, szczególnie w środowisku
alkalicznym. Najczęściej jest stosowany z BHT i BHA, z którymi
działa synergicznie. Galusan oktylu wykazuje również ograniczoną
rozpuszczalność w olejach, natomiast dobrze rozpuszcza się w etanolu.
Najlepiej rozpuszczalny w olejach, a najmniej – w wodzie jest galusan
dodecylu, ale jego efektywność przeciwutleniająca jest najmniejsza.
Galusany wykorzystywane są w produkcji olejów, tłuszczów jadalnych,
żywności typu „fast food”, gumy do żucia, płatków śniadaniowych
i innych przetworów zbożowych, past serowych, puree ziemniaczane-
go, pasztetów oraz przetworów mięsnych. W organizmie człowieka
galusany ulegają hydrolizie i są wydalane jako wolny kwas galusowy,
a także w połączeniach z kwasem glikuronowym. Wszystkie galusany
wykazują działanie alergizujące i mogą powodować stany zapalne skóry
i błon śluzowych. Mogą również niekorzystnie wpływać na metabolizm
żelaza w organizmie.

Butylohydroksyanizol (BHA) (E 320)

Stanowi mieszaninę 90-95% 3-tetr-4-hydroksyanizolu i około 5%
2-tetr-butylo-4-hydroksyanizolu. Dobrze rozpuszcza się w olejach
i tłuszczach i jest nierozpuszczalny w wodzie. Jest bardzo efektyw-
nym przeciwutleniaczem w tłuszczach pochodzenia zwierzęcego,
a nieco mniej w olejach roślinnych. Ogranicza jełczenie tłuszczów
oraz chroni przed utlenianiem witaminy rozpuszczalne w tłuszczach,
krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe, aromaty i barwniki. Wykazuje
efekt „carry through”, tj. przeniesienia podczas obróbki termicznej
działania przeciwutleniacza znajdującego się w oleju do produktu
końcowego (np. frytek, chipsów). Wykazuje działanie synergiczne
z BHT i galusanami. Stosowany jest również do impregnowania
materiałów opakowaniowych. Działa także hamująco na rozwój nie-
których pleśni i bakterii. Stosuje się go w produkcji olejów i tłuszczów

jadalnych, tłuszczu mlecznego, aromatów i olejków eterycznych,
płatków śniadaniowych oraz innych przetworów zbożowych, prze-
tworów z ziemniaków, pieczywa cukierniczego, ciast, marcepanu,
koncentratów zup i bulionów oraz gumy do żucia. Nie jest zalecany
w produktach i odżywkach dla dzieci.

Butylohydroksytoluen (BHT) (E 321)

Wykazuje podobne właściwości jak BHA, jednak jest mniej odporny
na podwyższoną temperaturę. Zazwyczaj jest stosowany łącznie z BHA
i galusanem propylu. Wykazuje również działanie bakteriostatyczne.
Nie jest zalecany w produktach i odżywkach dla dzieci. Butylohy-
droksytoluen, podobnie jak BHA, jest dobrze wchłaniany z przewodu
pokarmowego i odkłada się w tkance tłuszczowej. Jego duże dawki
mogą mieć działanie uczulające i teratogenne. Zaburzają również
metabolizm witaminy K.

Obok typowych przeciwutleniaczy istotną rolę w hamowaniu

procesów utleniania składników żywności odgrywa grupa dodatków
zwanych synergentami. Wspomagają one i przedłużają działanie prze-
ciwutleniaczy. Mechanizm ich działania polega na aktywowaniu funkcji
przeciwutleniacza oraz kompleksowaniu śladów metali ciężkich, które
w sposób istotny katalizują procesy utleniania. Do najważniejszych
synergentów zalicza się: wersenian wapniowo-sodowy (EDTA) (E 385),
kwasy: cytrynowy (E 330), winowy (E 334) i jabłkowy (E 296), lecytynę
(E 322), difosforany(V), niektóre aminokwasy i peptydy.

Sól wapniowo-disodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego
(EDTA)

(ADI = 0-2,5 mg/kg mc.) jest bardzo silnym sekwestrantem.

Ma zdolność wiązania jonów metali wielowartościowych, zwiększając
w ten sposób trwałość produktów. Zapobiega zmianom barwy wy-
wołanym obecnością jonów żelaza, miedzi, manganu i cynku. Działa
synergicznie z przeciwutleniaczami i konserwantami. Ponadto wykazuje
działanie bakteriostatyczne. Stosowana jest dla utrzymania właściwej
barwy konserw warzywnych i kompotów, bierze również udział w za-
chowaniu klarowności win i napojów. Znajduje także zastosowanie
w przemyśle koncentratów spożywczych, sosów, dresingów, majonezów
i sałatek warzywnych.

Lista syntetycznych przeciwutleniaczy jest oczywiście znacznie

większa. Niektóre z nich są dopuszczone do stosowania w paszach
i karmach dla zwierząt, przemyśle kosmetycznym oraz w przemyśle
spożywczym w krajach spoza Unii Europejskiej [np. ethoxyquin
(EQ), kwas nordihydrogwajaretowy (NDGA), tetr-butylohydrochinon
(TBHQ)].

Tetr-butylohydrochinon (INS 319), stosowany np. w USA, jest łatwo

rozpuszczalny w tłuszczach i olejach. Tymczasowa wartość akceptowa-
nego dziennego pobrania (ADI) dla TBHQ wynosi 0-0,7 mg/kg masy
ciała. Jest jednym z najbardziej efektywnych przeciwutleniaczy, szcze-
gólnie w odniesieniu do wielonienasyconych kwasów tłuszczowych.
Wykazuje efekt „carry through”. Nie tworzy barwnych kompleksów
z jonami miedzi lub żelaza. Odznacza się również właściwościami bakte-
riostatycznymi w stosunku do niektórych drobnoustrojów. Stosowany
jest w produkcji olejów i tłuszczów jadalnych, pasztetów i wyrobów
garmażeryjnych, żywności typu „fast food”, płatków śniadaniowych
oraz przetworów ziemniaczanych.

Ponieważ zarówno kwas askorbinowy, jak i jego pochodne oraz

tokoferole nie są limitowanymi (z wyjątkiem środków spożywczych
przeznaczonych dla dzieci i niemowląt) dodatkami do żywności i nie
budzą większych obaw toksykologów, a procedury ich oznaczania są
takie same jak dla witamin, w pracy dokonano przeglądu jedynie metod
stosowanych w analizie typowych przeciwutleniaczy syntetycznych.

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

/2007

Rys. 4. Struktura
chemiczna butylo-
hydroksyanizolu

Metody analityczne stosowane
w analizie galusanów, BHA i BHT

Większość procedur analitycznych opisujących ilościowe oznacze-
nie syntetycznych przeciwutleniaczy w żywności poprzedzona jest
opisem separacji oznaczanych substancji z matrycy. Stosuje się tutaj
destylację z parą wodną, destylację próżniową oraz ekstrakcję, często
z późniejszym oczyszczaniem uzyskanego ekstraktu na drodze roz-
działu ciecz/ciecz lub na kolumnach wypełnionych odpowiednim
złożem. Jako czynniki ekstrahujące stosuje się acetonitryl, heksan,
chloroform, etanol, metanol, propanol, eter naftowy, dimetylo-
sulfotlenek oraz ich mieszaniny. W przypadku próbek o dużej
zawartości tłuszczu można zastosować ekstrakcję przeciwutleniaczy
wraz z tłuszczem w aparacie Soxhleta za pomocą eteru naftowego
lub innego rozpuszczalnika, a następnie ekstrakcję przeciwutleniaczy
z wyekstrahowanego tłuszczu surowego. Opisane są również proce-
dury podwójnej ekstrakcji – w pierwszej ekstrahowane są galusany
przy użyciu np. octanu amonu, natomiast w drugiej – z roztworem
etanolu lub metanolu – BHA i BHT. Najprostszym testem jakościo-
wym służącym do wykrywania dodatku syntetycznych przeciwutle-
niaczy jest metoda AOAC (965.28). Polega ona na rozpuszczeniu
próbki tłuszczu w eterze naftowym, ekstrakcji, odparowaniu eteru,
rozpuszczeniu pozostałości w alkoholu i dodatku wodorotlenku
amonu. Występowanie różowego zabarwienia świadczy o obecności
galusanu propylu. W tej samej procedurze BHA wykrywany jest
w reakcji z odczynnikiem Ehrlicha [roztwór azotanu(III) sodu
z kwasem sulfanilowym], dając czerwonopurpurowe zabarwienie.
Natomiast w przypadku BHT eterowy roztwór tłuszczu oczyszcza
się za pomocą kolumny wypełnionej Florosilem oraz dodaje diani-
zydynę, roztwór azotanu(III) sodu i chloroform. Jeżeli po wymie-
szaniu i rozdzieleniu faza chloroformowa jest zabarwiona na kolor
różowy lub czerwony, w próbce obecny jest BHT. Do oznaczania
syntetycznych przeciwutleniaczy opracowanych jest również kilka
metod kompleksometrycznych. W jednej z nich próbkę rozpuszcza
się w eterze naftowym, galusan propylu ekstrahuje wodą i następnie
wytrąca z Mg(II), uzyskany osad rozpuszcza się i dodaje EDTA,
którego nadmiar oznacza się z Zn(II).

W metodach spektrofotometrycznych wykorzystuje się absorpcję

roztworów syntetycznych przeciwutleniaczy w zakresie ultrafioletu.
Etanolowe roztwory galusanów wykazują maksimum absorpcji przy
λ = 275 nm, BHA – przy λ = 290 nm, a BHT – przy λ = 278 nm.
Metody te mają zastosowanie dla próbek, w przypadku których łatwo
określić wpływ absorpcji matrycy. W wielu przypadkach konieczne
jest zastosowanie wielokrotnych ekstrakcji z wykorzystaniem różnych
rozpuszczalników lub ich mieszanin oraz dodatkowym oczyszczaniem
ekstraktów. W literaturze opisanych jest również wiele metod spek-
trofotometrycznych opartych na pomiarach absorbancji w zakresie
widzialnym przez barwne kompleksy z odpowiednimi reagentami,
tworzone najczęściej w reakcjach wykorzystujących właściwości
redukujące przeciwutleniaczy. Przykładami takich metod są reakcja
redukcji jonów żelaza(III) i formowanie barwnych kompleksów
w obecności jonów żelaza(II). W oznaczaniu galusanów można
również wykorzystać reakcję z winianem żelaza(II) (AOAC 952.09)
lub siarczanem(VI) żelaza(II), a następnie ekstrakcję alkoholem izo-
amylowym i pomiar absorbancji przy λ = 530-580 nm. W przypadku
BHA stosuje się reakcję z odczynnikiem Gibba, w której powstaje
niebieska pochodna indofenolu, lub z odczynnikiem Ehrlicha, pod-
czas której tworzy się czerwonopurporowy barwnik azowy. Reakcją
specyficzną dla BHT jest wykorzystanie dianizydyny w obecności
kwasu azotowego(III), wskutek czego powstaje barwny chromogen,

Numer wg

systemu

oznaczeń UE

Nazwa

ADI

[mg/kg masy

ciała]

Maksymalna

dawka

[mg/kg]

E 300

Kwas askorbinowy

nie określone

–

E 301

Askorbinian sodu

nie określone

–

1, 2

E 302

Askorbinian wapnia

nie określone

–

1, 2

E 304

Estry kwasów tłuszczowych

i kwasu askorbinowego

0-1,25

–

1, 3, 6

E 306

Mieszanina tokoferoli

0-2,0

–

1, 4

E 307

α-tokoferol

0,15-2,0

–

1, 4, 6

E 308

γ-tokoferol

0,15-2,0 –

1, 4, 6

E 309

δ-tokoferol

0,15-2,0

–

1, 4, 6

E 310

Galusan propylu

0-1,4

200-1000

E 311

Galusan oktylu

0-0,1

200

E 312

Galusan dodecylu

nie określone

200

E 320

Butylohydroksyanizol (BHA)

0-0,5

100

E 320

Butylohydroksytoluen (BHT)

0-0,3

25-400

E 315

Kwas izoaskorbinowy

nie określone

500-1500

E 316

Izoaskorbinian sodu

nie określone

500-1500

Tabela 1. Przeciwutleniacze stosowane w przetwórstwie żywności
1 – nie limituje się, 2 – limitowany w odżywkach dla niemowląt i dzieci (0,3 g/kg),
3 – limitowany w odżywkach dla niemowląt i dzieci (0,1 g/kg), 4 – limitowany
w odżywkach dla niemowląt i dzieci (10 mg/l), 5 – limitowany w oliwie z oliwek
(200 mg/l), 6 – limitowany w przetworach zbożowych dla dzieci (0,1 g/kg)

Rys. 1. Struktura chemiczna kwasu L-askorbinowego i dehydroaskorbinowego

Rys. 2. Struktura chemiczna tokoferoli

Rys. 3. Struktura chemiczna galusanów

Rys. 6. Struktura
chemiczna tetr-
butylohydrochinonu

Rys. 5. Struktura
chemiczna butylo-
hydroksytoluenu

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

/2007

który ekstrahuje się chloroformem. Jeszcze innym przykładem ozna-
czania zawartości BHT jest reakcja z p-nitroaniliną.

Metody chromatograficzne są najbardziej rozwiniętymi i najlepiej

opracowanymi technikami analizy substancji przeciwutleniających.
Podstawowymi metodami w tym zakresie są chromatografia bibułowa
i cienkowarstwowa. Ich ogromną zaletą są niskie koszty wyposażenia
oraz prostota analiz. Chromatografia cienkowarstwowa jest znacznie
szybsza niż bibułowa, jednak charakteryzuje się gorszą powtarzalnością.
Ze względu na różną polarność syntetycznych przeciwutleniaczy często
stosuje się również chromatografię bibułową w odwróconym układzie
faz. Rozpuszczalnikami najczęściej stosowanymi do rozdziału przeciw-
utleniaczy metodą chromatografii bibułowej są: roztwory metanolu,
etanolu, dioksanu, octanu etylu i metylu, aceton, tetrachlorek węgla
oraz ich mieszaniny. Natomiast reagentami wywołującymi chromato-
gramy mogą być np. kwas molibdenofosforowy lub azotan(VI) sodu
w obecności amoniaku. W chromatografii cienkowarstwowej jako fazy
stacjonarne są stosowane modyfikowane żele krzemionkowe (czasem
z dodatkiem fluorescencyjnego indykatora), acetylowana celuloza,
tlenek glinu lub poliamidy. Poza rozpuszczalnikami stosowanymi
w chromatografii bibułowej można tu wykorzystać również: benzen,
ksylen, chloroform, propanol, glikol polietylenowy oraz ich mieszaniny.
Jako substancji wywołujących używa się: kwasu fosforomolibdenowego,
kwasu sulfanilowego, azotanu(V) srebra, dianizydyny, siarczanu(VI) że-
laza(III), odczynnika Folin-Ciocalteau, chlorku żelaza(III) w dipirydolu
oraz odczynnika Gibba.

Chromatografia gazowa z wielu względów jest bardzo wartościo-

wym narzędziem w analizie przeciwutleniaczy. Metoda ta charaktery-
zuje się dużą selektywnością, czułością i małą czasochłonnością. Takie
przeciwutleniacze jak BHA i BHT mogą być oznaczane bezpośrednio,
natomiast w przypadku bardziej polarnych galusanów przed rozdziałem
przeprowadza się je w lotne pochodne. Stosuje się zarówno kolumny
nisko polarne, jak i polarne, termostatowane w szerokim zakresie
temperatur. Jako fazy ruchome znajdują zastosowanie azot, argon i hel.
Najczęściej stosowanymi detektorami w analizie przeciwutleniaczy są:
detektor płomieniowo-jonizacyjny, cieplno-przewodnościowy oraz
wychwytu elektronów. Opisane są również procedury z zastosowaniem
technik sprzężonych GC-IR i GC-MS. Przykładem metody oznacza-
nia BHT, BHA i EQ w paszach z wykorzystaniem chromatografii
gazowej jest procedura podana w normie PN-R-64786. Przewiduje
ona ekstrakcję przeciwutleniaczy, w zależności od rodzaju próbki, za
pomocą metanolu, n-heksanu lub aceonitrylu, a następnie rozdział
chromatograficzny w kolumnie szklanej (210°C, gaz nośny – azot)
i detekcję z wykorzystaniem detektora płomieniowo-jonizacyjnego
(250°C). Podobne warunki oznaczania BHT i BHA w zbożowych
płatkach śniadaniowych z ekstrakcją za pomocą disiarczku węgla podaje
norma AOAC 968.17. W przypadku bardziej polarnych i mniej lotnych
galusanów przeprowadza się je przed rozdziałem w lotne pochodne,
na drodze metylacji, acetylacji lub trimetylo-sililacji. Istnieją również
procedury opisujące równoczesne oznaczanie BHA i BHT oraz galu-
sanów po przeprowadzeniu ich w lotne pochodne.

Chromatografia cieczowa, a w szczególności wysokosprawna

chromatografia cieczowa, znajduje szerokie zastosowanie w analizie
przeciwutleniaczy w żywności. Pozwala na szybki rozdział i analizę
ilościową nielotnych i termicznie labilnych związków. W literaturze
opisanych jest wiele procedur oznaczania pojedynczych, a częściej
mieszanin syntetycznych przeciwutleniaczy w żywności. Pozwala
ona także na rozdział izomerów BHA. Sam proces rozdzielania
oznaczanych przeciwutleniaczy może odbywać się w normalnym lub
odwróconym układzie faz, a także z zastosowaniem chromatografii

par jonowych, jonowymiennej lub micelarnej. Zastosowanie znajduje
szeroka gama faz stacjonarnych oraz eluentów, zarówno w elucji
izokratycznej, jak i gradientowej. Najczęściej stosuje się kolumny
typu: BondaPak C18, z wypełnieniem Corasil II, LiChrosorb RP18,
NovaPak C18, Spherisorb i Ultrasphere ODS, LiChrosrb NH

i inne. Fazami ruchomymi, często w elucji gradientowej, mogą być:
cykloheksan, tetrahydrofuran, n-heptan, dichlorometan, metanol,
acetonitryl, dioksan, octan amonu, propanol oraz różne bufory
i ich mieszaniny. Podstawową detekcją jest detekcja w ultrafiolecie
w zakresie od około 235 nm do 360 nm. Opisane są również pro-
cedury z zastosowaniem innych detektorów: fluorymetrycznego,
amperometrycznego, z matrycą diodową oraz elektrochemicznego.
Przykładem procedury z zastosowaniem HPLC jest metoda AOAC
983.15, opisująca oznaczanie przeciwutleniaczy w olejach i tłuszczach
jadalnych. Według niej przeciwutleniacze ekstrahuje się acetonitrylem,
a ekstrakt zagęszcza i rozpuszcza w propanolu. Rozdziału dokonuje
się w kolumnie typu C18 z żelem krzemionkowym, stosując elucję
gradientową (roztwór kwasu octowego i acetonitryl-metanol) oraz
detekcję przy λ = 280 nm.

Pozostałe metody. Wśród innych metod analitycznych stoso-

wanych w oznaczaniu syntetycznych przeciwutleniaczy w żywności
należy wymienić techniki woltametryczne z zastosowaniem elektrod
rtęciowych, węglowych i platynowych. Opracowano także metody
wykorzystujące analizę przepływowo-wstrzykową z detekcją elektro-
chemiczną lub z biosensorem enzymatycznym, które ze względu na
możliwości zanalizowania wielu próbek w krótkim czasie mogą być
wykorzystywane w rutynowych analizach. Opisane są również metody
fluorymetryczne oznaczania przeciwutleniaczy z wykorzystaniem np.
reakcji galusanu propylu z terbem(III) w obecności siarczanu dode-
cylu. Opracowano również metodę chemiluminescencyjną opartą
na unieruchomionym na membranie celulozowej układzie luminal/
/hematyna. Ponadto do oznaczania syntetycznych przeciwutleniaczy
zaproponowano takie metody instrumentalne, jak: spektroskopia
w podczerwieni, micelarna elektrokinetyczna chromatografia kapi-
larna oraz strefowa elektroforeza kapilarna.

Piśmiennictwo
1. AOAC Official Methods of Analysis. 1995.
2. Gertig H.: Żywność a zdrowie. Wydawnictwo Lekarskie PZWL,

Warszawa 1996.

3. Karovičcová J., Šimko P.: Determination of synthetic phenolic antioxi-

dants in food by high-performance liquid chromatography. “Journal of
Chromatography A”, 2000, 882, 271-281.

4. Nollet L.M.L. (ed.): Food analysis by HPLC. Second edition. Marcel

Dekker, Inc., New York, Basel 2000.

5. Nollet L.M.L. (ed.): Handbook of food analysis. Second edition. Vol. 2.

Residues and other food component analysis. Marcel Dekker, Inc., New
York, Basel 2004.

6. PN-R-64786-1997 Pasze. Oznaczanie BHT, BHA, EQ.
7. Pokorny J., Yanishlieva N., Gordon M. (eds.): Antioxidants in food.

Practical applications. CRC Press, Woodhead Publishing Limited,
Cambridge, England 2001.

8. Rutkowski A., Gwiazda S., Dąbrowski K.: Kompendium dodatków do

żywności. Hortimex, Konin 2003.

9. Sikorski Z.E. (red.): Chemia żywności – skład, przemiany i właściwości

żywności. WNT, Warszawa 2000.

10. Wood R., Foster L., Damant A., Key P.: Analytical methods for food

additives. CRC Press, Woodhead Publishing Limited, Cambridge,
England 2000.

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

/2007

laboratorium przemysłowe | temat numeru ŻYWNOŚĆ I FARMACJA

Laboratorium |

/2008

Suplementacja biojogurtów

surowcami roślinnymi

bogatymi w antyoksydanty

– korzyści i zagrożenia

Streszczenie
Moda na żywność funkcjonalną spowodowała znaczący wzrost
zainteresowania surowcami, które dodane do żywności powodują
zwiększenie jej wartości prozdrowotnych. Producenci żywności
powinni jednak być bardzo ostrożni w suplementacji żywności
probiotycznej surowcami roślinnymi bogatymi w przeciwutleniacze.
Z jednej strony niektóre z wprowadzonych antyoksydantów mogą
spowodować zmniejszenie liczby dobroczynnych bakterii w końco-
wym produkcie, co zmniejszy jego wartość, z drugiej strony, w wyniku
działania drobnoustrojów, przeciwutleniacze mogą ulec transforma-
cji w związki nieaktywne biologicznie. W obu przypadkach produkt
końcowy będzie pozbawiony swoich prozdrowotnych właściwości
i przestanie spełniać kryteria żywności funkcjonalnej.

Summary
The growing popularity of functional food has caused an increasing
interest in raw materials, which can raise the pro-health value of
food when supplemented. Food producers should be careful when
adding plant raw material abounding in antioxidants into probiotic
food. On the one hand, some of the introduced antioxidants can
cause the decrease of the amount of beneficial bacteria. On the
other hand, antioxidants can be transformed by microorganisms
into biologically inactive compounds. In both cases, the final pro-
duct will be devoid of its pro-health values and will not fulfil the
requirements for functional food.

Słowa kluczowe
probiotyki, przeciwutleniacze, Lactobacillus casei, żywność funk-
cjonalna

Key words
probiotics, antioxidants, Lactobacillus casei, functional food

Integralną częścią każdego rynku żywności jest konsument. Jego
potrzeby i preferencje są ważnymi wskaźnikami dla producentów
żywności, w znacznym stopniu decydującymi o sukcesie danego
produktu na rynku. Aby utrzymać zainteresowanie kupujących,
wytwórcy wprowadzają nowe technologie i produkty charaktery-
zujące się konkretnymi cechami funkcjonalnymi.

Współczesny konsument, mający rozległą wiedzę, dobre ro-

zeznanie rynkowe, łatwy dostęp do źródeł masowego przekazu,
możliwości podróżowania po całym świecie, a zatem dokonywania
obserwacji i porównań, staje się coraz bardziej wymagający. Na-
byta przez niego żywność powinna charakteryzować się wysoką
wartością odżywczą, odpowiednimi walorami sensorycznymi, wy-
godą w użyciu i przechowywaniu. Przede wszystkim zaś powinna
być bezpieczna dla zdrowia. Moda na zdrowy styl życia i dbałość
o zdrowie przyczyniają się do zwiększenia popytu na produkty
o specjalnie zaprojektowanym składzie. Żywność zmodyfikowa-
na w taki sposób, by przynosiła konkretne korzyści zdrowotne,
nazywana jest żywnością funkcjonalną lub projektowaną. Obecne
w niej składniki bioaktywne pomagają utrzymać organizm w do-
brej kondycji psychicznej i fizycznej, zwiększają jego odporność
i ograniczają ryzyko wystąpienia wielu schorzeń.

Probiotyki

W dzisiejszych czasach najważniejsze i najczęściej używane w żywno-
ści funkcjonalnej składniki to: probiotyki, prebiotyki, przeciwutle-

niacze oraz witaminy. Szczególny wzrost zainteresowania, zarówno
naukowców, jak i lekarzy, budzą ostatnio probiotyki.

Jednym z najchętniej spożywanych rodzajów żywności probio-

tycznej są tzw. biojogurty, czyli jogurty, które w swym składzie,
oprócz typowych dla tego produktu szczepów Lactobacillus delbru-
eckii ssp. bulgaricus i Streptococcus thermophilus, zawierają także żywe
kultury bakterii probiotycznych. Najczęściej stosowanymi w prze-
myśle probiotykami są szczepy bakterii kwasu mlekowego z rodza-
jów Lactobacillus i Bifidobacterium (przykłady podano w ramce 1,
str. 22). Do probiotyków zaliczane są także inne drobnoustroje,
m.in.: Enterococcus faecium, Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus
oraz drożdże Saccharomyces boulardii (1).

Wykazano, że spożywanie żywych lub liofilizowanych bakterii

probiotycznych zwiększa przyswajalność białek i związków mineral-
nych, reguluje przemianę materii ze szczególnym uwzględnieniem
pasażu treści pokarmowej, zapobiega i łagodzi objawy zaparć oraz
biegunek u dzieci i dorosłych, stymuluje system immunologiczny
oraz normalizuje równowagę mikroflory jelitowej. Bakterie pro-
biotyczne wykazują również właściwości przeciwnowotworowe,
hamują objawy arteriosklerozy, a także wspomagają profilaktykę
miażdżycy i choroby wieńcowej serca (2, 3). Właśnie ze względu na
wyżej wymienione właściwości prozdrowotne biojogurty cieszą się
dużą popularnością wśród konsumentów. Z kolei znaczna konku-
rencja na rynku wymusiła na producentach urozmaicenie dostęp-
nego w sklepach asortymentu i wprowadzenie nowych produktów.

dr Aleksandra Duda-Chodak
dr Tomasz Tarko

Katedra Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

laboratorium przemysłowe | temat numeru ŻYWNOŚĆ I FARMACJA

Laboratorium |

/2008

Zwykle nowatorstwo dotyczy niespotykanej kompozycji smakowej,
uzyskiwanej poprzez dodatek rozmaitych owoców, np. egzotycz-
nych. Coraz częściej producenci starają się podnieść atrakcyjność
swojego wyrobu poprzez dodatek innych, pozytywnie działających
na zdrowie składników, jak witaminy lub przeciwutleniacze.

Materiał roślinny stanowi cenny surowiec w produkcji biojo-

gurtów, gdyż oprócz walorów smakowo-zapachowych dostarcza
znacznych ilości witamin i antyoksydantów. Biojogurty suplemen-
towane takimi surowcami, oprócz wysokiej wartości prozdrowotnej
związanej z aktywnością bakterii probiotycznych, będą stanowiły
źródło ważnych składników bioaktywnych.

Wpływ antyoksydantów
na mikroorganizmy

Przeciwutleniacze neutralizujące wolne rodniki i inne reaktywne
cząstki, a także spowalniające lub hamujące reakcje wolnorodniko-
we, działają ochronnie w sytuacjach stresu oksydacyjnego. Dlatego
też uważa się je za elementy diety, które spowalniają procesy sta-
rzenia i zapobiegają rozwojowi wielu chorób, m.in. serca i naczyń
krwionośnych, Parkinsona, Alzheimera, nowotworów, katarakty
i wielu innych (5). Coraz liczniejsze publikacje dowodzą także,
że substancje o właściwościach przeciwutleniających wykazują
działanie przeciwbakteryjne (6), przeciwgrzybicze (7) i przeciw-
wirusowe (8, 9).

Doniesienia literaturowe ostatnich lat coraz częściej potwierdzają

hamujący wpływ antyoksydantów na różne gatunki bakterii. Wyraźnie
widać w nich korzystne efekty dla organizmu ludzkiego, spowodo-
wane ograniczeniem wzrostu drobnoustrojów chorobotwórczych
lub powodujących psucie się żywności. Wykazano na przykład,
że olej z oliwek pierwszego tłoczenia, który obfituje w związki
polifenolowe, działa bakteriobójczo w stosunku do szerokiego
spektrum bakterii, zarówno patogennych gatunków mikroflory
jelitowej (Clostridium perfringens, Escherichia coli), jak i organizmów
pożądanych (Lactobacillus acidophilus czy Bifidobacterium bifidum).
Również większość przebadanych patogenów żywności (Listeria
monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica, Yersinia sp.,
Shigella sonnei) nie przeżywało w doświadczeniach in vitro godzin-
nego kontaktu z oliwą z oliwek (10). Przeciwutleniacze oliwy w wa-
runkach in vitro działały też silnie bakteriobójczo w stosunku do
ośmiu badanych szczepów H. pylori, z których trzy były odporne
na różne antybiotyki (11). Oliwa z oliwek wydaje się więc intere-
sującą alternatywą w leczeniu i profilaktyce choroby wrzodowej
i nowotworów żołądka, a ponadto może być wykorzystywana jako
składnik zabezpieczający żywność przed rozwijającymi się w niej
drobnoustrojami patogennymi.

Bogatym źródłem antyoksydantów, głównie katechin i epiga-

lokatechin, związków o silnym działaniu bakteriobójczym, jest
herbata. Wykazano, że wodne ekstrakty z herbat zielonej, czarnej
i jaśminowej (10% w/v) hamowały wzrost w hodowli in vitro ta-
kich patogenów żywności, jak Listeria monocytogenes i Staphylococcus
aureus, nie działały natomiast na Escherichia coli O157:H7 i Salmo-
nella enterica serotyp Enteritidis (12). Galusan epigalokatechiny
(EGCG) działa bakteriobójczo na szczepy S. aureus odpornych na
metycylinę, co więcej – niweluje ich odporność na antybiotyki
β-laktamowe (13).

Mechanizm działania przeciwutleniaczy na bakterie polega

głównie na zakłócaniu ich metabolizmu, zaburzeniu integralności
ścian komórkowych, blokowaniu przepływu elektronów w łańcu-
chu transportu oraz hamowaniu namnażania bakterii. Z punktu

widzenia technologa żywności szczególnie istotne wydają się wła-
ściwości bójcze wobec drobnoustrojów mogących powodować
psucie się żywności oraz mikroorganizmów chorobotwórczych
przenoszonych przez żywność. Należy jednak podkreślić, że prze-
ciwutleniacze mogą oddziaływać także na prawidłową mikroflorę
naszego organizmu i na bakterie, które są niezbędne do wytworze-
nia niektórych produktów spożywczych. Istnieje zatem ryzyko, że
antyoksydanty wprowadzone do jogurtu wraz z wsadem owoco-
wym będą wchodziły w interakcje z bakteriami kwasu mlekowego,
w tym także ze szczewami probiotycznymi.

Wpływ bakterii na przeciwutleniacze

Analizując interakcje antyoksydantów z mikroorganizmami, nie
można pominąć innego bardzo ważnego aspektu. Nie tylko prze-
ciwutleniacze oddziałują na drobnoustroje. Bardzo powszechna
jest też relacja odwrotna – liczne badania naukowe dowodzą, że
bakterie, szczególnie jelitowe, uczestniczą w przemianach metabo-
licznych związków przeciwutleniających. Pod wpływem enzymów
bakteryjnych oraz trawiennych w przewodzie pokarmowym często
dochodzi do uwalniania różnych związków z matrycy żywności oraz
ich aktywacji. Powstające w wyniku tych reakcji pochodne mogą
charakteryzować się znacznie niższymi lub wyższymi właściwościa-
mi antyoksydacyjnymi niż substancje prekursorowe.

Kwas elagowy oraz jego pochodne (elagitaniny) to obecne

w truskawkach, malinach i granatach silne przeciwutleniacze.
Składniki te są jednak metabolizowane przez mikroflorę jelitową
do pochodnych, urotiliny A i B, o znacznie większej bioprzy-
swajalności niż związki wyjściowe, jednak charakteryzujących się

laboratorium przemysłowe | temat numeru ŻYWNOŚĆ I FARMACJA

Laboratorium |

/2008

słabszymi właściwościami antyoksydacyjnymi (14). Kwas chloroge-
nowy, będący estrem kwasów kawowego i chinowego, jest jednym
z najbardziej powszechnych polifenoli w diecie człowieka, gdyż
występuje w wielu owocach, warzywach oraz kawie. Jednak jego
biodostępność jest ściśle uzależniona od metabolizmu bakterii
przewodu pokarmowego, w szczególności bakterii zasiedlających
jelito grube. Do najważniejszych pochodnych powstających na
skutek aktywności tych mikroorganizmów należą kwasy: m-ku-
marowy, benzoesowy i hipuronowy, obecne w osoczu i moczu
osób spożywających dietę obfitującą w kwas chlorogenowy (15).
Również picie zielonej i czarnej herbaty powoduje zwiększone
wydzielanie kwasu hipuronowego do moczu (16). Główny zwią-
zek przeciwutleniający w herbatach, katechina, zarówno w postaci
monomerowej, jak i dimerowej (teaflawiny) czy polimerowej (tearu-
biginy), ulega przekształceniom w jelicie grubym i jest wchłaniany
właśnie w postaci pochodnych. Inny przeciwutleniacz, arbutyna
(glukopiranozyd hydrochinonu), jest związkiem obecnym w wielu
roślinach, szczególnie dużo zawiera jej borówka brusznica (5-7%).
W środowisku alkalicznym arbutyna ulega hydrolizie do hydro-
chinonu o silnym działaniu bakteriobójczym, głównie względem
bakterii chorobotwórczych występujących w drogach moczowych.
Wykazano również, że niektóre bakterie jelitowe (E. ramulus, Bac-
teroides distasonis, E. coli) mogą przekształcać arbutynę do hydro-
chinonu (17, 18).

Na podstawie licznych badań można stwierdzić, że transformacje

flawonoidów polegają najczęściej na hydrolizie ich glikozydów do
aglikonów oraz cięciu wiązania w pierścieniu C (19). Wykazano,
że flawonoidy niewchłonięte w jelicie cienkim są metabolizowane
przez bakterie w jelicie grubym. Beztlenowe bakterie z przewodu
pokarmowego człowieka są zdolne do hydrolizowania glikozydów
do aglikonów: Bacteroides distasonis hydrolizuje robininę do kemp-
ferolu, a Bacteroides uniformis i Bacteroides ovatus przekształcają ru-
tynę do kwercetyny.

Niektóre przeciwutleniacze mogą więc objawiać swoje prozdro-

wotne działanie dopiero po przekształceniu w aktywne pochodne
przez mikroorganizmy.

Znaczenie interakcji
bakteria – przeciwutleniacz

Znajomość interakcji między poszczególnymi drobnoustrojami
i antyoksydantami jest niezbędna do właściwego wykorzystywa-
nia tych związków. Wątpliwości pojawiają się szczególnie w sy-
tuacji suplementacji żywności zawierającej bakterie probiotyczne
surowcami roślinnymi bogatymi w przeciwutleniacze. Interakcje
te są bardzo słabo przebadane i poznane, jednak na podstawie
doświadczeń z innymi mikroorganizmami można się spodziewać,
że przeciwutleniacze mogą znacząco obniżać liczbę bakterii lub
nawet prowadzić do ich zabicia.

Wyniki wstępnych badań przeprowadzonych przez autorów

wskazują, że obawy te są poniekąd słuszne. W doświadczeniach
wykorzystano czyste związki (katechina, kwercetyna, kwas chlo-
rogenowy) oraz ekstrakty z surowców roślinnych o różnej aktyw-
ności antyoksydacyjnej (dzika róża, głóg, aronia, kawa). Dodatek
ekstraktów z owocu aronii, owocu dzikiej róży oraz kawy powo-
dował znaczny spadek liczby bakterii Lactobacillus casei w kultu-
rach. W hodowlach z dodatkiem ekstraktu z aronii obserwowany
spadek liczebności bakterii w porównaniu z kontrolą utrzymywał
się przez cały czas trwania eksperymentu na podobnym poziomie.
Może to świadczyć o tym, że aktywne antybakteryjne związki z aro-

• Lactobacillus acidophilus (NCFM, R0052, LA-1, LA-5, LB, NCFB 1748,

R0011, Lat 11/38)

•  Lactobacillus casei (DN-114001, Shirota)
•  Lactobacillus fermentum ( VRI003, RC-14, KLD)
•  Lactobacillus gasseri (TMC0356, SBT10239, SBT10241)
•  Lactobacillus johnsonii (LA-l, N312, LC1)
•  Lactobacillus lactis (HN019, L1A)
•  Lactobacillus paracasei (CRL 431, LP-33, F19)
•  Lactobacillus plantarum (299v, ACA-DC287)
•  Lactobacillus reuteri (RC-14, ATCC 55730,)
•  Lactobacillus rhamnosus (HN001, R0011, LB21, GG, VTT E -7800,

GR-1, 271, LB21)

•  Lactobacillus salivarius (UCC118, LM2-118, CECT5713)
•  Lactococcus lactis (LIA)
•  Bifidobacterium animalis (DN 173 010)
•  Bifidobacterium breve (Yakult)
•  Bifidobacterium infantis (35264)
•  Bifidobacterium lactis (Bb-12, HN019)
•  Bifidobacterium longum (BB536, DSM2009, CSCC1941)
•  Saccharomyces cerevisiae (boulardii)

Ramka 1. Przykładowe gatunki (szczepy) bakterii probiotycznych wykorzy-
stywanych w przemyśle (4)

Żywność zmodyfikowana w taki sposób, by przynosiła konkretne korzyści
zdrowotne, nazywana jest żywnością funkcjonalną lub projektowaną.
Obecne w niej składniki bioaktywne pomagają utrzymać organizm
w dobrej kondycji psychicznej i fizycznej, zwiększają odporność organizmu
i ograniczają ryzyko wystąpienia wielu schorzeń.

fot. Shutterstock

laboratorium przemysłowe | temat numeru ŻYWNOŚĆ I FARMACJA

Laboratorium |

/2008

nii nie ulegają samoistnej degradacji ani metabolizowaniu przez
bakterie i przez cały czas działają antybakteryjnie. W przypadku
suplementacji ekstraktem z głogu, choć charakteryzował się on
stosunkowo wysoką aktywnością antyoksydacyjną, nie wykazano
istotnych statystycznie różnic w ilości uzyskanej biomasy bakte-
ryjnej względem kontroli. Prawdopodobnie więc w jego skład nie
wchodzi żaden czynnik działający bakteriobójczo lub bakteriosta-
tycznie względem L. casei.

Ekstrakty roślinne są z definicji mieszaniną różnych związków,

nie tylko antyoksydacyjnych, i ich dodatek do produktów zawiera-
jących kultury probiotyczne może być przyczyną pogorszenia się
jakości tych wyrobów. W dzikiej róży, aronii i głogu obficie wy-
stępuje witamina C oraz różne alkaloidy i garbniki, które również
wywierają antybakteryjny efekt (20). Ziarna kawy palonej zawierają,
oprócz kofeiny, niezwykle silny – jak dotąd niezidentyfikowany
– składnik antybakteryjny (21).

Dlatego też przeprowadzono dodatkowe doświadczenia, w któ-

rych bakterie Lactobacillus casei hodowano w obecności różnych
stężeń pojedynczych związków o właściwościach przeciwutlenia-
jących: kwasu chlorogenowego, katechiny i kwercetyny. Z danych
literaturowych wynika, że związki te, ze względu na aktywność anty-
bakteryjną, mogą być skuteczne w zwalczaniu licznych patogenów
przewodu pokarmowego i chorób przenoszonych przez żywność
(12, 22), mogły zatem odpowiadać za zahamowanie wzrostu bak-
terii w doświadczeniach.

Stwierdzono, że dodatek katechiny w stężeniach 100-400 µM

do produktów probiotycznych zawierających L. casei sprzyja na-
mnażaniu się tych bakterii. Natomiast zastosowanie kwercetyny
– substancji o zbliżonej aktywności antyoksydacyjnej – wywołu-
je efekt odwrotny, tj. obniżenie liczebności pożądanych mikro-
organizmów w produkcie. Kwas chlorogenowy nie powodował
istotnych statystycznie różnic, z wyjątkiem najwyższego zasto-
sowanego stężenia (400 µM). Różnice w wynikach uzyskanych
dla tych trzech substancji są spowodowane nie tylko odmienną
aktywnością antyoksydacyjną, ale są wypadkową kilku mechani-
zmów i interakcji, dlatego należy je rozpatrywać wieloczynnikowo.
Znaczącą rolę odgrywa tu przede wszystkim odmienna struktura
chemiczna tych trzech związków, a co za tym idzie – inne inte-
rakcje z mikroorganizmami. Kwas chlorogenowy jest pochodną
kwasów fenolowych, natomiast kwercetyna i katechina to flawono-
idy zbudowane z trzech pierścieni. Bakterie z rodzaju Lactobacillus
charakteryzują się zdolnością do przekształcania w reakcjach bio-
chemicznych tylko niektórych z zastosowanych przeciwutleniaczy,
nie wpływając na pozostałe.

Podobne efekty mogą mieć miejsce również w przypadku innych

gatunków organizmów probiotycznych stosowanych w przemyśle
spożywczym. Dlatego też producenci żywności powinni być bardzo
ostrożni w suplementacji żywności probiotycznej, np. biojogurtów,
surowcami roślinnymi bogatymi w przeciwutleniacze. Z jednej stro-
ny niektóre z wprowadzonych antyoksydantów mogą spowodować
zmniejszenie liczby dobroczynnych bakterii w końcowym produkcie,
co zmniejszy jego wartość, z drugiej zaś przeciwutleniacze mogą ulec
transformacji w wyniku działania drobnoustrojów w związki nieak-
tywne biologicznie. W obu przypadkach jednoczesne wprowadzenie
do żywności dwóch składników, każdy o potencjalnie korzystnym dla
zdrowia konsumenta oddziaływaniu, spowoduje nie spotęgowanie,
ale utratę tych właściwości, a uzyskany produkt końcowy będzie po-
zbawiony swoich prozdrowotnych właściwości i przestanie spełniać
kryteria żywności funkcjonalnej.

Piśmiennictwo
1. Weese J.S.: Probiotics, prebiotics, and synbiotics. „JEVS”, 2002, vol. 22 (8),

357-360.

2. Bielecka M.: Żywność probiotyczna. „Ped. Współ. Gastroenterol. Hepatol.

Żyw. Dziecka”, 2002, 4, 1, 27-32.

3. Reid G., Jass J., Sebulsky M.T. et al.: Potential Uses of Probiotics in Clinical

Practice. „Clin. Microbiol. Rev.”, 2003, 16, 658-672.

4. www.usprobiotics.org/products.asp.
5. Maniak B., Targoński Z.: Przeciwutleniacze naturalne występujące w żyw-

ności. „Przem. Ferm. Owoc.-Warz.”, 1996, 4, 7-10.

6. Rauha J.P., Remes S., Heinonen M. et al.: Antimicrobial Effects of Finnish

Plant Extracts Containing Flavonoids and other Phenolic Compounds. „Int.
J. Food Microbiol.”, 2000, 56, 3-12.

7. Newton S.M., Lau C., Gurcha S.S. i wsp.: The Evaluation of Forty-

-Three Plant Species for in Vitro Antimycobacterial Activities; Isolation of
Active Constituents from Psoralea Corylifolia and Sanguinaria Canadensis.
„J. Ethnopharmacol.”, 2002, 79, 57-67.

8. Droebner K., Ehrhardt C., Poetter A., et al.: CYSTUS052, a Polyphenol-

-Rich Plant Extract, Exerts Anti-Influenza Virus Activity in Mice. „Antiviral
Res.”, 2007, 76, 1-10.

9. Gabbay E., Zigmond E, Pappo O. et al.: Antioxidant Therapy for Chro-

nic Hepatitis C after Failure of Interferon: Results of Phase II Randomized,
Double-Blind Placebo Controlled Clinical Trial. „World J. Gastroenterol.”,
2007, 13, 40, 5317-5323.

10. Medina E., de Castro A., Romero C. et al.: Comparison of the Concen-

trations of Phenolic Compounds in Olive Oils and Other Plant Oils, Correla-
tion with Antimicrobial Activity. „J. Agric. Food Chem.”, 2006, 54, 14,
4954-4961.

11. Romero C., Medina E., Vargas J. et al.: In Vitro Activity of Olive Oil Po-

lyphenols against Helicobacter Pylori. ”J. Agric. Food Chem.”, 2007, 55,
680-686.

12. Kim S., Ruengwilysup C., Fung D.Y.: Antibacterial Effect of Water-Soluble

Tea Extracts on Foodborne Pathogens in Laboratory Medium and in a Food
Model. „J. Food Prot.”, 2004, 67, 11, 2608-2612.

13. Zhao W.H., Hu Z.Q., Okubo S. et al.: Mechanism of Synergy Between

Epigallocatechin, Gallate and β-lactams against Methicillin-Resistant Sta-
phylococcus Aureus. „Antimicrob. Agents Chemother.”, 2001, 45, 6,
1737-1742.

14. Cerdá B., Espín J.C., Parra S. et al.: The Potent in vitro Antioxidant El-

lagitannins from Pomegranate Juice Are Metabolised into Bioavailable but
Poor Antioxidant Hydroxy-6H-dibenzopyran-6-one Derivatives by the Colonic
Microflora of Healthy Humans, „Eur. J. Nutr.”, 2004, 43, 205-220.

15. Gonthier M.P., Verny M.A., Besson C. et al.: Chlorogenic Acid Bioava-

ilability Largely Depends on its Metabolism by the Gut Microflora in Rats.
„J. Nutr.”, 2003, 133, 1853-1859.

16. Mulder T.P., Rietveld A.G., van Amelsvoort J.M.: Consumption of Both

Black Tea and Green Tea Results in an Increase in the Excretion of Hippuric
Acid into Urine. „Am. J. Clin. Nutr.”, 2005, 81, 256-260.

17. Blaut M., Braune A., Wunderlich S. et al.: Mutagenicity of Arbutin in

Mammalian Cells after Activation by Human Intestinal Bacteria. „Food
Chem. Toxicol.”, 2006, 44, 11, 1940-1947.

18. Siegers C., Bodinet C., Syed A.S. et al.: Bacterial Deconjugation of Arbu-

tin by Escherichia Coli. „Phytomedicine”, 2003, 10, IV, 58-60.

19. Winter J., Moore L.H., Dowell V.R. et al.: C-Ring Cleavage of Flavonoids

by Human Intestinal Bacteria. „Appl. Environ. Microbiol.”, 1989, 55, 5,
1203-1208.

20. Gournelis D.C., Laskaris G.G., Verpoorte R.: Cyclopeptide Alkaloids.

„Nat. Prod. Rep.”, 1997, 14, 1, 75-82.

21. Daglia M., Papetti A., Dacarro C. et al.: Isolation of an Antibacterial

Component from Roasted Coffee. „J. Pharm. Biomed. Anal.”, 1998, 18,
219-225.

22. Almeida A.A.P., Farah A., Silva D.A.M. et al.: Antibacterial Activity of

Coffee Extracts and Selected Coffee Chemical Compounds against Enterobac-
teria. „J. Agric. Food Chem.”, 2006, 54, 23, 8738-8743.

żywności oraz naturalne źródła, normalnie same niespożywane jako
żywność i nieużywane jako charakterystyczne jej składniki. Barw-
nikami są również preparaty otrzymane ze środków spożywczych
i innych naturalnych źródeł surowcowych, uzyskane w procesie
fizycznej lub chemicznej ekstrakcji, w której ekstrahuje się selek-
tywnie pigmenty odpowiednio pod kątem ich odżywczych albo
aromatycznych składników. Natomiast barwnikami nie są środki
spożywcze suszone lub zagęszczone oraz składniki aromatyczne
mające również właściwości barwiące (np. papryka, szafran, kurku-
ma). Barwniki nie powinny być stosowane do żywności nieprze-
tworzonej, mleka i niektórych produktów mleczarskich, olejów
i tłuszczów zwierzęcych, jaj i przetworów z jaj, mąki i produktów
przemiału zbóż oraz skrobi, pieczywa, makaronów, cukru, niektó-
rych przecierów, past, sosów, koncentratów, soków i nektarów, nie-
których przetworów owocowych i produktów przemysłu rybnego
i mięsnego, kawy, herbaty, soli, octu, miodu oraz niektórych na-
pojów alkoholowych. Zdecydowany zakaz stosowania barwników
dotyczy żywności przeznaczonej dla niemowląt.

Rozwój syntezy chemicznej umożliwił uzyskanie dużej ilości

substancji o charakterze barwników, z których niektóre znalazły
zastosowanie w produkcji żywności. Zaletami barwników synte-
tycznych w porównaniu z barwnikami naturalnymi są: niższa cena,
standardowa moc barwienia, większa trwałość i odporność na wa-
runki środowiska, jednorodność chemiczna, większa wydajność,
wysoka czystość barwy oraz możliwość używania ich w mieszani-
nach – co stwarza duże możliwości kolorystyczne. Pod względem
budowy chemicznej syntetyczne barwniki organiczne stosowane
jako dodatki do żywności można zaliczyć do pięciu klas. Pierwszą
stanowią barwniki azowe, w których grupą chromoforową jest gru-
pa azowa (-N=N-). W zależności od liczby grup azowych można

Syntetyczne barwniki

jako dodatki do żywności

dr inż. Lesław Juszczak

Katedra Analizy i Oceny Jakości Żywności
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

mgr inż. Katarzyna Pietrzyk

Zespół Szkół nr 1 w Miechowie

Streszczenie
Barwa produktów żywnościowych jest jednym z podstawowych
wyróżników jakościowych przy ocenie produktu przez konsumen-
ta. Atrakcyjny kolor zachęca do zakupu i wpływa na postrzeganie
smakowitości żywności. Jednak ze względu na możliwość degra-
dacji naturalnych barwników żywności podczas jej przetwarzania
i przechowywania istnieje konieczność stosowania barwników jako
substancji dodatkowych. Stosowanie organicznych barwników
syntetycznych do barwienia żywności powinno być monitorowane,
co wymaga odpowiednich uregulowań prawnych i adekwatnych
procedur analitycznych.

Summary
The colour of food products is one of the basic qualitative deter-
minants during the evaluation of the product by the consumer.
Attractive colours encourage buying and influence they way
we perceive the taste of the food. However, when faced with the
possibility of the degradation of natural food dyes during the
processing and storage stages, it becomes necessary to apply
dyes as additional substances. Applying organic synthetic dyes
to food should be monitored, which requires suitable settlements
as well as the introduction of the adequate legal and analytic
procedures.

Słowa kluczowe
barwa produktów żywnościowych, organiczne barwniki syntetycz-
ne, barwienie żywności

Key words
the colour of food products, organic synthetic dyes, to dye food

Atrakcyjność sensoryczna żywności jest jednym z podstawowych
kryteriów oceny produktu przez konsumenta. Barwa produktu za-
chęca lub zniechęca konsumenta do jego zakupu, jest pośrednim
czynnikiem w odczuwaniu smakowitości i ostrzega przed spoży-
ciem produktu nieświeżego. Ze względu na określoną trwałość
i stabilność naturalnych barwników występujących w żywności
oraz możliwość ich degradacji pod wpływem procesów techno-
logicznych lub w trakcie przechowywania zachodzi konieczność
stosowania barwników jako dodatków w produkcji środków spo-
żywczych. Celem barwienia żywności jest odtworzenie pierwotnej
barwy utraconej w wyniku jej przetwarzania i/lub przechowywania,
a także nadanie określonego zabarwienia produktom bezbarwnym
lub wzmocnienie istniejącej barwy (np. w przypadku produktów
poddawanych później rozcieńczaniu). Stosowanie barwników po-
zwala również na standaryzację koloru różnych partii produktów.
Barwienie żywności nie może być stosowane w celu ukrycia złej
jakości produktu lub objawów jego zepsucia.

Do barwienia środków spożywczych stosuje się: barwne części

roślin jadalnych, barwniki organiczne naturalne, organiczne syn-
tetyczne identyczne z naturalnymi, organiczne syntetyczne oraz
barwniki nieorganiczne. Stosowanie barwników jako substancji
dodatkowych w produkcji żywności reguluje Rozporządzenie
Ministra Zdrowia z dnia 23.04.2004 r. (Dz.U. z 2004 r. nr 94,
poz. 933). Natomiast Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia
12.10.2007 r. (Dz.U. z 2007 r. nr 199, poz. 1441) określa specyfi-
kacje i kryteria czystości substancji dodatkowych oraz wymagania
dotyczące pobierania próbek i metod analitycznych stosowanych
w trakcie urzędowej kontroli żywności. Zgodnie z Rozporządze-
niem z 2004 roku barwniki to substancje nadające lub przywraca-
jące barwę środkom spożywczym, obejmujące naturalne składniki

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

/2008

wyróżnić barwniki: mono-, bis-, tris- i poliazowe. Natomiast w za-
leżności od połączenia grup azowych z grupami aromatycznymi
związki te mogą dawać barwę żółtą, pomarańczową, czerwoną lub
brązową. Drugą klasę stanowią barwniki triarylometanowe, dające
barwę błękitną lub zieloną o różnych odcieniach, w których chro-
moforem jest grupa chinoidowa lub iminochinoidowa. Trzecia
klasa barwników to pochodne ksantenu, z których do żywności
dopuszczona jest jedynie erytrozyna. Kolejną klasą są barwniki
indygoidowe, z których do barwienia żywności można stosować
jedynie indygotynę. Ostanią, piątą klasą są barwniki chinolinowe,
z których w przemyśle spożywczym stosowana jest jedynie żółcień
chinolinowa. Syntetyczne barwniki organiczne stosowane do bar-
wienia produktów żywnościowych, ich oznaczenia oraz wartości
ADI zestawiono w tabeli 1 (s. 28).

Stabilność, a zatem możliwość zastosowania organicznych barw-

ników syntetycznych do barwienia środków spożywczych, zależy
od wielu czynników. Do najważniejszych działających destrukcyjnie
na barwniki można zaliczyć: obecność czynników utleniających
(ozon, chlor, chlorany(I)), redukujących (ditlenek siarki, cukry re-
dukujące, kwas askorbinowy), obecność jonów metali tworzących
z barwnikami nierozpuszczalne sole, pH środowiska, podwyższona
temperatura, światło oraz zakażenia mikrobiologiczne i związana
z nimi enzymatyczna degradacja barwników.

Charakterystyka
syntetycznych barwników organicznych

Tartrazyna (E 102) jest barwnikiem monoazowym i występuje
w postaci proszku lub granulatu o barwie żółtej i odcieniu po-
marańczowym. Jest ona odporna na działanie światła, tempera-
tury, zasad, kwasów, ditlenku siarki i kwasu askorbinowego, jest
stabilna w pH 3-8. Stosuje się ją dla uzyskania barwy cytrynowej,
a w mieszaninie z błękitem brylantowym FCF – barwy zielonej.
Może być również wykorzystywana w mieszaninie z innymi barw-
nikami dla kształtowania barwy brązowej. Używana jest do barwie-
nia napojów owocowych, galaretek, dżemów, marmolad, owoców
kandyzowanych, owocowych nadzień do ciast i zapraw do jogur-
tów, konserw warzywnych, ketchupu, dressingów, sosów czy ryb
wędzonych. W przemyśle mleczarskim znajduje zastosowanie przy
produkcji lodów, jogurtów deserów i serów twarogowych. Poza
tym jest wykorzystywana w przemyśle piekarskim, cukierniczym
oraz przy produkcji koncentratów spożywczych. Tartrazyna może
powodować reakcje pseudoalergiczne, jak również nietolerancję
u astmatyków i osób z nietolerancją salicylanów (aspiryny) oraz
bezsenność, nadpobudliwość i depresję. Barwnik ten jest także
czynnikiem uwalniającym histaminę, dlatego po jego spożyciu ast-
matycy mogą odczuć wzmożone objawy choroby. Tartrazyna nie
jest zalecana w produkcji żywności przeznaczonej dla dzieci, gdyż
może być odpowiedzialna za wystąpienie syndromu ADHD.

Żółcień chinolinowa (E 104) występuje w postaci proszku

lub granulek o barwie zielonkawożółtej. Jest odporna na działa-
nie światła, kwasów, podwyższonej temperatury i ditlenku siarki,
a wrażliwa na środowisko alkaliczne i kwas benzoesowy. Stosowana
jest dla uzyskania barwy cytrynowej, która w porównaniu z tartra-
zyną ma odcień bardziej zielonkawy. W mieszaninie z barwnika-
mi niebieskimi wykorzystywana jest dla uzyskania barwy zielonej.
Żółcień chinolinową używa się w produkcji napojów, nadzień
cukierniczych, kremów i pianek deserowych, galaretek, dżemów,
marmolad, deserów, gumy do żucia, przetworów rybnych i wódek
gatunkowych.

Żółcień pomarańczowa (E 110) jest barwnikiem mono-

azowym. Służy do uzyskiwania barwy pomarańczowoczerwo-
nej. Jest stabilna w pH 3-8 oraz odporna na działanie kwasów,
zasad, światła i podwyższonej temperatury. Nie jest odporna
na utlenianie, a w obecności kwasu askorbinowego może ule-
gać odbarwieniu. Stosowana jest w produkcji napojów owoco-
wych, kompotów truskawkowych (w mieszaninie z czerwienią
koszenilową), marmolad, galaretek, lodów, sosów, gumy do żu-
cia, konserw i przetworów warzywnych, jogurtów i deserów
mlecznych, słodyczy, pieczywa, wędlin i serków twarogowych
smakowych.

Azorubina (E 122) to barwnik monoazowy o barwie od ciem-

noczerwonej do jasnobrązowej. Jest odporny na działanie kwasów,
zasad, światła i podwyższonej temperatury, stabilny w pH 3-8. Daje
barwę niebieskoczerwoną o tonie podobnym do amarantu.
W mieszaninie z czerwienią koszenilową tworzy barwę malinową,
a z żółcienią pomarańczową – barwę truskawkową. Azorubina
jest stosowana do barwienia napojów, dżemów, galaretek, marmo-
lady, kompotów, owoców kandyzowanych i owocowych nadzień
do ciast, jogurtów, lodów oraz deserów. Jest również użyteczna
w przemyśle piekarskim i cukierniczym oraz przy produkcji kon-
centratów spożywczych.

Amarant (E 123) jest barwnikiem monoazowym o barwie

ciemnoczerwonej, odpornym na działanie światła, podwyższonej
temperatury oraz kwasów. Wrażliwy na ditlenek siarki, w obecno-
ści redukujących cukrów prostych ulega degradacji. Stosowany
jest w przemyśle owocowym mleczarskim oraz przy produkcji
koncentratów i napojów.

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

/2008

Czerwień koszenilowa (E 124) jest barwnikiem monoazowym

o barwie czerwonej. Jest odporna na działanie światła, temperatury
oraz środowiska, o pH w zakresie 3-8. Mniej odporna na działa-
nie zasad. W mieszaninie z E 110 bywa stosowana do uzyskania
barwy truskawkowej i pomidorowej, a z E 122 – barwy malinowej.
Czerwień koszenilową wykorzystuje się w przemyśle owocowym,
mleczarskim, w produkcji przetworów pomidorowych, napojów
bezalkoholowych, kremów i deserów, salami i innych przetworów
mięsnych.

Erytrozyna (E127) jest barwnikiem ksantenowym i występuje

w postaci niebieskoczerwonego proszku lub granulek. Jest stabilna
w środowisku o pH 3-8 i odporna na działanie temperatury, nato-
miast mało odporna na działanie środowiska zasadowego i światła.
Słabo rozpuszcza się w etanolu. W roztworach o pH około 3 tworzy
trudno rozpuszczalny kwas erytrozynowy. Erytrozyna stosowana
jest w przemyśle owocowym (np. do barwienia owoców przezna-
czonych do dekoracji), w przemyśle cukierniczym, koncentratów,
mięsnym i mleczarskim.

Czerwień Allura AC (E 129) to barwnik monoazowy o bar-

wie ciemnoczerwonej. Jest odporny na działanie światła, utlenianie,
podwyższoną temperaturę, stabilny w środowisku o pH 3-8. Czer-
wień Allura AC jest wrażliwa na działanie ditlenku siarki i słabo
rozpuszczalna w etanolu. Stosowana jest w przemyśle koncentratów,
cukierniczym, mleczarskim, mięsnym i napojów.

Błękit patentowy V (E 131) jest barwnikiem trójarylometano-

wym o barwie ciemnoniebieskiej. Jest odporny na działanie światła
i podwyższonej temperatury, natomiast wrażliwy na środowisko
kwaśne i zasadowe oraz na działanie ditlenku siarki. W celu uzyska-
nia barwy zielonej jest stosowany w kompozycjach z barwnikami
żółtymi. Znajduje zastosowanie do barwienia napojów i konserw
warzywnych oraz w przemyśle piekarskim i cukierniczym.

Indygotyna (E 132) to barwnik indygoidowy występujący

w postaci proszku lub granulatu o barwie ciemnoniebieskiej. Indy-
gotyna jest stabilna w środowisku o pH 3-8, mało odporna na pod-
wyższoną temperaturę i wrażliwa na działanie światła, środowiska
zasadowego, kwasu benzoesowego i ditlenku siarki. Szybko ulega
odbarwieniu w obecności związków mających właściwości redu-
kujące. Ze względu na swoją barwę jest stosowana do uzyskiwania
barwy czarnej jagody, a w mieszaninie z tartrazyną – do otrzymy-
wania barwy zielonej. Znajduje zastosowanie w przemyśle owoco-
wym, mleczarskim i cukierniczym.

Błękit brylantowy FCF (E 133) jest barwnikiem triarylome-

tanowym w postaci proszku lub granulek o barwie czerwonofio-
letowej z połyskiem metalicznym. Roztwory błękitu brylantowego,
w zależności od stężenia, dają barwę od żółtej do zielononiebie-
skiej. Jest odporny na działanie temperatury, światła, środowiska
o zróżnicowanym pH i ditlenku siarki. W mieszaninie z tartrazyną
tworzy barwę zieloną, a z amarantem – fioletową. Jest stosowany
w przemyśle owocowo-warzywnym, mleczarskim, w produkcji de-
serów i napojów bezalkoholowych.

Zieleń S (E 142) jest barwnikiem triarylometanowym. Wystę-

puje w postaci proszku lub granulek o barwie ciemnoniebieskiej
lub zielonej. Jest odporna na działanie podwyższonej temperatury
oraz środowiska kwaśnego i zasadowego, natomiast mało odporna
na działanie światła. Znajduje zastosowanie w przemyśle owocowo-
-warzywnym, cukierniczym oraz mleczarskim, a także w produkcji
napojów alkoholowych i bezalkoholowych.

Czerń brylantowa BN, czerń PN (E 151) jest barwnikiem

bisazowym o barwie czarnej. Jej wodne roztwory charakteryzują

się odcieniem niebieskofioletowym. Jest wrażliwa na działanie
podwyższonej temperatury, średnio odporna na działanie światła
i zróżnicowanego pH środowiska. W mieszaninach z barwnikami
czerwonymi jest używana do uzyskiwania barwy czarnej jagody,
natomiast z pomarańczowym – tonów brązowych. Wykorzystuje się
ją w przemyśle cukierniczym i owocowo-warzywnym, w produkcji
wyrobów czekoladopodobnych, sosów i produktów z ikry rybiej.

Brąz FK (E 154) jest mieszaniną sześciu soli sodu (rzadziej

potasu lub wapnia) barwników mono-, di- i triasowych. Występu-
je w postaci czerwonobrązowego proszku lub granulatu, tworząc
roztwory o barwach od żółtobrązowych do czerwonych. Jest wraż-
liwy na działanie światła, ale odporny na podwyższoną tempera-
turę i środowisko o zróżnicowanym pH. Znajduje zastosowanie
w produkcji ryb wędzonych i przetworów rybnych, koncentratów
spożywczych, napojów oraz w przemyśle cukierniczym.

Brąz HT (E 155) jest barwnikiem bisazowym w postaci proszku

lub granulek o barwie czerwonobrązowej. Jest odporny na działa-
nie światła i podwyższonej temperatury, nieco mniej na działanie
kwasów i zasad. Jest nierozpuszczalny w etanolu. Używany jest
w produkcji czekolady i wyrobów czekoladopodobnych, napojów
oraz w przemyśle mleczarskim.

Metody analityczne
stosowane w oznaczaniu
syntetycznych barwników organicznych

Identyfikacja i oznaczanie zawartości barwników syntetycznych
w żywności jest poważnym wyzwaniem dla analityków. Różnorod-
ność struktur chemicznych, mnogość pochodnych oraz obecność
produktów ich degradacji znacznie utrudniają jakościową ocenę oraz
ich ilościowy pomiar. Dodatkowym czynnikiem utrudniającym ana-
lizy, szczególnie ekstrakcję, jest możliwość występowania interakcji
pomiędzy obecnymi w żywności barwnikami a jej naturalnymi skład-
nikami. Ponadto ekstrahowane z próbek substancje barwne mogą
być wrażliwe na działanie tlenu, podwyższonej temperatury, światła,
jonów metali, a także innych katalizatorów, co dodatkowo może
komplikować cały proces analityczny. Większość procedur analitycz-
nych identyfikacji oraz oznaczania zawartości barwników syntetycz-
nych składa się z kilku etapów. Pierwszym etapem jest ekstrakcja,
której poprawność wykonania ma zasadniczy wpływ na cały proces
analityczny i uzyskany rezultat. Następnie ekstrakty są dodatkowo
oczyszczane z substancji interferujących. Ze względu na niewielki
dodatek barwników syntetycznych do produktów spożywczych otrzy-
mane ekstrakty często muszą być zagęszczane. Następnie barwniki
są separowane, identyfikowane i oznaczane ilościowo.

Wielkość i sposób przygotowania próbki do analizy barwników

syntetycznych jest uzależniony od rodzaju produktu. Próbki ciekłe
– takie jak napoje – mogą być analizowane bezpośrednio, jednak
w przypadku napojów gazowanych należy usunąć ditlenek węgla.
Napoje zawierające cząstki stałe (np. pochodzące z owoców) na-
leży najpierw przesączyć lub odwirować. Natomiast w przypadku
napojów alkoholowych należy usunąć zawarty w nich alkohol.
Rozpuszczalne w wodzie próbki stałe lub półstałe (np. napo-
je w proszku, dżemy, cukierki) rozpuszcza się w ciepłej wodzie
i dalej postępuje jak w przypadku napojów. Próbki stałe można
ekstrahować różnymi buforami lub roztworami acetonu, etanolu
lub metanolu. Otrzymane ekstrakty alkalizuje się (np. tetrabora-
nem sodu), a części stałe usuwa na drodze sączenia lub wirowa-
nia. Rozdrobnione próbki stałe można także zmieszać z piaskiem
lub ziemią okrzemkową i umieścić w kolumnie. Następnie lipidy

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

/2008

i inne substancje rozpuszczalne w tłuszczach wymywa się chloro-
formem, natomiast barwniki obecne w próbce odpowiednią fazą
wodną. Właściwe rozdrobnienie próbki oraz dobór fazy ekstrahu-
jącej powinny zapewnić całkowity odzysk oznaczanych barwników.
Dobre efekty w wielu przypadkach daje roztwór kwasu octowego.
Natomiast w przypadku oznaczania indygotyny i erytrozyny, któ-
re w środowisku kwaśnym mogą ulegać degradacji, jako czynnik
ekstrahujący stosuje się bufor o pH 7.

Ze względu na możliwość występowania trwałych połączeń

pomiędzy barwnikami a naturalnymi składnikami żywności
(głównie białkami i węglowodanami) konieczna może być wstęp-
na hydroliza próbki. W tym celu najczęściej stosowanymi en-
zymami są: amyloglukozydaza, lipaza, pektynaza, celulaza oraz
fosfolipaza. Próbki o dużej zawartości białka można potrakto-
wać acetonem lub etanolem w celu jego wytrącenia. Natomiast
próbki o dużej zawartości tłuszczu należy najpierw odtłuścić
(np. eterem naftowym). W przypadku oznaczania indygoty-
ny, która jest niestabilna w środowisku kwaśnym i zasadowym
oraz mało odporna na podwyższoną temperaturę, rozdrobnio-
ną próbkę ogrzewa się w łaźni wodnej w temperaturze poniżej
60

C w atmosferze azotu.

Syntetyczne barwniki organiczne mogą być izolowane z żywno-

ści lub ekstraktów, oczyszczane i zagęszczane na drodze wybarwia-
nia wełny, adsorpcji na różnego rodzaju adsorbentach, ekstrakcji
w odwróconym układzie faz, w układzie par jonowych lub przy
zastosowaniu żywic jonowymiennych. Wybarwianie wełny jest jedną
z najstarszych metod ekstrakcji i oczyszczania barwników spożyw-
czych. Zasada metody opiera się na zjawisku wybarwiania wełny
w środowisku kwaśnym przez barwniki o charakterze kwasowym.
Kawałki odtłuszczonej wełny dodaje się do zakwaszonej próbki
lub ekstraktu i ogrzewa. Następnie zabarwioną wełnę przemywa
się, a barwniki wymywa gorącym roztworem amoniaku. Niektóre
naturalne barwniki również mogą wybarwiać wełnę, jednak nie
są z niej usuwane roztworem amoniaku. W przypadku barwników
zasadowych próbkę należy zalkalizować roztworem amoniaku,
a barwniki z wybarwionej wełny wymywa się roztworem kwasu
octowego. Procedura ta jest jednak czasochłonna i nie znajduje
zastosowania do barwników wrażliwych na kwaśne lub zasadowe
środowisko oraz dla próbek o dużej zawartości białek, tłuszczów
i węglowodanów.

Innym sposobem oczyszczania i zagęszczania syntetycznych barw-

ników organicznych jest zjawisko adsorpcji na żywicy poliamidowej.
W metodzie tej możliwość separacji barwników związana jest z ich
adsorpcją na drodze tworzenia mocnych mostków wodorowych
pomiędzy grupami sulfonowymi barwnika a poliamidem. Proce-
dura taka obejmuje rozpuszczenie ekstraktu w wodzie zakwaszonej
kwasem octowym, dodanie proszku poliamidowego i przeniesienie
całości do kolumny. W celu usunięcia cukrów, kwasów i substancji
aromatycznych złoże przemywa się gorącą wodą. Natomiast za po-
mocą acetonu usuwa się barwniki zasadowe, rozpuszczalne w wo-
dzie karotenoidy i niektóre antocyjany. Zaadsorbowane na złożu
barwniki wymywa się metanolowym roztworem chlorku sodu czy
mieszaniną metanolu lub acetonu z amoniakiem. Procedura ta nie
może być stosowana przy oznaczaniu indygotyny i brązu HT.
Do oczyszczania ekstraktów zawierających barwniki można również
zastosować kolumny wypełnione celulozą oraz roztwory wodno-
alkoholowe niektórych soli. W oczyszczaniu ekstraktów znalazły
również zastosowanie kolumny wypełnione tlenkiem glinu, z któ-
rych barwniki wymywa się roztworem amoniaku.

Kolejną metodą jest ekstrakcja w układzie par jonowych z zasto-

sowaniem np. TBA. Metoda ta może być stosowana w przypadku
barwników anionowych i jest szczególnie polecana przy oznacza-
niu zawartości indygotyny, ze względu na jej wrażliwość na pod-
wyższoną temperaturę i skrajne pH środowiska. W oczyszczaniu
ekstraktów zawierających barwniki spożywcze zastosowanie znala-
zły również żywice jonowymienne (np. Amberlit LA-2 lub XAD-2),
z których oznaczane barwniki wymywa się roztworami butanolu
lub metanolu. Obecnie najczęściej stosowaną metodą oczyszcza-
nia i zagęszczania ekstraktów zawierających barwniki jest ekstrakcja
do fazy stałej przy zastosowaniu odpowiedniego wypełnienia (np.
Sep-Pak C18). W pierwszym etapie złoże przemywa się izopropano-
lem i roztworem kwasu octowego. Zakwaszoną próbkę podaje się
na kolumnę i usuwa cukry oraz substancje aromatyczne. Zawarte
w ekstrakcie barwniki wymywa się roztworami izopropanolu o róż-
nym stężeniu. Zgodnie z procedurą opisaną w standardach AOAC
2,5% roztworem izopropanolu wymywa się amarant i tartrazynę,
13% – czerwień allura, indygotynę i żółcień pomarańczowy, 20%
– błękit brylantowy i zieleń, a 50% – erytrozynę.

Do rozdziału syntetycznych barwników spożywczych stosuje

się głównie metody chromatograficzne i elektroforetyczne. Naj-
starszą techniką, obecnie już rzadko stosowaną, jest chromato-
grafia bibułowa z zastosowaniem wody i butanolu jako najbar-
dziej efektywnych rozpuszczalników. Do rozdziału spożywczych
barwników syntetycznych zaproponowano również inne odmiany
tej techniki: wielowymiarową oraz rotacyjną chromatografię bi-
bułową. W celu identyfikacji poszczególnych barwników wysu-
szony chromatogram napyla się roztworem kwasu solnego oraz

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

/2008

Wzór strukturalny

Nazwa własna

Numer wg systemu

oznaczeń UE

Numer wg systemu

oznaczeń Colour

Index

ADI

(mg/kg m.c.)

tartrazyna

E 102

19140

0-7,5

żółcień chinolinowa

E 104

47005

0-10

żółcień pomarańczowa S

żółcień pomarańczowa FCF

E 110

15985

0-2,5

azorubina, karmoizyna

E 122

14720

0-4

amarant

E 123

16185

0-0,5

czerwień koszenilowa

E 124

16255

0-4

erytrozyna

E 127

45430

0-0,1

czerwień Allura AC

E 129

16035

0-7

błękit patentowy V

E 131

42051

nieustalone

indygotyna, indygokarmina

E 132

73015

0-5

błękit brylantowy FCF

E 133

42090

0-12,5

zieleń S

E142

44090

nieustalone

czerń brylantowa BN

czerń PN

E 151

28440

0-1

brąz FK

E 154

nieustalone

brąz HT

E 155

20285

0-1,5

Tabela 1. Syntetyczne barwniki organiczne stosowane do barwienia produktów żywnościowych (ADI – acceptable daily intake, dopuszczalne dzienne pobranie)

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

/2008

amoniaku i obserwuje zmiany zabarwienia poszczególnych plam.
Inna metoda identyfikacji poszczególnych barwników polega
na wycięciu rozdzielonych na bibule plam i wymyciu poszczegól-
nych barwników za pomocą 60-70% roztworu etanolu; następnie
po zagęszczeniu wyznacza się spektra absorpcyjne w zakresie UV/
Vis. Chromatografia papierowa jest jednak techniką czasochłonną
i charakteryzuje się niską rozdzielczością. Bardziej zaawansowaną
metodą jest chromatografia cienkowarstwowa, charakteryzująca się
lepszą rozdzielczością i krótszym czasem analizy. Można ją wyko-
rzystać do rozdziału wieloskładnikowych mieszanin barwników,
a jej dodatkowa zaleta to niskie koszty. Najczęściej używanymi
złożami w tej metodzie są żel krzemionkowy i celuloza. Opra-
cowano również procedury wykorzystujące tlenek glinu, węglan
wapnia oraz poliamid. Ze względu na istotną zależność jakości
rozdziału od grubości warstwy adsorbentu zaleca się stosowanie
płytek standardowych. Jako rozpuszczalniki najczęściej stosuje się
roztwory etanolu, amoniaku, pirydyny, dimetylosulfotlenku, ace-
tonitrylu lub dioksanu. Do rozdziału syntetycznych barwników
spożywczych dostosowano również wysoko sprawną chromatografię
cienkowarstwową, chromatografię cienkowarstwową w układzie par
jonowych oraz chromatografię cienkowarstwową w odwróconym
układzie faz. Ta ostania technika umożliwiła zastosowanie wysoko
polarnych rozpuszczalników, bez ryzyka wymywania fazy stacjo-
narnej. Dodatkowymi zaletami chromatografii cienkowarstwowej
w odwróconym układzie faz są: skrócenie czasu analizy, lepsza
rozdzielczość, możliwość pominięcia etapu ekstrakcji, zastosowa-
nie znacznie prostszych układów rozpuszczalników i możliwość
separacji mieszanin, które trudno jest rozdzielić innymi metodami
(np. tartrazyna/błękit patentowy V).

Mieszaniny syntetycznych barwników spożywczych mogą być

również rozdzielane na drodze elektroforezy. Dysocjacja grup funk-
cyjnych barwnika powoduje, że cząsteczki posiadają ładunek elek-
tryczny i dzięki temu mogą migrować w polu elektrycznym. W tym
wypadku ładunek elektryczny może być zmieniany na drodze kom-
pleksowania barwników z jonami metali. Jako fazę stacjonarną można
zastosować żel poliakrylamidowy, a jako bufor – dimetyloformamid.
Obecnie najczęściej stosowaną metodą rozdziału mieszanin barw-
ników syntetycznych jest wysokosprawna chromatografia cieczowa,
szczególnie z zastosowaniem kolumn z odwróconym układem faz.
Jako fazy ruchome stosuje się mieszaniny: metanolu, acetonitrylu,
octanu amonu, buforu fosforanowego, kwasu o-fosforowego. Meto-
dą rozdziału syntetycznych barwników spożywczych, która obecnie
stanowi alternatywę dla wysokosprawnej chromatografii cieczowej,
jest elektroforeza kapilarna. Separacja oznaczanych barwników jest
oparta na różnicy w ruchliwości elektroforetycznej, która jest wprost
proporcjonalna do ładunku, a odwrotnie proporcjonalna do wielkości
cząstek. Opracowano również metody wykorzystujące micelarną elek-
trokinetyczną chromatografię kapilarną, gdzie w procesie rozdzielania
stosuje się bufory z dodatkiem związków powierzchniowo-czynnych
o stężeniu, powyżej którego tworzą się micele. Elektroforeza kapilar-
na jako technika rozdziału syntetycznych barwników organicznych
ma dużo zalet: jest metodą uniwersalną, szybką, prostą oraz odpo-
wiednio czułą i selektywną. Stosowane w niej kolumny są trwałe
i wymagają mniejszych objętości rozpuszczalników, co w efekcie
końcowym redukuje czas i koszty analiz.

Identyfikacja i ilościowe oznaczanie zawartości syntetycznych

barwników organicznych może się opierać na bazie różnych me-
tod: od najprostszych, polegających na wywołaniu barwnej reakcji,
do bardzo zaawansowanych, jak spektrometria masowa.

Najprostsza metoda rozdziału barwników na syntetyczne i na-

turalne oparta jest na ich rozpuszczalności. Większość naturalnych
barwników znajdujących się w żywności rozpuszcza się w alkoholu
i w eterze, natomiast syntetyczne barwniki organiczne są rozpusz-
czalne w wodzie. Podstawową metodą identyfikacji syntetycznych
barwników spożywczych jest wywołanie barwnej reakcji pomiędzy
barwnikiem i specyficznym reagentem. W tym celu stosuje się stężo-
ny kwas solny, stężony kwas siarkowy, 10% roztwór wodorotlenku
sodu oraz 12% roztwór amoniaku, a wynik reakcji porównuje się
z odpowiednia tabelą.

Powszechnie stosowaną metodą identyfikacji syntetycznych

barwników spożywczych jest spektrofotometria w świetle widzial-
nym, jednak wymaga ona wykreślania widm absorpcyjnych w kil-
ku rozpuszczalnikach o różnej polarności. Wykorzystać można
również wpływ pH środowiska na kształt widm. Jedna z metodyk
zaleca wykreślanie widm absorpcyjnych analizowanych roztworów
barwnika o różnym pH w zakresie 350-750 nm i następnie porów-
nanie otrzymanych widm z widmami standardów.

Obecnie najbardziej zaawansowaną techniką identyfikacji syn-

tetycznych barwników organicznych jest spektrometria masowa.
W tym przypadku wykorzystywany jest fakt, że sulfonowe grupy
barwników łatwo ulegają dysocjacji w roztworach wodnych, stąd
wytwarzanie jonów [R-(SO

)

]

jest stosunkowo proste. Najczęst-

szymi metodami jonizacji są: termorozpylanie, elektrorozpylanie
lub jonizacja chemiczna. Ponadto spektrometry masowe łączy się
z technikami stosowanymi w rozdziale barwników spożywczych:
chromatografią i elektroforezą kapilarną. Najprostszym sposo-
bem ilościowego oznaczania zawartości syntetycznych barwni-
ków organicznych są metody miareczkowe wykorzystujące fakt,
że barwniki azowe, triarylometanowe oraz indygoidowe łatwo
ulegają redukcji w obecności chlorku tytanu. Kolejną grupę me-
tod w ilościowej analizie barwników stanowią metody spektrofo-
tometryczne wykorzystujące możliwość barwników do absorpcji
światła. Barwniki żółte wykazują absorpcję w zakresie 400-435 nm,
pomarańczowe – 417-476 nm, a czerwone w zakresie 500-526 nm.
Kształty krzywych absorpcji ściśle jednak zależą od rodzaju za-
stosowanego rozpuszczalnika. Spektrofotometria może być wyko-
rzystana zarówno do identyfikacji, jak i ilościowego oznaczania
poszczególnych barwników po ich rozdziale, a także do analiz
mieszanin barwników. W tym celu należy przeprowadzić proces
derywatyzacji lub zastosować kalibrację wieloczynnikową. Spek-
trofotometria UV-Vis znajduje również szerokie zastosowanie
w połączeniu z chromatograficznymi lub elektroforetycznymi
metodami rozdziału barwników. Wymywane przez eluent z kolum-
ny poszczególne barwniki poddawane są detekcji, co umożliwia
ich jakościową i ilościową analizę. W przypadku rozdzielanych
mieszanin barwników detekcja odbywa się przy co najmniej czte-
rech długościach fali: 400 nm dla barwników żółtych, 475 nm dla
barwników pomarańczowoczerwonych, 525 nm dla barwników
purpurowoczerwonych oraz 600 nm w przypadku niebieskich
i zielonych barwników. Opracowano również procedury identy-
fikacji i ilościowego oznaczania barwników z detekcją w ultrafio-
lecie (254 i 280 nm). Nowocześniejszym sposobem detekcji jest
zastosowanie detektorów z matrycą diodową, umożliwiających
szybkie wykreślanie widm absorpcyjnych barwników rozdziela-
nych w kolumnie chromatograficznej.



Piśmiennictwo dostępne na stronie:
www.laboratorium.elamed.pl.

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

/2008

dr Joanna Sobolewska-Zielińska

Katedra Analizy i Oceny Jakości Żywności

Akademia Rolnicza w Krakowie

Konserwowanie żywności jest stosowane od wielu pokoleń. Nasi
przodkowie konserwowali żywność do własnego użytku cukrem,
solą oraz stosując inne metody, np. wędzenie. W dzisiejszych cza-
sach wraz ze zmianą stylu życia przyzwyczailiśmy się do żywności
przetworzonej i jednocześnie o dużej trwałości. Z tego też względu
powszechne stało się stosowanie w przemyśle spożywczym substancji
konserwujących.

W żywności podczas przechowywania zachodzą różnorodne

zmiany, na ogół niepożądane, które można określić jako:
– Fizjologiczne – zachodzące na skutek działania enzymów tkanko-

wych związanych z procesami dojrzewania, oddychania i transpiracji.
Zmiany tego typu zachodzą w surowcach roślinnych.

– Chemiczne – powodowane przez reakcje chemiczne składników

żywności zachodzące między sobą (np. nieenzymatyczne brunat-
nienie) lub ze składnikami środowiska (np. utlenianie).

– Fizyczne – wynikające ze zmian struktury fizycznej samego produktu

(np. schnięcie) lub z oddziaływania czynników fizycznych otoczenia
(np. zbrylanie).

– Mikrobiologiczne – powodowane przez działalność drobnoustro-

jów (np. pleśnienie).
Substancje konserwujące, zwane potocznie konserwantami

(ang. preservatives), są dodatkami chemicznymi przedłużającymi
trwałość żywności poprzez zabezpieczenie jej przed rozkładem spo-
wodowanym przez drobnoustroje. Ich cechą jest hamowanie rozwoju
mikroorganizmów albo ich niszczenie już przy niskich dawkach,
najczęściej ok. 0,1%.

Mechanizm działania substancji konserwującej na drobnoustroje

jest złożony. Zależy od wielu czynników, takich jak rodzaj i liczba
drobnoustrojów, a także od składu i właściwości żywności. Najważ-
niejszą rolę w tym mechanizmie odgrywa hamowanie lub blokowanie
procesów biochemicznych w komórce drobnoustroju. Dzieje się to
głównie poprzez:

– naruszenie półprzepuszczalnych właściwości błony komórkowej

i transportu substancji odżywczych;

– hamowanie syntezy DNA, białka i innych niezbędnych składników

odżywczych komórki;

– hamowanie aktywności lub inaktywację enzymów biorących udział

w metabolizmie wewnątrzkomórkowym;

– gwałtowne aktywowanie enzymów powodujących rozkład wysoko-

energetycznych nukleotydów.
Efektywność działania konserwantów wspomagają lub obniżają

warunki środowiska, a szczególnie pH, skład chemiczny produktu,
dodatek substancji obniżających aktywność wody (cukier, sól kuchen-
na), rodzaj obecnych drobnoustrojów oraz okres przechowywania
produktu. Największe znaczenie praktyczne ma oddziaływanie pH.
Im niższe pH, tym dodatki konserwujące o charakterze słabych
kwasów lub ich soli wykazują silniejsze działanie, gdyż najsilniej
działają w stanie niezdysocjowanym, a wraz ze wzrostem pH wzrasta
stopień ich dysocjacji.

W produktach typu emulsje, takich jak masło, margaryna czy

majonez, występują głównie dwie fazy: tłuszczowa i wodna. Rozwój
drobnoustrojów następuje w fazie wodnej lub na granicy faz. Z tego
względu konserwanty muszą mieć powinowactwo do fazy wodnej,
ponieważ jeżeli jest ono większe od tłuszczowej, wówczas przechodzą
one właśnie do fazy wodnej. Zmniejsza to znaczenie efektywności
ich działania.

Stosowanie chemicznych konserwantów powinno mieć jednak

charakter pomocniczy i to w najniższych uzasadnionych stęże-
niach. W utrwalaniu żywności należy dążyć przede wszystkim
do stosowania fizycznych metod, takich jak: pasteryzacja, steryli-
zacja, mrożenie czy suszenie, oraz metod biologicznych, jak np.
ukwaszanie. Należy również zaznaczyć, że – tak jak inne czynniki
hamujące rozwój mikroorganizmów – również konserwanty są
skuteczne tylko w przypadku, gdy zakażenie utrwalanego produktu

Streszczenie
Substancje konserwujące są to dodatki chemiczne przedłużające
trwałość żywności poprzez zabezpieczenie ich przed rozkładem
spowodowanym przez drobnoustroje. W pracy przedstawiono
charakterystykę najważniejszych konserwantów z uwzględnieniem
wybranych metod ich oznaczania. Uwzględniono kierunki ich
działania oraz praktyczne zastosowanie w przemyśle spożywczym
zgodnie z najnowszym Rozporządzeniem Ministra Zdrowia z dnia
23 kwietnia 2004 roku oraz jego zmianami z dnia 20 kwietnia
2005 roku.

Summary
Preservatives are chemical additives which extend shelf-life of
food through protection against decay caused by microbes. In the
paper the author shows properties of the most important prese-
rvatives and presents a few selected methods. The activity and
practical uses for food industry were taken into consideration in
the study, according to the newest regulation of Minister of Health
(2004-04-23), modified by amendment (2005-04-20).

Słowa kluczowe
substancje konserwujące, działanie konserwantów, zastosowanie
konserwantów

Key words
preservatives, the activity of preservatives, practical uses of
preservatives

Środki konserwujące

w żywności i metody ich oznaczania

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

/2006

drobnoustrojami nie jest zbyt duże. Natomiast nie można stosować
substancji konserwujących jako środka, który przedłuża trwałość
nadpsutej żywności.

Dla zapewnienia trwałości w przemyśle spożywczym stosuje się

jednocześnie kilka czynników hamowania rozwoju drobnoustrojów
tzw. metodą kombinowaną albo płotkową (ang. hurdle technology).
W zależności od charakteru produktu spożywczego dobiera się
kombinację takich czynników, jak: odpowiednia dawka cieplna (F),
wychładzanie (t), aktywność wody (a

), zakwaszanie (pH), potencjał

oksydo-redukcyjny (E

) oraz konserwanty (Ch). Drobnoustroje mogą

się rozwijać przy niektórych z nich, ale kolejna bariera staje się nie do
pokonania. Przykładem zastosowania takiej technologii jest kiełbasa
surowo dojrzewająca typu salami, gdzie trwałość produktu zapewnia-
my poprzez obniżenie pH, a następnie obniżenie aktywności wody
(podsuszenie produktu).

Wśród chemicznych konserwantów wpływających na utrwalanie

żywności można wyróżnić dwie zasadnicze grupy:
1. Typowe konserwanty (o działaniu przeciwdrobnoustrojowym).

W grupie tej spotyka się podział na antyseptyki, tj. związki
chemiczne o stosunkowo prostej budowie pochodzenia pozami-
krobiologicznego, dodawane zwykle w ilości dziesiętnych części
procenta, oraz antybiotyki – związki chemiczne wytwarzane
przez drobnoustroje, stosowane w ilości od kilku do kilkuset
części na milion. Podział ten i definicje nie są ścisłe, bowiem
niektóre antyseptyki (np. kwas propionowy) wytwarzane są przez
mikroorganizmy, a niektóre antybiotyki można otrzymać na
drodze syntezy.

2. Substancje stosowane w innym celu, lecz wykazujące również

działanie konserwujące (przeciwutleniacze tłuszczów, barwników,
witamin, substancji smakowych, substancje zabezpieczające przed
enzymatycznym i nieenzymatycznym brunatnieniem).

Środki konserwujące
w przepisach i normach

W połowie ubiegłego stulecia, przy gwałtownym rozwoju przemysłu,
dodawanie środków konserwujących było często nadużywane i miało
nieraz na celu przysłonienie złej jakości produktów. Często używa-
no środków o znacznej szkodliwości dla człowieka, np. formaliny
do mleka czy kwasu borowego do masła. Rozbudowa przepisów
i ustaw o utrwalaniu żywności oraz systematyczna kontrola żywności
przez odpowiednie organy publiczne przyczyniły się do względ-
nego uporządkowania sprawy stosowania środków chemicznych
do konserwowania żywności. Obecnie przepisy o żywności są już
względnie ustabilizowane w różnych krajach i tylko co jakiś czas są
nowelizowane w celu wyłączenia jakiegoś środka, którego szkodliwość
została udowodniona, lub w celu włączenia nowej substancji o dużej
skuteczności konserwującej i braku toksyczności.

Od 1 maja 2004 roku w Polsce obowiązuje Rozporządzenie Ministra

Zdrowia z 23 kwietnia 2004 r. w sprawie dozwolonych substancji do-
datkowych i substancji pomagających w przetwarzaniu. W porównaniu
z poprzednio obowiązującym aktem prawnym, w nowym rozporzą-
dzeniu wprowadzono pewne zmiany dostosowujące krajowe przepisy
do wymagań zawartych w dyrektywach Unii Europejskiej. Oprócz
poprzednich zapisów, nowe rozporządzenie zawiera postanowienia
dwóch ostatnio wydanych dyrektyw:
1. Dyrektywy Parlamentu Europejskiego i Rady 2003/114/WE

z 22 grudnia 2003 r.

2. Dyrektywy Parlamentu Europejskiego i Rady 2003/115/WE

z 22 grudnia 2003 r.

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

/2006

Ponadto do 12 lipca 2003 r. kraje członkowskie Unii Europejskiej

miały obowiązek wprowadzić do regulacji krajowych postanowienia
Dyrektywy Rady 2001/112/WE z 20 grudnia 2001 r., dotyczące soków
owocowych i niektórych produktów podobnych przeznaczonych
do spożycia przez ludzi. W Rozporządzeniu z 23 kwietnia 2004 r.
uwzględniono również zmiany lub uzupełnienia wynikające z nowej
interpretacji niektórych zapisów dyrektyw lub mające charakter po-
rządkowy. W kolejnym roku wydano Rozporządzenie Ministra Zdrowia
z dnia 20 kwietnia 2005 r. zmieniające przepisy w sprawie dozwolonych
substancji dodatkowych i substancji pomagających w przetwarzaniu.
W rozporządzeniach tych wymieniono dopuszczone do stosowania
substancje konserwujące, które przedstawiono w tabeli 1.

W Załączniku 2 omawianego rozporządzenia znajdują się również

maksymalne dawki poszczególnych konserwantów, wyrażone w mg/kg
lub odpowiednio w mg/l, dopuszczone do stosowania w określonych
przez ustawę produktach spożywczych. W przypadku stosowania
równolegle dwóch konserwantów ich dawka sumaryczna nie może
być wyższa od dawki maksymalnej jednego konserwantu. Każda użyta
substancja konserwująca powinna być wyszczególniona na opakowaniu
jednostkowym produktu.

Charakterystyka najważniejszych
substancji konserwujących
i metody ich oznaczania

Kwas sorbowy i jego sole
Kwas sorbowy ulega w organizmie człowieka procesowi E-oksydacji,
typowemu dla kwasów tłuszczowych, dzięki czemu zaliczany jest do
najbezpieczniejszych konserwantów. Jest skuteczny w stanie niezdyso-
cjowanym, stąd jego działanie wzrasta wraz ze spadkiem pH środowiska.
W niskich zakresach pH wykazuje skuteczniejsze działanie niż kwas
benzoesowy. Kwas sorbowy i jego sole (potasu i wapnia) wykazują
działanie konserwujące, hamując rozwój pleśni i drożdży w produktach
o odczynie pH 3-6, słabiej do pH 7. Działa on efektywnie na hamowa-
nie rozwoju bakterii z rodzaju: Acetobacter, Bacillus, Achromobacter,
Clostridium, Escherichia, Enterobacter, Proteus, Pseudomonas, Pro-
pionibacterium, Salmonella, Sarcina, Staphylococcus, Vibrio, zaś tylko
w niewielkim stopniu na bakterie kwasu mlekowego. Dzięki temu jest
bardzo użyteczny przy wyrobie kiszonek i w serowarstwie.

Istnieje wiele metod oznaczania tego konserwantu w produktach

spożywczych:
– Metoda spektrofotometryczna polegająca na oddestylowaniu kwasu

sorbowego z parą wodną i spektrofotometrycznym oznaczeniu jego
zawartości w destylacie przy długości fali O = 256 nm (PN-90/A-
-75101/25).

– Metoda spektrofotometryczna polegająca na pomiarze absorbancji

zielono zabarwionego kompleksu, który tworzy kwas sorbowy
z benzotiazolem (sulfonian 2-metylo-merkapto-benzotiazolo-p-ety-
lotoluen) w obecności bezwodnika kwasu octowego.

– Metoda spektrofotometryczna polegająca na oddestylowaniu

kwasu sorbowego z parą wodną, utworzeniu barwnego kom-
pleksu z kwasem 2-tiobarbiturowym i pomiarze absorbancji przy
długości fali O = 532 nm (PN-90/A-75101/25). Metoda ta ma
zastosowanie do próbek nie zawierających substancji tłuszczo-
wych i alkoholu.

– Metoda spektrofotometryczna polegająca na wywołaniu barwnej

reakcji pomiędzy kwasem sorbowym i rezorcyną w środowisku
alkalicznym i pomiarze absorbancji powstałego barwnego kom-
pleksu przy długości fali O = 420 nm. Metoda ta ma zastosowanie
w wypadku produktów o niskiej zawartości cukrów.

Lp.

Numer według

systemu

oznaczeń UE

Nazwa

w języku polskim

Nazwa

w języku angielskim

E 200

Kwas sorbowy

Sorbic acid

E 202

Sorbinian potasu

Potassium sorbate

E 203

Sorbinian wapnia

Calcium sorbate

E 210

Kwas benzoesowy

Benzoic acid

E 211

Benzoesan sodu

Sodium benzoate

E 212

Benzoesan potasu

Potassium benzoate

E 213

Benzoesan wapnia

Calcium benzoate

E 214

Ester etylowy kwasu

p-hydroksybenzoesowego

Ethyl p-hydroxybenzoate

E 215

Ester etylowy kwasu

p-hydroksybenzoesowego

– sól sodowa

Sodium ethyl

p-hydroxybenzoate

E 216

Ester propylowy kwasu

p-hydroksybenzoesowego

Propyl p-hydroxybenzoate

E 217

Ester propylowy kwasu

p-hydroksybenzoesowego

– sól sodowa

Sodium propyl

p-hydroxybenzoate

E 218

Ester metylowy kwasu

p-hydroksybenzoesowego

Methyl p-hydroxybenzoate

E 219

Ester metylowy kwasu

p-hydroksybenzoesowego

– sól sodowa

Sodium methyl

p-hydroxybenzoate

E 220

Bezwodnik kwasu

siarkawego (dwutlenek

siarki)

Sulphur dioxide

E 221

Siarczyn sodu

Sodium sulphite

E 222

Wodorosiarczyn sodu

Sodium hydrogen

sulphite

E 223

Pirosiarczyn sodu

Sodium metabisulphite

E 224

Pirosiarczyn potasu

Potassium

metabisulphite

E 226

Siarczyn wapnia

Calcium sulphite

E 227

Wodorosiarczyn wapnia

Calcium hydrogen

sulphite

E 228

Wodorosiarczyn potasu

Potassium hydrogen

sulphite

E 230

Bifenyl, difenyl

Biphenyl

E 231

Ortofenylofenol

Orthophenyl phenol

E 232

Sól sodowa

ortofenylofenolu

Sodium orthophenyl

phenol

E 234

Nizyna

Nisin

E 235

Natamycyna

Natamycin, Pimaricin

E 239

Heksametylenocztero-

amina

Hexamethylene tetramine

E 242

Dimetylodiwęglan

Dimethyl dicarbonate

E 249

Azotyn potasu

Potassium nitrate

E 250

Azotyn sodu

Sodium nitrite

E 251

Azotan sodu

Sodium nitrate

E 252

Azotan potasu

Potassium nitrate

E 280

Kwas propionowy

Propionic acid

E 281

Propionian sodu

Sodium propionate

E 282

Propionian wapnia

Calcium propionate

E 283

Propionian potasu

Potassium propionate

E 284

Kwas borny

Boric acid

E 285

Czteroboran sodu

(boraks)

Sodium tetraborate

(borax)

E 1105

Lizozym

Lysozyme

Tabela 1. Dozwolone substancje konserwujące.

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

/2006

Zawartość kwasu sorbowego można też oznaczyć po przepro-

wadzeniu ich w estry metylowe z wykorzystaniem chromatografii
gazowej lub bezpośrednio po ekstrakcji, wykorzystując wysokospraw-
ną chromatografię cieczową (HPLC), najczęściej w odwróconym
układzie faz.

Kwas benzoesowy i jego sole
W dawkach do 0,1% w środowisku kwaśnym (pH 2,0-4,5) wykazuje
on wyraźne działanie hamujące w stosunku do drożdży, pleśni i wielu
gatunków bakterii, przy czym bakterie mlekowe są mało wrażliwe na
kwas benzoesowy. Jego działanie konserwujące ma pochodzić z oddzia-
ływania na błonę komórkową oraz z inhibicyjnego wpływu na wiele
reakcji enzymatycznych, zwłaszcza wywoływanych przez dehydrogenazę
glukozowo-fosforanową i L-mleczanową.

Metody oznaczania kwasu benzoesowego:

1. Metoda spektrofotometryczna polega na ekstrakcji kwasu benzoeso-

wego zawartego w próbce przy użyciu eteru etylowego, reekstrakcji
alkalicznej tego kwasu, oczyszczeniu przez utlenianie zakwaszonym
roztworem dichromianu(VI) potasu i oznaczeniu spektrofoto-
metrycznym oczyszczonego kwasu przez scharakteryzowanie go
obecnością dwóch pików: przy długości fali O = 272 i 279 nm.

2. Metoda spektrofotometryczna polega na ekstrakcji kwasu ben-

zoesowego przy użyciu eteru etylowego, utworzeniu barwnego
kompleksu z hydroksyloaminą i pomiarze absorbancji przy długości
fali O = 533 nm.

3. Metoda miareczkowa polega na ekstrakcji kwasu benzoesowego

zawartego w próbce przy użyciu chloroformu, odparowaniu roz-
puszczalnika, rozpuszczeniu pozostałości w alkoholu etylowym
i miareczkowaniu alkoholowego roztworu kwasu benzoesowego

0,05 M roztworem wodorotlenku sodu w obecności fenoloftaleiny
jako wskaźnika.

4. Metoda spektrofotometryczna oznaczania kwasu p-hydroksyben-

zoesowego lub jego soli, polegająca na pomiarze absorbancji
różowoczerwonego kompleksu powstałego podczas reakcji
tego kwasu z odczynnikiem Millona (roztwór rtęci i kwasu
azotowego(V)).

5. Metody z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii cieczo-

wej, najczęściej w odwróconym układzie faz.

Estry kwasu p-hydroksybenzoesowego oraz ich sole sodowe
(parabeny)
Parabeny działają hamująco zarówno na rozwój bakterii, drożdży, jak
i pleśni. Szczególnie efektywne są w stosunku do pleśni. Działanie kon-
serwujące związane jest z oddziaływaniem na błonę cytoplazmatyczną
drobnoustrojów i wzrasta ze wzrostem długości łańcucha alkalicznego.
Parabeny są odporne na działanie tlenu z powietrza, a także niskie
i wysokie temperatury przetwarzania, łącznie ze sterylizacją. Mogą
być wykorzystywane do utrwalania żywności w środowisku kwaśnym
i lekko zasadowym (pH 3-8).

Metody oznaczeń opierają się głównie na wykorzystaniu wysoko-

sprawnej chromatografii cieczowej. Najczęściej stosuje się odwrócony
układ faz, a jako eluent stosuje się acetonitryl z wodą i kwasem octo-
wym, acetonitryl z octanem amonu lub metanol z wodą. Do detekcji
stosuje się najczęściej detektor UV.

Ditlenek siarki i siarczany(IV)
Działanie konserwujące SO

polega na zakłóceniu metabolizmu ko-

mórki i uszkodzeniu jej ścian komórkowych. Największą aktywność

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

/2006

wykazuje on w środowisku o pH <4 w formie niezdysocjowanego
kwasu siarkowego(IV). Hamuje działanie enzymów oksydoreduk-
cyjnych, lecz nie hamuje aktywności enzymów pektynolitycznych.
Ditlenek siarki zapobiega rozwojowi szczególnie bakterii mlekowych
i octowych. Silniej działa na pleśnie niż na drożdże, zwłaszcza
szlachetne, dlatego jest stosowany w winiarstwie. Metody iznaczeń
tego związku:
1. Metoda jodometryczna (wg PN-90/A-75101/23) – polega na

bezpośrednim miareczkowaniu badanej próbki roztworem
jodu w obecności skrobi jako wskaźnika. Metoda ta może być
stosowana do roztworów bezbarwnych lub słabo zabarwionych,
nie zawierających innych substancji redukujących jod (kwas
L-askorbinowy, jony S

, CN

). W celu oznaczenia wolnego SO

miareczkuje się bezpośrednio wolny zakwaszony wyciąg próbki
i zachodzi wówczas reakcja:

+ 2 H

O + I

= H

+ 2 HI

Aby oznaczyć ilość związanego SO

, alkalizuje się środowisko

w celu rozłożenia formy związanej, a następnie zakwasza się je
i ponownie miareczkuje mianowanym roztworem jodu. Na pod-
stawie wyników oznaczenia SO

wolnego i związanego oblicza się

całkowity.

2. Metoda destylacyjna (wg PN-90/A-75101/23) – jest stosowana

w przypadku próbek mocno zabarwionych lub zawierających inne
reduktory i polega na oddestylowaniu SO

z mocno zakwaszonego

środowiska, w atmosferze CO

, i oznaczeniu SO

w destylacie

poprzez miareczkowanie jodem.

3. Metoda potencjometryczna – polegająca na zastosowaniu ogniwa

składającego się z dwóch elektrod platynowych, spolaryzowanych
prądem stałym i połączonych z pehametrem jako detektorem
punktu końcowego miareczkowania z jodem.

Azotany(III) i (V)
Azotan(III) potasu jest substancją peklującą, nadającą przetworom
mięsnym charakterystyczne różowoczerwone zabarwienie, a jed-

nocześnie zapobiegającą rozwojowi niektórych drobnoustrojów.
Azotany(III) działają w zasadzie tylko na bakterie, a nie hamują
rozwoju drożdży i pleśni. Skuteczność działania antybakteryjnego
wzrasta z obniżeniem pH środowiska. Oprócz utrwalania barwy
praktyczne znaczenie azotanów(III) w przetwórstwie mięsa polega
na hamowaniu rozwoju bakterii Clostridium botulinum, które
wytwarzają bardzo silne trujące toksyny. U małych dzieci azota-
ny(III) mogą powodować zaburzenia w wymianie tlenowej krwi
(methemoglobinemia). W przewodzie pokarmowym mogą tworzyć
N-nitrozoaminy i inne połączenia N-nitrozowe, które są podejrzane
o działanie nowotworowe.

Metody oznaczania azotanów(V):

1. Metody spektrofotometryczne:

a) metoda z difenyloaminą w środowisku H

, gdzie wskutek

reakcji powstają niebiesko zabarwione sole difenylobezydyny;

b) reakcja z dimetoksystrychniną (brucyną) w środowisku H

dająca czerwono zabarwione produkty.

2. Miareczkowanie potencjometryczne lub konduktometryczne, wyko-

rzystujące reakcję z nitronem (silna zasada organiczna otrzymana
z trifenyloaminoguanidyny), polega na niespecyficznym strącaniu
azotanów(V).
Jednak azotany(V) najczęściej poddaje się redukcji do azotanów(III)

za pomocą kolumny wypełnionej kadmem albo bezpośrednio używając
soli kadmu bądź też wykorzystując enzymy.

Metody oznaczania azotanów(III):

1. Metody spektrofotometryczne – wykorzystują barwne po-

łączenia grupy -NO

, która jest chromoforem ze związkami

organicznymi:
a) metoda Griessa – polega na reakcji z roztworem kwasu

sulfanilowego w kwasie solnym lub octowym i roztworem
chlorowodorku N-(1-naftylo)etylenodwuaminy. Powstający
kompleks ma czerwone zabarwienie, a pomiaru absorbancji
dokonuje się przy długości fali O = 538 nm (wg PN-92/A-
-75112);

b) metoda z dimetyloaniliną, dającą żółto zabarwiony roztwór

p-nitrozodimetyloaniliny;

Nazwa substancji

Przykłady zastosowań

Kwas sorbowy i jego sole

Napoje mleczne, sery twarde i topione, sosy sałatkowe, pasty, margaryna,

koncentraty zup, przetwory rybne, sałatki owocowe, galaretki, owoce

kandyzowane, słodycze, nadzienia cukiernicze, napoje bezalkoholowe, wina

Kwas benzoesowy i jego sole,

ester etylowy, propylowy i metylowy kwasu p-hydroksybenzoesowego oraz jego sole

Pulpy i przeciery owocowe, soki owocowe, dżemy, sosy, marynaty, marynaty rybne,

konserwy rybne, margaryna, oliwki, piwo, syropy, napoje bezalkoholowe, jogurty,

tłuszcze cukiernicze, dania barowe

Ditlenek siarki, siarczan(IV) sodu, wodorosiarczan(IV) sodu, disiarczan(IV)

sodu, disiarczan(IV) potasu, siarczan(IV) wapnia, wodorosiarczan(IV) wapnia,

wodorosiarczan(IV) potasu

Pulpy i soki owocowe, owoce i warzywa suszone, dżemy, sałatki owocowe

i warzywne, syropy skrobiowe, wina, napoje bezalkoholowe, skorupiaki i głowonogi

Difenyl, o-fenylofenol,

o-fenylofenolan sodu

Ochrona owoców cytrusowych przed pleśnieniem

Nizyna

Puddingi z semoliny i tapioki, sery dojrzewające i topione, mascarpone

Natamycyna

Powierzchnia serów i kiełbas suszonych i peklowanych

Heksametylonotetraamina

Ser Provolone

Ester dimetylowy kwasu pirowęglowego

Napoje orzeźwiające i owocowe, płynny koncentrat herbaty

Azotan(III) potasu, azotan(III) sodu

Peklowane konserwy mięsne, konserwy mięsne w puszkach

Azotan(V) sodu, azotan(V) potasu

Peklowane produkty mięsne, sery, śledzie i szprotki marynowane w occie

Kwas propionowy i jego sole

Pieczywo i wyroby ciastkarskie, sery i substytuty serów dojrzewających (wyłącznie

na powierzchnię)

Tabela 2. Substancje konserwujące i ich zastosowanie.

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

/2006

c) metoda z chlorowodorkiem 2-etoksy-6,9-dwuaminoakrydyny (riwa-

nolem) – podczas reakcji powstaje kompleks o pomarańczowym
zabarwieniu. Pomiaru absorbancji dokonuje się przy długości fali
O = 580-600 nm.

2. Metody potencjometryczne – wykorzystujące słabe zdolności utle-

niające jonów azotanowych(III) w środowisku kwaśnym w reakcji
z jodem:

2 NO

+ 2 I

+ 4 H

= I

+2 NO +2 H

a) miareczkowanie potencjometryczne (w układzie elektroda

platynowa/elektroda kalomelowa) lub miareczkowanie poten-
cjometryczne strąceniowe;

b) miareczkowanie biamperometryczne w układzie dwóch spolary-

zowanych elektrod platynowych;

c) metoda polegająca na utlenianiu azotanów(III) do azotanów(V)

octanem ołowiu(IV) w środowisku 1 M roztworu chlorku sodu,
a następnie miareczkowanie potencjometryczne z punktem koń-
cowym przy ok. 795 mV.

3. Metody chromatograficzne:

a) metoda wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC)

z zastosowaniem kolumny jonowymiennej (wg Europejskiego
Komitetu Normalizacyjnego – CEN);

b) metoda wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC)

w odwróconym układzie faz (kolumna RP8) z detekcją UV przy
długości fali O = 205 nm.

Podsumowanie

Stosowanie substancji dodatkowych w procesie produkcji żywności,
a także w przemyśle farmaceutycznym i kosmetycznym podyktowane
jest wieloma względami. Jednak zawsze ma na celu podniesienie jakości
produktu, jego atrakcyjności sensorycznej bądź zapewnienie prawidło-
wości procesów technologicznych i przechowalniczych. Dopuszczone
do użytku substancje konserwujące są bezpieczne dla ogółu populacji
pod warunkiem, że są stosowane zgodnie z obowiązującymi uregulo-
waniami prawnymi i zgodnie z Dobrą Praktyką Produkcyjną.

Piśmiennictwo
1. ChromCircle, Applications Products IUPAC Tips, Merck, 1997.
2. Fortuna T., Juszczak L., Sobolewska-Zielińska J.: Podstawy analizy

żywności, skrypt do ćwiczeń. Wydawnictwo AR w Krakowie, Kraków
2003.

3. Gajda J., Karłowski K., Jarecka J., Świtka A., Kuma K., Rokicka B.:

Substancje dodatkowe do żywności w świetle zmian krajowego
ustawodawstwa żywnościowego. „Przemysł Spożywczy”, 2003, 3,
8-10.

4. Gajda J.: Krajowe przepisy dotyczące substancji dodatkowych do

żywności po wejściu Polski do UE. „Przemysł Spożywczy”, 2004,
6, 20-21, 33.

5. Kołakowski E.: Substancje konserwujące żywność. Część I. „Prze-

mysł Spożywczy”, 2000, 4, 46-52.

6. Kołakowski E.: Substancje konserwujące żywność. Cz. II. Stosowa-

nie konserwantów w świetle prawa żywnościowego w Polsce i Unii
Europejskiej. „Przemysł Spożywczy”, 2000, 5, 39-41.

7. Pijanowski E., Dłużewski M., Dłużewska A., Jarczyk A.: Ogólna

technologia żywności. WNT, Warszawa 1997.

8. PN-90/A-75101/23: Przetwory owocowe i warzywne. Przygotowanie

próbek i metody badań fizykochemicznych. Oznaczenie zawartości
dwutlenku siarki.

9. PN-90/A-75101/24: Przetwory owocowe i warzywne. Przygotowanie

próbek i metody badań fizykochemicznych. Oznaczenie zawartości
kwasu benzoesowego.

10. PN-90/A-75101/25: Przetwory owocowe i warzywne. Przygotowanie

próbek i metody badań fizykochemicznych. Oznaczenie zawartości
kwasu sorbowego.

11. PN-90/A-79120/10: Wina i miody pitne. Przygotowanie próbek

i metody badań fizykochemicznych. Oznaczenie zawartości dwu-
tlenku siarki (SO

12. PN-92/A-75112: Owoce, warzywa i ich przetwory. Oznaczanie

zawartości azotanów i azotynów.

13. Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 20 kwietnia 2005 r.

zmieniające Rozporządzenie w sprawie dozwolonych substancji
dodatkowych i substancji pomagających w przetwarzaniu (Dz.U.
nr 79, poz. 693).

14. Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 23 kwietnia 2004 r.,

w sprawie dozwolonych substancji dodatkowych i substancji po-
magających w przetwarzaniu (Dz.U. nr 94, poz. 933).

15. Rutkowski A, Gwiazda S., Dąbrowski K.: Dodatki funkcjonalne

do żywności. Agro& Food Technology, Katowice 1993.

16. Rutkowski A., Gwiazda S., Dąbrowski K.: Kompendium dodatków

do żywności. Hortimex, Konin 2003.

17. Saad B., Bari M.F., Saleh M.I., Ahmad K., Talib M.K.M.: Simultaneous

deterination of preservative (benzoc acid, sorbic acid, methylparaben
and propylparaben) in foodstuffs using high-performance liquid
chromatography. “J. Chrom. A.”, 2005, 1073, 1-2, 393-397.

18. Sikorki Z. (red.): Chemia żywności. Skład, przemiany i właściwości

żywności. WNT, Warszawa 2000. Tabela 1. Dozwolone substancje
konserwujące.

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

/2006

Na atrakcyjność produktów spożywczych wpływa wiele czynników,
z których istotne znaczenie ma smakowitość. Smak słodki jest
szczególnie pożądany i akceptowany przez konsumentów. Wiele
produktów uzyskuje słodki smak dzięki dodatkom specjalnych
substancji. Najpowszechniej stosowanym związkiem jest sacharoza,
która, obok nadawania produktom słodkiego smaku, pełni szereg
funkcji technologicznych:
–  wpływa na kształtowanie właściwości reologicznych,
–  w wyższych stężeniach działa konserwująco,
–  stabilizuje substancje aromatyczne,
–  wpływa na barwę produktów,
–  bierze udział w żelowaniu niektórych polisacharydów.

Sacharoza wykazuje jednak również niekorzystne działanie na

organizm człowieka: jest jedną z przyczyn nadwagi i otyłości, a co
za tym idzie – innych chorób cywilizacyjnych oraz jest czynnikiem
powodującym próchnicę zębów.

Oprócz sacharozy w przetwórstwie żywności wykorzystuje się:

– monosacharydy (glukoza, fruktoza);
– disacharydy (maltoza, laktoza, trehaloza), które charakteryzuje niższa

słodkość niż sacharozę;

– cukier inwertowany, otrzymany w wyniku hydrolizy sacharozy,
– syrop fruktozowy, otrzymywany przez enzymatyczną izomeryzację

glukozy;

– produkty hydrolizy skrobi (glukoza krystaliczna, syropy o róż-

nym stopniu scukrzenia: glukozowe i glukozowo-fruktozowe,
maltozowe).
Ważną grupą substancji stosowanych w przetwórstwie żywności

są alditole (poliole) – wielowodorotlenowe alkohole cukrowe (ta-
bela 1, s. 32). Otrzymywane są na drodze redukcji cukrów w tem-
peraturze 100-200

C, pod ciśnieniem 40-50 atm i uwodornienia.

Poszczególne związki należące do tej grupy różnią się znacznie
swoimi właściwościami (głównie rozpuszczalnością oraz stopniem

słodyczy). Ich słodkość jest mniejsza niż ich prekursorów i dlatego
stosowane są jako wypełniające substancje słodzące. Często są
stosowane razem z mono- i disacharydami, a także z substancjami
intensywnie słodzącymi. W wielu produktach pełnią rolę czynnika
kształtującego właściwą teksturę i zastępują sacharozę, obniżając
wartość kaloryczną. Alditole są odporne na niskie pH, wykazują
niską reaktywność w procesie nieenzymatycznego ciemnienia, za-
pobiegają krystalizacji sacharozy, nie zwiększają poziomu glukozy
we krwi i w niewielkim stopniu ulegają fermentacji alkoholowej
i wchłanianiu w jelicie cienkim przewodu pokarmowego. Jako
dozwolone substancje dodatkowe nie wymagają limitowania, a ich
dodatek w trakcie procesu technologicznego jest determinowany
zasadami dobrej praktyki produkcyjnej.

Substancje intensywnie słodzące

Substancje intensywnie słodzące, syntetyczne lub pochodzenia
naturalnego charakteryzują się kształtowaniem wysokiego odczucia
słodyczy przy niemal całkowitym braku wartości kalorycznej. Są
przeznaczone do stosowania do produkcji słodzików stołowych,
żywności przeznaczonej dla diabetyków oraz produktów niskoka-
lorycznych. Stosuje się je w wytwarzaniu: napojów bezalkoholo-
wych, deserów, wyrobów cukierniczych, gumy do żucia, napojów
alkoholowych oraz przetworów owocowych i warzywnych. Wykaz
substancji intensywnie słodzących oraz ich maksymalne dawki re-
guluje Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 23 kwietnia 2004 r.
w sprawie dozwolonych substancji dodatkowych i substancji
pomagających w przetwarzaniu (Dz.U. 2004, nr 94, poz. 933 wraz
z późniejszymi zmianami). Zgodnie z tym rozporządzeniem sub-
stancji słodzących nie wolno stosować w środkach spożywczych
dla niemowląt i małych dzieci. Podstawowe informacje dotyczące
substancji intensywnie słodzących, które można stosować w Polsce,
zestawiono w tabeli 2 (s. 33).

dr inż. Lesław Juszczak

Katedra Analizy i Oceny Jakości Żywności

Akademia Rolnicza w Krakowie

Streszczenie
Żywność oraz napoje o zredukowanej wartości energetycznej
są popularnymi środkami spożywczymi w Europie oraz w Sta-
nach Zjednoczonych. Substancje intensywnie słodzące służące
do jej produkcji są dodatkami do żywności, które w znacznym
stopniu przyciągają uwagę konsumentów. Obecnie w Polsce do
stosowania w przemyśle spożywczym dopuszczonych jest osiem
niskokalorycznych substancji słodzących. W produkcji żywności
stosowane są również różne alkohole cukrowe. Wykorzystanie
tych substancji jako dodatków do żywności wymaga posiadania
przez laboratoria kontrolne odpowiednich metod i procedur ana-
litycznych. W pracy dokonano przeglądu substancji słodzących, ze
szczególnym uwzględnieniem substancji niskokalorycznych oraz
metod analitycznych używanych do ich oznaczania.

Summary
Reduced-sugar foods and beverages are very popular in Europe
and US, and the sweeteners that make them possible are among
the most conspicuous ingredients in the food supply. In Poland
eight low-calorie sweeteners are currently approved for use in
food industry. A variety of sugar alcohols are also accepted for
food processing. Utilization of these substances as food additives
requires having adequate testing methods and procedures by
inspection laboratories. In the paper, a review of sweeteners, with
a special consideration of low-calorie sweeteners, and analytical
methods used for its analysis, was carried out.

Słowa kluczowe
niskokaloryczne substancje słodzące, metody analityczne

Key words
low-calorie sweeteners, analytical methods

Substancje słodzące

i metody ich oznaczania

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

/2006

Acesulfam K

Został odkryty w 1967 roku. Otrzy-
mywany jest jako pochodna kwasu
acetylooctowego. Jest on odporny na
ogrzewanie (pasteryzacja, sterylizacja)
oraz stabilny w pH 3-7. Szybko wywo-
łuje odczucie smaku słodkiego, które
jednak dosyć szybko zanika. W niskich
stężeniach nie pozostawia gorzkiego

i metalicznego posmaku. Wykazuje synergizm smakowy z aspartamem
oraz cyklaminianami i taumatyną. Często stosowany jest z poliolami
(np. sorbitolem), dając słodycz zbliżoną do sacharozy. Acesulfam K jest
prawie całkowicie wchłaniany w przewodzie pokarmowym i następnie
wydalany w niezmienionej postaci. Nie kumuluje się w organizmie
i nie jest metabolizowany przez bakterie jelitowe.

Aspartam

Dipeptyd (ester metylowy L-asparagino-L-fenyloalaniny) został
wynaleziony w 1965 roku. Jest słabo rozpuszczalny i mało stabilny
w roztworach wodnych i alkoholowych. Nie pozostawia gorzkiego
posmaku i wykazuje synergizm smakowy z sacharyną, acesulfa-
mem K i cyklaminianami. Kaloryczność aspartamu, podobnie jak
białek, wynosi 4 kcal/g, ale ze względu na dużą słodkość jest on
stosowany w niewielkich dawkach, dlatego traktowany jest jako
substancja bezkaloryczna. Zasadniczą wadą aspartamu jest jego
niska odporność na działanie podwyższonej temperatury i kwa-
śnego środowiska. W skrajnych warunkach ulega przemianom,
powodującym powstawanie diketopiperazyny, która uważana jest
za związek szkodliwy. W przewodzie pokarmowym aspartam jest
hydrolizowany do kwasu asparaginowego i estru metylowego fe-
nyloalaniny, z którego powstaje metanol i fenyloalanina. Dlatego
produkty z dodatkiem aspartamu nie powinny być stosowane przez
osoby chore na fenyloketonurię.

Kwas cyklaminowy (cykloheksylosulfaminowy) i jego sole: K, Ca

Został odkryty w 1937 roku.
Jest produktem syntezy cy-
kloheksyloaminy i kwasu
aminosulfonowego. Jest ła-
two rozpuszczalny w wodzie

oraz odporny na podwyższoną temperaturę i zmiany pH. Podczas
ogrzewania w środowisku silnie kwaśnym może ulegać hydroli-
zie, tracąc swą słodkość. W wyższych stężeniach wykazuje smak
słodkawo-kwaśny i posmak metaliczny. Działa synergistycznie
z sacharyną, modyfikując jej metaliczny posmak. W latach 60. i 70.
liczne badania wykazywały jego rakotwórczość i embriotoksycz-
ność, co spowodowało usunięcie go z listy substancji stosowanych
w produkcji żywności. Weryfikacja wyników badań w latach 90.
spowodowała ponowne wprowadzenie go do wykazu dozwolonych
substancji dodatkowych.

Sacharyna i jej sole (K, Na, Ca)

Została odkryta w 1879 roku. Jest imidem
kwasu o-sulfobenzoesowego, otrzymywanym
na bazie toluenu i kwasu ftalowego. Rozpusz-
czalność sacharyny w wodzie zależy od formy
– sól sodowa jest znacznie bardzie rozpusz-
czalna w porównaniu do czystej sacharyny.
Sacharyna jest odporna na temperaturę

i stabilna w roztworach o pH 2-7. Nie jest metabolizowana w organizmie,
a synergizm smakowy wykazuje z aspartamem i cyklaminianami. Sacharyna
stosowana pojedynczo pozostawia gorzko-metaliczny posmak (wyczuwalny
przez 25% populacji), który nasila się wraz ze wzrostem stężenia. Stąd
stosowana jest z substancjami maskującymi (leucyna, glicyna) oraz z cykla-
minianami, aspartamem lub sucralozą. Przez wiele lat sacharynę uważano
za substancję potencjalnie niebezpieczną i rakotwórczą, jednak obecnie
jest dopuszczona do stosowania w przemyśle spożywczym.

Taumatyna

Jest polipeptydem zbudowanym z 207 aminokwasów. Otrzymuje się
ją z owoców zachodnioafrykańskiej rośliny z rodziny Thaumatococcus
danieli Benth. Dobrze rozpuszcza się w wodzie. Nie wykazuje metalicz-
nego posmaku i jest stabilna w roztworach o pH 2-6. Charakteryzuje
się ograniczoną odpornością na ogrzewanie, szczególnie w roztworach
o pH > 6. Działa synergistycznie z innymi substancjami intensywnie
słodzącymi, maskując ich gorzkawo-metaliczny posmak.

Neohesperydyna DC

Jest dichlorochalkonem otrzymywanym na drodze uwodorniania
flawonoidów (głównie neohesperydyny), występujących naturalnie
w niektórych owocach cytrusowych (np. w gorzkich pomarańczach).
Jest stosunkowo odporna na podwyższoną temperaturę i stabilna w roz-
tworach o pH 1-7. Wykazuje silne działanie synergistyczne z innymi
składnikami żywności, poprawiając zapach i smak wielu produktów.
Jej słodki smak z chłodzącą mentolową nutą utrzymuje się stosunkowo
długo. W przewodzie pokarmowym jest wchłaniana w niewielkim
stopniu, jednak metabolizowana jest przez florę bakteryjną.

fot. Shutt

ock

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

/2006

Sukraloza (trichlorogalaktosacharoza)

Została odkryta w 1976 roku. Otrzymywana jest w procesie selek-
tywnego chlorowania sacharozy. Dobrze rozpuszcza się w wodzie
i alkoholu. Odporna na działanie podwyższonej temperatury, niskiego
pH, a także podwyższonego ciśnienia. Wykazuje synergizm z innymi
substancjami słodzącymi.

Sól aspartamu i acesulfamu

Otrzymywana jest przez ogrzewanie aspartamu i acesulfamu K w stosunku
około 2:1 w roztworze o odczynie kwaśnym, a następnie poprzez krystali-
zację. Tak otrzymany produkt jest bardziej stabilny niż sam aspartam.

Alitam

Jest dipeptydem otrzymywanym syntetycznie na bazie kwasu L-aspara-
ginowego i D-alaniny. Jest około dwa tysiące razy słodszy od sacharozy,
a ADI dla niego wynosi 0-1 mg/kg m.c. Dobrze rozpuszcza się w wodzie
i alkoholu. W środowisku obojętnym odporny na temperaturę, natomiast
mało stabilny w środowisku kwaśnym i zasadowym. Charakteryzuje się
smakiem bardzo zbliżonym do sacharozy. Alitam jest dopuszczony do
stosowania w Australii, Nowej Zelandii, Meksyku oraz w Chinach.

Dulcyna (p-fenetylokarbamid)

Związek otrzymany na bazie fenacetyny i mocznika. Słabo rozpusz-
czalny w wodzie i 70-350 razy słodszy od sacharozy. Był powszechnie
stosowany w pierwszej połowie XX wieku. Obecnie nie stosowany
w przetwórstwie żywności ze względu na udowodnione działanie
rakotwórcze i embriotoksyczne.

Glycyrricina

Jest tripentenem glikozydowym otrzymywanym z soku korzeni lukrecji
(Glycyrrhiza glabra). Jest pięćdziesiąt razy słodsza od sacharozy. Charak-
teryzuje się posmakiem słodkawo-gorzkawym. Znajduje ograniczone
zastosowanie ze względu na silny posmak lukrecji. Stosowana jest
w Japonii do produktów sojowych, a także aromatyzacji tytoniu.

Neotam

Jest syntetycznie otrzymanym dipeptydem na bazie kwasu asparaginowego
i fenyloalaniny o ADI = 2 mg/kg m.c. Neotam jest 7-8 tysięcy razy słodszy
od sacharozy. Dobrze rozpuszcza się w wodzie i wykazuje synergizm
smakowy z sacharyną. Dopuszczony do stosowania w Australii, Nowej
Zelandii, Chinach, Rosji, Meksyku, USA i w Ameryce Południowej.

P-4000 (ester n-propylowy 2 amino-4-nitrofenolu)

Substancja wycofana ze stosowania ze względu na działanie toksyczne.

Stewiozyd (Stevia)

Jest naturalną substancją uzyskiwaną z roślin Stevia rebaudiana Bertoni,
rosnących głównie w Paragwaju. Czysty stewiozyd charakteryzuje się
ograniczoną rozpuszczalnością w wodzie. Natomiast produkt handlo-
wy o nazwie Stevia wykazuje dużą rozpuszczalność i różny stopień
czystości. Jest odporny na działanie kwasów i enzymów. Degradacji
ulega w środowisku silnie zasadowym. Wykazuje synergizm z asparta-
mem, acesulfamem oraz cyklaminianami. Stosowany jest w Paragwaju,
Brazylii, Japonii, Chinach i Korei Południowej.

Ze względu na większe bezpieczeństwo oraz preferencje i akceptacje
konsumenckie syntetyczne środki słodzące próbuje się zastępować
naturalnymi. Prowadzone są badania nad możliwością wykorzystania
niektórych białek roślinnych jako naturalnych substancji słodzących

oraz modyfikatorów smaku. Przykładami mogą być: monellina (słodkość
1500-3000), pentadyna (słodkość 500) oraz curculina (słodkość 9000).

Metody stosowane w wykrywaniu
i oznaczaniu substancji
intensywnie słodzących

Metody klasyczne

Najlepszym przykładem jest tu wagowa metoda oznaczania sacharyny
w preparacie słodzącym zawierającym jako wypełniacz wodorowęglan
sodu. Sacharynę ekstrahuje się z próbki za pomocą eteru, a po odparo-
waniu oznaczenie wykonuje się wagowo. Obecność dulcyny w żywności
można wykrywać na podstawie barwnych reakcji pozostałości po ekstrak-
cji eterem etylowym i reakcji z kwasem azotowym(V) (pomarańczowe za-
barwienie) lub siarkowym(VI) – zabarwienie czerwone. Neohesperydynę
można wykryć w barwnej reakcji z tetrahydroboranem sodu. Znane są
również metody miareczkowe, których przykładem może być oznaczanie
kwasu cyklaminowego poprzez rozdział na kolumnie jonowymiennej,
z której jest on eluowany kwasem solnym, a całość jest miareczkowana
azotanem(III) sodu. Inna procedura dla kwasu cyklaminowego przewi-
duje usunięcie siarczanów za pomocą azotanu(III) sodu w obecności
chlorku baru, którego nadmiar miareczkuje się EDTA.

Metody spektrofotometryczne

Klasycznym przykładem wykorzystania spektrofotometrii w oznaczaniu
dulcyny w napojach jest pomiar absorbancji przy długości fali λ = 294 nm
po wcześniejszej ekstrakcji octanem etylu. Natomiast dla P-4000 stosuje
się eter naftowy. W przypadku słodzików stołowych zawartość sacharyny
można oznaczyć po rozpuszczeniu próbki w wodorotlenku sodu i po-
miarze absorbancji przy λ = 265 nm (Polska Norma PN-EN 1376:1999).
Zawartość sacharyny w gumach do żucia można oznaczyć po ekstrakcji
chloroformem i pomiarze absorbancji roztworu wodnego przy λ = 235 lub
234 nm. Pomiary spektrofotometryczne często poprzedzane są chemiczną
lub enzymatyczną derywatyzacją analitu. W przypadku aspartamu wykorzy-
stuje się reakcje z 1,4-dioksanem, dimetyloformamidem oraz p-chloranilem,
a absorbancję mierzy się przy λ = 520 nm. W innej metodzie aspartam
ekstrahuje się węglanem propylenu, a następnie przeprowadza reakcję
z ninhydryną, p-benzochinonem lub dietyloditiokarbaminianem sodu
i mierzy absorbancję przy λ = 585 nm. Aspartam można również oznaczyć,
hydrolizując go α-chmotrypsyną między innymi do metanolu, który utlenia
się za pomocą oksydazy alkoholowej do formaldehydu, dającego kompleks
z fluoranem-P. Pomiaru absorbancji dokonuje się przy λ = 410 nm. Spektro-
fotometryczną metodę oznaczania acesulfamu-K w preparatach słodzących
podaje Polska Norma PN-EN 1377:1999. Metoda polega na rozpuszczeniu
próbki badanego preparatu w wodzie i oznaczeniu acesulafmu-K przez
pomiar absorbancji przy λ = 277 nm. Spektrofotometryczne oznaczanie
cyklaminianów w napojach, dżemach oraz deserach można przeprowadzić
na skutek działania chloranów(I), ekstrakcji heksanem lub cykloheksanem

Nazwa

wg UE

Słodkość w stosunku

do sacharozy*

Kaloryczność

[kcal/g]

Sorbitol i syrop sorbitolowy

E 420

0,5-0,6

2,6

Mannitol

E 421

0,5-0,6

1,6

Izomalt E

953

0,4-0,5

2,0

Maltitol i syrop maltitolowy

E 965

0,6-0,9

2,1

Laktitol

E 966

0,3-0,5

2,0

Ksylitol

E 967

ok. 1

2,4

Tabela 1. Alditole (poliole) stosowane w przetwórstwie żywności.
* sacharoza = 1

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

/2006

oraz pomiaru absorbancji przy λ = 314 nm. Inną techniką jest hydroliza
kwasu cyklaminowego do cykloaminy przy pomocy np. kwasu solnego
w podwyższonej temperaturze, a następnie reakcji z 1,4-benzochinonem.
Jeszcze innym sposobem jest przeprowadzenie N-nitrozowania kwasu cy-
klaminowego za pomocą kwasu azotowego(III) i pomiar jego pozostałości
na drodze reakcji z safraniną. Kwas cyklaminowy można również oznaczyć
na drodze spektrofotometrycznego miareczkowania azotanem(III) sodu.
Zawartość glycyrriciny można analizować, hydrolizując ją do aglikonu, który
po ekstrakcji oznacza się spektrofotometrycznie. Oznaczenie zawartości
sacharyny w napojach można oprzeć na jej reakcji z fenotiaziną i octanem
miedzi(II) i następnie ekstrakcji heksanem. Substancje słodzące o charak-
terze anionowym mogą być również oznaczane spektrofotometrycznie
poprzez reakcje z barwnikami (safraniną, azurytem, błękitem nilowym,
oranżem akrydynowym oraz fuksyną).

Metody chromatograficzne

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest obecnie
jedną z najczęściej wykorzystywanych metod w analizie substancji
słodzących. Jej dużą zaletą jest możliwość równoczesnego oznaczania
wielu składników: mieszanin środków słodzących, substancji słodzących
i przeciwutleniaczy, konserwantów, alkaloidów oraz syntetycznych
barwników. Najczęściej stosowane procedury wykorzystują odwrócony
układ faz (RP) z kolumnami typu C18 (czasem C8), o wielkości ziaren
wypełnienia 5-10 µm i długości 250 mm. W tym przypadku tempera-
tura ma niewielki wpływ na rozdział składników i najczęściej kolumnę
termostatuje się w 25

C. Wykazano także, że temperatura kolumny

może być podniesiona (30-50

C), co pozwala na obniżenie ciśnienia.

Jako rozpuszczalniki, zarówno w elucji izokratycznej, jak i gradientowej,
stosowane są: woda, kwas o-fosforowy, cytrynowy i octowy lub ich sole,
z acetonitrylem, metanolem lub 2-propanolem jako organicznymi mo-
dyfikatorami. Istotne znaczenie ma również pH fazy ruchomej, które
najczęściej wynosi od 3 do 4,5, a czasami 6-7, i jest kontrolowane poprzez
odpowiednie bufory. Sposób detekcji uzależniony jest od natury analizo-
wanych związków. Najczęściej stosuje się detekcję spektrofotometryczną
UV przy λ = 254 nm, 210 nm lub 200 nm. Przykładem oznaczania
zawartości aspartamu za pomocą RP-HPLC jest procedura opisana w Pol-
skiej Normie PN-A-79039:1996. Przewiduje ona rozdział na kolumnie
RP-18 przy zastosowaniu acetonitrylu i buforu fosforanowego (12:88)
i detekcję przy długości fali λ = 200 nm. Do równoczesnego oznaczenia
aspartamu, acesulfamu K i sacharyny można również wykorzystać elucję
mieszaniną acetonitrylu i buforu fosforanowego (10:90) oraz pomiar
absorbancji przy λ = 220 nm. Równoczesne oznaczenie zawartości cy-
klaminianów i sacharyny może być wykonane zgodnie z Polską Normą
PN-EN 1379:1999 przy zastosowaniu mieszaniny diwodoroortofosfora-
nu(V) potasu z metanolem (70:30) oraz przez pomiar absorbancji przy
λ = 265 nm. Procedurę oznaczania zawartości acesulfamu K, aspartamu
i sacharyny w artykułach żywnościowych opisuje także norma PN-EN

12856:2002, a cyklaminianu – PN-EN 12857:2002. Opracowane są
również procedury detekcji UV przy zmiennej długości fali oraz z wy-
korzystaniem detektora fluorescencyjnego, refraktometrycznego (RI),
elektrochemicznego lub spektrometru masowego. W przypadku gdy
detekcja UV nie daje dobrych rezultatów (np. cyklaminiany), można za-
stosować derywatyzację przed- lub postkolumnową. Dla cyklaminianów
przewiduje się utlenianie i reakcję np. z 4-fluoro-7-nitrobenzofuranem.
Innym przykładem takiego postępowania jest reakcja po rozdziale chro-
matograficznym aspartamu z ninhydryną. Ponieważ niektóre substancje
intensywnie słodzące występują w roztworach w formie anionowej, ich
rozdział może odbywać się zgodnie z mechanizmem wymiany jonowej.
Stąd chromatografia jonowa może być alternatywą dla RP-HPLC ze
względu na zastosowanie znacznie tańszych eluentów. Opracowanych
jest wiele procedur oznaczania sacharyny, cyklaminianów, sukralozy
oraz aspartamu, jak również ich mieszanin. W tych przypadkach
stosuje się również detekcję konduktometryczną i amperometryczną.
Istnieją również metody HPLC stosowane do oznaczania produktów
degradacji substancji słodzących, co ma duże znaczenie w przypadku ich
potencjalnej toksyczności. Opracowane są także procedury oznaczania
stereoizomerów aspartamu z wykorzystaniem różnych chiralnych faz
stacjonarnych lub ruchomych. Również zespolenie wysokosprawnej
chromatografii cieczowej (RP-HPLC) ze spektrometrem masowym
wyposażonym w termiczne rozpylanie pozwala na rozdział stereoizo-
merów aspartamu.

Chromatografia gazowa (GC) znajduje bardzo ograniczone za-

stosowanie w analizie substancji intensywnie słodzących ze względu
na niską lotność ich analitów oraz trudności w ich selektywnym prze-
prowadzeniu w lotne pochodne. Opracowano jednak kilka procedur
do oznaczania substancji słodzących, ich produktów rozkładu oraz
zanieczyszczeń, które mogą im towarzyszyć. Przykładem może być
tutaj oznaczanie zawartości sacharyny po N-metylacji za pomocą
diazometanu lub silanizacji. Metylacja może być również zastosowana
do derywatyzacji cyklaminianów po ich ekstrakcji octanem etylu.
Inną metodą jest reakcja cyklaminianów z azotanami(III) w obecności
kwasu solnego. W przypadku aspartamu proponuje się zastosowanie
pirolitycznej chromatografii gazowej ze spektrometrią masową.

Chromatografia planarna, a głównie cienkowarstwowa (TLC),

znajduje zastosowanie w analizie substancji intensywnie słodzących ze
względu na niskie koszty zakupu niezbędnego wyposażenia. W przy-
padku aspartamu można wykorzystać mieszaninę n-butanol/kwas
octowy/woda oraz reakcję z ninhydryną. Dla acesulfamu-K, sacharyny
i kwasu cyklaminowego stosuje się rozdział na żywicy poliamidowej
i reakcję z 2,7-dichlorofluoresceiną. Innym przykładem jest rozdział
kwasu cyklaminowego i sacharyny za pomocą mieszaniny n-butanol/
kwas octowy/woda oraz reakcji z kwasem ftalowym i aniliną. Dalsza
elucja analitów za pomocą kwasu octowego pozwala na ich ozna-
czenie spektrofotometryczne. Do rozdziału cyklaminianów, dulcyny

Nazwa

Nazwa handlowa

wg UE

ADI*

[mg/kg m.c.]

Słodkość w stosunku

do sacharozy

Maksymalna dawka

w zależności od produktu [mg/kg]

Acesulfam K

Sunett

E 950

0-15

130-200

350-2000

Aspartam

Nutra Sweet

, Equal

E 951

0-40

160-220

300-5500

Kwas cyklaminowy i jego sole: K i Ca

Asdsugrin

, Dulcinelten

E 952

0-11

30-40

250-2500

Sacharyna i jej sole:

K, Na i Ca

Sweet Twin

E 954

0- 5

200-700

80-1200

Taumatyna

Talin

E 957

–

750-1600

50-400

Neohesperydyna DC

–

E 959

0-5

250

10-400

Sukraloza

Splenda

E 955

0-15

400-800

10-1000

Sól aspartamu i acesulfanu

–

E 962

–

150-200

25-2000

Tabela 2. Substancje intensywnie słodzące.
* ADI – dopuszczalne dzienne pobranie (mg/kg masy ciała)

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

/2006

i sacharyny można również zastosować płytki pokryte żelem krzemion-
kowym lub celulozą, mieszaninę acetonu z octanem etylu oraz czerwień
metylową. Najważniejsze diterpeny glikozydowe obecne w Stevi mogą
być rozdzielone za pomocą mieszaniny chloroform/metanol/woda
i następnie zidentyfikowane w reakcji z chlorkiem sulfurylu.

Elektroforeza kapilarna (CE) jest metodą alternatywną dla HPLC.

Pozwala na analizę zarówno pojedynczo występujących substancji
słodzących oraz produktów ich degradacji, jak i ich mieszanin oraz
substancji słodzących i konserwantów, syntetycznych barwników
i alkaloidów. Opracowane są również różne procedury wykorzystujące
takie techniki, jak: kapilarna elektroforeza strefowa (CZE), miceralna
elektrokinetochromatografia (MEKC) oraz izotachoforeza kapilarna
(CITP). Jako elektrolity wypełniające kapilary stosuje się najczęściej
bufory zawierające fosforany, borany, benzoesany i glicyniany o pH 6-9.
W niektórych przypadkach stosuje się dodatek organicznych modyfi-
katorów (acetonitryl, metanol). Najczęściej stosowanym typem detekcji
jest absorpcja w świetle UV lub wykorzystanie detektora z matrycą
diodową albo elektrochemicznego. Kapilarna elektroforeza strefowa
pozwala również na rozdział produktów degradacji oraz epimeryzacji,
a także stereoizomerów aspartamu.

Metody elektroanalityczne

W tej grupie metod opracowane są procedury oznaczania zawartości
substancji intensywnie słodzących z wykorzystaniem polarografii stało-
i zmiennoprądowej, różnicowej polarografii pulsowej i woltamperome-
trii. Przykładem może być tutaj reakcja cyklaminianów z azotanem(III)
sodu oraz octanem ołowiu i polarograficzny pomiar zawartości
ołowiu pozostałego w roztworze. W analizie substancji intensywnie
słodzących wykorzystuje się również jonoselektywne elektrody oraz
reakcje z barwnikami o charakterze kationowym (rodamina, błękit
metylenowy). Innym przykładem może być oznaczanie cyklaminianów
w reakcji z azotanem(III) sodu z wykorzystaniem miareczkowania
z biamperometryczną detekcją punktu końcowego.

Analiza przepływowo-wstrzykowa (FIA) znajduje zastosowanie

przy oznaczaniu pojedynczych substancji słodzących w dużej liczbie
próbek. Najczęściej wykorzystuje się detekcję spektrofotometryczną,
chociaż opracowano również metody wykorzystujące biosensory, detek-

tory elektrochemiczne, atomową spektrometrię absorpcyjną oraz zjawi-
sko chemiluminescencji. Przykładem może być oznaczanie aspartamu
w reakcji z ninhydryną w mieszaninie etanolu i izopropanolu. Jeszcze
inna procedura przewiduje wytwarzanie kompleksu Cu(II) – aspartam.
Cyklaminiany można analizować metodą FIA w reakcji z azotanem(III)
sodu, którego nadmiar oznacza się metodą Griessa. Natomiast detekcja
z wykorzystaniem absorpcyjnej spektrometrii atomowej stosowana jest
w analizie soli sacharyny i kwasu cyklaminowego.

Sensory

Wykorzystanie pierwszego sensora do oznaczania substancji intensywnie
słodzących opisano w 1985 roku. Największe zastosowanie mają sensory
enzymatyczne z elektrochemiczną transdukcją. Przykładem może być
amperometryczne oznaczanie apsartamu, w którym wykorzystuje się sensor
z enzymami: α-chymotrypsyną i oksydazą alkoholową, unieruchomionymi
metodą kowalencyjnego usieciowania przez aldehyd glutaronowy. Innym
przykładem są sensory wykorzystujące interakcje pomiędzy substancjami
słodzącymi a bimolekularnymi membranami z fosfatydylocholiny. Jesz-
cze inne sensory wykorzystują powinowactwo substancji słodzących do
odpowiednich faz stałych (np. Sephadex, krzemionka).

ELISA

Również testy immunoenzymatyczne z użyciem przeciwciał poliklonal-
nych lub monoklonalnych znalazły zastosowanie w analizie substancji
intensywnie słodzących. Opracowane są już metody oznaczania sacha-
ryny, taumatyny i glycyrriciny.

Piśmiennictwo
1. Brzozowska A. (red.): Toksykologia żywności. Przewodnik do ćwiczeń.

Wydawnictwo SGGW, 1996.

2. Greting H.: Żywność a zdrowie. Wydawnictwo Lekarskie PZWL,

Warszawa 1996.

3. Kroger M., Meister K., Kava R.: Low-calorie sweeteners and other sugar

substitutes: a review of the safety issues. “Comprehensive Reviews in
Food Science and Food Safety”, 2006, 5, 35-47.

4. Krutosikova A., Uher M.: Naturalne i syntetyczne substancje o słodkim

smaku. PWN, Warszawa 1990.

5. Krygier K.: Sztuczne substancje słodzące i ich zastosowanie w żywności na

polskim rynku. „Cukiernictwo i Piekarnictwo”, 2002, 11, 38-40.

6. Nollet L.M.L. (ed.): Food analysis by HPLC. Second edition. Marcel

Dekker, Inc., New York, Basel 2000.

7. Nollet L.M.L. (ed.): Handbook of food analysis. Second edition. Vol. 2.

Residues and other food component analysis. Marcel Dekker, Inc., New
York, Basel 2004.

8. Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 23 kwietnia 2004 r.

w sprawie dozwolonych substancji dodatkowych i substancji po-
magających w przetwarzaniu. Dz.U. 2004, nr 94, poz. 933.

9. Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 20 kwietnia 2005 r.

zmieniające Rozporządzenie w sprawie dozwolonych substancji
dodatkowych i substancji pomagających w przetwarzaniu. Dz.U.
2005, nr 79, poz. 693.

10. Rutkowski A., Gwiazda S., Dąbrowski K.: Kompendium dodatków do

żywności. Hortimex, Konin 2003.

11. Wood R., Foster L., Damant A., Key P.: Analytical methods for food

additives. CRC Press, Woodhead Publishing Limited, Cambridge
England 2000.

12. Yebra-Biurrum M.C.: Flow injection determinations of artificial swe-

eteners: a review. “Food Additives and Contaminants”, 2000, 17, 9,
733-738.

fot. Shutt

ock

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

/2006