Transformacja, koniugacja trójrodzicielska,
elektroporacja
Transformacja, koniugacja trójrodzicielska,
elektroporacja
1.
Koniugacja
2.
Transformacja-
pobieranie wolnego DNA ze środowiska
a)
Naturalna- kom. Naturalnie kompetentne
b)
Sztuczna (indukowana)
3.
Transdukcja-
przenoszenie DNA z udziałem bakteriofagów
a)
Ogólna-
przenoszenie dowolnej cechy
b)
Specyficzna-
przenoszenie określonych cech
4.
Transfekcja-
Transformacja komórek eukariotycznych
5.
Stabilna- połączona z integracją DNA do genomu
6.
Przejściowa- jeśli cząsteczka DNA nie ulegnie integracji, ekspresja
wprowadzonego genu zostanie zgubiona w miarę podziałów
komórkowych.
Mechanizmy horyzontalnego
transferu genów (HTG):
Przekazywanie fragmentów DNA z dawcy do biorcy
Nie wymaga kontaktu fizycznego
komórki biorcy pobierają aktywnie fragmenty chromosomu
dawcy, które ulegają następnie rekombinacji z homologicznymi
odcinkami DNA w chromosomie biorcy.
Transformacje można przeprowadzić w obu kierunkach – ten sam
szczep może być użyty jako dawca i jako biorca
Zjawisko odkryte przez Griffitha w 1928r, wyjaśnione przez
Avery’ego w 1944
Bakterie osiągające stan kompetencji spontanicznie: Bacillus,
Streptococcus, Azotobacter, Helicobacter
Bakterie będące w stanie konstytutywnej kompetencji np.
Neisseria gonorrhoeae
TRANSFORMACJA
Jest to stan w którym bakterie mogą być transformowanen
Wydajność transformacji - % otrzymywanych trwałych
transformantów, zależy przede wszystkim od stanu
komórek biorców, a więc ich zdolności do aktywnego
pobierania DNA z pożywki – określamy to mianem
kompetencji
W procesie pobierania DNA bierze udział szereg białek
enzymatycznych występujących w błonie i ścianie
komórkowej
Zdolność kompetencji jest cechą dziedziczną określonego
szczepu
Tylko bakterie wytwarzające białkowy czynnik kompetencji
są zdolne do transformacji
Stan kompetencji
1.
Luźna adsorpcja cząsteczek DNA do miejsc receptorowych
na powierzchni komórki
2.
Transport DNA przez ściany i błony komórkowe do wnętrza
komórki. U niektórych gatunków proces ten jest związany z
degradacją jednego łańcucha podwójnego heliksu
3.
Transport DNA do nukleoidu, dopasowanie do
homologicznego fragmentu
4.
W procesie rekombinacji między DNA biorcy i pobranym
fragmentem DNA dawcy powstaje heterodupleks.
Heterodupleks jest replikowany z chromosomu bakteryjnego
i po podziale połowa komórek potomnych będzie zawierała
allele znajdujące się we włączonym fragmencie DNA
Proces transformacji-
etapy
Występuje gdy dochodzi do transformacji dwóch
sprzężonych, blisko siebie leżących genów
Powstają podwójne transformanty
Kotransformacja
Pseudomonas stutzeri- przekazuję marker oporności
na ryfampicynę
Pseudomonas sp. – plazmidy
Acinetobacter calcoaceticus- zdolność do syntezy
histydyny
Przykłady transformacji w
środowisku naturalnym
1.
indukcja kompetencji przez specjalne, przedtransformacyjne
zabiegi, np.u Escherichia coli można wymusić stan kompetencji
poprzez traktowanie komórek CaCl
2
(jony Ca2+ zwiększają
przepuszczalność ściany komórkowej) w niskiej temperaturze.
2.
elektroporacja – polega na zadziałaniu prądem o wysokim
napięciu, który powoduje czasowe tworzenie się porów w błonie
komórkowej co ułatwia wnikanie DNA. Można używać do
transformacji komórek gramdodatnich i gramujemnych.
3.
protoplastyzacja komórek – stosuje się głównie w bakteriach
gramdodatnich np. Bacillus, Streptomyces. Protoplasty (komórki
pozbawione ściany komórkowej) uzyskuje się poprzez
potraktowanie np. polietylenoglikolem.
4.
balistyka (metoda tzw. „armatki genowej”) – stosuje się głownie do
transformacji roślin. Polega na wstrzeliwaniu drobnych kuleczek
wolframowych lub złotych opłaszczonych DNA.
Transformacja indukowana
Mierzy się ją w przeliczeniu na ilość transformantów
np. ilość wyrośniętych kolonii w przeliczeniu na
mikrogram DNA
Zależy od:
Stopnia pokrewieństwa
Liczby kompetentnych komórek
Stężenia DNA
Odpowiedniej temperatury
Wydajność transformacji
a)
Komórki wytwarzają białkowy czynnik kompetencji (jego ilość
zmienia się w czasie wzrostu bakterii), wchodzi on w reakcję z
receptorem błonowym, który po aktywacji wysyła sygnał do
chromosowego DNA i umożliwia ekspresję genów
kompetencji, których produktami są różne białka np.
autolizyny, które ułatwiają ekspozycję nukleaz i białek
wiążących DNA na powierzchni komórki.
b)
Dwuniciowe fragmenty DNA są adsorbowane na powierzchni
komórki za pomocą białek wiążących. Nukleazy degradują
jedną nić DNA, druga łączy się z białkami stanu kompetencji i
zostaje wprowadzona do wnętrza komórki. Obce genomowe
DNA odszukuje homologiczny odcinek w genomie
gospodarza i w procesie rekombinacji (podwójny c-o)
dochodzi do wymiany pojedynczych nici DNA.
Mechanizm transformacji
Quorum sensing (QS), sygnalizator zagęszczenia
jest systemem komunikacji między komórkami
bakterii uczestniczącym w regulacji ekspresji genów
w odpowiedzi na gęstość populacji drobnoustrojów
ma szczególne znaczenie w opanowywaniu przez
bakterie nowych terytoriów i precyzuje do jakich
warunków mogą zaadoptować się poszczególne
drobnoustroje
stwierdzono u bakterii Gram-dodatnich i Gram-
ujemnych
Quorum sensing
W systemie międzykomórkowej komunikacji pośredniczą małe
cząsteczki sygnalizacyjne (autoinduktory). Po przekroczeniu
progowego stężenia tych związków (co świadczy o osiągnięciu
przez populację mikroorganizmów odpowiedniej liczebności, czyli
kworum) dochodzi do skoordynowanej zmiany ekspresji genów,
niezbędnej do efektywnego współdziałania całej populacji
Procesy, w których wykorzystywane jest przez bakterie zjawisko
quorum sensing:
bioluminescencja
wzrost
biosynteza antybiotyków
transfer plazmidów
wytwarzanie biofilmu
wirulencja
Quorum sensing
Proces polegający na traktowaniu komórek
czynnikiem fizycznym jakim jest prąd o
dużym napięciu, rzędu kilowoltów, przez
kilka milisekund.
W błonie komórek powstają wpuklenia, które
przekształcają się w małe hydrofobowe pory,
które
następnie
przechodzą
w
duże
hydrofilowe pory zdolne do przepuszczania
cząsteczek DNA. Zamykają się one gdy
skończy się działanie impulsu
Jest to skuteczny sposób na wprowadzenie
DNA do różnych typów komórek
Elektroporacja
(elektrotransformacja)
Metoda pozwala transformować komórki bakteryjne,
które trudno wprowadzić w stan kompetencji,
stosowana również w przypadku komórek
drożdżowych, roślinnych i zwierzęcych
pozwala wprowadzić duże cząsteczki DNA, rzędu
setek kpz i charakteryzuje się bardzo dużą
wydajnością.
Wadą jest to że komórki traktujemy wysokim
napięciem i w ten sposób możemy bardzo łatwo je
uśmiercić
Elektroporacja
Jest to wymiana DNA między bakteriami za
pośrednictwem wirusów bakteryjnych
Wyróżniamy dwa rodzaje transdukcji:
1.
Niespecyficzną (ogólną)- fagi P1, P22
2.
Specyficzną np. fag λ
Bakteriofag, fag - wirus atakujący bakterie. Przeważnie
dany bakteriofag zdolny jest do infekcji tylko jednego
gatunku (a czasem tylko szczepu) bakterii.
Transdukcja
Transdukcja
Przebieg transdukcji
bakteriofagiem
1.
bakteriofag zakaża komórkę
2.
kwasy nukleinowe, zarówno bakteryjne, jak i bakteriofagowe
zostają pocięte na mniejsze części pod wpływem enzymów
wirusowych
3.
kompletne wiriony opuszczają komórkę bakteryjną; niektóre
kapsydy zostały błędnie "załadowane" bakteryjnym DNA
(kolor zielony)
4.
bakteriofag niosący bakteryjny DNA zakaża kolejną bakterię
5.
DNA z komórki bakterii-dawcy zostało wstrzyknięte do
komórki bakterii-biorcy (krzywa koloru zielonego zakończona
kuleczkami)
6.
DNA z komórki donora zastąpiło fragment DNA akceptora
Przeprowadzana przez fagi przenoszące odcinki
DNA o ściśle określonej długości, mające na obu
końcach sekwencje cos rozpoznawane przez fagowe
terminazy
Przenoszony fragment DNA jest połączony
wiązaniami kowalencyjnymi z DNA bakteriofaga
Replikacja w cyklu lizogennym oraz litycznym
Transdukcja specyficzna
Przenoszenie odcinków DNA o wielkości
niezdeterminowanej (ważne aby odcinek mieścił się
w główce fagowej)
Długość fragmentu DNA komórkowego, jaki zostaje
zapakowany do główki fagowej, odpowiada długośi
pakowanego DNA fagowego, co w przypadku faga
P22 wynosi ok. 40 kpz, zaś faga P1- 100 kpz.
Proces rozpoczyna się w miejscu sekwencji pac
rozpoznawanej przez endonukleaze
Transdukcja ogólna
Cykl lizogenny- odmiana replikacji wirusów,
polegająca na wnikaniu materiału genetycznego
wirusa do komórki gospodarza i jego replikacji wraz
z DNA gospodarza, która nie prowadzi do lizy
komórki.
Cykl lityczny – cykl życiowy bakteriofaga polegający
na zakażeniu bakterii, produkcji nowych cząstek
fagowych, rozpadzie bakterii i uwolnieniu nowych
bakteriofagów.
Cykl lizogenny a lityczny
Transformacja komórek eukariotycznych DNA plazmidowym lub
bakteriofagowym
Wyróżniamy różne metody transfekcji:
1.
chemiczna
a)
transfekcja kompleksami DNA z fosforanem wapnia
b)
lipofekcja − transfekcja liposomami zawierającymi DNA lub RNA
2.
elektroporacja − transfekcja za pomocą krótkotrwałego szoku
elektrycznego w roztworze zawierającym kwas nukleinowy. Szok
elektryczny powoduje przejściowe utworzenie w błonie komórkowej
mikroporów, przez które może się dostać DNA lub RNA.
3.
pocisk genowy − transfekcja balistyczna − wstrzeliwanie do wnętrza
komórki mikrokulek złota opłaszczonych DNA
4.
mikroiniekcja – roztwór DNA jest wstrzykiwany bezpośrednio do jądra
komórkowego, lub w przypadku RNA do cytoplazmy, za pomocą
specjalnie spreparowanej szklanej kapilary.
Transfekcja kom. euk.