MIKROBIOLOGIA

MIKROBIOLOGIA

ĆWICZENIA 2 i 3

Sterylizacja.

Od kiedy większość eksperymentów przeprowadzana jest na czystych kulturach

mikroorganizmów,   tzn.   na   pojedynczych,   określonych   gatunkach,   koniecznością   stała   się
możliwość skutecznej sterylizacji/wyjaławiania (pozbawienia żywych organizmów oraz ich
form przetrwalnych) różnych materiałów, m.in. podłoży hodowlanych, końcówek do pipet,
butelek   oraz   innych   naczyń   i   przyrządów   służących   do   przechowywania   czy   posiewu
mikroorganizmów   i   utrzymywanie   ich   w   takim   stanie   przez   dłuższy   czas.   Jeśli   taki
wyjałowiony  materiał  zostanie   zanieczyszczony   innymi   mikroorganizmami,  nie   dodanymi
tam celowo, to mówi się wówczas o zakażeniu. Sterylizację można przeprowadzić różnymi
metodami, dostosowanymi do właściwości sterylizowanego materiału.

 Sterylizacja parowa – najczęściej używanym urządzeniem do sterylizacji jest

autoklaw.   Służy   on   do   sterylizacji   podłoży,   plastików   laboratoryjnych,   i   innych
materiałów   wrażliwych   na   wysokie   temperatury.   Dzięki   zastosowaniu   autoklawu,
czyli pojemnika umożliwiającego   ogrzewanie pod zwiększonym ciśnieniem można
osiągnąć temperatury powyżej punktu wrzenia wody pod ciśnieniem atmosferycznym.
Aktualna temperatura pary wytwarzanej z wody w autoklawie zależy od ciśnienia, ale
temperatura przy danym ciśnieniu jest znacznie niższa, jeśli w komorze znajduje się
powietrze.   Ponieważ   efektywność   sterylizacji   zależy   od   temperatury,   a   nie   od
ciśnienia, należy zapewnić usunięcie powietrza ze sterylizatora za pomocą zaworu.

 Sterylizacja sucha – stosowane do sterylizacji szkła i innych materiałów odpornych na

wysokie temperatury oraz materiałów nieodpornych na wilgoć.

 Filtrowanie – metoda stosowana do sterylizacji płynnych roztworów substancji

termowrażliwych, np. antybiotyki czy witaminy oraz do sterylizacji powietrza
przepływającego przez komory laminarne. Do sterylizacji płynów najczęściej
wykorzystywany jest sterylny filtr nastrzykawkowy o średnicy porów 0,2 – 0,45 µm.

 Naświetlanie – najczęściej stosowane w laboratoriach jest promieniowanie UV o

długości fal ok. 260 nm. Służy do częściowej sterylizacji pomieszczeń, komór
laminarnych.

Podłoża mikrobiologiczne.

Podłoże mikrobiologiczne jest to sztucznie stworzone środowisko do hodowli

drobnoustrojów   zawierające,   w   postaci   przyswajalnych   związków,   wszystkie   pierwiastki
uczestniczących   w   tworzeniu   masy   komórkowej.   Mikroorganizmy   do   wzrostu   wymagają
źródła energii,  węgla, soli  mineralnych  i czasem tzw. czynników  wzrostowych.  Czynniki
wzrostowe to substancje odżywcze, takie jak witaminy, aminokwasy czy zasady purynowe i
pirymidynowe. Substancje te wchodzą w skład komórek, ale nie wszystkie komórki mogą je
syntetyzować. Organizmy wymagające do wzrostu takich dodatkowych czynników nazywają
się auksotrofami, w odróżnieniu do prototrofów, które nie są uzależnione od dodatkowych
substancji   odżywczych.   Ze   względu   na   skład,   podłoża   dzielimy   na   minimalne,   pełne   i
wzbogacone. Podłoża minimalne zawierają tylko źródło energii, węgla i sole mineralne oraz
czasem   pojedyncze   czynniki   wzrostowe.   Podłoża   pełne   zawierają   wszystkie   substancje
niezbędne do dobrego wzrostu drobnoustrojów (źródło węgla, azotu, sole mineralne, wiele
czynników wzrostowych). Podłoża wzbogacone stosuje się do hodowli drobnoustrojów słabo
rosnących  in   vitro,   wymagających   dodatkowych   substancji   odżywczych.   Jako   czynniki
wzbogacające podłoża stosuje się: krew, surowicę, płyny  wysiękowe, wyciąg  wątrobowy,
mleko, żółtko jaj, sok z pomidorów.

Ze względu na konsystencje podłoża dzielimy na płynne, półpłynne i stałe. Pierwsze

kultury bakteryjne prowadzone były na pożywce płynnej - bulionie odżywczym (wyciąg z
tkanek zwierzęcych). Robert Koch wykorzystał plaster ziemniaka, kiedy uświadomił sobie
potrzebę   pożywek   stałych.   Jednakże   nie   wszystkie   mikroorganizmy   rosną   na   ziemniaku.
Kolejną   próbą   było   dodanie   żelatyny   do   pożywki   płynnej,   jednakże   żelatyna   ulega
upłynnieniu  w warunkach standardowej  inkubacji. Wtedy zastosowano agar  jako czynnik
zespalający   pożywki   mikrobiologiczne,   który   obecnie   jest     najbardziej   uniwersalnym
czynnikiem. Agar jest nie rozkładany przez większość bakterii. Otrzymuje się go z morskich
krasnorostów,   u   których   występuje   w   ścianach   komórkowych.   Agar   rozpuszcza   się   w
temperaturze 100

C, krzepnie przy temperaturze 45

C (stężenie 2% w pH obojętnym). Agar

zestalony może być inkubowany w temperaturach do 100

C i pozostaje w konsystencji stałej.

Podłoża ze względu na przeznaczenie i zastosowanie dzielimy na namnażające,

wybiórcze (zawierają dodatek substancji chemicznych hamujących wzrost konkretnej grupy
drobnoustrojów), namnażająco -wybiórcze (pozwala na namnożenie jednego typu organizmu,
a hamuje wzrost innych), oraz pożywki izolacyjne (podłoże stałe zawierające odpowiedni
wskaźnik pozwalający odróżnić od siebie kolonie bakterii).

Podłoża do hodowli mogą być przygotowane w różnej formie. Hodowle płynne w

zależności od ilości podłoża prowadzi się w probówkach, kolbach, butlach lub
fermentatorach. Hodowle na podłożu stałym wykonujemy na szalkach Petriego, słupach, lub
skosach.

Przykładowe pożywki drożdżowe:
Podłoże minimalne płynne:
Zestaw soli mineralnych (nitrogen base)

6,7 g

Glukoza

20 g

Woda destylowana

1000 ml

Podłoże pełne stałe:
Bacto-Ekstrakt drożdżowy

10 g

Bacto-Pepton

20 g

Glukoza

20 g

Agar

20 g

Woda destylowana

1000 ml

Przechowywanie mikroorganizmów

Mikroorganizmy przechowywane w różnych warunkach różnią się znacznie od siebie czasem
przeżywania okresu przechowywania. W celu krótkoterminowego – kilka dni do ok. dwóch
tygodni  -  przechowywania  drobnoustrojów  wystarczy   je  włożyć   do  chłodziarki   w formie
takiej jakiej są – w podłożu płynnym lub posiane na szalce agarowej.  Chcąc je przechować
dłużej należy je zamrozić. Aby zamarzająca woda nie zniszczyła komórek drobnoustrojów,
zamraża się je w 15% roztworze glicerolu. W temperaturze –20 C mikroorganizmy mogą być
przechowywane   kilka   miesięcy   a   w   temperaturze   –70   C   mogą   być   przechowywane
praktycznie bezterminowo.

Cykl życiowy drożdży

Drożdże Saccharomyces cerevisiae są bardzo dobrym eukariotycznym organizmem
modelowym dzięki posiadaniu małego genomu, małej liczbie chromosomów oraz krótkiego
czasu podwojenia. Są łatwe w hodowli, szybko rosną, są łatwe do manipulacji genetycznych.
Nie formują grzybni, rozmnażają się tylko przez pączkowanie. Ogromną zaletą drożdży jest
możliwość utrzymywania ich zarówno jako szczepy diploloidalne jak i haploidalne. Istnienie

stabilnej   fazy   haploidalnej   jest   wyjątkowo   atrakcyjne   dla   genetyków   ze   względu   na
możliwość   izolacji   i   identyfikacji   szczepów   niosących   recesywne   mutacje.   Naturalnie
występujące szczepy drożdży są diploidalne i mają funkcjonalny allel genu HO, powodujący
spontaniczną   zmianę   typu   kojarzeniowego   co   każdy   podział.   Szczepy   laboratoryjne   mają
zmutowany gen ho i dzięki temu mogą być utrzymywane jako szczepy o niezmiennym typie
kojarzeniowym. Haploidy mogą występować jako dwa typy kojarzeniowe, typ kojarzeniowy
a- lub α-, różniące się od siebie tylko w jednym locus, zwanym locus MAT. Dwa allele tego
locus   to  MATa  i  MATα.   Stabilne   szczepy  a-  lub  α-   dzielą   się   mitotycznie   produkując
identyczne   klony   komórek.     Szczep  MATa  kojarzy   się   ze   szczepem    MATα  poprzez
kompleksowy   proces  cytoplazmatycznej   i   jądrowej   fuzji   dzięki   czemu   powstaje   komórka
diploidalna.   Taka   komórka   jest   również   stabilna   i   dzieląc   się   mitotycznie   produkuje
identyczny genetycznie klon. Istnienie stabilnego diploida jest również bardzo korzystne dla
genetyków.   Pozwala   na   określenie   recesywności   lub   dominacji   nowej   mutacji   lub   na
przeprowadzenie testu komplementacji (czy szczepy niosące po jednej mutacji niosą allele
tego samego genu czy są to mutacje w różnych genach).

Gdy drożdże są wystawione na działanie niekorzystnych warunków pokarmowych,

komórki diploidalne przechodzą mejozę produkując cztery komórki potomne, zwane
askosporami: dwie typu kojarzeniowego a- i dwie typu kojarzeniowego α-. Askospory tworzą
tetradę, która jest zawarta w pojedynczej strukturze zwanej ascus (worek). Gdy przywróci się
odpowiednie warunki pokarmowe, każda z tych czterech askospor wykiełkuje i zacznie się
rozmnażać jako komórki haploidu.

Zadanie nr 1: Kojarzenie drożdży

Celem doświadczenia jest skojarzenie dwóch haploidalnych szczepów drożdży i otrzymanie
szczepu diploidalnego, zdolnego do wzrostu na podłożu minimalnym. Szczepy haploidalne
użyte w tym doświadczeniu są auksotrofami różnych aminokwasów i nie są w stanie rosnąć

na podłożu minimalnym. Dopiero po skojarzeniu powstaje heterozygotyczny diploid zdolny
do syntezy wszystkich aminokwasów. Należy skojarzyć szczepy każdy z każdym.

Materiały:
- probówki z trzema płynnymi kulturami haploidalnych drożdży
- pipeta i sterylne końcówki do pipety
- szalki Petriego ze stałym podłożem minimalnym

Przebieg doświadczenia:
Praca w grupach pod komorami laminarnymi.
1. Połóż szalkę minimalną na części z agarem i ją otwórz zdejmując pokrywkę.
2. Wstrząśnij płynną kulturę haploida nr1 na worteksie.
3. Nastaw pipetę na 10

l.

4. Otwórz naczynie ze sterylnymi końcówkami do pipet i delikatnie nabij jeden na pipetę
dbając, by podczas wyciągania nie dotknąć niczego jej sterylnym końcem.
5. Włóż delikatnie pipetę do probówki i przenieś kroplę zawiesiny drożdży na szalkę
umieszczając ją po lewej stronie szalki.
6. Dbając, by niczego po drodze nie dotknąć, przenieś drugą kroplę zawiesiny drożdży i
umieść ją na środku szalki.
7. Wstrząśnij płynną kulturę haploida nr2 na worteksie.
8. Zmień końcówkę pipety i przenieś kroplę zawiesiny na prawą stronę szalki.
9. Zmień końcówkę pipety, przenieś kroplę zawiesiny i umieść ją na kropli będącej już na
środku szalki.
10. Poczekaj, aż krople wyschną.
11. Powtórz to wszystko dla drugiego (nr1 i nr3) i trzeciego (nr2 i nr3) kojarzenia i przełóż
szalkę do inkubatora.
Kontynuacja doświadczenia tydzień później.
12. Wyjmij szalki z inkubatora i oceń wzrost poszczególnych szczepów.

Zadanie nr 2: Test replik

Na   otrzymanych   szalkach   z   podłożem   pełnym   YPD   (yeast   peptone   dextrose)   wysiano
prototroficzny pod względem syntezy leucyny szczep drożdży. Istnieje jednak podejrzenie, że
nastąpiło zakażenie kultury wyjściowej innym, auksotroficznym pod tym samym względem
szczepem drożdży. W celu sprawdzenie, które kolonie wyrosłe na szalce z podłożem pełnym
są   auksotroficzne,   należy   wykonać   test   replik   na   podłożu   nie   zawierającym   leucyny.
Założeniem   tej   metody   jest   odbicie   drożdży   z   powierzchni   agaru   na   sterylny   welwet,   a
następnie transfer tego „wzoru” na kolejną szalkę. Doświadczenie ma na celu oszacowanie
proporcji   kolonii   drożdży   auksotroficznych   pod   względem   syntezy   leucyny   do   kolonii
prototroficznych, wyrosłych na tej samej szalce za pomocą testu replik.

Materiały:
- szalki z wyrośniętymi koloniami drożdży na podłożu YPD
- sterylne szmatki welwetowe
- szalki Petriego ze stałym podłożem SC-leu

Procedura:
Praca w grupach pod komorami laminarnymi.
1. Wyjmij z naczynia sterylny welwet i ostrożnie rozprostuj go uważając, by nie dotknąć
palcami powierzchni z włoskami w centrum szmatki.

2. Rozprostowaną szmatkę połóż na stemplu włoskami do góry i przymocuj do niego gumką
recepturką.
3. Szalkę matrycę otwórz, delikatnie przyciśnij agarem do welwetu i zamknij.
4. Szalkę docelową otwórz, delikatnie przyciśnij do welwetu, zamknij i umieść w
inkubatorze.
Kontynuacja doświadczenia tydzień później.
5. Wyjmij szalki z inkubatora i określ proporcję kolonii nie rosnących na podłożu testowym.

Zadanie nr 3: Obserwacja komórek wegetatywnych i zesporulowanych

drożdży pod mikrospkopem.

Materiały:
- płynne kultury drożdży wegetatywnych i zesporulowanych
- sterylne patyczki drewniane
- szkiełka mikroskopowe i nakrywkowe

Procedura:
Na szkiełko podstawowe należy nanieść pipetą kroplę kultury drożdży i nakryć szkiełkiem
nakrywkowym. Narysuj komórki wegetatywne i spory.

Zadanie nr 4: Oznaczanie genotypu drożdży wegetatywnych na podłożach

selekcyjnych

Doświadczenie ma na celu określenie genotypów pięciu szczepów drożdży na podstawie ich
zdolności   do   wzrostu   lub   jej   braku   na   różnych   podłożach.   Podłoża,   na   których   będą
przeprowadzane testy to podłoża syntetyczne pełne SCminus , czyli w pełni zdefiniowane o
dokładnie poznanym  składzie, w których brakuje pojedynczego czynnika wzrostowego, w
tym   wypadku   są   to   poszczególne   aminokwasy.   Na   takim   podłożu   mogą   rosnąć   tylko   te
drożdże,   które   mają   sprawny   szlak   syntezy   danego   aminokwasu.   Gdy   szlak   ten   jest
uszkodzony na jakimś etapie, drożdże na takim podłożu nie rosną i nazywane są aksotrofami
tego   poszczególnego   nutrientu,   np.   szczep   nie   rosnący   na   podłożu   SC-ura   to   auksotrof
uracylu.

Materiały:
- szalki z wyrośniętymi koloniami drożdży o nieznanym genotypie na podłożu pełnym
bulionowym YPD
- szalki z wykonanymi replikami na podłożach SC-lys, SC-ade, SC-ura, SC-leu, SC-his

Procedura:
Na podstawie wyników wzrostu kolonii odbitych na szalkach testowych określ genotypy
poszczególnych szczepów drożdży.

Zadanie nr 5: Oznaczanie genotypu askospor na podłożach selekcyjnych

Używając   mikromanipulatora   można   rozdzielić   askospory   pochodzące   z   jednej   tetrady.
Uzyskuje   się   w   ten   sposób   genetycznie   identyczne   haploidalne   klony   będące   produktem
mejozy   jednej   komórki   diploidalnej.   W   ten   sposób   można   otrzymać   szczepy   o   nowym
pożądanym genotypie. Doświadczenie ma na celu określenie genotypów askospor powstałych
w   wyniku   sporulacji   diploidalnego   szczepu   drożdży   oraz   określenie,   czy   askospory
rzeczywiście pochodzą z jednej tetrady.

Document Outline