Sprawozdanie 2. 

Politechnika Wrocławska 

Wydział Chemiczny 

Strona 1 z 4 
Data zajęć: 2008/10/24 

Enzymologia (BTC4033l) 
laboratorium 
mgr inż. Dominika Bystranowska 
PT, 16:10-18:45, F-4/C3 

Ćwiczenie 2. 

Sporządzenie nasyconego roztworu 

siarczanu amonu. 

Grupa IV 
Anna Dawiec 
Mateusz Jędrzejewski 
Aleksandra Korkuś 

 

Ćwiczenie 2.  Wstęp 

Siarczan amonu 

NH







SO



 to bezbarwne ciało stałe; substancja krystaliczna i higroskopijna. 

Masa molowa 132,14

[1]

 g/mol; gęstość 1,77

[1]

 g/cm

3

 (20°C), rozpuszczalność w wodzie 760

[1]

 g/l (20°C), 

pH 5-6

[1]

 (50 g/l H

2

O, 20°C). Rozpuszczalność znacznie zależy od temperatury. Sól hydrolizuje, 

zgodnie z reakcją 1., a przez to pH jest lekko kwaśne (sól mocnego kwasu i słabej zasady). 

 

NH



 2H



O  NH



OH   H

O

 

(Reakcja 1.) 

Rozpuszczalność białek zależy w szczególności od: temperatury, pH, siły jonowej roztworu oraz zdolności 

białka do hydratacji. Wysalanie białek jest procesem wytrącania białka z roztworu. Polega na uszkodzeniu 

otoczki hydratacyjnej, białko staje się mniej rozpuszczalne. Rozpuszczalność większości białek zmniejsza 

się w roztworach  stężonych soli  (zmiana  siły jonowej  roztworu).  Często stosowaną  solą  do  wysalania 

białek  jest  siarczan  amonu.  Białko  najłatwiej  wysolić  w  pH  równym  jego  punktowi  izoelektrycznemu 

(wówczas rozpuszczalność białka jest najmniejsza). Jest to proces odwracalny. Rozpuszczalności różnych 

białek są różne. Wysalanie stosuje się do frakcjonowania białek, wstępnego oczyszczania, a w szczególności 

do zagęszczania rozcieńczonych roztworów białek. Sól można usunąć z roztworu stosując dializę. 

[1]  Karta charakterystyki substancji niebezpiecznej CHEMPUR – siarczan amonu (http://alchem.eu/_upload/pliki/amonu_siarczan.pdf). 

Ćwiczenie 2.  Cel 

Przygotowanie 100 ml nasyconego roztworu siarczanu amonu potrzebnego do Ćwiczenia 3. 

Ćwiczenie 2.  Wykonanie 

Przygotowano  zlewkę  300  ml.  Podgrzewając  i  mieszając  rozpuszczono  90  g  siarczanu  amonu 

w 100 ml 1 mM EDTA. Pod wyciągiem miareczkowano roztwór 5% roztworem amoniaku do pH 7,5. 

Ciepły roztwór przesączono przez lejek Büchnera, użyto pompki wodnej. Przesączony roztwór 

przelano do zlewki 300 ml. Zlewkę podpisano i przykryto folią aluminiową. 

Ćwiczenie 2.  Wyniki 

Używając wagi analitycznej odważono 90 g siarczanu amonu. 



NH







SO



 90 g 



zlewki

 130,6 g 



ważona

 

NH







SO



 

zlewki

 220,6 g 

Używając cylindra miarowego zmierzono 100 ml 1 mM EDTA. Używając uniwersalnych papierków 

wskaźnikowych określano pH roztworu (żółty pH 6,0; zielony pH 7,0; ciemnozielony pH 7,5). 

Ćwiczenie 2.  Wnioski 

Otrzymano  ok.  100  ml  nasyconego  roztwór  siarczanu  amonu  o  pH  7,5.  Podczas  ogrzewania 

nieznaczna ilość roztworu mogła wyparować. Intensywnie mieszano, dzięki temu rozpuszczono cały 

dodany siarczan amonu. Rozpuszczalność siarczanu amonu rośnie wraz z temperaturą. Przy sączeniu 

roztwór ostygał. Niewielkie ilości nadmiaru siarczanu amonu wykrystalizowały na sączku. 

Sprawozdanie 2. 

Politechnika Wrocławska 

Wydział Chemiczny 

Strona 2 z 4 
Data zajęć: 2008/10/24 

Enzymologia (BTC4033l) 
laboratorium 
mgr inż. Dominika Bystranowska 
PT, 16:10-18:45, F-4/C3 

Ćwiczenie 1. 

Zapoznanie się z metodą określania aktywności 

aldolazowej wykorzystującej test hydrazynowy. 

Grupa IV 
Anna Dawiec 
Mateusz Jędrzejewski 
Aleksandra Korkuś 

 
W ramach dodatkowego zadania powtórzono Ćwiczenie 1. z dnia 2008/10/17. 

 Ćwiczenie 1.  Wstęp 

Aldolazy  to  enzymy  należące  do  klasy  liaz.  Występują  w  różnych  izoformach.  Izolowane 

są  z  tkanki  mięśniowej,  wątroby  i  mózgu.  Biorą  udział  w  jeden  z  reakcji  glikolizy  oraz 

glikoneogenezy. Katalizują reakcję rozszczepienia oraz kondensacji aldolowej (Reakcja 2.) 

CH

2

OPO

3

C

C

C

C

CH

2

OPO

3

O

H

O

H

OH

H

OH

CH

2

OPO

3

C

C

H

O

OH

H

C

C

CH

2

OPO

3

OH

O

H

H

fruktozo-1,6-disfosforan

aldolaza

+

fosfodihydroksyaceton

aldehyd

3-fosfoglicerynowy

2-

2-

2-

2-

 

Reakcja 2. – Reakcja katalizowana przez aldolazę 

Stężenia  enzymu # można  próbować  wyznaczyć  poprzez  pomiar  absorbancji $ przy  280  nm 
oraz  stosując  prawo  Lamberta-Beera  (1),  gdzie % to  współczynnik  ekstynkcji,  a & to  długość 
drogi optycznej. Zależność absorbancji od stężenia może mieć charakter liniowy dla małych stężeń. 

 

$  % · & · # 

(1) 

Aktywność  enzymu  wyznacza  się  poprzez  zmianę  stężenia  (poprzez  zmianę  absorbancji) 

w czasie – szybkość zmiany stężenia. Jednostkę aktywności U definiuje się zgodnie ze wzorem (2). 

 

U 

) µmol substratu

) min

 

(2) 

Test hydrazynowy służy do wyznaczania aktywności aldolazy. Polega na spektrofotometrycznym 

oznaczaniu  zmiany  stężenia  hydrazonu  aldehydu  3-fosfoglicerynowego  (H)  przy  240  nm. 

W reakcji charakterystycznej H powstaje z aldehydu 3-fosfoglicerynowego i siarczanu hydrazyny 

w stosunku 1:1. 

Stężenia i aktywności aldolazowe są proporcjonalne do rozcieńczenia (3). 

 

1

2



3

4

3

5

3

5

 

(3) 

Ćwiczenie 1.  Cel 

Wyznaczenie stężenia aldolazy z mięśni oraz oznaczenie jej aktywności testem hydrazynowym. 

Porównanie otrzymanych wyników z Ćwiczeniem 1. z dnia 2008/10/17. 

 

 

Sprawozdanie 2. 

Politechnika Wrocławska 

Wydział Chemiczny 

Strona 3 z 4 
Data zajęć: 2008/10/24 

Enzymologia (BTC4033l) 
laboratorium 
mgr inż. Dominika Bystranowska 
PT, 16:10-18:45, F-4/C3 

Ćwiczenie 1. 

Zapoznanie się z metodą określania aktywności 

aldolazowej wykorzystującej test hydrazynowy. 

Grupa IV 
Anna Dawiec 
Mateusz Jędrzejewski 
Aleksandra Korkuś 

 

Ćwiczenie 1.  Wykonanie 

W części I wyznaczono stężenie aldolazy. Odmierzono 3 ml buforu (10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA). 

Zmieszano  z  60  μl  stężonego  roztworu  aldolazy  (o  nieznanym  stężeniu).  Odnośnik  sporządzono 

używając samego buforu. Zmierzono absorbancję $

67

 względem odnośnika przy 280 nm. 

W części II wyznaczono aktywność aldolazy. Odmierzono 1,5 ml 2,6 mM siarczanu hydrazyny zawartym 

w roztworze (100 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA). Zmieszano z 200 μl 30 mM fruktozodifosforanu. Odnośnik 

sporządzono analogicznie. Wyzerowano spektrofotometr względem odnośnika. Dodano 25 μl roztworu 

aldolazy z części I, natomiast do odnośnika dodano taką samą objętość buforu (10 mM Tris/HCl, 1 mM 

EDTA). Zmierzono absorbancję $

7

 względem odnośnika przy 240 nm przez 3 minuty. Część II powtórzono. 

Ćwiczenie 1.  Wyniki 

Tabela 1. – Obliczenia dla roztworu aldolazy w kuwetach pomiarowych 

 

pomiar 1° 

pomiar 2° 

średnia* 

uwagi 

8

9:

 

;µl< 

60 

- 

$

67

 

 

0,1842 

odczyt 
ze spektrofotometru 

=

ald



 

;mg/ml< 

0,2024 

=

ald





@

AB

C

AB

B,)%

·E

 

8

:

 

;µl< 

25 

8

:



F

ald

G

ald



 

$

7

H

 

 

0,13 

0,09 

0,11 

odczyt z wykresu 1. 

$

7

I

 

 

0,32 

0,30 

0,31 

odczyt z wykresu 1. 

Δ$

7

 

 

0,19 

0,21 

0,20 

Δ$

7

 $

7

I

K $

7

H

 

 

=

ald

 

;mg/ml< 

2,933 ∙ 10

–3

 

=

ald



G

ald



L

:M

 

Δt 

;min< 

3 

3 

3 

- 

Akt

ald

 

;U/ml< 

0,0232 

0,0256 

0,0244 

Akt

ald



O@

B

P

Q

·E·∆S

· 10

 

Akt

tot

 

;U< 

0,0400 

0,0442 

0,0421 

Akt

tot

 Akt

ald

· 8

 

Akt

spec

 

;U/mg< 

7,91 

8,73 

8,32 

Akt

spec



Akt

ald

M

G

ald

M

 

* średnia arytmetyczna z pomiarów 1° i 2°. 

gdzie:  masa aldolazy: 

ald

 5 µg 

 

długość drogi optycznej (szerokość kuwety): &  1 cm 
masowy współczynnik ekstynkcji dla aldolazy mięśniowej (przy 280 nm): %

67

7,9%

 0,91 

ml

mg·cm

 

molowy współczynnik ekstynkcji dla hydranazonu GAP (przy 240 nm): W

X

 2730 

1

M·cm

 

 

objętość: 8

 1,5 ml   200 µl   25 µl  1725 µl  1,725 ml 

 

rozcieńczenie: 1

:



3[

M

3

:M

3

:M



3

M

3

:M



9\] µl

] µl

 69 

 

Sprawozdanie 2. 

Politechnika Wrocławska 

Wydział Chemiczny 

Strona 4 z 4 
Data zajęć: 2008/10/24 

Enzymologia (BTC4033l) 
laboratorium 
mgr inż. Dominika Bystranowska 
PT, 16:10-18:45, F-4/C3 

Ćwiczenie 1. 

Zapoznanie się z metodą określania aktywności 

aldolazowej wykorzystującej test hydrazynowy. 

Grupa IV 
Anna Dawiec 
Mateusz Jędrzejewski 
Aleksandra Korkuś 

 

Tabela 2. – Obliczenia dla wyjściowego roztworu aldolazy 

wykonane na podstawie wartości średnich pomiarów 1° i 2° 

 

uwagi 

=

ald

9

 

;mg/ml< 

10,3 

=

ald

9

 1

9:

· 1

:

· =

ald

 1

9:

· =

ald



 

Akt

ald

9

 

;U/ml< 

85,9 

Akt

ald

9

 1

9:

· 1

:

· Akt

ald

 

Akt

tot

9

* 

;U< 

85,9 

Akt

tot

9

 Akt

ald

9

· 8

9

 

Akt

spec

9

 

;U/mg< 

8,32 

Akt

spec

9



Akt

ald

)

G

ald

)



L

):

·L

:M

·Akt

ald

M

L

):

·L

:M

·G

ald

M

 Akt

spec

 

* objętość wyjściowego preparatu aldolazy 8

9

 1 ml. 

gdzie: 

 

rozcieńczenie: 1

9:



3[



3

):

3

):



777 µl ^7 µl

^7 µl

 51 

Ćwiczenie 1.  Wnioski 

Dobrano odpowiednie rozcieńczenia roztworu aldolazy do badania jej aktywności metodami 

spektrofotometrycznymi.  Stężenie  aldolazy  w  roztworze  wyjściowym  wynosi  10,3  mg/ml. 

Zgodnie  z  wykresem  1.  absorbancja,  więc  także  stężenie  (1),  H  rośnie,  z  dobrym 

przybliżeniem,  liniowo  w  czasie.  Aktywność  aldolazowa  zależy  od  stężenia  enzymu, 

im roztwór bardziej rozcieńczony tym aktywność aldolazowa mniejsza. Aktywność całkowita 

(totalna) zależy od objętości roztworu. Aktywność specyficzna aldolazy nie zależy od stężenia 

enzymu i wynosi średnio 8,32 U/mg. Średnią arytmetyczną wyznaczono z dwóch niezależnych 

od  siebie  pomiarów  dających  zbliżone  wyniki  (ich  odchylenie  standardowe  wynosi  0,58). 

Ćwiczenie 1. wykonano mniej dokładnie niż dnia 2008/10/17 (wtedy odchylenie standardowe 

wyników  wynosiło  0,15).  Aktywność  specyficzną  wyznaczono  wówczas  na  7,58  U/mg. 

Pomiary wykonywano korzystając z tego samego spektrofotometru. 

Test  hydrazynowy  pozwolił  na  wyznaczenie  aktywności  aldolazy.  Jest  to  szybka  i  prosta 

metoda.  Jej  zastosowanie  było  możliwe,  ponieważ  w  reakcji  powstawał  produkt  H,  który 

posiadał maksimum absorbancji przy 240 nm. Inne substraty reakcji w roztworze praktycznie 

nie absorbowały przy 240 nm. 

 

Załączniki 

1.

 

Wykres spektrofotometru: zmiany absorbancji w czasie dla dwóch pomiarów (Wykres 1.). 

2.

 

Instrukcja „Ćwiczenie 1.” wraz z bieżącymi obliczeniami. 

3.

 

Instrukcja „Ćwiczenie 2.” wraz z bieżącymi obliczeniami.