Chromatografia
Chromatografia kolumnowa
Chromatografia – po co?
Zastosowanie:
oczyszczanie
wydzielanie
analiza jakościowa
analiza ilościowa
Chromatogram czarnego atramentu
Optymalizacja eluentu
Optimum 0.2 < R
F
< 0.5
Chromatografia
Chromatografia kolumnowa
Chromatografia – po co?
Zastosowanie:
oczyszczanie
wydzielanie
analiza jakościowa
analiza ilościowa
Chromatogram czarnego atramentu
Optymalizacja eluentu
Optimum 0.2 < R
F
< 0.5
Chromatografia kolumnowa
Chromatografia kolumnowa jest bardzo dobrą i wydajną
techniką słuŜącą do wydzielania i oczyszczania produktów
naturalnych i syntetycznych.
Mechanizm rozdziału jest identyczny z mechanizmem rozdziału
w chromatografii cienkowarstwowej.
dzięki istnieniu róŜnic w sile oddziaływań międzycząsteczkowych
dla róŜnych związków pomiędzy składnikami mieszaniny, a fazą
ruchomą oraz składnikami mieszaniny a fazą stacjonarną.
W roli fazy stacjonarnej moŜna uŜywać rozmaitych
adsorbentów.
najczęściej w chemii organicznej stosowanym jest silikaŜel (bardzo
silnie polarny)
Związki polarne (b) adsorbują się silniej na polarnych cząsteczkach
silikaŜelu, dlatego są wymywane z kolumny później niŜ składniki mniej
polarne (a), które poruszają się szybciej przy zastosowaniu rozpuszczalnika
mniej polarnego.
Chromatografia kolumnowa – co i jak?
Przygotowanie kolumny
Załadowanie kolumny
Rozwijanie kolumny
Zbieranie frakcji
Analiza frakcji
Przygotowanie kolumny
Kolumna powinna być
ustawiona pionowo!!!
silikaŜel
„korek” z
waty
Pakowanie kolumny
przygotowanie zawiesiny adsorbentu w eluencie
do eluentu wsypuje się adsorbent
zamieszać zawiesinę i zanim opadnie na dno, przelać
do kolumny
odczekać chwilę, do „ubicia” się adsorbentu w
kolumnie
otwarcie kranu, aŜ do momentu gdy wysokość eluentu
nad adsorbentem wyniesie ok. 5 mm
nie moŜna dopuścić do obniŜenia się poziomu
rozpuszczalnika poniŜej poziomu adsorbentu!!!
zamknąć kran
Wpływ wielkości cząstek adsorbentu i szybkości
przepływu na wysokość półki teoretycznej
Ź
ródło: Skoog, Holler, and Nieman, Principles of Instrumental Analysis, 5
th
edition, Saunders College Publishing.
Aplikacja próbki do kolumny
Przed aplikacją próbki wskazane jest, aby na
warstwę adsorbentu nasypać piasku (2-5 mm)
Próbka powinna być rozpuszczona w jak
najmniejszej ilości eluentu
OstroŜnie wprowadza się ją na warstwę
adsorbentu, tak aby nie spowodować
mieszania się z adsorbentem
Następnie naleŜy ostroŜnie dodać eluent, tak
aby nie dopuścić do zmieszania się z
rozdzielaną próbką
Rozwijanie kolumny i zbieranie frakcji
OstroŜnie otworzyć kran
Następuje rozdział substancji na warstwie
adsorbentu
NaleŜy starać się utrzymywać stałą wysokość
rozpuszczalnika nad fazą stacjonarną
Od dołu kolumny naleŜy odbierać kolejne frakcje w
z góry ustalonych ilościach
Objętość frakcji dobiera się empirycznie
Proces prowadzi się do czasu, aŜ wszystkie
analizowane związki opuszczą kolumnę
Rozwijanie kolumny i zbieranie frakcji
zmiana zlewki, gdy
pojawi si
ę
Ŝ
ółty kolor
W celu szybkiego uzyskania niebieskiego zwi
ą
zku,
nale
Ŝ
y u
Ŝ
y
ć
rozpuszczalnika bardziej polarnego.
Rozdział zwi
ą
zków bezbarwnych
Bardzo cz
ę
sto rozdzielane (oczyszczane) zwi
ą
zki s
ą
bezbarwne.
zbiera si
ę
frakcje o niewielkiej obj
ę
to
ś
ci
obj
ę
to
ść
frakcji dobiera si
ę
w zale
Ŝ
no
ś
ci
od wielko
ś
ci (długo
ść
,
ś
rednica) kolumny
typowa wielko
ść
frakcji wynosi 1 – 10 cm
3
ka
Ŝ
d
ą
z frakcji analizuje si
ę
wykonuj
ą
c
oznaczenie metod
ą
TLC
ł
ą
czy si
ę
frakcje zawieraj
ą
ce t
ę
sam
ą
substancj
ę
Analiza frakcji
Analizę frakcji wykonuje się najczęściej
stosując metodą TLC
Po wykonaniu analiz łączy się frakcje
zawierające ten sam związek, a następnie
usuwa rozpuszczalnik
W końcowym etapie otrzymuje się oczyszczone
związki
Inne waŜne zasady
nie powinno się dopuszczać do wyschnięcia kolumny,
kolumny nie naleŜy poddawać udarom mechanicznym,
nie powinno się w sposób gwałtowny obniŜać ciśnienia
eluentu,
naleŜy przestrzegać zaleceń producenta co do
warunków pracy kolumny,
zasada działania identyczna jak tradycyjnej chromatografii
kolumnowej
budowa kolumny zbli
Ŝ
ona do tradycyjnej
stosuje si
ę
niewielkie nadci
ś
nienie
szybszy rozdział substancji
Chromatografia kolumnowa – „Flash”
Chromatografia kolumnowa – „Flash”
Budowa kolumny
Aplikacji próbki
Rozwijanie kolumny
Zbieranie frakcji
Analiza – TLC
Poł
ą
czenie frakcji
Chromatografia kolumnowa – „Flash”
Średnica
kolumny
[mm]
Obj.
eluentu
a
[ml]
Ilość próbki (typowa)
[mg]
Obj.
frakcji
[ml]
∆
R
F
> 0.2
∆
R
F
> 0.2
10
100
100
40
5
20
200
400
160
10
30
400
900
360
20
40
600
1600
600
30
50
1000
2500
1000
50
a
Typowa objętość eluentu potrzebna do pakowania kolumny i elucji