Podstawowe metody barwienia bakterii 

 

W mikroskopach można oglądać bakterie żywe lub utrwalone.  

Żywe ogląda się: 

  w ciemnym polu widzenia 
 

w kropli wiszącej 

  w mikroskopie kontrastowo-fazowym.  

Bakterie można zabarwić bez utrwalania, przyżyciowo, ale robi się to bardzo rzadko. 

Barwienie  umożliwia  obejrzenie  układu  przestrzennego,  morfologii  i  anatomii  komórek.  Celem  barwienia  jest 

wykazanie bakterii w badanym preparacie.  

Metody barwienia bakterii 

Barwniki  dzielą  się  na  2  grupy:  zasadowe  i  kwaśne.  Ze  względu  na  kwaśne  pH  składników  komórki  bakteryjnej, 

w bakteriologii maja zastosowanie głównie barwniki zasadowe, takie jak: 

 

fiolet krystaliczny 

 

fiolet metylowy 

 

fuksyna 

 

błękit metylenowy 

 

zieleń metylenowa 

 

zieleń malachitowa  

 

safranina 

Z barwników kwaśnych używane są eozyna i fuksyna kwaśna.  

Podział metod barwienia 

Barwienie dzieli się na: 

  Negatywne 
  Pozytywno-negatywne 
  Pozytywne 

o  proste 
o 

złożone 

Barwienie  negatywne  –  do  kropli  żywych  bakterii  na  szkiełku  dokłada  się  kroplę  grubo  dyspersyjnego  barwnika,  

jak  np.  tusz  chiński  lub  nigrozyna.  Drugim  szkiełkiem  o  oszlifowanych  brzegach  wykonuje  się  rozmaz  obu 

zmieszanych kropli. Po wysuszeniu na ciemnym tle podłoża widoczne są bezbarwne kształty komórek bakteryjnych. 

Barwniki nie wnikają do wnętrza komórki, lecz zabarwiają tło. 

Barwienie pozytywno-negatywne – za pomocą tej metody można wykazać obecność otoczek u bakterii. W 1 ml soli 

fizjologicznej  zawiesza  się  ok.  10

9

  bakterii,  dodaje  się  kroplę  fuksyny karbolowej.    Zawiesinę  ogrzewa  się 

do 70 stopni przez 1-2 min. Jest to faza pierwsza barwienia – pozytywna.  

Następnie  krople  zawiesiny  kładzie  się  na  szkiełko  i  dodaje  się  druga  kroplę  barwnika  grubodyspersyjnego. 

Szkiełkiem  o  oszlifowanych  brzegach  robi  się  rozmaz.  Preparat  suszy  się  w  temperaturze  pokojowej  Jest  to 

faza negatywna.  

W mikroskopie widoczne są czerwono zabarwione komórki na ciemnym tle. Jeśli bakterie maja otoczki, to dookoła 

czerwono zabarwionej komórki są dobrze widoczne bezbarwne otoczki na ciemnym tle.  

Barwienie  pozytywne  –  w  tej  metodzie  bakterie  barwią  się  i  są  widoczne  na  bezbarwnym  tle.  Po przygotowaniu 

preparatu na szkle można go zabarwić metodą prosta lub złożoną.   

Barwienie  proste  –  w  barwieniu  tym  można  stosować  dowolnie  wybrany  barwnik  bakteriologiczny. 

Najczęściej  używany  jest  błękit  metylenowy  wg  Lofflera.  Na  utrwalony  preparat  nalewa  się  barwnik 

na 10 min.  Spłukuje  się  wodą.  Bakterie  barwią  się  na  niebiesko.  Do  barwienia  prostego  można  tez  użyć 

rozcieńczonej w wodzie fuksyny karbolowej.  

Barwienie złożone – najczęściej stosowane są metody: 

  Grama  –  fiolet  krystaliczny  +  płyn  Lugola  +  etanol  +  fuksyna:  bakterie  Gram+  barwią  się  na 

ciemnofioletowo (kwasy tejchojowe), a Gram- na kolor czerwony. 

  Ziehla-Neelsena  –  fuksyna  karbolowa  +  grzanie  +  kwaśny  alkohol  +  błękit  metylenowy:  prątki, 

przetrwalniki i zarodniki grzybów barwią się na czerwono, reszta preparatu na niebiesko 

  Neissera  –  barwnik  Neissera  I+II  +  chryzoidyna:  widoczne  ciałka  Ernsta-Babesa  (na  granatowo  – 

u maczugowców), komórki na żółto 

  Giemsy – utrwalony preparat barwi się barwnikiem Giemsy 

Pożywki 

Pożywkami  lub  podłożami  nazywamy  płynne,  półpłynne  lub  stałe  mieszaniny  różnych  związków  chemicznych, 

w których lub na których rozmnażają się bakterie lub inne drobnoustroje. 

Właściwości pożywek 

W  skład  pożywek  wchodzi  woda,  którą  należy  destylować,  aby  nie  zawierała  domieszek  metali.  Do niektórych 

pożywek wyjątkowo stosuje się wodę wodociągową. 

Pożywka powinna być: 

1.  Izotoniczna dla danego gatunku 

2.  Jałowa  –  wyjaławia  się  je  przez  stosowanie  temperatury  i  przez  sączenie.  Przeprowadza  się  tyndalizację, 

gotowanie  w  aparacie  Kocha,  wyjaławianie  w  sterylizatorach  parowych  oraz  sączenie  przez  filtry 

Berkfelda lub Seitza.  

3.  Świeża  –  przechowuje  się  je  w  lodówkach  lub  zamrażarkach,  rzadziej  w  temperaturze  pokojowej. 

Najwłaściwsza temperatura to 4 stopnie. Gotowych pożywek nie przechowujemy dłużej niż 5-7dni. 

4.  W  szkle  obojętnym  –  szkło  myje  się  w  detergentach,  kilkakrotnie  płucze  się  w  wodzie  destylowanej, 

zatyka się  korkami  z  ligniny,  pakuje  w  papier  i  tak  przygotowane  wyjaławia się  w  sterylizatorach 

na suche powietrze. 

5.  Skontrolowana  –  zawsze  po  wykonaniu  serii  danej  pożywki  trzeba  skontrolować  jej  właściwości 

fizjologiczne i biochemiczne. Należy do tego dobrać jeden lub kilka szczepów wzorcowych. 

Podział pożywek: 

  PROSTE – bakterie mniej wybredne: 

o 

płynne 

  bulion zwykły 
  woda peptonowa 

o 

półpłynne – bulion zwykły + agar 

  zwykła 
  wzbogacona 

o 

stałe 

  agar zwykły 
  żelatyna 

  WZBOGACONE – bakterie bardziej wymagające: 

o 

płynne 

  bulion wzbogacony 
  bulion z krwią 

o 

stałe 

  agar wzbogacony 
  agar z krwią 
  agar cukrowy (Brauna) 
  pożywka Mullera-Hintona – do antybiogramów 

 

WYBIÓRCZE – selektywnie wybierane bakterie 

o 

wybiórczo-namnażające  –  pożywki,  w  których  niektóre  bakterie  chorobotwórcze  ulegają 

namnożeniu, a wzrost innych jest hamowany lub niemożliwy: 

  bulion z żółcią (Salmonella) 
  pożywka SF wg Leifsona (Salmonella, Shigella) 
  pożywka z żółcią i zielenią brylantową (E. coli, Enteriobacteriaceae) 

o 

wybiórczo-różnicujące – pożywki stałe, na których kolonie poszczególnych drobnoustrojów wykazują 

charakterystyczne cechy: 

  pożywka Levine’a (Enterobacteriaceae) 
  pożywka Chapmana (S. aureus, zwłaszcza z kału) – na pożywce rosną tylko halofity, oporne 

na  działanie  7,5%  NaCl.  Gronkowce  wykorzystują  mannitol,  zakwaszają  pożywkę  i  barwią 
kolonie  na  żółto.  Gronkowce  koagulazoujemne  tworzą  znacznie  mniejsze  i  niezabarwione 
kolonie 

  agar SS (Salmonella, Shigella) 

 

RÓŻNICUJĄCE  –  pozwalają  na  wykrycie  cech  fizjologicznych  i  biochemicznych,  jak  enzymy,  katabolity 

i anabolity u izolowanych gatunków bakterii: 

o 

stałe 

  pożywka Krumwieda (różnicowanie Salmonella, Shigella, Escherichia, Klebsiella) 
  pożywka  Kliglera  (różnicowanie  Salmonella,  Shigella  flexneri,  Escherichia,  Proteus, 

wykrywanie H

2

S u innych bakterii) 

o 

płynne – barwny szereg pożywek do wykrywania pojedynczych cech: 

  podłoża do wykrywania zdolności rozkładu cukrów, alkoholi, glikozydów 
  pożywka laktozowa z purpurą bromokrezolową (LPB) 
  woda peptonowa 10% (wykrywanie indolu) 
  pożywka Clarka (testy Metyl Red i Vogesa-Proskauera) 
  zmodyfikowana pożywka Christensena (wykrywanie ureazy) 
  pożywka Simmonsa (z cytrynianem sodu) 
  pożywka żelatynowa (wykrywanie żelatynazy) 
  agar półpłynny zwykły lub wzbogacony (badanie ruchliwości) 

 
 
 

  SPECJALNE – bardzo wymagające gatunki bakterii i mikoplazm 

o 

do hodowli beztlenowców 

  pożywka Tarrozziego-Wrzoska (beztlenowce ogólnie) 
  pożywka z tioglikolanem sodowym (Clostridium)  
  bulion z farszem mięsnym (Clostridium) 

o 

do hodowli prątków gruźlicy 

  pożywka Loewensteina-Jensena 
  pożywki płynne – syntetyczne 

o 

pożywka Lofflera (C. diphtheriae) 

o 

pożywka Fletchera (Leptospira) 

o 

agar czekoladowy (pałeczki krztuśca) 

o 

podstawowa pożywka do hodowli mikoplazm 

o  pożywki do hodowli grzybów: 

  pożywka Sabourauda 

 

stała 

  deficytowa 
  plynna 

  TRANSPORTOWE – służą do przechowywania i przewozu pobieranych materiałów 

Podstawowe czynności przy pobieraniu materiałów do badań 
mikrobiologicznych 

 
Podstawowe  znaczenie  w  diagnostyce  mikrobiologicznej  ma  okres  choroby,  w  którym  pobiera  się  materiał. 

Procentowo  największą  wykrywalność  (izolację)  osiąga  się  w  materiałach  pobranych  w pierwszych  dniach 

zachorowania, w ostrej fazie choroby. W chorobach przewlekłych materiały należy pobierać w okresie zaostrzenia 

lub pobierać wielokrotnie w krótkich odstępach czasu. 

Zależnie od jednostki chorobowej pobiera się:  

  krew 
 

wymazy z nosa, gardła, spojówek, narządów moczowo-płciowych i ran 

 

ślinę,  

 

płyn mózgowo-rdzeniowy,  

 

kał,  

  mocz,  
 

ropę, zawartość ropni,  

 

płyn opłucnowy i otrzewnowy 

 

włosy, paznokcie 

 

strupy i zeskrobiny skóry 

  szpik kostny 

Zasady pobierania materiałów 

1.  Próbki do badań pobiera się przed podaniem antybiotyków 

2.  Lekarz osobiście pobiera lub nadzoruje pobranie materiału 

3.  Próbki pobiera się do jałowych pojemników 

4.  Pojemnik musi być opisany przed pobraniem materiału 

5.  Miejsca  pobrania  nie  można  myć,  przecierać,  przepłukiwać.  Wyjątek  stanowią  nakłucia,  podczas  których 

skórę w miejscu nakłucia należy zdezynfekować 

6.  Bezpośrednio po pobraniu materiały wysłać go do pracowni mikrobiologicznej 

Interpretacyjny podział materiałów 

Zależnie od miejsca pobrania z organizmu,  materiały można podzielić na 3 duże grupy: 

1.  Materiały  pobrane  z  zamkniętych  miejsc  organizmu  –  bez  kontaktu  ze  środowiskiem  zewnętrznym  

jak krew, płyn M-R, ropa z zamkniętych ropni, płyny z jam surowiczych, szpik kostny, żółć podczas operacji 

chirurgicznych, mocz pobrany podczas cystoskopii, wycinki tkanek podczas zabiegów.  

Jeżeli  w  preparatach  z  tych  materiałów  znajdą  się  bakterie  lub  inne  drobnoustroje,  to  są  one  czynnikami 

etiologicznymi obserwowanej choroby. 

2.  Materiały  pobrane  z  otwartych  miejsc  organizmu  –  mających  pośredni  lub  bezpośredni  kontakt  ze 

środowiskiem  poza  organizmem,  jak:  plwocina,  wymazy  z  jam  nosa,  gardła,  migdałków,  jamy  ustnej 

i zębodołów, otwartych ropni i przetok, wymazy i zeskrobiny ze zmian skórnych i paznokci, wymazy z ucha 

i ze spojówek, mocz pobrany metodą środkowego strumienia, wymazy z narządów moczowo-płciowych, treść 

żołądkowa i wymiociny, żółć pobrana przez sondę, kał i wymazy z odbytnicy. 

Jeżeli w preparatach z tych materiałów znajda się bakterie lub inne drobnoustroje to trzeba określić, czy są 

one odpowiedzialne za istniejące objawy chorobowe, czy też znajdują się jako flora normalna, albo dostały 

się do materiały przypadkowo. 

3.  Materiały  pobrane w  czasie  sekcji  zwłok  –  należy  pamiętać,  że  tylko  sekcja wykonana  kilka  godzin  po 

zgonie daje możliwość izolowania właściwych bakterii. 

Krew – badania serologiczno-immunologiczne 

Do  odczynów  serologicznych  (OWD,  aglutynacja  probówkowa,  odczyn  neutralizacji,  odczyny  precypitacyjne, 

odczyny immunoenzymatyczne i radioimmunologiczne, ASO i in.), wystarczy pobrać  do jałowej probówki 3-4 ml 

krwi bez cytrynianu sodowego. 

Krew – posiewy 

Jeden z najtrudniejszych działów diagnostyki mikrobiologicznej. Należy przygotować odpowiednie podłoża i zestaw 

do pobierania krwi oraz wyjałowić jodyną skórę nad żyłą, z której pobiera się krew w odpowiednim okresie choroby. 

Stosuje  się  ścisłą  a-  i  antyseptykę,  3  sterylne  igły  (wkłucie  do  żyły,  odpowietrzenie  pojemnika  z  podłożem  oraz 

wkłucie do pojemnika) oraz zabezpiecza się podłoże przed zanieczyszczeniem bezpośrednio po pobraniu. 

Posiew krwi od jednego chorego wykonuje się kilkakrotnie, najlepiej na 60 minut przed lub w czasie wystąpienia 

szczytu gorączki. 

Płyn MR 

Do  badań  pobiera  się  4-5  ml  płynu.  Najczęstsze  błędy  to  niezachowanie  pełnej  jałowości.  Płyn  należy  przenosić 

i przechowywać  w  temperaturze  30  stopni.  Płyn  MR  zawierający  ewentualne  meningokoki  należy  utrzymywać 

w temp 26-40 stopni. W niskich temperaturach meningokoki giną. 

Mocz 

Pobieramy  7-10  ml.  Powinno  się  pobierać  przez  cewnik,  ale  wtedy  często  dochodzi  do  zakażeń  Proteus, 

Pseudomonas,  Escherichia.  Obecnie  po  umyciu  narządu  moczowo-płciowego  pobiera  się  środkowy  strumień 

moczu. Do badania w kierunku obecności prątków gruźlicy pobiera się 500 ml. 

Gardło 

 

Pobieramy rano, na czczo i bez mycia zębów 

 

Rękawiczki jednorazowe i maseczka 

 

Pobieramy  materiał  ze  zmian  chorobowych  pręcikiem  zanurzonym  w  jałowej  soli  fizjologicznej, 

bez dotykania okolicznych tkanek, zwłaszcza języka 

  W nosie analogicznie – pobieramy z przedsionka nosa, z obu stron. Albo z przewodów nosowych, głębiej. 

Plwocina 

 

Pobiera się rano, na czczo, po przepłukaniu jamy ustnej i gardła przegotowaną wodą. 

  W diagnostyce gruźlicy zbiera się plwocinę przez cały dzień, przez odkrztuszanie. 

 

W  przypadku  trudności  można  zastosować  leki  wykrztuśne  albo  inhalację  prowokacyjną  za  pomocą 

mieszaniny roztworów NaCl i glikolu propylenowego. 

Inne informacje 

  Wszelkie  wymazy  szybko  wysychają,  co  powoduje  obumarcie  wrażliwych  bakterii.  W  razie  konieczności 

przechowywania wymazów należy na dno probówki nalać kilka kropli jałowego izotonicznego NaCl.  

 

Posiew kału w kierunku pałeczek czerwonki wykonuje się przy łóżku chorego. 

 

W skierowaniu oprócz danych szpitala, lekarza, chorego i rodzaju badań należy uwzględnić leki zażywane 

przez pacjenta, a także wrażliwość na rzadko stosowane antybiotyki.