Slajd 1

Nasienie

 plemniki


płyn nasienny (plazma nasienia)

wydzielina pęcherzyków nasiennych (60-70%)

- wydzielina prostaty (ok. 30%)

wydzielina jąder, najądrzy, gruczołów opuszkowo-cewkowych (5%)



komórki okrągłe (leukocyty, komórki spermatogenezy)



całkowita liczba plemników

– odzwierciedla wydajność produkcji

plemników przez jądra oraz drożność dróg wyprowadzających nasienie



całkowita objętość płynu nasiennego

– odzwierciedla aktywność

wydzielniczą gruczołów

Warunki wstępne badania nasienia:



Informacje dla pacjenta powinny być przekazane ustnie i umieszczone

w formie pisemnej w pokoju przeznaczonym do oddawania nasienia.



Do analizy musi być dostarczony cały ejakulat.



Wstrzemięźliwość płciowa – co najmniej 48 h, ale nie dłużej niż 7 dni.

W przypadku powtarzania badania wstrzemięźliwość płciowa powinna

być taka sama.



Badanie powinno być powtórzone przynajmniej dwukrotne w

odstępach nie krótszych niż 7 dni i nie dłuższych niż 3 tygodnie.

Warunki wstępne badania nasienia:



Badanie powinno być rozpoczęte przeciągu 1 h od ejakulacji.



Nasienie powinno być oddawane w specjalnym pomieszczeniu

niedaleko od laboratorium, drogą masturbacji do pojemnika ogrzanego

do temp. 20-37 C



W przypadku gdy pacjent nie jest w stanie oddać nasienia drogą

masturbacji możliwe jest użycie specjalnych prezerwatyw

przeznaczonych do tego celu.

 W przypadku badania mikrobiologicznego pacjent powinien:



oddać mocz



umyć ręce i penis mydłem



dokładnie wypłukać mydło



do wytarcia użyć jednorazowego ręcznika



oddać ejakulat do jałowego pojemnika

 Przez pierwsze 5 minut od ejakulacji:

Pojemnik z próbką nasienia umieścić w inkubatorze

(37

) na okres potrzebny do upłynnienia.



upłynnienie ocenić makroskopowo i mikroskopowo



w trakcie upłynniania umieścić pojemnik na mieszadle

rotacyjnym (temp. 20-37 C)



jeśli próbka nie upłynni się w przeciągu 30 min odczekać z
rozpoczęciem dalszych analiz kolejne 30 min.

ETAPY BADANIA NASIENIA



Po 30 nim ale przed upływem 60 minut od

ejakulacji:

czas upłynnienia

wygląd/kolor

lepkość/konsystencja

objętość

-pH

preparat bezpośredni (ruchliwość i rozcieńczenie)

żywotność (w przypadku niskiej ruchliwości)

-rozmaz do morfologii

-ocena liczby

ETAPY BADANIA NASIENIA



Po 30 nim ale przed upływem 60 minut od

ejakulacji:

- test MAR (mixed antiglobulin reaction)

ocena komórek peroksydazo-pozytywnych

- immunobead test (preparat)

- odwirowanie nasienia



Przed upływem 3 godzin od ejakulacji:

przesłanie próbki do badania mikrobiologicznego



Później ale tego samego dnia (lub następnego z

zamrożonej próbki)

ocena markerów czynności gruczołów dodatkowych

- immunobead test

ETAPY BADANIA NASIENIA

Upłynnianie nasienia:

Norma: do 60 min.
(zwykle 15 min.)

Prawidłowe nasienie jest homogenne i upłynnia się w

przeciągu 60 min w temperaturze pokojowej pod wpływem

enzymów pochodzących z

prostaty (PSA)

Obecność pasm śluzu może utrudniać procedurę liczenia

plemników i sugeruje stan zapalny lub zaburzenia upłynnienia.



upłynnienie można ocenić makroskopowo i/lub mikroskopowo



w trakcie upłynniania zaleca się umieścić pojemnik na mieszadle rotacyjnym

(temp. 20-37 C)



jeśli próbka nie upłynni się w przeciągu 30 min. odczekać z rozpoczęciem

dalszych analiz kolejne 30 min.

Nasienie nieupłynnione:

dodanie równej objętości

PBS w wersji Dulbecco

(

Dulbecco’s Posphate Buffered Saline) i wymieszanie pipetą

mechaniczne mieszanie strzykawką z igłą o średnicy wewnętrznej

0.84

– 0.69 mm

- trawienie roztworem 10 IU/ml bromeliny w Dulbecco-PBS

UWAGA:
Należy odnotować w wyniku użycie określonej metody i
uwzględnić rozcieńczenie przy ocenie liczby plemników

Preparat o dużym stopniu nieupłynnienia

może upośledzać zdolność plemników do

zapłodnienia

Obecność ciałek żelatynowych

UWAGA



Preparat o podwyższonej lepkości

może utrudniać

- ocenę ruchu

- ocenę koncentracji /całkowitej liczby plemników

- wykrycie plemników opłaszczonych przeciwciałami

- pomiary markerów biochemicznych

W celu zmniejszenia lepkości próbki stosujemy takie same metody

jak przy próbce nasienia nieupłynnionego.

Objętość:

Norma: 1,5 ml

Plazma nasienia produkowana jest głównie w gruczołach dodatkowych.

Większość wydzielana jest z pęcherzyków nasiennych a jedynie od 0,5

and 1 ml pochodzi z gruczołu krokowego.



Zważyć pojemnik przed oddaniem nasienia i zapisać masę



Zważyć pojemnik razem z nasieniem i zapisać masę



Obliczyć masę próbki



Obliczyć objętość próbki przy założeniu, że gęstość właściwa ejakulatu

wynosi 1 g /ml (1,043-1,102 g/ml)

 Metoda wagowa:



Metoda objętościowa:



nasienie może być oddane do specjalnego cylindra

miarowego o szerokim otworze



objętość odczytuje się ze skali z dokładnością do 0,1 ml

Niska objętość ejakulatu:

- utrata części próbki
- zablokowanie dróg wyprowadzających nasienie
- wrodzony obustronny brak nasieniowodów (niedorozwój
pęcherzyków nasiennych)

częściowy wytrysk wsteczny

niedobór androgenów

Wysoka objętość ejakulatu:

- wysięk w przypadku aktywnego zapalenia gruczołów dodatkowych

Ocena objętości nasienia poprzez aspirację próbki nasienia do skalowanej

pipety/strzykawki, lub przelanie do skalowanego cylindra/probówki

nie jest zalecane !!!

Utrata próbki rzędu 0.3 – 0.9 ml !!!

UWAGA

pH:

Wartość referencyjna: 7,2

Zakres papierków wskaźnikowych : 6.0 do 10.0 lub 6.5 do 10.0

Jeśli pH < 7,0 przy azoosprmii może to

oznaczać obustronną niedrożność

nasieniowodów

Ocenę należy przeprowadzić po

upłynnieniu nasienia ale nie później

niż 60 min od ejakulacji

GRUCZOŁ KROKOWY

PĘCHERZYKI

NASIENNE

Wydzielina

kwaśna

Wydzielina zasadowa



Wstępna ocena preparatu bezpośredniego (pow. 100x):

•

występowanie pasm śluzu

• agregacja lub aglutynacja plemników

• obecność komórek innych niż plemniki tj. leukocytów,

niedojrzałych komórek spermatogenezy, komórek

nabłonkowych

Ocena mikroskopowa preparatów:

Preparat nasienia musi być bardzo dokładnie wymieszany przed

wykonaniem każdej analizy!!

Do mieszania polecana jest jednorazowa pipetka Pasteura o szerokim ujściu

(1,5 mm). Należy delikatnie zaaspirowaś próbkę około 10 razy.

Nie stosować vortexu, ponieważ powoduje uszkodzenia plemników.

Ocena ruchu plemników:

Kategorie ruchu:
PR

- ruch postępowy (niezależnie od szybkości)

- ruch niepostępowy

- brak ruchu

Wartość referencyjna:

40% PR + NP

lub

32% PR

22 mm

10 µl

Głębokość 20µm

Oceniamy 2 x przynajmniej 200 plemników

– 30% 50%

- 5% 15%

- 65% 35%

Średnia = (65+35):2 = 50

Różnica = 65 – 35 = 30

200

Wynik do

powtórzenia

– 37% 28%

- 3% 6%

- 60% 66%

Średnia = (60+66):2 = 63

Różnica = 66 – 60 = 6

200

Wynik

prawidłowy

PR 32%; NP 4%; IM 63%

Żywotność plemników



Żywotność plemników

– ocena integralności błony komórkowej

powinna zawsze

być wykonywana w próbkach nasienia z

nieprawidłowym ruchem plemników (<40% PR), ale

może

być

wykonywana rutynowo dla każdej próbki nasienia

Żywotność plemników:

Test eozyna/nigrozyna

- Test eozynowy

- Test wodny (HOS Test)

Wartość referencyjna:

58 % plemników żywych

Ocena:

Oceniamy 2 x przynajmniej 200 plemników

X 400

X 1000

Test eozyna/nigrozyna

- zmieszać po 50 µl nasienia i roztworu eozyna-nigrozyna
- wykonać rozmaz
- oceniać od razu po wyschnięciu, lub później po zatopieniu w
odpowiednim (bezwodnym) medium, pod imersją (1000x)

Plemniki nieżywe

- główki czerwone

- ciemnoróżowe

Plemniki żywe

- główki białe

- jasnoróżowe

Test eozynowy

- pobrać po 5 µl

(lub po 10 µl)

nasienia i roztworu eozyny na szkiełko

mikroskopowe, dokładnie wymieszać
-przykryć szkiełkiem nakrywkowym (22x22mm)

(lub 24x40 mm)

- po 30 min. oceniać pod powiększeniem 200 lub 400 x (najlepiej w
mikroskopie kontrastującym fazy)

Plemnik nieżywy

- główki czerwone

- ciemnoróżowe

Plemniki żywe

- główki niezabarwione

- jasnoróżowe

Test hipoosmotyczny (HOS test)

- pobrać po 100 µl nasienia i roztworu hipotonicznego
- inkubować w 37ºC przez 5 min (ICSI) lub 30 min (badania nasienia)
- pobrać 10 µl na szkiełko, przykryć szkiełkiem nakrywkowym (22x22
mm) i oceniać pod powiększeniem 200x lub 400x najlepiej w
mikroskopie kontrastującym fazy

- alternatywa do testów barwionych
- używany gdy należy uniknąć barwienia plemników (plemniki do ICSI)

Plemniki żywe

- różne typy

puchnięcia witki

Plemnik nieżywy

-brak efektu

puchnięcia witki

Agregacja

–przyleganie (na zasadzie adhezji)

nieruchomych plemników do siebie oraz

przyleganie ruchomych plemników do pasm śluzu

i innych nieruchomych elementów nasienia

komórka

nabłonkowa

ciałka

resztkowe

plemniki

– główka do główki

– witka do witki

(główki wolne)

– koniec witki do

końca witki

– mieszana (razem

głowka-głowka i witka-

witka)

– plątanina (główki i

witki zaplątane; głowki

w aglutynacie witek))

– izolowana

<10

plemników

– masywna,

brak wolnych

plemników

– średnia

10 – 50

plemników

– duża

> 50

plemników

Typ

Stopień

Ocena liczby plemników:

Badanie wstępne:

Określenie właściwego rozcieńczenia (preparat bezpośredni)

-Pow. 400x (HPF

– high power field)

22 mm

10 µl

4 nl

50g NaHCO

+10ml 35% formaliny uzupełnić

wodą dest. do 1000ml

1. Określenie właściwego rozcieńczenia



korzystamy z preparatu bezpośredniego używanego do oceny ruchu



oglądamy

jeden

z preparatów bezpośrednich



oceniamy liczbę plemników w polu widzenia na podstawie

przynajmniej 5 pól mikroskopu (HPF – high power filed; 200x lub 400x)

22 mm

10 µl

4 nl

pow. 400x



Jedno pole widzenia to zwykle

– ok.

16 nl objętości

próbki nasienia przy powiekszeniu 200x

- ok.

4 nl objętości

próbki nasienia przy powiększeniu 400x

Kamera Neubauera

Głębokość 100 µm

3 mm

1 mm

20 nl

25 nl

22 mm

4 nl

100 plemników

500 plemników

4 nl 100 plemników

20 nl 500 plemników

100 nl 2500 plemników

Rozcieńczenie:

1:5 (1+4) 100 nl 500 plemników

Liczba plemników

w polu widzenia

(pow. 400x)

Rozcieńczenie

Numery pól do

zliczania plemników

< 2

(1 + 1)

wszystkie 9 pól

2-15

(1 + 1)

pole nr 5,4,6

16-100

(1 + 4)

pole nr 5,4,6

> 101

(1 + 19)

pole nr 5,4,6

C = (N/n) x (1/20) x

wsp. rozcieńczenia

C = (N/n) x (1/100) x

– liczba zliczonych plemników

- liczba rzędów

Przykład:

rozcieńczenie 1+4 (1:

)

C = (N/n) x (1/20) x

C = (N/n) x (1/4)

215

plemników

rzędach

224

plemników

rzędach

Suma:

215

224

= 439

Różnica:

224

–

215

= 9

C =

(215 + 224) /(6 +6) x (1/4)

C = 9,1 x 10

/ml

Postępowanie w przypadku bardzo niskiej liczby plemników

22 mm

4 nl

Ok. 4 plemniki

< 1 mln/ml

Ok. 2 plemniki

< 0,5 mln/ml

rozcieńczenie 1+1 (1:

)

C = (N/n) x (1/100) x

C = (N/n) x (1/50)

Gdzie N –liczba zliczonych plemników

n – liczba zliczonych siatek (9+9=18)

Postępowanie w przypadku bardzo niskiej liczby plemników

Jeśli w preparacie przyżyciowym nie znaleziono plemników należy:



próbkę odwirować przy 3000

przez 15 min.



cały osad rozprowadzić na szkiełku podstawowym



przykryć szkiełkiem nakrywkowym (zalecane 20 x 50 mm)



oglądać cały preparat w poszukiwaniu plemników.



jeśli nie znaleziono żadnego plemnika jest to

azoospermia



jeśli znaleziono plemniki jest to

kryptozoospermia

Pow.

200x

Oceniamy ok.1200 pól widzenia

Budowa morfologiczna plemników:

Norma:

4% o prawidłowej budowie

(Kruger strict criteria)

Metody barwienia:

-Papanicolaou
-Shorr
-Diff-quick

Budowa morfologiczna plemników:

długość główki 4 – 5

długość wstawki

ok. 5 – 7 um

długość witki

ok. 45 um um

szerokość główki
2.5 – 3.5 um

szerokość wstawki

poniżej 1 um

region akrosomalny

40 – 70% powierzchni główki

Główka

– regularny zarys, owalna z wyraźnie

zaznaczonym

akrosomem

zajmującym od

40-

70%

powierzchni ; dopuszcza się obecność

małych wakuoli

w regionie akrosomalnym,

których powierzchnia nie przekracza 20%
powierzchni główki; region postakrosomalny nie
może zawierać wakuoli

Wstawka

– smukła, regularna w zarycie o

podobnej długości jak główka; główna oś
wstawki powinna byś przedłużeniem długiej osi
główki; przywieszka cytoplazmatyczna nie
powinna przekraczać 1/3 wielkości główki

Witka

– jednakowa grubość na całej długości,

cieńsza od wstawki, długość 45 m (ok. 10
długości główki); może wykazywać wygięcia,
jednak nie pod ostrym kątem sugerującym
złamanie witki

Komórka nabłonkowa

Makrofag degenerujący?

Granulocyt obojętnochłonny

Spermatyda

Granulocyt obojętnochłonny

Bakterie

makrofag

cytoplazma

spermatocyty

dzieląca się

spermatyda

degenerująca

spermatyda

dzieląca się

spermatyda

cytoplazma

spermatyda

degenerujące

spermatydy

dzielący się

spermatocyt

fagocytujący

makrofag

spermatyda

monocyt

granulocyty

obojętnochłonne

degenerujący leukocyt

Ocena „komórek okrągłych”:

Komórki nabłonkowe cewki moczowej

Komórki prostaty

Komórki spermatogenezy

Leukocyty

- neutrofile

– 50 – 60 %

- makrofagi

– 20 – 30 %

- limfocyty

– 2 – 5 %

Immunocytochemiczne barwienie

na obecność antygenu CD45

(wszystkie leukocyty)

Leukocyty:

Komórki preoksydazo-dodatnie

(granulocyty obojętnochłonne)

Wartości referencyjne w badaniu nasienia

WHO 2010

Objętość ejakulatu

1,5 ml

2 ml

7,2

Koncentracja plemników

15 mln/ml

20 mln/ml

Całkowita liczba plemników

39 mln/ejakulat

40 mln/ejakulat

Ruch plemników

40% kat. PR+NP lub; 32 % kat. PR (WHO 2010)

50% kat. a i b lub; 25 % kat. a (WHO 1999)

Morfologia plemników

4 % o prawidłowej budowie (WHO 2010)

14 % o prawidłowej budowie (WHO 1999)

30 % o prawidłowej budowie (WHO 1992)

Żywotność plemników

58%

żywych

50%

żywych