(Microsoft Word - 7. Fosfataza kwa\234na.doc)

Ćwiczenie 7

ENZYMY. KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH

Część doświadczalna obejmuje:

− wyznaczenie optimum pH dla reakcji katalizowanej przez kwaśną fosfatazę

− wyznaczenie szybkości początkowej reakcji katalizowanej przez kwaśną fosfatazę

WPROWADZENIE

Fosfataza kwaśna (EC 3.1.3.2) – „enzym znacznikowy” lizosomów, głównego miejsca

trawienia wewnątrzkomórkowego

Fosfatazy to grupa enzymów należących do klasy hydrolaz (klasa 3 – obejmuje en-

zymy rozszczepiające wiązania z udziałem cząsteczki wody, Tabela 1), podklasy enzymów

hydrolizujących wiązania estrowe (esterazy), podpodklasy hydrolaz monoestrów fosforano-

wych.

Tabela 1. Klasy enzymów (Koolman i Röhm 2005)

Fosfatazy katalizują odszczepienie reszty fosforanowej od cukrowców, białek, tłuszczowców,

nukleotydów i wielu innych naturalnych estrów kwasu fosforowego według poniższej reakcji:

R-O-PO

H¯ + H

O R-OH + H

Poza naturalnymi substratami, hydrolazy monoestrów fosforanowych rozszczepiają także

estry fosforanowe fenoli, np. p-nitrofenylofosforan.

Fosfatazy działają w pH alkalicznym, z optymalnym pH w zakresie 9,0 – 11,0, jak

również w pH kwaśnym i obojętnym, w zakresie 4,5 – 7,0. Te ostatnie są typowe dla komórek

roślinnych, chociaż nie brakuje ich także w komórkach zwierzęcych, gdzie występują przede

wszystkim w lizosomach, niewielkich błonowych pęcherzykach będących głównym miej-

scem trawienia wewnątrzkomórkowego. Lizosomy zawierają specyficzny zestaw hydrolaz,

optymalnie aktywnych w środowisku kwaśnym, uczestniczących w rozkładzie organelli ko-

mórkowych i wszystkich rodzajów makrocząsteczek dostarczanych do komórki różnymi dro-

gami. Wiodącym enzymem jest tu kwaśna fosfataza uznawana za tzw. „enzym znaczniko-

wy” lizosomów. Kwaśne środowisko światła lizosomu (pH ~ 5) jest utrzymywane dzięki

działaniu błonowej H

-ATPazy, pompującej H

z cytozolu do wnętrza lizosomu (Ryc. 1).

Ryc. 1. Schemat lizosomu (Alberts i wsp. 1999)

W obojętnym pH cytoplazmy (pH 7 – 7,3), hydrolityczne enzymy lizosomalne wykazują ni-

ską aktywność. Jest to przypuszczalnie mechanizm obronny przed samoistnym strawieniem

fosfataza

komórki, w przypadku, gdyby enzymy dostały się do cytoplazmy. W komórkach roślin i

grzybów rolę lizosomów pełni wakuola komórkowa. Kwaśny odczyn wnętrza wakuoli, istot-

ny dla aktywności występujących tam enzymów hydrolitycznych, jest utrzymywany dzięki

działaniu dwóch pomp protonowych (H

-ATPazy i H

-PPazy) zlokalizowanych w błonie ota-

czającej wakuolę, tzw. tonoplaście.

Podstawy kinetyki enzymatycznej

Kinetyka enzymatyczna stanowi dział enzymologii zajmujący się zagadnieniami zwią-

zanymi z szybkością reakcji katalizowanych enzymatycznie. Szybkość reakcji enzymatycz-

nej (V), która jest miarą aktywności, czyli katalitycznego działania enzymu, mierzy się

podobnie jak szybkość reakcji chemicznych. Jest ona w pewnym zakresie proporcjonalna do

stężenia substancji reagujących; wyznacza ją przyrost stężenia produktu reakcji w czasie.

Miarą szybkości reakcji w danym momencie jest więc wzrost stężenia produktu, jaki następu-

je w jednostce czasu.

Aktywność enzymatyczną wyrażamy w dwóch standardowych jednostkach. Są to:

jednostka enzymatyczna (U) oraz katal (kat). Jednostka enzymatyczna (U) jest to taka

ilość enzymu, która katalizuje przekształcenie 1

µmola substratu w ciągu 1 minuty, w warun-

kach optymalnych dla danego enzymu. Katal (kat) jest jednostką aktywności enzymatycznej

obowiązującą w układzie SI i jest definiowany jako aktywność katalityczna, która zwiększa

szybkość reakcji o 1 mol na sekundę, w warunkach optymalnych.

Przy stałym stężeniu enzymu i substratu szybkość powstawania produktu reakcji powinna być

wprost proporcjonalna do czasu reakcji. W rzeczywistości tylko w początkowej fazie reakcja

ta jest reakcją pierwszego rzędu (Ryc. 2), co znaczy, że szybkość działania enzymu jest li-

niową funkcją czasu – jest to tzw. szybkość początkowa reakcji enzymatycznej (V

Ryc. 2. Wzrost ilości produktu reakcji enzymatycznej w czasie

Należy pamiętać, że w analizach in vitro stężenie substratu maleje w czasie reakcji i przy

dłuższym czasie inkubacji zależność pomiędzy przyrostem produktu, a czasem reakcji nie

będzie funkcją liniową (Ryc. 2). Również enzym w trakcie wykonywania oznaczeń może

ulegać denaturacji, co pogłębia powyższy efekt. Wartość V

uzyskuje się przez wykreślenie

linii prostej stycznej do początkowego odcinka krzywej, poczynając od czasu zerowego

(Ryc. 2). Nachylenie tej prostej ma wartość V

. Dla badań kinetyki enzymów in vitro niezwy-

kle ważne jest więc określenie czasu reakcji, w którym przyrost produktu reakcji enzyma-

tycznej jest wprost proporcjonalny do czasu.

Szybkość reakcji enzymatycznej zależy od wielu czynników fizycznych i chemicznych, ta-

kich jak: stężenie enzymu, stężenie substratu, temperatura, pH, stężenie aktywatorów i inhibi-

torów. Większość enzymów wykazuje maksymalną aktywność w środowisku o określonym

stężeniu jonów wodorowych (w określonym pH). Wynika to stąd, że w katalizie enzymatycz-

nej biorą udział, między innymi, zjonizowane grupy funkcyjne centrum aktywnego. Odsetek

cząsteczek enzymu, w których grupy kwasowe lub zasadowe znajdują się w formie jonowej,

zależy od pK tych grup i stężenia jonów wodorowych w roztworze. Zależność aktywności

enzymatycznej od pH przyjmuje najczęściej postać krzywej w kształcie dzwonu (Ryc. 3).

Ryc. 3. Zależność aktywności enzymu od pH (Koolman i Röhm 2005)

produkt (

µmole)

czas (min)

Rozpiętość optimum pH, czyli takiej wartość pH, przy której aktywność jest maksymalna,

jest bardzo duża. Dla wielu enzymów optimum pH znajduje się w pobliżu pH komórki (pH

7,0), ale np. pepsyna (EC 3.4.23.1) występująca w kwaśnym środowisku żołądka wykazuje

najwyższą aktywność w pH około 2,0, a arginaza (EC 3.5.3.1.) w pH powyżej 10,0. Optymal-

ną wartość pH, która jest jedną z wartości liczbowych charakteryzujących dany enzym, wy-

znacza się z wykresu zależności aktywności od pH.

WYKONANIE

Zasada metody

W ćwiczeniu, do wyznaczenia optimum pH, podobnie jak w wyznaczaniu szybkości

początkowej reakcji, stosuje się metodę, w której naturalny substrat kwaśnej fosfatazy zo-

staje zastąpiony sztucznym substratem – p-nitrofenylofosforanem (analogiem naturalnego

substratu). Enzym hydrolizując p-nitrofenylofosforan, uwalnia p-nitrofenol, który w środowi-

sku zasadowym tworzy żółto zabarwiony anion p-nitrofenolanowy.

fosfataza

O N

p-nitrofenylofosforan (pNPP) p-nitrofenol (pNP)

Natężenie barwy mierzone przy

λ = 405 nm jest proporcjonalne do ilości zhydrolizowanego

substratu. Ryc. 4 przedstawia widmo absorpcyjne p-nitrofenylofosforanu (pNPP) i p-

nitrofenolu (pNP).

Ryc. 4. Widmo absorpcyjne pNPP i
pNP w środowisku alkalicznym

Odczynniki:

1. 8 mM p-nitrofenylofosforan w H

2. 0,1M NaOH

3. 0,9% NaCl

4. 0,5 M bufory Tris-octan o pH 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5

Materiał:

Wyciąg z ziemniaka: obrany i umyty ziemniak zetrzeć na tarce, przesączyć przez warstwę

nylonu. Odstawić do lodówki.

Wyznaczanie optimum pH kwaśnej fosfatazy

Do probówek napipetować po: 0,25 ml 8 mM p-nitrofenylofosforanu i 0,25 ml odpo-

wiedniego buforu, kolejno od pH 4,0 do 6,5. Próby wykonać w dwóch powtórzeniach dla

każdego pH. Starannie wymieszać zawartość probówek i wstawić je do łaźni wodnej o temp.

C (preinkubacja). Wyciąg z ziemniaka zawierający kwaśną fosfatazę rozcieńczyć 250x

używając 0,9% roztworu NaCl (w cylinderku miarowym na 25 ml).

Do preinkubowanych prób zawierających napipetowany substrat i bufor dodawać, w

odstępach co 30 sekund, po 0,5 ml rozcieńczonego roztworu enzymu. Próby inkubować 15

minut w temperaturze 30

C, po czym reakcję przerwać dodając do każdej z nich po 5 ml

0,1M roztworu NaOH, w odstępach co 30 sekund i w kolejności takiej jak dodawano enzym.

Próbę kontrolną (zerową) wykonać równolegle z próbami badanymi postępując na-

stępująco: do probówki napipetować 0,25 ml buforu o pH 5,0 oraz 0,25 ml roztworu p-

nitrofenylofosforanu. Mieszaninę inkubować 15 minut w łaźni wodnej razem z próbami ba-

danymi, po czym dodać 5 ml 0,1 M roztworu NaOH, a na końcu dodać 0,5 ml enzymu (en-

zym w takich warunkach nie będzie już działał, ponieważ roztwór zawiera wysokie stężenie

NaOH).

Natężenie barwy zmierzyć wobec próby zerowej przy

λ = 405 nm. Wykreślić krzywą

zależności szybkości hydrolizy p-nitrofenylofosforanu (wyrażoną jako absorbancja przy

405nm) od pH.

Wyznaczanie szybkości początkowej reakcji

Wyznaczanie szybkości początkowej reakcji hydrolizy p-nitrofenylofosforanu należy

wykonać używając 4 lub 5 różnych rozcieńczeń wyciągu z ziemniaka (różne stężenie enzy-

mu). Każda para ćwiczeniowa przygotowuje jedno z wybranych rozcieńczeń wyciągu, np.

10x, 50x, 100x lub 250x (wyciąg należy rozcieńczyć 0,9% roztworem NaCl w cylindrze mia-

rowym na 25 ml) i wykonuje oznaczenie szybkości początkowej dodając do mieszaniny reak-

cyjnej wyciąg o określonym rozcieńczeniu (każda para inne rozcieńczenie!).

Do suchych probówek napipetować po 0,25 ml buforu octanowego o pH optymalnym

dla aktywności kwaśnej fosfatazy (zwykle jest to pH 5,5) i 0,25 ml roztworu substratu (próby

wykonać w dwóch powtórzeniach). Każda próba zawiera zatem po 0,5 ml mieszaniny inku-

bacyjnej o pH optymalnym dla fosfatazy kwaśnej. Próby wstawić do łaźni wodnej o tempera-

turze 30

C. Reakcję enzymatyczną rozpocząć dodając do każdej próby, w odstępach co 30

sekund, po 0,5 ml ekstraktu ziemniaczanego o odpowiednim rozcieńczeniu (10x, 50x,

100x lub 250x). Próby inkubować: 2, 4, 6, 8, 10 i 12 minut. Reakcję przerwać dodając, w

30-sekundowych odstępach, po 5 ml 0,1M roztworu NaOH w kolejności takiej jak dodawa-

no enzym.

Próby zerowe należy przygotować następująco: do probówki napipetować 0,25 ml

buforu o pH 5,5 oraz 0,25 ml p-nitrofenylofosforanu. Mieszaninę inkubować 12 minut w łaź-

ni wodnej razem z próbami badanymi, po czym dodać 5 ml 0,1M roztworu NaOH i na koniec

0,5 ml enzymu o danym rozcieńczeniu.

Dokonać pomiaru absorbancji przy

λ = 405 nm wobec próby zerowej. Na podstawie

otrzymanych wyników należy wykreślić zależność szybkości hydrolizy p-nitrofenylofos-

foranu (wyrażonej jako wartości absorbancji przy 405 nm) od czasu inkubacji, dla odpowied-

niego rozcieńczenia enzymu. Wszystkie pary ćwiczeniowe wymienią się wynikami, a następ-

nie każda osoba wykona jeden wykres, który będzie przedstawiał wyniki uzyskane przez całą

grupę ćwiczeniową. Należy przeanalizować przebieg krzywych zależności dla poszczegól-

nych rozcieńczeń enzymu!

Zagadnienia do przygotowania:

− podstawy katalizy enzymatycznej (zbliżenie i orientacja substratu, eliminacja wody, stabi-

lizacja stanu przejściowego, przenoszenie grup funkcyjnych)

− kinetyka reakcji enzymatycznych (aktywność enzymatyczna, jednostki aktywności, teoria

wysyceniowa Michaelisa-Menten, szybkość początkowa, szybkość maksymalna )

− enzymy izosteryczne i allosteryczne

− klasyfikacja i nomenklatura enzymów