Biochemia
ŻYWIENIE CZŁOWIEKA
Ćwiczenie 3
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Katedra Biotechnologii Żywności
1
Ćwiczenie 3
Temat: WPŁYW STĘŻENIA SUBSTRATU I OBECNOŚCI INHIBITORÓW
NA SZYBKOŚĆ REAKCJI ENZYMATYCZNEJ.
WYZNACZANIE STAŁEJ MICHAELISA K
M
.
Część teoretyczna
Szybkość reakcji chemicznej jest w każdej chwili proporcjonalna do stężenia substancji re-
agujących i oznacza stosunek przyrostu stężenia produktu reakcji (lub ubytku substratu) do czasu, w
którym ten przyrost (ubytek) nastąpił. Miarą szybkości w danym momencie jest więc przyrost stę-
żenia produktu (lub ubytek stężenia substratu), jaki by nastąpił w jednostce czasu, gdyby szybkość
reakcji w tym okresie była niezmienna. Wobec tego, że szybkość ta się zmienia (maleje wskutek
wyczerpywania się reagujących substancji), przyrosty czasu, w którym mierzone są stężenia, po-
winny być możliwie krótkie.
Przy stałym stężeniu enzymu szybkość reakcji enzymatycznej zależy w pewnych granicach
od stężenia substratu. Przy bardzo niskim stężeniu substratu szybkość reakcji zależy liniowo
(wprost proporcjonalnie) od tego stężenia (reakcja rzędu I). Przy bardzo wysokich - w stosunku do
stężenia enzymu - stężeniach substratu szybkość reakcji ma wartość maksymalną i niezależną od
dalszego zwiększania stężenia (reakcja rzędu 0). Przy pośrednim stężeniu substratu mamy do czy-
nienia z reakcją rzędu ułamkowego. Takie stężenie substratu, przy którym szybkość reakcji osiąga
wartość równą połowie szybkości maksymalnej (1/2 V
max
), wyrażone w molach na dm
3
ewentualnie
w gramach na dm
3
- określa się mianem stałej Michaelisa-Menten (K
m
). Im mniejszego potrzeba
stężenia substratu (S) aby uzyskać szybkość reakcji równą 1/2 V
max.
, tym mniejsza jest wartość K
m
i
tym większe powinowactwo enzymu do substratu, będące odwrotnością stałej Michaelisa,
(1/K
m
).
Wyznaczenie wartości K
m
pozwala określić stopień powinowactwa różnych enzymów i róż-
nych substratów. Dla reakcji hamowanych można tym sposobem określić charakter i intensywność
inhibicji. W przypadku inhibicji kompetycyjnej (współzawodniczącej) wartość K
m
będzie większa
(mniejsze powinowactwo enzymu do substratu) niż w reakcji niehamowanej, a szybkość maksy-
malna reakcji nie ulegnie zmianie. Natomiast w przypadku reakcji hamowanej niekompetycyjnie
(niwspółzawodnicząco) wartość K
m
pozostanie bez zmian, obniżeniu ulegnie natomiast szybkość
maksymalna takiej reakcji. Jeżeli wzrostowi stałej Michaelisa-Menten będzie towarzyszył jedno-
cześnie spadek szybkości reakcji enzymatycznej to mamy do czynienia z inhibicją o charakterze
mieszanym. Substancje zmniejszające szybkość reakcji enzymatycznej (hamujące) nazywane są in-
hibitorami. Inhibitory enzymów należą do narkotyków, środków konserwujących, różnego rodzaju
trucizn i toksyn. Inhibitorami są również związki tworzące kompleksy z metalami będącymi częścią
centrum katalitycznego lub biorącymi udział w procesie katalitycznym. Należą tu np. cyjanki,
azydki, H
2
S i CO, które upośledzają oddychanie komórkowe, hamując większość oksydaz z Fe lub
Cu w grupie czynnej. Na zasadzie inhibicji kompetycyjnej działa także wiele leków stosowanych
np. w leczeniu hipercholesterolemii i AIDS.
Biochemia
ŻYWIENIE CZŁOWIEKA
Ćwiczenie 3
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Katedra Biotechnologii Żywności
2
Część praktyczna
1. WYZNACZANIE V
MAX
, K
M
I TYPU INHIBICJI DLA REAKCJI HYDROLIZY
SACHAROZY PRZEZ INWERTAZĘ DROŻDŻOWĄ.
Inwertaza (sacharaza, -fruktofuranozydaza) należy do hydrolaz katalizujących rozszczepia-
nie wiązań -glikozydowych w cząsteczkach sacharozy z uwolnieniem cząsteczek glukozy i frukto-
zy. Sacharoza jest -D-glukopiranozylo- -fruktopiranozydem, jej hydroliza może więc dotyczyć
dwóch różnych wiązań glikozydowych: -glukopiranozydowego (od strony pierścienia glukozy)
lub -fruktofuranozydowego (od strony pierścienia fruktozy).
Rzeczywiście wydzielono dwie grupy inwertaz posiadające zdolność katalizowania jednej lub
drugiej reakcji. Inwertaza izolowana z drożdży piekarskich jest -fruktozydazą, tzn. katalizuje hy-
drolizę fruktozydów, a glikozydy nie ulegają jej działaniu. Hydrolizę sacharozy nazywa się inwersją
i stąd nazwa enzymu – inwertaza. Katalizowaną przez inwertazę reakcję inwersji sacharozy wyko-
rzystuje się na skalę przemysłową do otrzymywania „cukru inwertowanego”, będącego namiastką
miodu (miód pszczeli jest mieszaniną fruktozy i glukozy). Optymalne pH działania inwertazy wy-
nosi około 5,0 a przy pH równym 10 enzym ten jest już zupełnie nieaktywny. Aktywność inwertazy
można mierzyć metodą redukcyjną, ponieważ w miarę postępowania hydrolizy sacharozy wzrasta
stężenie cukrów redukujących. Pozwala to wyznaczyć szybkości początkowe reakcji przy różnych
stężeniach substratu (sacharozy) i z wykresu Michaelisa-Menten lub Lineweavera-Burka wyzna-
czyć stałą Michaelisa. Inhibitorami aktywności katalitycznej inwertazy są np. glicerol, mocznik,
AgNO
3
.
Odczynniki:
0,1 mg% roztwór inwertazy drożdżowej w 0,05 M buforze cytrynianowym o pH 5,2
0,5%, 1%, 2%, 4%, 6%, 8% i 12%, roztwór sacharozy w 0,05 M buforze cytrynianowym o
pH 5,2
wzorcowy roztwór glukozy o stężeniu 12 mg%, z którego należy sporządzić wzorce o stęże-
niach: 0 mg%, 6 mg% i 12 mg%, to znaczy rozlać do probówek:
0 mg% - 2 ml
wody destylowanej
6 mg% - 1 ml
wody destylowanej + 1 ml
glukozy 12 mg%
12 mg% - 2 ml glukozy 12 mg%
odczynniki do metody Somogyi–Nelsona
1 M roztwór mocznika w 0,05 M buforze cytrynianowym o pH 5,2
Postępowanie:
Przygotować trzy szeregi po 5 probówek. Do pierwszych dwóch szeregów probówek odmie-
rzyć po 1 ml przygotowanych uprzednio roztworów substratu (sacharozy), zaczynając od najniższe-
go stężenia, a więc 0,5%, a kończąc na najwyższym czyli 6%. Pierwszy z tych szeregów będzie sta-
nowił serię kontrolną, a drugi serię prób właściwych. Do trzeciego szeregu probówek rozlać naj-
pierw po 0,5 ml roztworu mocznika (inhibitora), a następnie po 0,5 ml odpowiednich roztworów
sacharozy, zaczynając od stężenia 1% a kończąc na stężeniu 12% (patrz poniższa tabela!!). Szereg
ten będzie stanowił próby właściwe z inhibitorem.
rodzaj prób
stężenie substratu
próby kontrolne
0,5%
1%
2%
4%
6%
próby właściwe
0,5%
1%
2%
4%
6%
właściwe z inhibitorem
1%
2%
4%
8%
12%
Biochemia
ŻYWIENIE CZŁOWIEKA
Ćwiczenie 3
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Katedra Biotechnologii Żywności
3
a) próby właściwe bez inhibitora i z inhibitorem: wstawić do łaźni wodnej o tempera-
turze 30
o
C (± 0,1
o
C) na ok. 3 minuty w celu dogrzania. Następnie dodawać do nich w
odstępach trzydziestosekundowych (ze stoperem ) po 1 ml roztworu enzymu - inwer-
tazy, wymieszać przez wstrząsanie i inkubować przez dokładnie 10 minut w łaźni
wodnej o temp. 30
o
C. Reakcję przerywać dodając do każdej probówki (zachowując
kolejność i odstępy czasowe) po 2 ml miedziowego odczynnika Somogyi. Wyjąć pro-
bówki z łaźni i wymieszać.
b) serie kontrolne: dodawać najpierw 2 ml
miedziowego odczynnika Somogyi a później
1 ml roztworu enzymu i dobrze wymieszać. Inkubacja przez 10 minut nie jest tu po-
trzebna.
c) wzorce glukozy: należy także dodać po 2 ml
odczynnika Somogyi.
d) Oznaczanie cukrów redukujących metodą Somogyi – Nelsona,
Ustawić na statywie metalowym probówki z próbami właściwymi (z inhibitorem
i bez), kontrolnymi i wzorcami glukozy. Wstawić statyw na wrzącą łaźnię wodną i go-
tować przez 10 minut (stoper). Po ostudzeniu dodawać po 2 ml odczynnika arseno-
molibdenowego, intensywnie wstrząsając probówki aż do całkowitego rozpuszczenia
osadu i wypienienia roztworu. Następnie zawartość probówek uzupełnić do kreski
wodą destylowaną i dobrze wymieszać zatykając probówki korkiem. Odczytać absor-
bancję wszystkich prób na spektrofotometrze przy długości fali 500 nm. Barwa roz-
tworu po rozcieńczeniu jest trwała przez około 45 minut.
e) Opracowanie wyników.
Ilość cukrów redukujących, w przeliczeniu na glukozę, odczytać z krzywej
wzorcowej. Wyniki przedstawić graficznie. Sporządzić krzywą wysycenia enzymu
substratem tj. zależność V = f (S), gdzie: V = ilość glukozy wytworzona w ciągu 15
minut inkubacji, S = stężenie substratu (sacharozy)
Wyznaczyć szybkość maksymalną (V
max
) i stałą Michaelisa–Menten (K
m
) dla
reakcji hydrolizy sacharozy w obecności inhibitora i bez inhibitora.
Ostatnie zmiany: 13.02.2013