6 klas enzymów :

1. Oksydoreduktazy → Reakcje oksydacyjno-redukcyjne

2. Transferazy → Przenoszenie grup funkcyjnych

3. Hydrolazy → Reakcje hydrolizy

4. Liazy → Enzymy odszczepiaj¡ce od substratów okre±lon¡ grup¦ (niehydrolitycznie) z wy-

tworzeniem podwójnego wi¡zania lub odwrotnie, przyª¡czaj¡ce grupy do podwójnych wi¡-

za«

5. Izomerazy → Izomeryzacja

6. Ligazy → Enzymy katalizuj¡ce reakcje syntezy, którym towarzyszy odszczepienie reszt

kwasu fosforowego od ATP lub analogicznego trójfosforanu

1 Hydrolazy

Do jednej z najliczniej reprezentowanej klasy enzymów zaliczaj¡ si¦ hydrolazy (EC 3), katalizuj¡-

ce reakcje hydrolizy wi¡za« chemicznych wyst¦puj¡cych w zwi¡zkach naturalnych. Przedmiotem

niniejszego ¢wiczenia b¦dzie oznaczanie aktywno±ci enzymatycznej bydl¦cej ?-trypsyny. Gªów-

n¡ podklas¡ hydrolaz stanowi¡ enzymy uczestnicz¡ce w hydrolizie wi¡za« peptydowych. S¡ one

okre±lane ogólnym terminem peptydaz lub proteaz (EC 3.4). Ze wzgl¦du na rodzaj substratu i

poªo»enie wi¡zania peptydowego ulegaj¡cego hydrolizie, proteazy mo»na podzieli¢ na dwie kate-

gorie:

1. egzopeptydazy, które katalizuj¡ reakcje hydrolizy wi¡za« peptydowych w maªych peptydach

i wymagaj¡ obecno±ci wolnej N- lub C-ko«cowej grupy funkcyjnej,

2. endopeptydazy (zwane te» proteinazami), które wykazuj¡ aktywno±¢ enzymatyczn¡ w sto-

sunku do protein.

W zale»no±ci od mechanizmu dziaªania proteinazy podzielono na cztery podgrupy: serynowe,

cysteinowe, aspartylowe i metaloproteinazy.

2 Sposoby regulacji aktywno±¢i enzymów

1. poprzez odwracaln¡ mody?kacj¦ kowalencyjn¡

2. poprzez aktywacj¦ proteolityczn¡

3. poprez oddziaªywania allosteryczne

4. wi¡zania biaªek regulatorowych

W do±wiadczeniu 1 badali±my przybli»on¡ kinetyk¦ hamowania aktywno±ci trypsyny.

W do±wiadczeniu 2 oznaczali±my zale»no±ci aktywno±ci trypsyny od pH.

1

Fosfataza kwa±na (EC 3.1.3.2) stanowi enzym znacznikowy lizosomów, gªównego miejsca

trawienia wewn¡trzkomórkowego. Fosfatazy to grupa enzymów nale»¡cych do klasy hydrolaz

(klasa 3  obejmuje enzymy katalizuj¡ce hydrolityczny rozpad wi¡za«chemicznych, tabela 1),

podklasy enzymów hydrolizuj¡cych wi¡zania estrowe (esterazy), podpodklasy hydrolaz mono-

estrów fosforanowych.

3 Hydroliza lipidów mleka lipaza trzustkowa

Lipazy s¡ to enzymy z grupy hydrolaz, które powoduj¡ hydroliz¦ estrów kwasów tªuszczowych.

W odró»nieniu od esteraz wykazuj¡ aktywno±¢ na granicy dwóch faz:wodnej, w której s¡ bardzo

dobrze rozpuszczalne i lipidowej. Enzymy te odpowiedzialne s¡ za metabolizm lipidów- fosfolipi-

dów i glikolipidów, b¦d¡cych gªównymi skªadnikami biologicznych membran oraz triacylogliceroli,

stanowi¡cych rezerwuar energii. Z uwagi na znaczny udziaª lipidów w biomasie serca, lipazy od-

grywaj¡ wi¦c te» wa»n¡ rol¦ w prawidªowym funkcjonowaniu tego organu. W ostatnich latach

wraz z rozwojem biotechnologii wzrasta te» zainteresowanie powy»szymi enzymami w takich dzie-

dzinach jak: medycyna kliniczna, farmakologia, technologia »ywienia, przemysª spo»ywczy oraz

przeróbka olejów. Aktywno±¢ lipazy okre±la si¦ na podstawie ilo±ci uwolnionych kwasów tªuszczo-

wych, w czasie dziaªania enzymu w optymalnych warunkach w substracie zawieraj¡cym tªuszcz.

Ilo±¢ uwolnionych kwasów tªuszczowych w próbkach badanego substratu, pobieranych w kolej-

nych odst¦pach czasu, oznacza si¦ przez miareczkowanie mianowanym roztworem wodorotlenku

potasowego wobec fenoloftaleiny jako wska¹nika.

2

Miareczkowanie → chemiczna technika analizy ilo±ciowej polegaj¡ca na dodawaniu roztworu

- tzw. titranta z biurety w postaci kropel do roztworu zwanego analitem. Roztwory odczynników

o znanym st¦»eniu (mianie) u»ywane do miareczkowania nazywa si¦ roztworami mianowanymi.

St¦»enia roztworów mianowanych wyra»a si¦ molowo±ci¡ (mol/l).

W naszym przypadku titrantem z biurety byª 0.05M KOH. Potem obliczali±my mikroekwi-

walenty kwasów tªuszczowych za pomoc¡ wzoru:

mikroekwiwalenty =

(A − B) ∗ C ∗ 1000

D

(1)

gdzie:

1. A → ilo±¢ mL KOH zu»yta do miareczkowania próby wªa±ciwej

2. B → ilo±¢ mL KOH zu»yta do miareczkowania próby zerowej

3. C → st¦»enie molowe KOH

4. D → ilo±¢ mleka poddane miareczkowaniu

3