Hydrolazy

Hydrolazy

-

-

peptydazy 

peptydazy 

(pepsyna, trypsyna)

(pepsyna, trypsyna)

Cel 

Cel 

ć

ć

wicze

wicze

ń

ń

:

:

Ocena wp

Ocena wp

ł

ł

ywu pH 

ywu pH 

ś

ś

rodowiska na aktywno

rodowiska na aktywno

ść

ść

pepsyny

pepsyny

Ocena aktywno

Ocena aktywno

ś

ś

ci trypsyny na podstawie 

ci trypsyny na podstawie 

ilo

ilo

ś

ś

ci strawionego bia

ci strawionego bia

ł

ł

ka mierzonego metod

ka mierzonego metod

ą

ą

biuretow

biuretow

ą

ą

E.C.3.3.4.4.1 Pepsyna

E.C.3.3.4.4.1 Pepsyna

Wyst

Wyst

ę

ę

powanie:

powanie:

•

•

Proteaza soku 

Proteaza soku 

Ŝ

Ŝ

o

o

łą

łą

dkowego

dkowego

•

•

Produkowana przez kom

Produkowana przez kom

ó

ó

rki g

rki g

ł

ł

ó

ó

wne b

wne b

ł

ł

ony 

ony 

ś

ś

luzowej 

luzowej 

Ŝ

Ŝ

o

o

łą

łą

dka

dka

•

•

Posta

Posta

ć

ć

nieaktywna (preenzym)

nieaktywna (preenzym)

-

-

Pepsynogen

Pepsynogen

Aktywacja:

Aktywacja:

•

•

Proces spontaniczny przy pH poni

Proces spontaniczny przy pH poni

Ŝ

Ŝ

ej 5 w trzech 

ej 5 w trzech 

etapach

etapach

•

•

Kwa

Kwa

ś

ś

ne 

ne 

ś

ś

rodowisko 

rodowisko 

Ŝ

Ŝ

o

o

łą

łą

dka zapewnia obecno

dka zapewnia obecno

ść

ść

HCl

HCl

•

•

Odci

Odci

ę

ę

cie 

cie 

ł

ł

a

a

ń

ń

cucha 44 aminokwas

cucha 44 aminokwas

ó

ó

w powoduje 

w powoduje 

ods

ods

ł

ł

oni

oni

ę

ę

cie kwasu glutaminowego znajduj

cie kwasu glutaminowego znajduj

ą

ą

cego 

cego 

si

si

ę

ę

w centrum aktywnym enzymu

w centrum aktywnym enzymu

•

•

Optimum pH 1

Optimum pH 1

-

-

2

2

PEPSYNA

PEPSYNA

PEPSYNOGEN

PEPSYNOGEN

Dzia

Dzia

ł

ł

anie:

anie:

•

•

Hydrolaza peptydylo

Hydrolaza peptydylo

-

-

peptyd

peptyd

ó

ó

w 

w 

rozk

rozk

ł

ł

adaj

adaj

ą

ą

ca wi

ca wi

ą

ą

zania peptydowe bia

zania peptydowe bia

ł

ł

ek 

ek 

za wyj

za wyj

ą

ą

tkiem keratyn i protamin

tkiem keratyn i protamin

•

•

Preferuje wi

Preferuje wi

ą

ą

zania utworzone pomi

zania utworzone pomi

ę

ę

dzy 

dzy 

fenyloalanin

fenyloalanin

ą

ą

i tyrozyn

i tyrozyn

ą

ą

z innymi 

z innymi 

aminokwasami oraz leucyn

aminokwasami oraz leucyn

ą

ą

i kwasem 

i kwasem 

glutaminowym 

glutaminowym 

E.C.3.4.4.4. Trypsyna

E.C.3.4.4.4. Trypsyna

Wyst

Wyst

ę

ę

powanie:

powanie:

•

•

Proteaza soku trzustkowego

Proteaza soku trzustkowego

•

•

Produkowana przez kom

Produkowana przez kom

ó

ó

rki trzustki w 

rki trzustki w 

formie nieaktywnej

formie nieaktywnej

-

-

trypsynogenu

trypsynogenu

Aktywacja:

Aktywacja:

•

•

Niezb

Niezb

ę

ę

dny jest udzia

dny jest udzia

ł

ł

enterokinazy

enterokinazy

-

-

enzym 

enzym 

produkowany przez b

produkowany przez b

ł

ł

on

on

ę

ę

ś

ś

luzow

luzow

ą

ą

dwunastnicy

dwunastnicy

•

•

Jest to proces autokatalityczny

Jest to proces autokatalityczny

•

•

Odcinany jest fragment 6

Odcinany jest fragment 6

-

-

ciu 

ciu 

aminokwas

aminokwas

ó

ó

w powoduj

w powoduj

ą

ą

c ods

c ods

ł

ł

oni

oni

ę

ę

cie 

cie 

w centrum aktywnym uk

w centrum aktywnym uk

ł

ł

adu Gli

adu Gli

-

-

Asp

Asp

-

-

Ser

Ser

-

-

Gli

Gli

•

•

Optimum pH 7

Optimum pH 7

-

-

9

9

TRYPSYNA

TRYPSYNA

TRYPSYNOGEN

TRYPSYNOGEN

Dzia

Dzia

ł

ł

anie:

anie:

•

•

Hydrolaza peptydylo

Hydrolaza peptydylo

-

-

peptyd

peptyd

ó

ó

w 

w 

katalizuj

katalizuj

ą

ą

ca rozpad wi

ca rozpad wi

ą

ą

zania peptydowego 

zania peptydowego 

utworzonego przez lizyn

utworzonego przez lizyn

ę

ę

i arginin

i arginin

ę

ę

z 

z 

innymi aminokwasami

innymi aminokwasami

E.C.3.4.4.4. Chymotrypsyna

E.C.3.4.4.4. Chymotrypsyna

•

•

Dzia

Dzia

ł

ł

anie nie jest do ko

anie nie jest do ko

ń

ń

ca poznane, 

ca poznane, 

prawdopodobnie rozk

prawdopodobnie rozk

ł

ł

ada wi

ada wi

ą

ą

zania 

zania 

utworzone przez aminokwasy aromatyczne

utworzone przez aminokwasy aromatyczne

Hormony:

Hormony:

•

•

W trawieniu bia

W trawieniu bia

ł

ł

ek niezb

ek niezb

ę

ę

dny jest udzia

dny jest udzia

ł

ł

:

:





Gastryny pobudzaj

Gastryny pobudzaj

ą

ą

cej sekrecj

cej sekrecj

ę

ę

HCl

HCl





Sekretyny pobudzaj

Sekretyny pobudzaj

ą

ą

cej wydzielanie soku 

cej wydzielanie soku 

trzustkowego, w kt

trzustkowego, w kt

ó

ó

rym zapewnia obecno

rym zapewnia obecno

ść

ść

odpowiedniej ilo

odpowiedniej ilo

ś

ś

ci wody i jon

ci wody i jon

ó

ó

w HCO

w HCO

3

3

-

-





Pankreozyminy wp

Pankreozyminy wp

ł

ł

ywaj

ywaj

ą

ą

cej na wydzielanie soku 

cej na wydzielanie soku 

trzustkowego oraz perystaltyk

trzustkowego oraz perystaltyk

ę

ę

przewodu 

przewodu 

pokarmowego

pokarmowego

Wch

Wch

ł

ł

anianie aminokwas

anianie aminokwas

ó

ó

w:

w:

•

•

Niezb

Niezb

ę

ę

dna jest obecno

dna jest obecno

ść

ść

PLP oraz jon

PLP oraz jon

ó

ó

w 

w 

Mn

Mn

•

•

Najszybciej wch

Najszybciej wch

ł

ł

aniana jest cysteina, 

aniana jest cysteina, 

natomiast najwolniej wch

natomiast najwolniej wch

ł

ł

aniany jest kwas 

aniany jest kwas 

glutaminowy i kwas asparaginowy

glutaminowy i kwas asparaginowy

Zadanie 1

Zadanie 1

Badanie aktywno

Badanie aktywno

ś

ś

ci pepsyny w r

ci pepsyny w r

ó

ó

Ŝ

Ŝ

nych warunkach pH

nych warunkach pH

Wykonanie.

Wykonanie.

Do prob

Do prob

ó

ó

wek oznaczonych 1, 2, 3, 4 odmierzy

wek oznaczonych 1, 2, 3, 4 odmierzy

ć

ć

po 2 cm3 pepsyny. Prob

po 2 cm3 pepsyny. Prob

ó

ó

wk

wk

ę

ę

nr 4  ogrza

nr 4  ogrza

ć

ć

nad palnikiem 

nad palnikiem 

(inaktywacja pepsyny). Do pozosta

(inaktywacja pepsyny). Do pozosta

ł

ł

ych prob

ych prob

ó

ó

wek doda

wek doda

ć

ć

: 

: 

1 

1 

-

-

2 cm

2 cm

3

3

0,2 mol/dm

0,2 mol/dm

3

3

HCl

HCl

2 

2 

-

-

2 cm

2 cm

3 

3 

1 mol/dm

1 mol/dm

3

3

CH

CH

3

3

COOH

COOH

3 

3 

-

-

2 cm

2 cm

3

3

buforu o pH 7,2

buforu o pH 7,2

Nast

Nast

ę

ę

pnie do wszystkich 4 prob

pnie do wszystkich 4 prob

ó

ó

wek doda

wek doda

ć

ć

niewielk

niewielk

ą

ą

porcj

porcj

ę

ę

bia

bia

ł

ł

ka. Pr

ka. Pr

ó

ó

by wstawi

by wstawi

ć

ć

do 

do 

ł

ł

a

a

ź

ź

ni wodnej o temp. 37

ni wodnej o temp. 37

°

°

C. Po 

C. Po 

godzinnej inkubacji obejrze

godzinnej inkubacji obejrze

ć

ć

pr

pr

ó

ó

by.  Poda

by.  Poda

ć

ć

nr prob

nr prob

ó

ó

wki, w 

wki, w 

kt

kt

ó

ó

rej bia

rej bia

ł

ł

ko uleg

ko uleg

ł

ł

o strawieniu?

o strawieniu?

Zadanie 2

Zadanie 2

Badanie aktywno

Badanie aktywno

ś

ś

ci trypsyny

ci trypsyny

Wykonanie.

Wykonanie.

Do 3 prob

Do 3 prob

ó

ó

wek wir

wek wir

ó

ó

wkowych oznaczonych 1, 2, 3 odmierzy

wkowych oznaczonych 1, 2, 3 odmierzy

ć

ć

po 1 cm

po 1 cm

3

3

30%  TCA. W oddzielnej prob

30%  TCA. W oddzielnej prob

ó

ó

wce 

wce 

„

„

A

A

”

”

przygotowa

przygotowa

ć

ć

uk

uk

ł

ł

ad inkubacyjny 

ad inkubacyjny 

sk

sk

ł

ł

adaj

adaj

ą

ą

cy si

cy si

ę

ę

z 4 cm

z 4 cm

3

3

1% kazeiny w 0,1 mol/dm3 NaHCO3 oraz 1 cm3 trypsyny. 

1% kazeiny w 0,1 mol/dm3 NaHCO3 oraz 1 cm3 trypsyny. 

Zawarto

Zawarto

ść

ść

zmiesza

zmiesza

ć

ć

. Po tej czynno

. Po tej czynno

ś

ś

ci natychmiast pobra

ci natychmiast pobra

ć

ć

1 cm3 tej mieszaniny do 

1 cm3 tej mieszaniny do 

prob

prob

ó

ó

wki wir

wki wir

ó

ó

wkowej oznaczonej  nr 0. 

wkowej oznaczonej  nr 0. 

Pozosta

Pozosta

ł

ł

o

o

ść

ść

mieszaniny w prob

mieszaniny w prob

ó

ó

wce 

wce 

„

„

A

A

”

”

inkubowa

inkubowa

ć

ć

przez 10 min. w temp. 37

przez 10 min. w temp. 37

°

°

C. Po 

C. Po 

10 min. pobra

10 min. pobra

ć

ć

po 1 cm

po 1 cm

3

3

tej mieszaniny do prob

tej mieszaniny do prob

ó

ó

wek wir

wek wir

ó

ó

wkowych  nr 1 i 2. 

wkowych  nr 1 i 2. 

Pr

Pr

ó

ó

by 0, 1, 2 odstawi

by 0, 1, 2 odstawi

ć

ć

na 10 min. a nast

na 10 min. a nast

ę

ę

pnie wirowa

pnie wirowa

ć

ć

15 min. z u

15 min. z u

Ŝ

Ŝ

yciem si

yciem si

ł

ł

y         

y         

2 000 x g. Po wirowaniu supernatant wyla

2 000 x g. Po wirowaniu supernatant wyla

ć

ć

. 

. 

Do osadu doda

Do osadu doda

ć

ć

1 cm

1 cm

3 

3 

1 mol/dm

1 mol/dm

3

3

NaOH, a po rozpuszczeniu si

NaOH, a po rozpuszczeniu si

ę

ę

osadu, doda

osadu, doda

ć

ć

4 cm

4 cm

3

3

odczynnika miedziowego. Zmiesza

odczynnika miedziowego. Zmiesza

ć

ć

zawarto

zawarto

ść

ść

i pozostawi

i pozostawi

ć

ć

w temp. pokojowej na 

w temp. pokojowej na 

oko

oko

ł

ł

o  20 min.

o  20 min.

W tym czasie przygotowa

W tym czasie przygotowa

ć

ć

pr

pr

ó

ó

b

b

ę

ę

„

„

ś

ś

lep

lep

ą

ą

”

”

(odczynnikow

(odczynnikow

ą

ą

) 

) 

–

–

4 cm

4 cm

3

3

odczynnika 

odczynnika 

miedziowego i 1 cm

miedziowego i 1 cm

3

3

wody dest. Odczyta

wody dest. Odczyta

ć

ć

absorbancj

absorbancj

ę

ę

pr

pr

ó

ó

b 0, 1, 2  przy d

b 0, 1, 2  przy d

ł

ł

ugo

ugo

ś

ś

ci 

ci 

fali 540 nm wobec pr

fali 540 nm wobec pr

ó

ó

by 

by 

„

„

ś

ś

lepej

lepej

”

”

. Zawarto

. Zawarto

ść

ść

bia

bia

ł

ł

ka w badanym roztworze 

ka w badanym roztworze 

odczyta

odczyta

ć

ć

z krzywej wzorcowej.

z krzywej wzorcowej.