M
IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ć
wiczenie 15
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
1
M
ETODY
D
EZYNFEKCJI
1.
M
ETODY FIZYCZNE
1.1.
Z
ASTOSOWANIE WYSOKICH TEMPERATUR NA SUCHO
1.2.
ZASTOSOWANIE WYSOKICH TEMPERATUR NA MOKRO
1.3.
ZASTOSOWANIE PROMIENIOWANIA
(UV,
X,
GAMMA
)
W praktyce mikrobiologicznej wykorzystuje się najczęściej hamujące lub zabójcze
działanie na mikroorganizmy nadfioletowej części widma słonecznego o długości fali
250-260 nm, a więc tą część widma, która jest najsilniej absorbowana przez kwasy
nukleinowe.
Ź
ródłem promieniowania są lampy kwarcowe, wypełnione oparami rtęci, emitujące w 95%
promieniowanie o długości fali 258 nm. Promieniowanie UV jest wykorzystywane do
niszczenia mikroorganizmów występujących w powietrzu i na odkrytych powierzchniach
zamkniętych pomieszczeń o niewielkim zapyleniu (silosów, magazynów, chłodni, ładowni
statków, laboratoriów, kamer). Ponieważ charakteryzuje się słabą przenikliwością – nie
przenika przez zwykłe szkło, stąd promieniowanie UV nie jest wykorzystywane do
wyjaławiania szkła i podłoży agarowych w szklanych naczyniach.
Efekt biobójczy promieniowania zależy między innymi od objętości napromienianego
powietrza, wielkości powierzchni, odległości i ustawienia lamp UV. Czas emisji
promieniowania nie powinien być krótszy niż 30 min, odległość lampy od sterylizowanej
powierzchni nie może przekraczać 3 m, a lampy winny być ustawione prostopadle do
powierzchni.
Do sterylizacji sprzętu medycznego jednorazowego użytku, surowców i preparatów
farmaceutycznych oraz utrwalania produktów spożywczych (świeżych i suszonych
owoców i warzyw, mięsa drobiowego, ryb, przypraw i ziół, a zwłaszcza do niszczenia
mikroorganizmów w zamkniętych pojemnikach, np. w konserwach) wykorzystuje się
niekiedy promieniowanie jonizujące (X, gamma), które charakteryzuje się bardzo dużą
przenikliwością, energią i aktywnością biologiczną. Ponieważ stosowanie dawek
promieniowania pow. 10 kGy (radiopasteryzacja, radiosterylizacja) powoduje zmiany
właściwości organoleptycznych, odżywczych i zdrowotnych produktów, stąd do ich
sterylizacji stosuje się dawki promieniowania nie przekraczające tej wartości (raduryzacja,
radycydacja).
Raduryzacja
to zmniejszenie ogólnej liczby mikroorganizmów i
zahamowanie rozwoju form przeżywających ten zabieg;
radycydacja
– zmniejszenie
liczebności populacji mikroorganizmów patogennych (np. Clostridium, Salmonella) i
zahamowanie produkcji toksyn bakteryjnych (np. jadu kiełbasianego przez Clostridium
botulinum
). Stosowanie tych metod jest dozwolone tylko w niektórych krajach UE.
M
IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ć
wiczenie 15
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
2
2.
M
ETODY MECHANICZNE
2.1.
F
ILTROWANIE
Zabieg ten stosujemy w przypadku. gdy mamy do czynienia z materiałami, które w
podwyższonej temperaturze ulegają zmianom fizycznym i chemicznym. Są to zwykle pożywki
zawierające witaminy, aminokwasy, surowicę, mocznik i termolabilne składniki dodawane do
podłoży. Do wyjaławiania używa się najczęściej filtry membranowe o porach od 0,20-0,40 (0,75) µm
ś
rednicy. Ponieważ pory są mniejsze od wymiarów bakterii, odfiltrowane drobnoustroje osadzają się
na filtrze, a uzyskany filtrat jest jałowy.
Stosowane są:
filtry z ziemi okrzemkowej
filtry ze szkła spiekanego
filtry azbestowe
filtry membranowe
2.2.
W
IROWANIE
Jest zabiegiem dzięki któremu następuje oddzielanie komórek mikroorganizmów od
zawiesiny. Wykonujemy je w wirówkach z regulowanymi obrotami i czasem działania, a
materiał wirowany umieszcza się w specjalnie przygotowanych pojemnikach.
3.
M
ETODY CHEMICZNE
Do sterylizacji podłóg, ścian i powierzchni roboczych, linii technologicznych, czy też
maszyn lub ich części stosuje się także (zgodnie z zaleceniami producenta) różne środki
dezynfekcyjne. Różnią się one aktywnością biologiczną i mechanizmami działania.
Aktywność biologiczna środków dezynfekcyjnych zależy od rodzaju związku chemicznego;
gatunku mikroorganizmów, ich wieku i liczebności populacji; czynników środowiskowych -
temperatura, kwasowość podłoża i obecność w nim innych związków chemicznych,
zwłaszcza organicznych.
3.1.
W
AŻNIEJSZE GRUPY ZWIĄZKÓW
Fenol i pochodne
Czwartorzędowe związki amoniowe
Związki chloru
Związki jodu
Alkohole
Aldehydy
Związki rtęci
Związki srebra
Barwniki
•
Czwartorzędowe sole amoniowe
Charakteryzuje je szerokie spektrum działania (bakterie G+ i G-, grzyby pleśniowe,
drożdże, wirusy), długotrwały efekt sterylizacyjny i przyjemny zapach. Ujemną stroną tych
preparatów jest silna presja selekcyjna i możliwość uodpornienia się bakterii G- (np. Proteus
vulgaris
i Serratia marcescens), co wymusza konieczność przemiennego ich stosowania z
M
IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ć
wiczenie 15
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
3
preparatami
o
odmiennych
mechanizmach
działania
(związkami
nadtlenowymi,
podchlorynem). Ich aktywność ulega osłabieniu w obecności białka, tłuszczu, mleka i mydła.
Najważniejsze to Sterinol (10% bromek benzylododecylo-dwumetyloamoniowy – używany
jako środek dezynfekcyjno-myjący) i Laurosept (25% bromek dwumetylaurylobenzylo-
amoniowy). Obecnie ogranicza się stosowanie tych preparatów ze względu na istnienie wielu
szczepów opornych. Inne preparaty to np. Zephirol, Dezogen, Bradosol, Cetavlon, Asepsol.
Względnie mały zakres działania i właściwości prowadzące do powstawania opornych
szczepów pałeczek gram ujemnych , ograniczają ich stosowanie w szpitalach.
•
Związki nadtlenowe
Należą tu m.in. kwas nadoctowy, nadtlenek wodoru, nadsiarczan potasowy.
Najpowszechniej stosowany kwas nadoctowy jest aktywny w stosunku do form
wegetatywnych i przetrwalnych bakterii. Ponieważ związek ten nie wykazuje właściwości
korozyjnych i łatwo ulega rozkładowi na produkty nieszkodliwe (woda, tlen, kwas octowy)
dla produktów spożywczych, może być stosowany do dezynfekcji systemów zamkniętych
(np. w browarnictwie i winiarstwie) bez konieczności przepłukiwania ich wodą. Taka
procedura zapobiega powtórnemu skażeniu systemu, gdy jakość mikrobiologiczna będącej do
dyspozycji wody nie jest najlepsza. Ponadto związek ten może być użyty do sterylizacji
przedmiotów termowrażliwych i dezynfekcji rąk. Związki nadtlenowe (kwas nadoctowy,
nadboran sodu, nadsiarczan potasu) – są wrażliwe na obecność substancji organicznych.
Kwas nadoctowy może działać sporobójczo.
•
Alkohole
(etanol, izopropanol).
Charakteryzuje je szerokie działanie biobójcze (formy wegetatywne bakterii G+ i G-)
uwarunkowane obecnością wody. Z tego też względu działają najsilniej jako 50-70% roztwór
wodny. Aktywność alkoholi wzrasta wraz ze wzrostem liczby molowej i liczby C w łańcuchu,
a maleje w obecności substancji organicznej. Są wykorzystywane do dezynfekcji systemów
zamkniętych bez konieczności płukania wodą, powierzchni roboczych, sprzętu i rąk.
Alkohole etylowy, propylowy, działają bakteriobójczo również na prątki gruźlicy oraz
niektóre wirusy. Mają słabą zdolność ścinania białka i zdolność penetracji dlatego mogą być
stosowane tylko do czystych powierzchni. Stosowane również do dezynfekcji rąk.
•
Związki chloru
Najczęściej stosowany jest podchloryn sodowy (NaOCl), którego aktywność zależy od
równowagi w roztworze pomiędzy HClO/OCl
-
. Kwas podchlorawy jest 10-20 razy
możniejszym czynnikiem dezynfekującym niż postać anionowa. Najsilniejsze działanie
wykazują w środowisku kwaśnym.(pH 5.0-6.0). Wykorzystywany jest przy dezynfekcji ścian,
powierzchni chłodni i komór przechowalniczych. W zetknięciu z komórkami drobnoustrojów
wydziela zjonizowany tlen, który denaturuje białka, niszczy błonę plazmatyczną oraz
inaktywuje enzymy z grupami –SH. Działa biobójczo w stosunku do bakterii, drożdży,
grzybów i wirusów.
Oprócz podchlorynu sodowego stosowana jest także chloramina T, najaktywniej działająca w
ś
rodowisku o pH 6.0-6.2. Do dezynfekcji rąk stosuje się roztwory 0,5-1%, natomiast do ścian,
sufitów, podłóg czy stołów 5%.
•
Jodofory
To kompleksowe połączenia jodu z polimerami, biopolimerami lub związkami
powierzchniowo czynnymi spełniającymi rolę nośników. Ich aktywność bójcza polega na
uwalnianiu jodu, który utlenia grupy SH oraz wytwarza kompleksy z białkami błony
cytoplazmatycznej. Maksymalną aktywność wykazują w pH 2.0-4.0. Wykazują szerokie
M
IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ć
wiczenie 15
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
4
spektrum działania, niszczą bakterie, grzyby pleśniowe, drożdże i wirusy już przy stężeniach
12-25 ppm. Ze względu na wywoływanie korozji metali oraz przebarwianie tworzyw
sztucznych zastosowanie jodoforów w przemyśle spożywczym i biotechnologicznym jest
ograniczone do dezynfekcji powierzchni nie mających kontaktu z żywnością.
•
Aldehydy
Jako środki dezynfekujące wykorzystywane są aldehyd mrówkowy i glutarowy (aktywny
w pH 7.5-8.5, bójczy wobec bakterii, wirusów, grzybów i prątków gruźlicy), jednak ze
względu na toksyczność nie mogą być wykorzystywane do dezynfekcji powierzchni
mających kontakt z żywnością. Dość powszechnie stosowanym preparatem jest formalina
(wodny lub alkoholowy 3-20% roztwór formaldehydu). Działa na formy wegetatywne i
przetrwalne bakterii, grzyby i wirusy.
•
Sole metali ciężkich
To przede wszystkim sole srebra. Tworzą one połączenia z grupami SH enzymów i białek
strukturalnych komórki. W aseptyce znajdują zastosowanie azotany, cytryniany i mleczany
srebra.
•
Barwniki
Są stosowane głównie jako łagodne antyseptyki, np. fiolet krystaliczny, zieleń
malachitowa i brylantowa, barwniki akrydynowe. Jako związki zasadowe łatwo przenikają
przez błony i reagują z kwasami nukleinowymi powodując zahamowanie syntezy DNA i
ś
mierć komórki.
UWAGA:
Wykorzystanie takich środków dezynfekcyjnych, jak: aldehydy (mrówkowy, glutarowy,
formalina), związki fenolowe i pochodne fenoli (fenol, lizol, kwas karbolowy), związki chloru
(podchloryn sodowy, chloramina T), jodofory (połączenia jodu z polimerami lub SPC),
związki azotu (pochodne biguanidyny kw. glutaminowego i pirydyny), metale ciężkie, jest
bardzo często ograniczone jedynie do dezynfekcji powierzchni roboczych nie mających
kontaktu z żywnością, a w niektórych krajach (zwłaszcza UE) wręcz zakazane. Wynika to z ich
toksyczności (alergie, zakłócenia metabolizmu), wywoływania podrażnień skóry i błon
ś
luzowych, słabej biodegradacji, długotrwałego przykrego zapachu, działania korozyjnego,
wysokiej presji selekcyjnej i możliwości wykształcenia się form odpornych, uwarunkowania
ich aktywności od czynników środowiskowych.
Preparaty dezynfekcyjne stosowane w zakładach przemysłu spożywczego i w
procesach biotechnologicznych muszą być pozytywnie zaopiniowane przez Państwowy Zakład
Higieny, a preparaty aseptyczne mieć certyfikat MZiOS.
4.
M
ECHANIZM DZIAŁANIA
Mechanizm działania związany jest w pierwszym rzędzie ze strukturą chemiczną
i właściwościami substancji biologicznie czynnej związku. W zależności od tych czynników,
a także od stężenia efektem może być zahamowanie wzrostu i rozwoju mikroorganizmów
(działanie statyczne) lub w następstwie oddziaływania na zasadnicze struktury lub szlaki
metaboliczne ich zabicie (działanie biobójcze). Polegać ono może na: uszkadzaniu lub
zmianie przepuszczalności ściany komórkowej i błony cytoplazmatycznej oraz wypływie do
ś
rodowiska zewnętrznego składników komórki; utlenianiu struktur komórkowych i
M
IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ć
wiczenie 15
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
5
zakłóceniu procesów metabolicznych mikroorganizmów; tworzeniu kompleksów z białkami -
blokowaniu grup funkcyjnych (-NH
2
, -SH, -COOH); dezaktywacji enzymów; spowodowaniu
koagulacji cytoplazmy i denaturacji białek (cytoplazmatycznych, enzymatycznych, kwasów
nukleinowych).
Metody
Czynnik
Sposób działania
fizyczne
działanie wysoką
temperaturą
denaturacja białek i kwasów nukleinowych, rozerwanie wiązań
wodorowych
"suche gorąco"
denaturacja białek i kwasów nukleinowych
promieniowanie
UV
tworzenie się dimerów tyminowych w DNA, działanie mutagenne
promieniowanie
jonizujące (gamma)
jonizacja cząsteczek wody
chemiczne
tlenek etylenu
reaguje z grupami –NH
2
, -SH, -COOH i -OH białek, oraz z DNA i z
RNA.
alkohole
denaturacja białek, rozpuszczanie lipidów
aldehydy
alkilacja, reagują z grupami –NH
2
, -SH, -COOH
chlorowce
w reakcji z wodą tworzą kwas podchlorawy, wydziela się
zjonizowany tlen, który denaturuje białka, niszczy błonę
cytoplazmatyczną i inaktywuje enzymy z grupami -SH
fenole
denaturacja białek, rozrywanie błon komórkowych
mechaniczne
filtr z porach o
ś
rednicy 0,22 µm
bakterie osadzają się na filtrze
5.
O
KREŚLANIE SIŁY DZIAŁANIA ŚRODKÓW DEZYNFEKCYJNYCH
Siła działania preparatów zależy od wielu czynników, dlatego opracowano metody oceny ich
działania. W myśl przepisów przeprowadzenie właściwej oceny badanego preparatu wymaga
określenia jego:
działania bakteriostatycznego,
działania bakteriobójczego,
stężenia użytkowego.
Przy oznaczaniu przeciwbakteryjnego działania preparatów używane są szczepy: Staphylococcus
aureus
NCTC
1
4163, Escherichia coli NCTC 8196, Proteus vulgaris NCTC 4635 i Pseudomonas
aeruginosa
NCTC 6749. Działanie przeciwgrzybicze ocenia się używając szczepów Trichophyton
gypseum, Microsporum gypseum i Candida albicans.
Do oceny antywirusowej nie ustalono dotąd
szczepów wzorcowych, najczęściej stosuje się Poliomyelitis typ 1, 2 i 3, wirus VSV, Herpes hominis
typ 1 i 2, adenowirusy typ 12 i 14 oraz wirus Vaccini (ospy krowiej).
5.1.
O
KREŚLANIE DZIAŁANIA BAKTERIOSTATYCZNEGO
Celem jest ustalenie najmniejszego stężenia związku lub preparatu hamującego wzrost
bakterii. Wartość tę nazywamy MIC (Minimal Inhibitory Concentration).
W celu oznaczenia działania bakteriostatycznego preparatu, z roztworu wyjściowego przygotowuje się
szereg rozcieńczeń w dowolnym stosunku (np. 1:10, 1:15, 1:20, 1:25 itd.). Roztwory przygotowuje się
w jałowej wodzie destylowanej. Następnie do szeregu probówek zawierających po 9 ml podłoża
bulionowego przenosi się po 1 ml każdego rozcieńczenia (rys. 5.) i po 0,05 ml odpowiednio
1
NCTC = The National Collection of Type Cultures
M
IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ć
wiczenie 15
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
6
rozcieńczonej 24-godziennej hodowli bulionowej szczepu wzorcowego. Hodowle inkubuje się w 37ºC
przez 72 h.
Probówkę zawierającą największe rozcieńczenie preparatu, w której nie wystąpił wzrost, przyjmuje
się za graniczną, a stężenie środka za najmniejsze hamujące wzrost dla danego stosunku rozcieńczeń.
Można następnie tę wartość uściślić wykonując kolejny szereg rozcieńczeń (np. 1:10, 1:11, 1:12, 1:13
itd.). Jeśli preparat powoduje zmętnienie bulionu i uniemożliwia ocenę wizualną, należy wysiać ezą z
każdej probówki na podłoże stałe i ocenę po 48-godzinnej inkubacji w 37ºC.
Rys. 5. Wyznaczanie wartości MIC metodą
zawiesinową
5.2.
O
KREŚLANIE DZIAŁANIA BAKTERIOBÓJCZEGO
Polega na ustaleniu najmniejszego stężenia preparatu lub związku dezynfekującego
działającego bakteriobójczo. Najmniejsze stężenie bakteriobójcze oznacza się jako MBC
(Minimal Bactericidal Concentration). Wartość MBC ustala się po określeniu MIC. W
badaniach używa się 2 z 4 szczepów wzorcowych, dla których wartości MIC były największe.
Oceniając wartości MBC dla badanego preparatu, zawsze porównuje się je z wartościami
MBC dla preparatu standardowego (dla tych samych szczepów), i tak dla pochodnych
fenolowych jest to fenol, dla związków chloru – podchloryn sodowy i chloramina o znanym
stężeniu. Do badania używa się 24-godzinnej hodowli szczepów standardowych w podłożu
bulionowym.
Z preparatu wzorcowego (o znanej zawartości związku czynnego) oraz z preparatu
badanego sporządza się szereg rozcieńczeń. Probówki z rozcieńczeniami wzorca oraz
badanego środka dezynfekującego (po 5 ml) oraz probówki z hodowlami bulionowymi
mikroorganizmu umieszcza się w łaźni wodnej o temperaturze 20ºC. Po upływie 15 minut do
pierwszej probówki z wzorcem lub badanym środkiem dodaje się 0,5 ml hodowli bulionowej,
miesza przez wirowanie i dokładnie po 30 sekundach dokonuje się posiewu do drugiej, a
następnie w odstępach 30 sekundowych do kolejnych probówek. Po upływie 5 minut od
posiania I probówki wstrząsa się jej zawartością i posiewa 1 oczko ezy do probówki
zawierającej 5 ml jałowego bulionu (z odpowiednim inaktywatorem). W 30-sekundowych
odstępach analogicznie wykonuje się następne posiewy. Całą serię posiewów powtarza się po
10 i 15 minutach. Probówki z posiewami umieszcza się w cieplarce o temp. 37ºC i inkubuje
48 h. Odczyt wyników polega na wizualnej ocenie wzrostu bakterii w podłożu (+) lub
stwierdzeniu braku wzrostu (-). Przykład zestawienia wyników podano w tabeli 2.
M
IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ć
wiczenie 15
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
7
Wyniki uzyskane przy oznaczaniu wartości MBC dla preparatu wzorcowego i badanego
pozwalają obliczyć tzw. współczynnik aktywności, za pomocą którego można obliczyć, ile
razy badany preparat jest słabszy lub silniejszy od środka przyjętego jako wzorcowy.
Tabela 2. Zapis wyników przy określaniu MBC
Środek
dezynfekcyjny
Stężenie środka dezynf.
[mg lub %]
Czas działania [min]
5
10
15
związek wzorcowy
5
10
15
20
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
związek badany
5
10
15
20
25
30
35
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
-
-
-
+
+
-
-
-
-
-
Obliczając ten współczynnik dzieli się najmniejsze stężenie preparatu wzorcowego nie
niszczące bakterii w czasie 5 minut, ale zabijające drobnoustroje w czasie 10 min, przez
najmniejsze stężenie preparatu badanego o takim samym działaniu. Dla danych z tabeli
współczynnik będzie wynosił:
6
,
0
25
15
.
.
=
=
adanego
preparatub
wspól
zorcowego
preparatuw
wspól
Otrzymana wartość 0,6 oznacza, że badany środek dezynfekcyjny ma aktywność równą 60%
aktywności preparatu wzorcowego, czyli działa o 40% słabiej. Jeśli wartość wyliczonego
współczynnika byłaby >1, tzn. że badany preparat działa tylokrotnie silniej od preparatu
wzorcowego.
5.3.
U
STALANIE STĘŻENIA UŻYTKOWEGO
Najczęściej stosowana jest metoda nośnikowa, w której używa się cylinderków
(metalowych, szklanych lub porcelanowych), stosowanych także do oznaczania mocy
antybiotyków. Cylinderki zanurza się w 0,1% roztworze asparaginy i wyjaławia przez 20
minut. Na powstałej błonce asparaginy łatwo przyczepiają się drobnoustroje. 20 takich
jałowych, ostudzonych cylinderków przenosi się do 20 ml 48-godzinnych hodowli
bulionowych odpowiednich szczepów. Po 15 minutach jałowo przenosi się je na szalki
Petriego wyłożone krążkami jałowej bibuły filtracyjnej i umieszcza całość w cieplarce na
37ºC na 45 minut w celu osuszenia. Następnie po jednym cylinderku przekłada się do
probówek z 10 ml danego rozcieńczenia badanego środka dezynfekcyjnego. Działanie
każdego rozcieńczenia powinno być badane przy użyciu 10 cylinderków. Po upływie 10
minut cylinderki przenosi się do osobnych probówek zawierających podłoże bulionowe ze
M
IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ć
wiczenie 15
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
8
ś
rodkiem unieczynniającym i inkubuje się 48 h w 47ºC. Największe rozcieńczenie środka, w
którym w żadnej z 10 probówek nie wystąpi wzrost, stanowi stężenie użytkowe, to jest takie,
które użyte w praktyce spowoduje zniszczenie drobnoustrojów. Jeśli uzyskuje się wyniki
odmienne dla różnych szczepów, za stężenie użytkowe przyjmuje się największe
rozcieńczenie działające jeszcze bakteriobójczo na najbardziej oporny szczep użyty do
badania. Oprócz tej próby laboratoryjnej, zwykle przeprowadza się jeszcze badania w
warunkach, w których ma być wykonana dezynfekcja.
5.4.
O
CENA SKUTECZNOŚCI PROCESÓW WYJAŁAWIANIA
W celu sprawdzenia skuteczności procesów wyjaławiania stosuje się kilka metod:
Do procesów wyjaławiania termicznego wykorzystuje się głównie metody
fizykochemiczne. Polegają one na określeniu stopienia się czystej substancji
chemicznej umieszczonej w kapilarze (w komorze autoklawu) bądź na użyciu
substancji chemicznych zmieniających zabarwienie po osiągnięciu odpowiedniej
temperatury w danym procesie wyjaławiania (rys. 6.).
Rys. 6. Taśma impregnowana z napisem AUTOCLAVED pojawiającym się po 15 minutach ekspozycji na
temperaturę 121ºC w parze wodnej w autoklawie.
Metody biologiczne polegają na użyciu próbek
odpowiednio przygotowanych przetrwalników
drobnoustrojów
z
rodzaju
Bacillus
lub
Clostridium.
Probówki zawierające przetrwalniki
sterylizuje się razem z innymi produktami
poddanymi temu procesowi. Po zakończeniu
sterylizacji przetrwalniki zalewa się pożywką
bulionową i hoduje w termostacie. Wzrost bakterii
na pożywce dowodzi nieprawidłowości procesu
wyjaławiania. Handlowo dostępne są testy Sporal
A i Sporal S. Pierwszy zawiera przetrwalniki
Bacillus stearothermophilus
w papierowych
torebkach, służy do kontroli procesu wyjaławiania
w gorącej parze wodnej pod ciśnieniem. Sporal A ulega wyjałowieniu tylko wtedy gdy
temperatura autoklawu wynosi minimum 121ºC przez 20 minut. Sporal S służy do
kontroli suchego wyjaławiania, wymaga by temperatura suszarki utrzymywała się
przez 2 h na poziomie 160ºC lub odpowiednio 2,5 h – 150ºC, 3 h – 140ºC.
Metoda posiewu – polega na wysianiu próbki sterylizowanych produktów na
pożywki, brak wzrostu w ciągu określonego czasu świadczy o jałowości badanych
prób.
Metoda termostatowa – polega na umieszczeniu wyjałowionych produktów w temp.
37ºC przez 1-10 dni, ujemny wynik próby (brak wzrostu) potwierdza prawidłowość
procesu wyjaławiania
M
IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ć
wiczenie 15
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
9
Kontrola przepuszczalności filtrów – podczas mycia i innych czynności porowata
struktura filtra może ulec uszkodzeniu, powodując że filtr przestaje zatrzymywać
drobnoustroje. Kontrola polega na przesączeniu przez badany filtr odpowiednio
rozcieńczonej zawiesiny hodowli bulionowej małej pałeczki Serratia marcescens.
Jałowość przesączu świadczy o zatrzymaniu komórek przez filtr.
6.
Ź
RÓDŁA ZAKAŻEŃ W PRZEMYŚLE SPOŻYWCZYM
Zakażenia pierwotne
– pochodzące spoza zakładu przemysłowego, przyczynami są;
o
surowce
o
woda
o
powietrze
Zakażenia wtórne
– wewnątrzzakładowe, wywołane przez:
o
sprzęt technologiczny i aparaturę, przewody, węże, filtry i materiały
filtracyjne, maszyny do rozlewu i formowania, prasy i wagi
o
powietrze w pomieszczeniach
o
odzież i obuwie pracowników
o
brudne ręce pracowników
6.1.
K
ONTROLA CZYSTOŚCI W ZAKŁADACH PRZEMYSŁOWYCH
Pracownicy zakładu mogą być źródłem zakażenia na skutek choroby lub nosicielstwa, mogą też
przenosić drobnoustroje chorobotwórcze na swojej odzieży i skórze. Zapobieganie tym zakażeniom
polega na:
przestrzeganiu higieny osobistej personelu
wykonywaniu badań lekarskich przed przyjęciem do pracy (3-krotne badania kału na
nosicielstwo drobnoustrojów jelitowych, RTG klatki piersiowej, odczyn Wasermanna, badania
w kierunku schorzeń skórnych, górnych dróg oddechowych i ogólnego stanu zdrowia)
badania okresowe co pół roku
6.2.
H
IGIENA PERSONELU
Elementy codziennej higieny osobistej:
pozostawienie odzieży w szatni, w wydzielonych szafkach i założenie odzieży ochronnej
(fartuch lub kombinezon, nakrycie głowy, obuwie)
zmiana odzieży ochronnej co najmniej co 2-3 dni (lub codziennie) i dostosowanie jej do
charakteru pracy (rodzaj, długość, dokładność zapięcia itp.)
stała troska pracownika o higienę rąk (krótkie paznokcie, dokładne i częste mycie),
używanie środka dezynfekującego, suszarki lub jednorazowych ręczników
używanie gumowych rękawiczek przy niektórych pracach, skaleczeniach lub chorobach
skórnych
unikanie dotykania żywności bezpośrednio dłonią, zasłanianie ust i nosa przy kaszlu i
kichaniu
zdejmowanie fartucha przed wejściem do ubikacji
niepalenie tytoniu w pomieszczeniach produkcyjnych
M
IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ć
wiczenie 15
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
10
6.3.
H
IGIENA POMIESZCZEŃ PRODUKCYJNYCH
Urządzenia, aparatura i sprzęt powinny być wykonane z materiałów nieszkodliwych
(w kontakcie z żywnością) i łatwych do utrzymania w czystości
Zabiegi mycia i odkażania powinny być traktowane jako jeden z etapów technologii
produkcji (środki, czas, odpowiedzialny i przeszkolony pracownik)
Odpowiedni sprzęt i środki chemiczne do mycia i dezynfekcji
Zapewniona w wystarczającej ilości woda o odpowiednich parametrach
M
IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ć
wiczenie 15
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
11
O
CENA WRAŻLIWOŚCI BAKTERII
E
SCHERICHIA COLI NA RÓŻNE ŚRODKI
DEZYNFEKUJĄCE
–
TEST PŁYTKOWO
-
DYFUZYJNY
Badane preparaty
woda destylowana (kontrola)
30% nadtlenek wodoru
Vanish lub roztwór NaOH
Domestos, Flash lub inny środek zawierający pochodne chlorowe
96% alkohol etylowy
Wykonanie oznaczenia
1.
Przygotować rozcieńczenia badanych środków dezynfekujących (1:2, 1:10, 1:20, 1:50)
w wodzie destylowanej.
2.
Na powierzchnię 4 płytek Petriego z agarem odżywczym wysiać powierzchniowo
0,5 cm
3
24-godzinnej hodowli bakterii E. coli. Zawiesinę bardzo dokładnie
rozprowadzić głaszczką po powierzchni podłoża.
3.
Po 10 minutach na powierzchni podłoża rozłożyć jałową pęsetą, w mniej więcej
równej odległości od siebie, 4 krążki bibułowe nasączone różnymi stężeniami
badanego środka dezynfekującego + 1 krążek z kontrolą (1 płytka dla jednego
badanego preparatu). Na denku płytki zaznaczyć stężenie i rodzaj środka. Pamiętać o
zachowaniu jałowości podczas zanurzania i nakładania krążków bibuły.
Np. Flash
4.
Płytki inkubować w cieplarce (37ºC) przez 3-5 dni.
5.
Odczytać wyniki i zapisać w tabeli. Określić wrażliwość drobnoustroju na
poszczególne środki dezynfekcyjne przez pomiar wielkości strefy zahamowania
wzrostu przy poszczególnych krążkach. Wyciągnąć wnioski.
Strefa zahamowania wzrostu w zależności od środka dezynfekującego
Rodzaj środka dezynfekcyjnego
Rozcieńczenie
Strefy zahamowania wzrostu
(średnica w mm)
………..
1:2
1:10
1:20
1:50
1:10
1:20
1:2
1:50
kontrola
M
IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ć
wiczenie 15
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
12
Kontrola (woda destylowana)
O
CENA AKTYWNOŚCI BAKTERIOSTATYCZNEJ ROZTWORÓW FENOLU
1.
W celu oznaczenia działania bakteriostatycznego preparatu, z przygotowanego
szeregu rozcieńczeń 5% fenolu (nie rozcieńczony oraz rozcieńczony w stosunku 1:1,
1:2, 1:4, 1:9, 1:14, 1:19 i 1:49 w jałowej wodzie destylowanej) pobrać po 1 ml
roztworu i kolejno dodać do probówek zawierających po 9 ml jałowego płynu do
rozcieńczeń.
2.
Do każdej probówki jałowo przenieść po 1 ml zawiesiny odpowiednich
drobnoustrojów (24-hodowla E. coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae lub
Aspergillus niger
). Wymieszać.
3.
Hodowle inkubować w 37ºC przez 30 min.
4.
2 płytki Petriego z zestalonym agarem odżywczym podzielić na ćwiartki (zaznaczyć
pola pisakiem od spodu płytki oraz podpisać odpowiednim rozcieńczeniem i
mikroorganizmem). Na każdej ćwiartce wysiać po 1 oczku ezy z kolejnej probówki.
Płytki inkubować w 37ºC przez 24-73 h.
5.
Odczytać wyniki i narysować obraz płytek z wyrosłymi lub nie koloniami bakterii.
Wyznaczyć MIC – najmniejsze stężenie preparatu hamujące wzrost bakterii, czyli
największe rozcieńczenie preparatu, w którym nie wystąpił wzrost.
Wyciągnąć
wnioski.
Na przykład
O
CENA SKUTECZNOŚCI JAŁOWIENIA ZA POMOCĄ LAMP
UV
1.
Na powierzchnię 8 płytek Petriego z agarem odżywczym wysiać powierzchniowo
0,5 cm
3
24-godzinnej hodowli bakterii Escherichia coli. Zawiesinę bardzo dokładnie
rozprowadzić głaszczką po powierzchni podłoża.
2.
Podpisać płytki: kontrola, 1’, 5’, 10’, 20’ i 30’ otwarta, 40’ zamknięta, 40’ osłonięta
do połowy folią aluminiową.
3.
Po 10 minutach zachowując warunki aseptyki otwarte lub zamknięte (w zależności od
próby) płytki Petriego ustawić pod lampą UV na odpowiedni czas. Promienie UV
powinny padać prostopadle do powierzchni płytki.
4.
Po naświetleniu płytki zamknąć i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37ºC.
5.
Wyniki obserwacji (intensywność wzrostu oceniana od + do +++++) umieścić w
tabeli:
nierozc.
1:14
1:19
1:49
1:9
1:1
1:2
1:4
M
IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ć
wiczenie 15
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
13
Zależność pomiędzy czasem naświetlania a intensywnością wzrostu
Próbka badana
Czas [min]
Intensywność wzrostu
1. Płytka kontrolna
0
2. Płytka otwarta
1
3. Płytka otwarta
5
4. Płytka otwarta
10
5. Płytka otwarta
20
6. Płytka otwarta
30
7. Płytka zamknięta
40
8. Płytka osłonięta folią (połowa)
40
6.
Wyciągnąć wnioski na temat skuteczności jałowienia promieniowaniem UV