Metodyka pracy z bakteriofagami
Bakteriofagi - pasoŜyty wewnątrzkomórkowe bakterii
stadia:
→
wirion – ma morfologię, ale nie wykazuje metabolizmu, potrafi tylko
infekować
→
fag wegetatywny – nie ma morfologii, nie moŜemy stwierdzić jego
obecności; forma replikacyjna, dopiero uwolniony nowopowstały fag znowu ma
morfologię
Kształty:
→
sferyczny – „kijanka” z ogonkiem; dwudziestościan
→
postać nitkowata
Kapsyd (płaszcz)
nadaje kształt, zbudowany z białek
w środku upakowany kwas nukleinowy DNA lub RNA,
jedno- lub dwuniciowy
kształt „kijanki”:
np. fag T4
na ogonku pajęcze nóŜki + płytka (do adsorbowania na
powierzchni komórki)
fag λ
niekurczliwy ogonek + główka
fag T4
kurczliwy ogonek + główka
Poszczególne fagi mają róŜne liczby genów, np. fag T4 ma ok. 160 genów
Najwięcej jest genów kodujących syntezę białek
umoŜliwiających
wydostanie się z komórki i budujących kapsyd
Jedyny cel faga to adsorbowanie się na powierzchni bakterii. Jest to moŜliwe
tylko przy obecności u bakterii odpowiednich receptorów (np. lipoproteiny,
lipopolisacharydu ) w ścianie komórkowej, otoczce lub w pilusach płciowych
(w przypadku fagów męskich, atakujących komórki z plazmidem F, np. fag
M13)
Etapy zakaŜenia:
I adsorpcja
odnalezienie receptora, zaadsorbowanie się na komórce bakteryjnej
Fag T4 adsorbuje się dzięki płytce
Fag λ – końcem ogonka (receptorem jest białko LamB – poryna uczestnicząca w
transporcie maltozy)
II wstrzyknięcie materiału genetycznego
Płaszcz pozostaje na zewnątrz
Po wniknięciu mogą zajść dwa cykle:
a.
lityczny
po wprowadzeniu kwasu nukleinowego
synteza tzw. wczesnych białek, które inicjują replikację DNA fagowego
przy uŜyciu aparatu replikacyjnego bakterii
synteza cząstek kwasu nukleinowego faga
inicjacja syntezy białek późnych, tj. budujących kapsyd
pakowanie kwasu nukleinowego do kapsydu
produkcja lizozymu, który od zewnątrz rozpuszcza wiązania glikozydowe
w mureinie, co powoduje osłabienie struktury ściany komórkowej i rozpad
komórki
b.
lizogenny
po wprowadzeniu kwasu nukleinowego
synteza represora replikacji genomu fagowego (zamiast wczesnych
białek), co hamuje powstawanie nowych cząstek fagowych
materiał genetyczny wbudowuje się w genom bakterii;
wbudowany genom podlega tym samym procesom co genom bakterii
Fag λ – istnieje ściśle określone miejsce w genomie bakteryjnym, gdzie fag
moŜe się wbudować (pomiędzy genami gal i bio, kodującymi galaktozę i
biotynę); E. coli (λ)
→
oznaczenie zainfekowania fagiem λ; fag w formie
profaga, co oznacza, Ŝe póki występuje represor nie jest groźny dla komórki
szczep lizogenny: komórki zainfekowane profagiem są oporne na
zakaŜenie kolejnym takim samym lub podobnym fagiem
→
oporne na
superinfekcję; cecha ta często wykorzystywana jest w wirusologii
uzjadliwienie genomu bakteryjnego razem z fragmentem chromosomu
bakterii; fag λ wycinany jest z fragmentem genu gal lub bio
Uwolnione cząstki zawierają cechy komórki bakteryjnej
Transdukcja – przenoszenie przez fagi cech chromosomalnych do innych
komórek
Wycinanie przez zastosowanie promieniowania UV lub wysokiej
temperatury
Transdukcja zachodzi spontanicznie, gdy podczas podziału komórki zachodzi
nierównomierny rozdział represora replikacji kwasu nukleinowego faga, tak
Ŝe tylko jedna komórka potomna dostaje represor, druga zaś ulegfa lizie
T4
→
z jednego faga wnikającego, w obrębie jednej komórki powstaje ok. 200
nowych fagów
M13
→
tylko 8 genów, w tym 7 genów zachodzących
bardzo oszczędny
materiał
maturaza
→
białko „omnibusowe” (wieloczynnościowe); odpowiada za
adsorpcję, wprowadzenie DNA, replikację, dojrzewanie i uwalnianie
wnika do wierzchołków pilusów płciowych (inne fagi mogą teŜ wnikać z
boku pilusa); pilusy są droŜne, przez nie kwas nukleinowy wnika do środka
komórki
po zainfekowaniu jednym fagiem M13 moŜe powstać do tysiąca cząstek
fagowych
cykl nie prowadzi do lizy, dziurawi tylko komórkę, wychodzi z niej porcjami,
co pozwala komórce przeŜyć
Efekt działania faga w cyklu litycznym
→
obserwujemy na podłoŜu stałym
wykonanym metodą płytek dwuwarstwowych;
mętna, gęsta i nieprzejrzysta murawa, przerywana klarownymi miejscami,
tzw. łysinkami fagowymi, w których zaszła liza komórek
Łysianka powstaje wokół centrum infekcyjnego, tj. jednej komórki zaraŜonej
fagiem, która zakaŜa sąsiadujące komórki, prowadząc do ich lizy. Po kilku
cyklach powstaje widoczna gołym okiem, klarowna łysinka.
Jeśli komórka przeŜywa w wyniku przeprowadzania przez faga cyklu
lizogennego
→
moŜe nastąpić wolny wzrost i miejscowe rozrzedzenia mętnej
murawy, nie ma jednak klarownych łysinek.
We wcześniej przeprowadzanych doświadczeniach mogliśmy gołym okiem
zaobserwować wzrost kolonii pochodzącej od jednej komórki bakteryjnej.
Pracując z bakteriofagami moŜemy obserwować efekt działania jednej cząstki
fagowej.
Aby mieć pewność, Ŝe jedna komórka bakteryjna będzie zainfekowana nie
więcej niŜ jednym fagiem, musimy dodać duŜy nadmiar materiału bakteryjnego
i zainfekowany materiał hodować równomiernie rozprowadzony na podłoŜu
stałym
moŜliwe dzięki metodzie płytek dwuwarstwowych
Fagi wirulentne
liza
Fagi łagodne
10 % komórek nie ulega lizie, przeŜywa infekcję fagową
Jeśli mówimy o bakterii, Ŝe jest wraŜliwa na danego faga, to znaczy, Ŝe posiada
odpowiedni receptor.