© Copyright by $taś
1
Ogólne
- wymiary bakterii – 0,3-5 μm (do ich obserwacji wymagane powiększenie 500-1000 krotne mikroskopu, czyli
blisko zdolności rozdzielczej mikroskopu świetlnego)
- nukleoid- bardzo cienka, długa, dwuniciowa, kolista cząsteczka DNA
- plazmidy – dodatkowe struktury genetyczne
- błona komórkowa otoczona jest ścianą komórkową à najważniejszym składnikiem ściany jest mureinowy
szkielet podtrzymujący
o
ścianę komórkową bakterii Gram-ujemnych cechuje obecność porowatej błony zewnętrznej, na
powierzchni której występuje lipopolisacharyd odpowiedzialny za patogenezę zakażeń
powodowanych przez bakterie. U Gram dodatnich brak błony zewnętrznej.
- Wiele bakterii ma polisacharydowe otoczki chroniące przed fagocytozą
- Adhezyjne pile lub inaczej fimbrie ułatwiają adhezję do gospodarza
- Spory = przetrwalniki – formy spoczynkowe
-
Barwienie metodą Grama: bakterie Gram-dodatnie barwią się na kolor niebieskofioletowy, za ś bakterie
Gram-ujemne na kolor czerwony
o
Procedura barwienia prowadzi do zabicia bakterii
o
W pierwszym etapie nakłada się materiał na szkiełko w postaci cienkiej warstwy, suszy na powietrzu
i utrwala termicznie albo za pomocą alkoholu metylowego
o
Stosuje się techniki barwienia prostego lub złożonego.
o
Najbardziej znaną techniką barwienia prostego jest barwienie błękitem metylowym
o
Z kolei najważniejszą metodą barwienia złożonego jest metoda Grama:
§
Bakterie Gram dodatnie barwią się na kolor niebieskofioletowy
§
Bakterie gram ujemne barwią się na kolor czerwony
§
Ściana komórkowa bakterii gram-dodatnich zapobiega wypłukaniu kompleksu barwnik-
jodyna.
o
Procedura barwienia metodą Grama
§
Fiolet gencjany lub fiolet krystaliczny – 1 minuta
§
Zlanie barwnika, spłukanie płynem Lugola, następnie nawarstwienie płynem Lugola na 2-3
minuty
§
Zlanie płynu Lugola
§
Odbarwienie mieszaniną aceton/alkohol etylowy (1:4)
§
Spłukanie wodą
§
Barwienie kontrastowe rozcieńczoną fuksyną karbolową, 1 minuta
§
Spłukanie wodą
Porównanie komórki eukariotycznej i prokariotycznej
Procaryotae
Eucaryotae
Wielkość: 1-10 μm
Wielkość: 10-100 μm
Brak błony jądrowej
Obecna błona jądrowa
Pojedynczy chromosom
Wiele chromosomów
Brak histonów związanych z DNA
Histony związane z DNA
Podział prosty
Podział mitotyczny
Brak kompartmentów błonowych
Ma kompartmenty błonowe
Ściana komórkowa zbudowana z peptydoglikanu Ściana komórkowa zbudowana z chityny lub celulozy (jeżeli
obecna)
Brak steroidów
Mogą być obecne steroidy
Rybosomy 70S
Rybosomy 80S
Możliwe oddychanie beztlenowe
Brak oddychania beztlenowego
Brak zróżnicowania tkankowego
Zwykle zróżnicowane w tkanki
Możliwe wiązanie azotu
Wiązanie azotu niemożliwe
Budowa bakterii
-
nukleoid
o
to odpowiednik jądra u bakterii
o
składa się ze zwiniętej, kolistej cząsteczki DNA (dwuniciowej) pozbawionej błony jądrowej
© Copyright by $taś
2
-
plazmidy
o
to dodatkowe struktury genetyczne
o
kuliste, skręcone cząsteczki DNA
o
100-1000 –krotnie mniejsze od nukleoidu
o
zdolność do autonomicznej replikacji
o
wiele z nich zawiera geny, które kodują pewne cechy fenotypowe gospodarza
§
plazmidy wirulencyjne – zawierają determinanty wirulencji (chorobotwórczości) bakterii
§
plazmidy oporności – zawierają informację genetyczną determinującą oporność na leki
przeciwdrobnoustrojowe
-
cytoplazma
o
zawiera dużą ilość rozpuszczalnych nisko- i wysokocząsteczkowych substancji, RNA oraz około
20000 rybosomów
o
w cytoplazmie przechowywane materiały zapasowe
-
rybosomy
o
są złożonymi strukturami sferycznymi składającymi się z kilku cząsteczek RNA i wielu białek
towarzyszących. Działają jako aktywne ośrodku syntezy białek
o
ich współczynnik sedymentacji wynosi 70 jednostek Svedberga. Składają się z dwóch
podjednostek: 50S i 30S
-
błona komórkowa
o
błona ta charakteryzuje się dobrze poznaną selektywną półprzepuszczalnością
o
zbudowana z podwójnej warstwy fosfolipidów z licznymi białkami wbudowanymi w jej strukturę
§
permeazy
·
aktywny transport subst odżywczych z zewnątrz do wewnątrz
§
enzymy uczestniczące w syntezie ściany komórkowej np. mureiny
§
białka transferowe uczestniczące w sekrecji białek pozakomórkowych
·
4 systemy sekrecyjne
§
białka sensorowe (sygnałowe)
·
przekazują informacje ze środowiska zewnętrznego komórki do jej wnętrza
§
enzymy łańcucha oddechowego
·
u bakterii z metabolizmem tlenowym (takie samo jak u Eucaryota)
-
ściana komórkowa
o
ochrona, utrzymywanie gradientu ciśnień osmotycznych, nadanie kształtu, komunikacja ze
środowiskiem
o
mureina jest najważniejszym składnikiem ściany. Inaczej to peptydoglikan
o
ściana komórkowa bakterii Gram-dodatnich
§
ścianę tą tworzy worek mureinowy, który może składać się nawet z 40 warstw
§
błonowe kwasy lipotejchojowe są zakotwiczone w błonie cytoplazmatycznej
§
błonowe kwasy tejchojowe ściany komórkowej są związane kowalencyjnie z mureiną
§
przykłady białek związanych z ścianą komórkową
·
białko A
·
czynnik CF (clumbing factor)
·
białko wiążące fibronektynę u Staphylococcus aureus
·
białko M u Streptococcus pyogenes
© Copyright by $taś
3
o
ściana komórkowa bakterii Gram-ujemnych
§
warstwa mureinowa około 3-krotnie mniejsza niż u Gram dodatnich
§
zewnętrznym elementem strukturalnym ściany komórkowej jest błona zewnętrzna
zawierająca liczne białka (50% masy) oraz na zewnątrz niej lipopolisacharyd o istotnym
znaczeniu w mechanizmach zakażenia
·
błona zewnętrzna składa się z podwójnej warstwy lipidów, białek i
lipopolisacharydu (LPS, endotoksyna)
·
białka błony zewnętrznej
o
OmpA i lipoproteina mureinowa à mostek między błoną zewnętrzną a
mureiną
o
Poryny w błonie zewnętrznej à przechodzenie subst z zewnątrz do
przestrzeni peryplazmatycznej
o
Liczne biała Omp pełnią funkcje transportową
·
Lipopolisacharyd (LPS) – in. endotoksyna
o
Składa się z:
§
Lipid A
·
Odpowiedzialny za efekt toksyczny
§
Polisacharyd rdzeniowy
§
O-swoisty łańcuch polisacharydowy
·
Stanowi tzw. antygen O
·
Jego szczególna struktura chemiczna warunkuje
występowanie wielu wariantów antygenowych
© Copyright by $taś
4
o
Bakterie Gram-dodatnie a bakterie Gram-ujemne
§
Bakterie Gram-dodatnie mają prostszą, ale grubszą ścianę komórkową, która składa się z
wilu warstw peptydoglikanu z rozsianymi w nim polimerami kwasu tejchojowego
§
Bakterie Gram-ujemne mają cieńszą ścianę komórkową z dwucząsteczkową warstwą
peptydoglikanu i nie zawierają kwasów tejchohowych
o
Otoczka
§
Chroni komórki bakteryjne przed fagocytozą
§
Wiele bakterii chorobotwórczych wykorzystuje pozakomórkowe enzymy do jej produkcji
o
Rzęski
§
Umożliwiają ruch aktywny
§
Zbudowane z białek – flagelin
§
Typy urzęsienia
·
Monotrychalny (jednorzęse)
·
Lofotrychalny (czuborzęse) à rzęski skupione na jednym lub dwóch biegunach
komórki
·
Perytrychalny (wokołorzęse) à rzęski na całej powierzchni komórki
§
Bakteryjna rzęska składa się wyłącznie z flageliny i porusza się ruchem śrubowym wokół
haczykowatego ciałka podstawowego
o
Pile (fimbrie)
§
U Gram-ujemnych
§
Pile adhezyjne
·
Zakotwiczone w błonie zewnętrznej ściany komórkowej i rozchodzą się
promieniście na powierzchni komórki
·
Umożliwiają swoiste przyleganie bakterii do receptorów komórki gospodarza
·
Np. pile P (PAP), CFA1, CFA1, pile adhezyjne gonokoków
§
Pile koniugacyjne (pile płciowe)
·
Niezbędne do przekazywania plazmidów koniugacyjnych
o
Spory bakteryjne (endospory)
§
Spoczynkowe formy życia bakterii
§
Kuliste lub owalne
§
duża odporność na czynniki chemiczne i fizyczne
·
gruba ściana
·
stan odwodnienia
© Copyright by $taś
5
·
krzyżowe wiązania białek uwarunkowane solami wapniowymi kwasu pirydyna-2,6-
dikarboksylowego (utrudnia to denaturację białek)
Wymagania odżywcze bakterii
- węgiel
- jony
nieorganiczne
- składniki
organiczne
o
węglowodany
o
aminokwasy i krótkołańcuchowe poliipeptydy
o
witaminy, puryny i pirymidyny
-
cząsteczki będące donorami elektonów, np. amoniak, azotyny i siarkowodów są źródłem enegii
o
bakterie litotroficzne
o
bakterie heterotroficzne
-
zcąsteczki pzyjmujące elektrony są redukowane i odgrywają podstawową rolę w procesach oddychania
ifermentacji
o
tlen to końcowy akceptor elektronów w oddychaniu tlenowym
o
w procesie fermentacji końcowymi związkami przyjmującymi elektony są pirogronian, mleczan i
inne związki organiczne
- tlen
o
bakterie można podzielić na 5 grup w zależności od ich zapotrzebowania na tlen:
§
bezwzględne tlenowce
§
bezwzględne beztlenowce
§
względne beztlenowce – są zdolne do wykorzystywania zarówno cząsteczkowego tlenu,
jak i związków organicznych jako końcowych akceptorów elektronów
§
bakterie mikroaerofilne – rosną najlepiej w zwiększonym ciśnieniu parcjalnym CO2 (tj.
obniżonym tlenu)
§
bakterie aerotolerancyjne mogą przeżyć, ale nie rosnąć, przez krótki czas w obecności
tlenu atmosferycznego
Wzrost bakterii
-
bakterie rozmnażają się bezpłciowo przez podział poprzeczny na dwie komórki
-
ich liczba wzrasta w postępie logarytmicznym. Czas potrzebny do cyklu reprodukcyjnego jest nazwany
czasem generacji
o
bezwzględne beztlenowce rozmnażają się znacznie wolniej w porównaniu z bakteriami tlenowymi
- normalna krzywa wzrostu bakterii
o
krzywą tą otrzymuje się przez wprowadzenie bakterii wykazujących metabolizm spoczynkowy do
bulionu odżywczego, określenie liczby komórek w przedziałach czasowych i przedstawienie
uzyskanych wyników w układzie półlogarytmicznym
§
A – faza lag – wzrost masy bakteryjnej w jednostce objętości, jednak nie dochodzi do
wzrostu liczby komórek
§
B – faza przyspieszonego wzrostu
§
C – faza log (wzrostu wykładniczego) – liczba komórek wzrasta w postępie wykładniczym
§
D – faza opóźnionego wzrostu
§
E – faza stacjonarna – w wyniku wyczerpania składników odżywczych i wzrostu stężenia
toksycznych metabolitów
·
W tej fazie dostępność składników odżywczych jest czynnikiem ograniczającym
·
Dwa rodzaje bakterii: Bacillus i Clostridium, są zdolne do wytwarzania
przetrwalników (spor), czyli sporulacji. Jest to sposób różnicowania się komó®ke
© Copyright by $taś
6
prokariotycznych, który zostaje pobudzony po umieszczeniu bakterii w warunkach
niedoboru składników odżywczych
§
F – faza obumierania
- Dwufazowy
wzrost
o
Obserwuje się u bakterii zdolnych do wykorzystania dwóch różnych źródeł węgla
§
W początkowej eksplozji wzrostu jest wykorzystywany tylko jeden z węglowodanów
§
Po wyczerpaniu się pierwszego węglowodanu bakterie wchodzą w fazę stacjonarną, w
czasie której rozpoczyna się synteza enzymów i mechanizmów transportowych
prowadzących do wykorzystania drugiego węglowodanu
§
Kiedy warunki fizjologiczne są zadowalające, bakterie wkraczają w drugą fazę wzrostu
wykładniczego, opierającą się na wykorzystaniu drugiego węglowodanu
Czynniki zjadliwości bakteryjnej
- otoczki
o
na zewnątrz ściany komórkowej
o
chronią przed fagocytozą
o
to warstwa polimeru (najczęściej polisacharyd)
o
syntetyzowana przez enzymy znajdujące się w ścianie komórkowej bakterii
o
Możliwe mechanizmy zapobiegania fagocytozie
§
Otoczka przeszkadza w interakcji między przeciwciałem a C3
§
Otoczki mogą zapobiegać tworzeniu się C3b, Bb
- Adhezyny
o
Umożliwiają przyleganie do komórek śluzówki
o
Do czynników adhezyjnych można zaliczyć:
§
Fimbrie
§
Boczne łańcuchy lipopolisacharydu (antygeny O)
§
Białko M
- Inwazyjność
- Egzoenzymy
o
Enzymy rozkładające kolagen (tj. kolagenazy i hialuronidazy) i włóknik (tj. fibrynolizyny) umożliwiają
lepszą penetrację bakterii do tkanek
o
Enzymy rozkładające materiał komórkowy - proteinazy i lecytynazy
o
Enzymy modyfikujące i inaktywujące antybiotyki, takie jak β-lektynazy, są jednym z głównych
mechanizmów oporności bakteryjnej
- Toksyny
bakteryjne
o
Można je podzielić na:
§
Egzotoksyny à białka wytwarzane i uwalniane z komórki w celu wywołania toksyczności
·
Domena wiążąca i domena aktywna
·
Klasyfikacja czynnościowa:
o
Enterotoksyny – oddziałują na przewód pokarmowy
§
Toksyny ciepłochwiejne (Lt-I, LT-II)
§
Toksyna ciepłotrwała (ST)
§
Toksyna cholery
o
Neurotoksyny – wpływają na układ nerwowy
§
Toksyna botulinowa
§
Toksyna tężcowa (tetanospazmina)
o
Cytotoksyny – wpływają na komórki różnych tkanek
§
Toksyna błonicy
§
Toksyna A Pseudomonas
§
Endotoksyny à to część składowa bakterii
·
Są lipopolisacharydami (LPS) pochodzącymi ze ściany komórkowej bakterii Gram-
ujemnych
·
Endotoksyny nie są wydzielane aktywnie, a raczej uwalniane w czasie lizy bakterii
·
Są pierwotnie odpowiedzialne za rozwój posocznicy i wstrząsy septycznego
o
Patogeneza wstrząsu septycznego obejmuje aktywację makrofagów
przez LPS i uwolnienie licznych mediatorów, zwłaszcza czynnika martwicy
© Copyright by $taś
7
nowotworów (TNF-α) oraz interleukin (IL-1,6,8). Mediatory te zwane są
cytokinami prozapalnymi i są odpowiedzialne za większość
ogólnoustrojowych objawów zespołu wstrząsu septycznego. IL-8 ma
unikatową właściwość przyciągania i aktywacji granulocytów
obojętnochłonnych, przyczyniając się do mobilizacji komórek
fagocytujących, co jest niezbędne do eliminacji czynnika zakaźnego.
Flora fizjologiczna
-
liczebność prawidłowej mikroflory u dorosłego człowieka wynosi około 10
14
komórek bakterii
-
niektóre grzyby są również częścią mikroflory, natomiast wirusy i pasożyty nigdy
- znaczenie flory fizjologicznej
o
zajęcie miejsc wiązania na powierzchni komórek gospodarza zapobiega adherencji bakterii
chorobotwórczych do tych powierzchni
o
wydzielanie mucyny à ochrona przed przyleganiem organizmów chorobotwórczych
o
wydzielanie substancji uszkadzających, hamujących wzrost bakterii chorobotwórczych
o
pobudzanie układu odpornościowego
o
źródło witamin (głównie witaminy K)
o
stymulacja do odnowy śródbłonka
- anatomiczne rozmieszczenie flory bakteryjnej
o
skóra
§
większość to Gram-dodatnie bakterie beztlenowe
·
Staphylococcus epidermidis
·
Staphylococcus aureus
·
Propionibacterium
o
Jama ustna I górne drogi oddechowe
o
Przewód pokarmowy
§
W żołądku stosunkowo mało bakterii, bo kwaśne środowisko. Wyjątek stanowią
Mycobacterium tuberculosis i Helicobacter pylori, oba oporne na kwas żołądkowy.
o
Drogi moczowo-płciowe
§
W pochwie u kobiet najliczniejszą grupą są gatunki Lactobacillus. Czynnikiem sprzyjającym
rozwojowi zapalenia pochwy jest antybiotykoterapia. Ponieważ antybiotyki zmniejszają
normalne stężenie Lactobacillus i podnoszą pH w pochwie, ułatwiają namnażanie
drożdżaków i innych bakterii, które nie są wrażliwe na antybiotyki
Diagnostyka laboratoryjna zakażeń bakteryjnych
Mikroskopowe badanie materiałów pobranych od pacjentów:
-
barwienie
o
najczęściej wykorzystywane metody barwienia to:
§
metoda Grama
§
barwienie bakterii kwasoopornych
§
barwienie jodyną
§
metoda Giemsy
o
barwniki fluorescencyjne (fluorochromy)
§
są stosowane do szybkiej identyfikacji grzybów drożdżopodobnych i bakterii
§
najczęściej używane fluorochromy to:
·
oranż akrydynowy à barwi kwas nukleinowy bakterii i grzybów drożdżopodobnych
·
auramina i rodamina à wiążą się z kwasem mikolowym w ścianie prążków
·
fluorochromy zawierające kalkofluor à wiążą się z celulozą w komórkach grzybów
-
badanie w ciemnym polu
o
badanie to przeprowadza się za pomocą mikroskopu, który oświetla obiekt, pozostawiając ciemne
tło
o
metoda pozwala na obserwację krętków, które nie są widoczne w normalnym barwieniu
-
immunofluorescencja bezpośrednia
o
monoklonalne i poliklonalne przeciwciała znakowane fluoresceiną skierowane przeciwko swoistym
antygenom, dodawane do zawiesiny tkankowej lub komórkowej umożliwiają wykrycie
specyficznych mikroorganizmów
© Copyright by $taś
8
Hodowla i izolacja drobnoustrojów
- hodowla bakterii pozwala na izolację szczepów bakterii z materiałów klinicznych pochodzących od
pacjentów i na ich identyfikacje na podstawie wielu charakterystycznych cech
-
hodowla musi trwać co najmniej 18 godzin zanim uzyska się pierwsze wyniki
- pobieranie
materiałów
o
decydując się na pobranie materiału na posiew, należy wziąć pod uwagę wiele czynników, np.:
położenie geograficzne, porę roku, stadium choroby
o
próbki powinny być pobierane z miejsca, gdzie jest największe prawdopodobieństwo identyfikacji
czynnika etiologicznego choroby
o
materiał do badań należy pobierać przed rozpoczęciem leczenia lekami przeciwbakteryjnymi
o
pobrany materiał powinien być natychmiast umieszczony w podłożu transportowym
- podłoża
hodowlane
o
najczęściej stosowane pożywki to agar z krwią i agar czekoladowy
§
rośnie na nich większość drobnoustrojów
§
można na nie wysiewać wszystkie rodzaje materiałów z wyjątkiem kału
§
agar z krwią zawiera nieuszkodzone czerwone krwinki baranie
§
agar czekoladowy zawiera czerwone krwinki poddane lizie pod wpływem łagodnego
ogrzewania, które uwalniają nikotynamid kwasu adeninowego (NAD, czynnik V) i heminę
(czynnik X)
o
podłoże MacConkeya
§
to typ wybiórczy podłoża (pałeczki Gram-ujemne)
§
różnicowanie na podstawie zdolności do fermentacji laktozy
Testy serologiczne
- polegają na wykrywaniu swoistych przeciwciał u pacjenta
-
diagnostyka chorób zakaźnych oparta na wykrywaniu przeciwciał za pomocą testów serologicznych
- Wykonanie testów serologicznych jest uzasadnione, jeżeli:
o
Czynnik etiologiczny jest trudny do wyizolowania (np. zakażenia wirusowe, zakażenia
mikoplazmami, kiła)
o
Zakażenie jest umiejscowione głęboko (np. bruceloza, tularemia, paciorkowcowe zapalenie szpiku
kostnego, zapalenie płuc)
o
Trzeba potwierdzić rozpoznanie zakażenia poprzedzającego obecną chorobę
-
Jako zasadę przyjmuje się badanie serologiczne dwóch próbek krwi: jednej pobranej w ostrej fazie choroby
i drugiej 2-3 tygodnie później. Znaczący wzrost miana przeciwciał (tj. co najmniej czterokrotny) między
badanymi próbkami jest dowodem zakażenia bakterią, przeciwko której zostały wykryte przeciwciała
- Metody badań serologicznych
o
Odczyny wiązania dopełniacza
o
Odczyny IEA
o
Odczyny immunofluorescencji
o
Odczyn kłaczkujący
§
Jest oparty na wykrywaniu widocznych, dużych agregatów, które powstają w zawiesinie
swoistych przeciwciał reagujących z odpowiednimi antygenami zawartymi w surowicy
pacjenta
o
W odczynach pośredniej immunofluorescencji używa się znakowanychh fluoresceiną antyludzkich
przeciwciał do wykrywania ludzikich przeciwciał związanych ze znanym mikroorganizmem
§
Odczyn FTA-ABS
o
Odczyny immunodyfuzyjne
Document Outline