ĆWICZENIE NR 1
Drożdże – część praktyczna
A. Budowa komórki drożdżowej i fizjologia drożdży
Cel ćwiczenia
Poznanie budowy komórek drożdży i ich fizjologii.
Wykonanie
1. Badania makroskopowe
Rozróżnianie wybranych szczepów drożdży piwowarskich, gorzelniczych i
piekarskich
Na podłożu płynnym należy zwrócić uwagę na :
• występowanie osadu na dnie pożywki,
• gazowanie (ostrożne wstrząśnięcie płynu),
• tworzenie się kożuszka, błonki lub pierścienia na powierzchni płynu.
Na podłożu stałym po określonym czasie hodowli w temp. 20
0
C należy zwrócić
uwagę na:
• rodzaj wzrostu (jednolity nalot lub pojedyncze kolonie),
• powierzchnię wzrostu (matowa, błyszcząca) i strukturę kolonii (zwarta,
mazista),
• zabarwienie i kształt kolonii.
2. Badania mikroskopowe
Obserwacje mikroskopowe: kształtu, wielkości, sposobu ułożenia oraz rozmnażania
komórek. Preparaty wykonuje się z jedno dobowych kultur hodowanych na podłożu
płynnym w temp. 30
0
C. Preparaty mikroskopowe różnych ras drożdży: winiarskich,
piwowarskich, gorzelniczych, piekarskich.
2.1.Badanie żywotności drożdży — polega na zabarwieniu ich wodnym roztworem
błękitu metylenowego. Na szkiełku przedmiotowym do kropli badanych drożdży
dodaje się roztworu barwnika, przykrywa szkiełkiem nakrywkowym i ogląda pod
mikroskopem. Komórki martwe barwią się na niebiesko, natomiast żywe pozostają
niezabarwione.
2.2.Badanie obecności glikogenu — przeprowadza się podobnie, jak badanie na
żywotność z tym, że do barwienia używa się płynu Lugola. Komórki zawierające
glikogen będą zabarwione na kolor ciemnobrunatny, natomiast pozostałe na
jasnożółty.
3. Oznaczanie ilości komórek w 1 cm
3
gęstwy drożdżowej
Sporządza się szereg rozcieńczeń gęstwy drożdżowej (1:10, 1:50, 1:100) z udziałem
wody destylowanej i KOH (7 cm
3
H
2
O + 2 cm
3
5 % KOH + 1 cm
3
gęstwy drożdżowej).
Materiał po dokładnym wymieszaniu nanosi się pipetą na komorę Thoma i liczy pod
mikroskopem komórki drożdży przy powiększeniu 100-500 razy.
1
B. Drożdże piekarnicze
Cel ćwiczenia
Poznanie metod badań drożdży piekarskich prasowanych i suszonych, ocena
technologiczna drożdży.
Wykonanie
4. Sprawdzanie masy drożdży piekarskich suszonych
Zawartość opakowania zważyć z dokładnością do 0,1 g – porównać z deklarowaną
masą netto.
5. Określenie barwy
Barwę badanej próbki należy określać wzrokowo przy świetle dziennym
rozproszonym.
6. Określenie zapachu
Należy przeprowadzić w pomieszczeniu pozbawionym obcych zapachów, zapach
drożdży piekarskich prasowanych należy określić bezpośrednio po skrojeniu
wierzchniej warstwy cegiełki, a zapach drożdży piekarskich suszonych, paszowych i
piwowarskich — natychmiast po otwarciu opakowania.
7. Określenie konsystencji
Cegiełkę drożdży należy nagnieść lekko palcem w środku bocznej powierzchni;
konsystencja powinna być ścisła, dopuszcza się zewnętrzną mazistość, jeśli nie jest
połączona z przykrym zapachem rozkładającego się białka.
8. Oznaczanie zawiesiny wodnej
Do probówki szklanej wrzucić grudkę drożdży (około 1 g na 20 cm
3
) pobraną z
wnętrza cegiełki, dodawać porcjami wodę do około połowy pojemności probówki z
korkiem. Obserwować zawiesinę po całkowitym wymieszaniu — zawiesina powinna
być jednorodna, w ciągu 5 min nie powinna wykazywać grudek ani kłaczków na dnie
probówki.
9. Oznaczanie zawartości suchej masy
W naczyńku wagowym, wysuszonym w temp. 105
0
C do stałej masy i uprzednio
zważonym, odważyć około 1g drożdży z dokładnością do 0,001 g.
Naczyńko otwarte wraz z przykrywką umieścić w suszarce na 1,5–2h, w temp. 55–
60
0
C lub pod lampą promiennikową. Następnie otwarte naczyńko ponownie umieścić
w suszarce, w temp.105
0
C na 1h. Oznaczenie uważa się za zakończone, jeśli
różnica masy po kolejnym dosuszeniu nie przekracza 0,001g.
10. Kwasowość drożdży
Rozpuścić 10g drożdży w 50 cm
3
wody destylowanej i otrzymaną zawiesinę
miareczkować 0,1 M NaOH wobec fenoloftaleiny. Wynik podać w cm
3
1 M NaOH na
100g drożdży.
2
11. Oznaczanie czasu podnoszenia ciasta
5g drożdży odważyć w zlewce, na wadze technicznej z dokładnością do 0,01 g.
Sporządzić 160 cm
3
roztworu soli kuchennej o stężeniu 2,5%. Przenieść odważone
drożdże za pomocą przygotowanego roztworu (ogrzanego do temp. 35
0
C) do 280 g
mąki ogrzanej w cieplarce do temp. 35
0
C, uprzednio wsypanej do miesiarki.
Zanotować czas dodania drożdży do ciasta. Następnie miesić ciasto przez 5min po
czym przenieść do foremki ogrzanej do temp. 35
0
C, wysmarowanej wewnątrz olejem
jadalnym. Ciasto rozłożyć równomiernie w foremce, zawiesić poprzeczkę i
natychmiast wstawić foremkę do cieplarki. Ciasto pozostawić w cieplarce do chwili,
gdy dotknie ono poprzeczki (1 pęd). Następnie wyjąć foremkę z cieplarki i w ciągu
1min ugniatać ciasto w miesiarce lub ręcznie, i ponownie umieścić w foremce.
Zawiesić poprzeczkę i wstawić całość do cieplarki. Gdy ciasto dotknie poprzeczki,
zanotować czas (2 pęd) i powtórzyć wykonane czynności dla trzeciego pędu.
12. Oznaczanie aktywności sacharolitycznej drożdży
0,5g drożdży prasowanych, rozprowadzić w 10 cm
3
wody wodociągowej o temp.
35
0
C. Do otrzymanej zawiesiny dodać 10cm
3
, 10% roztworu sacharozy ogrzanego
do temp. 35
0
C. Następnie postępować według metody A lub B, w zależności od
dostępnego wyposażenia.
A) Kolbę zamknąć szczelnie korkiem zaopatrzonym w rurkę
odprowadzającą CO
2
do wyskalowanej biurety wypełnionej wodą i
wstawić do termostatu (35
0
C). Mierzyć czas wydzielenia 10cm
3
CO
2
Miarą aktywności sacharolitycznej jest ilość cm
3
CO
2
wydzielona przez
0,1 g s.s. drożdży w ciągu 1 godz.
B) Kolbę zamknąć szczelnie korkiem zaopatrzonym w rurkę fermentacyjną
napełnioną gliceryną, zważyć całość z dokładnością 0,01g, a następnie
wstawić do cieplarki (35
0
C) na okres 1 godziny. Znając różnicę mas
przed i po fermentacji obliczyć ilość wydzielonego CO
2
[cm
3
].
Aktywność sacharolityczną podać jako ilość cm
3
CO
2
wydzielonych
przez 0,1g s.s (suchej substancji) drożdży w ciągu 1 godz., wiedząc, że
1 mol CO
2
= 44,0g odpowiada objętości 22,4 dm
3
.
3
13. Bezpośrednie liczenie komórek drożdży w zawiesinie. Liczenie przy użyciu komór.
Komory do liczenia drobnoustrojów pod mikroskopem mają postać szklanych płytek z wyciętym wgłębieniem
podzielonym na kwadraty lub prostokąty o znanej powierzchni.
Używane są komory Thoma (hemocytometr), Howarda, Bürkera, Fuch Rosenthala i inne. Różnią się one
wymiarami powierzchni, na których liczy się drobnoustroje. Dane dotyczące powierzchni i głębokości podane
są na komorach.
W komorach można zasadniczo liczyć tylko większe komórki drobnoustrojów, takie jak drożdże, zarodniki i
strzępki grzybów. Ograniczenia te wynikają po pierwsze stąd, że grubość i głębokość komory nie pozwalają na
użycie obiektywów o dużej sile powiększenia, a więc tym samym o małej odległości roboczej i po drugie przy
dużej głębokości komory (100 mikrometrów = 0,1 mm) małe drobnoustroje np. bakterie o średnicy 5
mikrometrów (µm), mogą układać się w wielu płaszczyznach i przy użyciu silniejszych obiektywów o małej
głębi ostrości część komórek położona nad i pod płaszczyzną pola widzenia będzie niewidoczna.
Komorę Thoma przedstawia rysunek 3. Jest to grube szkiełko przedmiotowe z wyciętymi wgłębieniami o
głębokości 0,1 mm (100 µm). Wgłębienia te widoczne są gołym okiem po obydwu stronach środkowego
kanalika jako równoramienne krzyże, powstałe z przecięcia linii wyznaczających regularne, kwadratowe i
prostokątne powierzchnie. Bok kwadratu wynosi 1/20 mm (50 µm). Powierzchnia kwadracika wynosi więc
1/400 mm
2
(2500 µm
2
). W każdej siatce znajduje się 400 kwadracików. Po przykryciu komory szkiełkiem
przykrywkowym nad każdym kwadracikiem powstaje prostopadłościan o objętości 1/400 mm
2
x 0,1mm =
1/4000 mm
3
(2500 µm x 100 µm
3
= 25 000 µm
3
). Co piąty kwadrat w obu kierunkach podzielony jest na pół
dodatkową linią, w wyniku czego część kwadratów ma powierzchnię o połowę mniejszą, a cała komora
podzielona jest w ten sposób na 16 dużych kwadratów, z których każdy składa się z 16 małych kwadracików.
Na przecięciu dodatkowych linii powstają maleńkie kwadraciki o czterokrotnie mniejszej powierzchni równej
1/1600 mm
2
.
ora Thoma: a – widok z góry, b – widok z
Na powierzchni komory Thoma wyżłobione są trzy kanaliki tworzące literę H, dwa poprzeczne i jeden
środkowy, łączący je. Mają one za zadanie
zatrzymywać nadmiar płynu naniesionego na komorę.
Oznaczanie liczby drobnoustrojów przy użyciu komory
Thoma wykonuje się następująco. Zawiesinę komórek
drożdży mających tendencję do zlepiania się
rozcieńcza się, biorąc 5 objętości zawiesiny i 1 objętość
kwasu siarkowego rozcieńczonego wodą w stosunku
1:10, wytrząsa się kilka minut, przenosi szybko do
komory Thoma, przykrywa szkiełkiem przykrywkowym i
przystępuje do liczenia. Po ustawieniu oświetlenia,
należy znaleźć siatkę komory najpierw przy obiektywie
10x, a następnie przy obiektywie 40x. Jeśli stwierdzi się
zbyt duże zagęszczenie drobnoustrojów, to należy
próbę rozcieńczyć ilościowo, np. 10-krotnie i powtórzyć
oznaczenie. Oblicza się średnią liczbę drobnoustrojów
z ok. 40 małych kwadracików (o pow. 1/400 mm
2
). W
sumie należy policzyć ok. 700 komórek, by błąd nie
przekroczył 10%. Komórki rozmieszczone są
nierównomiernie, w jednych kwadracikach może być
ich kilka, a w innych - kilkanaście.
Przy średniej liczbie komórek w jednym kwadraciku (a)
(L) w 1 cm
3
wynosi:
= 4 • 10
6
• a • n
Rysunek 3. Kom
i rozcieńczeniu (n),
zawartość komórek
L
4
boku, c– wgłębienie z naciętymi kwadratami, c' –
siatka kwadratów w powiększeniu