plik

Postępy Biochemii 59 (4) 2013

379

Angelika Chachaj
Andrzej Szuba



Klinika Chorób Wewnętrznych, 4 Wojskowy

Szpital Kliniczny z Polikliniką i Uniwersytet

Medyczny, Wrocław



Klinika Chorób Wewnętrznych, 4 Wojskowy

Szpital Kliniczny z Polikliniką, ul. Weigla 5, 50-

981 Wrocław; tel./faks: (71) 76 60 599, e-mail:

szubaa@yahoo.com

Artykuł otrzymano 30 września 2013 r.

Artykuł zaakceptowano 11 października

2013 r.

Słowa kluczowe: naczynia limfatyczne, lim-

fangiogeneza, PROX1, VEGFR-3, VEGF-C,

wrodzona niewydolność naczyń limfatycz-

nych

Wykaz skrótów: BEC (ang. blood endothelial

cells) — komórki śródbłonka naczyń krwiono-

śnych; ECM (ang. extracellular matrix) — ma-

cierz pozakomórkowa; LEC (ang. lymphatic en-

dothelial cell) — komórki śródbłonka naczynia

limfatycznego; LYVE-1 (ang. lymphatic vessel

endothelial hyaluronan receptor-1) — receptor

hialuronianu-1; PROX1 (ang. prospero-related

homeobox transcription factor 1) — czynnik trans-

krypcyjny typu homeobox związany z Prospe-

ro-1; SMC (ang. smooth muscle cells) — komórki

mięśni gładkich; VEGF-A, -C, -D (ang. vascular

endothelial growth factor - A, -C, -D) — śródbłon-

kowy czynnik wzrostu — A, -C, -D; VEGFR-3

(ang. vascular endothelial growth factor receptor-3)

— receptor czynnika wzrostu śródbłonka na-

czyń typu 3

Śródbłonek naczyń limfatycznych

STRESZCZENIE

porównaniu do wiedzy o budowie i funkcji śródbłonka naczyń krwionośnych, która

była intensywnie rozwijana przez kilka ostatnich dziesięcioleci, postęp w poznawaniu

komórek śródbłonka limfatycznego (LEC, ang.

blood endothelial cells) był przez długie lata

niemożliwy z powodu braku swoistych metod, które pozwoliłyby na uwidocznienie naczyń

limfatycznych w tkankach. Dopiero kilka ostatnich lat przyniosło w tym względzie istotny

postęp. Identyfikacja specyficznych znaczników LEC oraz rozwój nowych doświadczalnych

modeli zwierzęcych umożliwiły identyfikację wielu antygenów i czynników wzrostu tych

komórek oraz izolowanie czystych populacji LEC. Badania wskazują na heterogenność i

plastyczność LEC oraz na aktywny ich udział w utrzymywaniu homeostazy przestrzeni po-

zakomórkowej, w transporcie lipidów, odpowiedzi immunologicznej oraz w patofizjologii

ostrych i przewlekłych chorób zapalnych, reakcji odrzucania przeszczepów i chorób nowo-

tworowych. Artykuł przedstawia aktualną wiedzę dotyczącą znaczenia oraz regulacji LEC,

zarówno w zdrowiu, jak i w chorobie.

WPROWADZENIE — POSTĘP W POZNAWANIU BUDOWY

MOLEKULARNEJ ŚRÓDBŁONKA LIMFATYCZNEGO

Chociaż pierwsze wzmianki o istnieniu układu limfatycznego sięgają aż do

czasów starożytnej Grecji, a anatomiczna budowa układu limfatycznego została

opisana w całości pod koniec XIX wieku [1], to jednak dopiero kilka ostatnich lat

przyniosło istotny postęp w rozumieniu molekularnej struktury i funkcji komórek

śródbłonka limfatycznego. W porównaniu do wiedzy o budowie i funkcji śród-

błonka naczyń krwionośnych (BEC, ang. blood endothelial cells), która była inten-

sywnie rozwijana przez kilka ostatnich dziesięcioleci, postęp w poznawaniu LEC

był przez długie lata niemożliwy z powodu braku swoistych metod, które po-

zwoliłyby na uwidocznienie naczyń limfatycznych w tkankach. Naczynia chłonne

są trudne do wizualizowania, ponieważ są one często nieregularne i zapadnięte.

Najczęściej nie można ich w sposób pewny odróżnić od naczyń krwionośnych [2].

Dopiero w ostatnim dziesięcioleciu odkryto szereg znaczników LEC, dzię-

ki którym możliwe jest badanie naczyń chłonnych i odróżnienie ich od naczyń

krwionośnych. Spośród znanych obecnie kilkunastu znaczników LEC, w bada-

niach immunohistochemicznych najczęściej wykorzystuje się obecność na LEC

podoplaniny, receptora hyaluronianu LYVE-1 (ang. lymphatic vessel endothelial

hyaluronan receptor-1), czynnika transkrypcyjnego typu homeobox związanego

z Prospero-1 (PROX1, ang. prospero-related homeobox transcription factor 1) oraz

receptora czynnika wzrostu śródbłonka naczyń typu 3 (VEGFR-3, ang. vascular

endothelial growth factor receptor-3) [3]. Dotychczas nie znaleziono znacznika LEC

w pełni swoistego dla nich. Wszystkie poznane dotąd znaczniki LEC mogą znaj-

dować się także w innych komórkach [4]. Dlatego w badaniach stosuje się kom-

binację znaczników, najczęściej LYVE-1/podoplanina lub LYVE-1/PROX1 [3].

Znaczniki LEC nie tylko pozwoliły na ich odróżnienie od BEC w trakcie obser-

wacji preparatów immunohistochemicznych, ale umożliwiły również intensywny

rozwój technik izolowania czystych populacji LEC, co dało podstawę do ich mole-

kularnego scharakteryzowania. LEC zostały po raz pierwszy wyizolowane w 1984

roku przez dwa zespoły badaczy, Johnstona i Walkera, z przewodu limfatycznego

krezki krowy oraz przez Bowmana i wsp., od pacjentki z masywnym szyjnośród-

piersiowym torbielowatym naczyniakiem limfatycznym. Rok później LEC zostały

wyizolowane z przewodu piersiowego psa i człowieka. W 1994 roku Leak i Jones

po raz pierwszy zademonstrowali proces limfangiogenezy in vitro [1].

Dzięki znacznikom LEC izolowanie tych komórek stało się dużo prostsze. Są

one obecnie separowane za pomocą cytometrii przepływowej, przy zastosowaniu

sortowania komórek w polu elektrycznym albo magnetycznym, zarówno z du-

żych naczyń limfatycznych, takich jak np. piersiowy przewód limfatyczny, jak i

380

www.postepybiochemii.pl

z naczyń chłonnych włosowatych, pochodzących właściwie

z każdej tkanki ludzkiej lub zwierzęcej. Wyizolowane w ten

sposób LEC mogą być następnie unieśmiertelniane [5] i ba-

dane metodą in vitro oraz z użyciem ciałek embrionalnych.

Badania metodą in vitro umożliwiają ocenę skutków

działania poszczególnych stymulatorów bądź inhibitorów

limfangiogenezy. Badania te pozwalają zatem jedynie na

odrębną ocenę poszczególnych etapów limfangiogenezy

(np. proliferacji, adhezji albo migracji LEC) [5].

W ostatnich latach możliwe jest również badanie popula-

cji LEC za pomocą tzw. ciałek embrionalnych, zawierających

komórki macierzyste, które zanurza się w sztucznej macierzy

pozakomórkowej lub wszczepia do organizmu myszy. Jest to

metoda pośrednia pomiędzy badaniami metodą in vitro i in

vivo. Umożliwia ona ocenę kolejnych etapów procesu limfan-

giogenezy w czasie jednego badania. Komórki macierzyste

pod wpływem odpowiednich czynników wzrostu dzielą się,

różnicują w stronę fenotypu LEC, a w końcu tworzą prymi-

tywny splot naczyń chłonnych. Ciałka embrionalne mogą

zawierać komórki macierzyste od normalnych, ale też od

zmutowanych myszy, co umożliwia np. porównanie procesu

nowotworzenia naczyń chłonnych w czasie prawidłowego

rozwoju osobniczego i w stanach patologicznych [5].

W badaniach LEC metodą in vivo do niedawna używa-

no prawie wyłącznie transgenicznych myszy. Badania z

ich użyciem umożliwiły poznanie funkcji biologicznych

wielu białek i genów biorących udział w procesie limfan-

giogenezy, jak również testowanie nowych leków pro- i

antylimfangiogennych [5,6]. Z uwagi na to, że manipulacje

genetyczne u myszy są czasochłonne i kosztowne, od kilku

lat w badaniach LEC stosuje się także modele małych zwie-

rząt – danio pręgowanego (Danio reiro, ang. zebrafish) i ki-

janki żaby (Xenopus laevis i Xenopus tropicalis). Zarodki tych

zwierząt można otrzymać w dużych ilościach i w krótkim

czasie, co umożliwia manipulacje genetyczne zakrojone

na większą skalę niż z użyciem transgenicznych myszy.

Ponadto, zarodki danio i kijanki żab są przezroczyste, co

pozwala bezpośrednio obserwować proces limfangiogene-

zy. Od 2005 roku, kiedy po raz pierwszy scharakteryzowa-

no u tych małych zwierząt układ limfatyczny, zdążyły już

posłużyć w wielu badaniach do poznania mechanizmów

molekularnych regulujących funkcję LEC [6].

PROCES LIMFANGIOGENEZY W CZASIE ROZWOJU

PŁODOWEGO I W STANACH PATOLOGICZNYCH

Limfangiogeneza u człowieka rozpoczyna się w 6–7 ty-

godniu płodowym, i jest to 3–4 tygodnie po rozpoczęciu

embrionalnej angiogenezy. W tym czasie wybrane subpo-

pulacje komórek śródbłonka żylnego, wykazujące syntezę

VEGFR-3, położone w bocznych częściach przednich, pier-

wotnych żył głównych, zaczynają tracić właściwości komó-

rek śródbłonka żylnego, różnicując się w stronę fenotypu

LEC. Pierwszym wskaźnikiem tej nowej tożsamości LEC

jest synteza na nich LYVE-1 [7]. Te pierwsze LEC, wyka-

zujące produkcję LYVE-1, zaczynają się intensywnie dzielić

i tworzą pierwotne struktury morfologiczne naczyń chłon-

nych, tzw. pierwotne woreczki limfatyczne (ang. primary

lymph sacs), u człowieka w liczbie 6 [8,9].

Obwodowe naczynia chłonne wyrastają z pierwotnych wo-

reczków limfatycznych poprzez pączkowanie, a następnie wy-

dłużanie i rozgałęzianie, w wyniku czego powstaje pierwotny

splot naczyń limfatycznych, przenikający tkanki i narządy.

Najważniejszymi stymulatorami tworzenia naczyń chłonnych

są śródbłonkowy czynnik wzrostu-C (VEGF-C , ang. vascular

endothelial growth factor-C) oraz śródbłonkowy czynnik wzro-

stu-D (VEGF-D, ang. vascular endothelial growth factor-D). Pod-

czas rozwoju płodowego są one wydzielane przez mezenchy-

malne komórki otaczające pierwotne żyły główne, ale także

przez komórki naczyń krwionośnych, w tym komórki mię-

śni gładkich (SMC, ang. smooth muscle cells) oraz BEC [10,11].

VEGF-C i -D są ligandami receptora VEGFR-3, znajdującego

się na LEC. Poprzez działanie na ten receptor indukują wzrost

naczyń chłonnych, zarówno podczas rozwoju płodowego, jak

i w życiu pozapłodowym. Nowo utworzone naczynia chłonne

przechodzą następnie proces przemodelowania i dojrzewania.

Obejmują one przekształcenie prymitywnego splotu limfa-

tycznego w hierarchiczną sieć naczyń chłonnych [8,12] .

Uformowany już układ chłonny jest strukturą, która

reaguje na zmiany otoczenia. U dorosłych, wiele stanów

patologicznych przebiega z nowotworzeniem naczyń

chłonnych. Tzw. patologiczna limfangiogeneza zachodzi

w przypadku ran, chorób autoimmunologicznych, po ra-

dioterapii oraz w chorobie nowotworowej. Najważniejszy-

mi czynnikami limfangiogennymi są w niej VEGF-C oraz

śródbłonkowy czynnik wzrostu-A (VEGF-A, ang. vascular

endothelial growth factor-A), wydzielane przez komórki za-

palne, ewentualnie przez komórki nowotworowe.

HETEROGENNOŚĆ I PLASTYCZNOŚĆ LEC

Badania ostatnich lat wskazują na heterogenność i pla-

styczność LEC. Cechy te charakteryzują również BEC [13].

Rozważając zjawisko heterogenności, w uproszczeniu moż-

na przyjąć, że w organizmie człowieka nie ma dwóch iden-

tycznych komórek LEC, biorąc jednocześnie pod uwagę ich

status anatomiczny, morfologiczny, metaboliczny, funkcjo-

nalny i immunologiczny [13]. LEC wykazują fenotypową

zmienność, szczególnie zależną od ich lokalizacji i stanu

funkcjonalnego. Przykładem może być porównanie LEC po-

chodzących z naczyń chłonnych włosowatych i zbiorczych

pod względem morfologii (omówione w kolejnym podroz-

dziale), ale także obecności na nich receptora LYVE-1 i po-

doplaniny. LEC z naczyń włosowatych wykazują syntezę

obydwu znaczników, natomiast LEC z naczyń zbiorczych

tylko podoplaniny. LEC pochodzące z węzłów chłonnych,

śledziony, grasicy, migdałków podniebiennych czy też z bio-

drowego naczynia chłonnego, znacznie różnią się od siebie

pod względem produkcji różnych antygenów [13]. Porówna-

no np. transkryptom LEC pochodzących z jelita z transkryp-

tomem LEC pochodzących ze skóry. Wykazano, że komórki

te różniły się ekspresją ponad dwustu genów [14]. Podobnie,

profile antygenów obecnych na LEC z okresu płodowego,

z tkanki zmienionej zapalanie albo z guza nowotworowego

także są inne w tych różnych funkcjonalnie stanach LEC [4].

Heterogenność LEC dotyczy również ich pochodzenia.

Chociaż pierwotne LEC, budujące pierwotne woreczki limfa-

tyczne, mają pochodzenie żylne, to jednak LEC mogą rozwijać

Postępy Biochemii 59 (4) 2013

381

się również bezpośrednio z komórek prekursorowych pocho-

dzących ze szpiku kostnego. Nie wiadomo jeszcze czy takie

prekursory budują naczynia chłonne w czasie rozwoju pło-

dowego u ludzi. Wykazano jednak, że mogą być one źródłem

LEC w czasie patologicznej limfangiogenezy. Szpikowymi

prekursorami LEC wydają się być głównie monocyty CD11b+.

Komórki te wykazują syntezę antygenowo swoistą zarówno

dla monocytów (CD68, CD11b), jak i dla LEC (LYVE-1, podo-

planina, VEGFR-3, i PROX1). Pod wpływem stymulacji zapal-

nej komórki te są zdolne do przekształcenia się w LEC [15,16].

Zjawisko plastyczności LEC odnosi się natomiast do ich

potencjalnie zmiennej tożsamości. Wykazano, że BEC i LEC

pochodzące ze skóry wykazują podobną ekspresję ponad 95%

genów. O różnicowaniu się w kierunku fenotypu LEC spośród

BEC pierwotnej żyły głównej decyduje gen czynnika trans-

krypcyjnego PROX1. Stwierdzono, że ekspresja tego genu w

BEC zapoczątkowuje przeprogramowanie BEC w stronę feno-

typu LEC poprzez aktywację genów specyficznych dla LEC i

wyciszenie genów specyficznych dla BEC. W odwrotnej sytu-

acji, gdy w wykształconej już komórce LEC dojdzie do inak-

tywacji genu Prox1, następstwem jest utrata fenotypu LEC, co

wykazano zarówno w warunkach in vitro, jak i in vivo [13].

BUDOWA ANATOMICZNA I HISTOLOGICZNA

UKŁADU CHŁONNEGO. ZNACZENIE LEC W

HOMEOSTAZIE PRZESTRZENI POZAKOMÓRKOWEJ

Układ chłonny wraz z układem krwionośnym tworzą

wspólnie układ krążenia. Płyn oraz makrocząsteczki, któ-

re opuszczają naczynia krwionośne włosowate, są trans-

portowane z przestrzeni śródmiąższowej przez naczynia

limfatyczne włosowate i wracają z powrotem do krwio-

biegu poprzez sieć większych, tzw. zbiorczych naczyń

chłonnych. Tym samym, układ chłonny uzupełnia funkcję

układu krwionośnego poprzez regulację ilości płynu śród-

tkankowego oraz transport z przestrzeni śródmiąższowej

białek, produktów rozpadu komórek, produktów prze-

miany materii, komórek odpornościowych i sodu. Usuwa

również bakterie, inne mikroorganizmy inwazyjne oraz

cząsteczki, np. pyłu i kurzu, które wnikają do organizmu

przez skórę, układ oddechowy i przewód pokarmowy.

Dzięki temu układ chłonny przeciwdziała obrzękowi tka-

nek oraz utrzymuje właściwe środowisko zewnętrzne dla

komórek ustroju [8].

Chociaż układ chłonny i krwionośny komplementarnie

utrzymują homeostazę organizmu, to strukturalnie i funk-

cjonalnie są odrębnymi jednostkami. Podczas gdy układ ser-

cowo-naczyniowy tworzy układ zamknięty, w którym krew

pompowana jest przez serce, układ limfatyczny stanowi sys-

tem otwarty, jednokierunkowy, niskociśnieniowy, wolno-

przepływowy, nie posiadający centralnej siły napędowej [8].

System naczyń limfatycznych obwodowo zaczyna się śle-

po zakończonymi naczyniami włosowatymi o średnicy 30–80

μm, które następnie przechodzą w naczynia zbiorcze, a te —

w dwa przewody chłonne (przewód piersiowy i prawy prze-

wód limfatyczny), uchodzące do układu żylnego. Podczas gdy

głównym zadaniem mikronaczyń limfatycznych jest wychwyt

płynu śródmiąższowego oraz elementów morfotycznych z

tkanki śródmiąższowej, większe naczynia chłonne zapewniają

transport chłonki z powrotem do krwiobiegu.

Naczynia limfatyczne są obecne w większości tkanek or-

ganizmu, z wyjątkiem mózgu, siatkówki, szpiku kostnego

oraz tkanek pozbawionych unaczynienia, takich jak naskórek,

włosy, paznokcie, chrząstki i rogówki [8,17]. Aplazja układu

chłonnego jest wadą letalną, a jego dysfunkcja (wrodzona albo

nabyta) skutkuje rozwinięciem obrzęku limfatycznego [17].

Chłonne naczynia włosowate są cienkościenne, o

średnicy większej niż krwionośne naczynia włosowate.

Zbudowane są z pojedynczej warstwy nachodzących na

siebie dachówkowato LEC, które mają kształt liści dębu i są

ze sobą połączone przez wyspecjalizowane, krótkie i niecią-

głe połączenia (ang. button-like junctions), zbudowane m.in.

z VE-kadheryny [18]. W przeciwieństwie do krwionośnych

naczyń włosowatych, chłonne naczynia włosowate nie po-

siadają błony podstawnej oraz są pozbawione pericytów i

SMC [18,19]. Od zewnątrz LEC są umocowane w otaczają-

cej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM, ang. extracellular

matrix) za pomocą elastycznych włókien kotwiczących, tzw.

filamentów, zbudowanych z fibrylliny i emiliny-1. Włókna

te łączą LEC z włóknistymi elementami ECM, tj. kolagenem,

fibronektyną, tenascyną C, witronektyną, lamininą [20]. Fi-

lamenty stanowią nie tylko stabilizację delikatnych chłon-

nych naczyń włosowatych, ale również zapewniają regu-

lację stopnia przepuszczalności ściany tych naczyń. W wa-

runkach fizjologicznych chłonne naczynia włosowate mają

światło zapadnięte, jednak, gdy następuje wzrost ciśnienia

śródmiąższowego, filamenty odciągają od siebie LEC, co

skutkuje powstawaniem szczelin pomiędzy tymi komór-

kami. W ten sposób zwiększa się przepuszczalność ściany

i poszerza się światło tych naczyń, co zapewnia zwiększo-

ny drenaż otaczającej tkanki oraz ułatwione przechodzenie

makromolekuł oraz komórek do światła naczyń chłonnych

[17,20].

O dużym znaczeniu filamentów dla prawidłowego

funkcjonowania układu chłonnego świadczą wyniki ba-

dania, w którym u myszy analizowano konsekwencje

związane z brakiem genu emiliny-1. Histologicznie, na-

czynia chłonne tych myszy charakteryzowały się hipo-

plastycznością, zmniejszoną ilością filamentów i niepra-

widłowymi połączeniami międzykomórkowymi, a kli-

nicznie anomalie te prowadziły do wystąpienia obrzęku

limfatycznego [21].

Większe naczynia chłonne budową przypominają żyły.

Są zbudowane z warstwy LEC połączonych między sobą w

sposób ciągły (ang. zipper-like junctions) i otoczonych błoną

podstawną oraz warstwą SMC. Skurcze zbudowanych z

tych komórek mięśni gładkich wzdłuż naczyń chłonnych,

oprócz ruchów klatki piersiowej oraz pracy mięśni szkie-

letowych, stanowią siłę napędową przepływu chłonki [18].

Wykazano, że naczynia przejściowe, znajdujące się pomię-

dzy naczyniami włosowatymi i zbiorczymi, posiadają nie-

ciągłą warstwę SMC. Większe naczynia chłonne, podob-

nie jak naczynia żylne, posiadają zastawki, zapewniające

jednokierunkowy transport. Zastawki te zbudowane są

z rdzenia przymocowanego do ściany naczynia oraz po-

krywających go LEC [17,20]. Na rycinie 1 przedstawiono

schemat budowy naczyń chłonnych włosowatych i zbior-

382

www.postepybiochemii.pl

czych oraz specyficznych dla nich połączeń międzykomór-

kowych pomiędzy LEC.

ZNACZENIE LEC W ODPOWIEDZI

IMMUNOLOGICZNEJ I W STANACH ZAPALNYCH

Układ chłonny pod względem czynnościowym można

postrzegać jako część układu odpornościowego, na który,

oprócz naczyń limfatycznych, składają się węzły chłonne,

migdałki, grasica, śledziona, wątroba, kępki Peyera i szpik

kostny. Dzięki skierowaniu antygenów, leukocytów, ma-

krofagów i komórek dendrytycznych z tkanek do węzłów

chłonnych, układ limfatyczny odgrywa istotną rolę w ini-

cjowaniu odpowiedzi immunologicznej organizmu oraz

podtrzymywaniu tolerancji wobec własnych antygenów

[8,17].

W ostatnich latach wykazano, że LEC odgrywają również

istotną, aktywną rolę w patofizjologii chorób zapalnych, za-

równo ostrych, jak i przewlekłych. W ostrych stanach zapal-

nych, takich jak np. rany, ostre infekcje, dochodzi raczej do

poszerzenia istniejących naczyń limfatycznych, niż do ich

nowotworzenia [22]. Przewlekłe zakażenia dróg oddecho-

wych, reumatoidalne zapalenie stawów, choroba Leśniow-

skiego-Crohna, wrzodziejące zapalenie jelita grubego, łusz-

czyca skóry i zapalenia skóry po naświetlaniu promienio-

waniem UVB są przykładami przewlekłych stanów zapal-

nych, w których, oprócz tworzenia naczyń krwionośnych,

dochodzi również do wzmożonej limfangiogenezy [23].

Aktywny udział LEC w procesach zapalnych wynika

przede wszystkim z wydzielania przez nie szeregu cytokin,

takich jak CCL21, CXCL12 i CCL27. Cytokiny te są ligan-

dami dla receptorów, odpowiednio CCR7, CXCR4, CCR10,

znajdujących się na dojrzałych komórkach dendrytycznych i

niektórych limfocytach T i B. Połączenie cy-

tokin z tymi receptorami działa na zasadzie

„pokazania paszportu” przez komórki od-

pornościowe i ułatwia przechodzenie tych

komórek do światła naczynia chłonnego, a

następnie do węzłów chłonnych [23,24].

Ponadto, LEC wykazują syntezę szeregu

cząsteczek adhezyjnych, m.in. mannozowe-

go receptora 1 (MR-1, ang. mannose recep-

tor 1), CLEVER-1 (ang. common lymphatic

endothelial and vascular receptor-1), ICAM-

1 (ang. intercellular adhesion molecule-1),

VCAM-1 (ang. vascular adhesion molecu-

le-1). Cząsteczki te pośredniczą w procesie

przylegania leukocytów do LEC i ułatwiają

tym samym ich przechodzenie z tkanek do

światła naczyń chłonnych [23,24].

Ustalenie biologicznej roli limfangioge-

nezy w stanach zapalnych wymaga dal-

szych badań [25]. Z jednej strony, nowo-

tworzone naczynia limfatyczne w obrębie

tkanki zmienionej zapalnie zmniejszają jej

obrzęk, kierują antygeny i komórki odpor-

nościowe do węzłów chłonnych, wzmac-

niając tym odpowiedź immunologiczną,

a po ustaniu stanu zapalnego pomagają

oczyścić tkankę z rozpadłych komórek, cy-

tokin, nadmiaru płynu i komórek odpornościowych [26].

Z drugiej jednak strony, nie można wykluczyć, że zwięk-

szony drenaż limfatyczny miejsca zapalenia zwiększa ry-

zyko przeniesienia drobnoustrojów i cytokin zapalnych

po całym organizmie. Ponadto, wiadomo, że w przypadku

transplantacji narządów, np. nerek albo rogówki, nasilona

limfangiogeneza po przeszczepie, zwiększając migrację ko-

mórek odpornościowych do węzłów chłonnych, zwiększa

niepożądaną reakcję immunologiczną „gospodarz przeciw-

ko przeszczepowi” (ang. host versus graft reaction). Próby za-

stosowania leków hamujących limfangiogenezę wydają się

poprawiać ogólną przeżywalność przeszczepów. Wymaga

to jednak dalszych badań [27].

ZNACZENIE LEC W GOSPODARCE LIPIDOWEJ

Naczynia chłonne są również odpowiedzialne za wchła-

nianie tłuszczy oraz witamin rozpuszczalnych w tłuszczach

(A,D,E,K) z jelit, a z drugiej strony, uczestniczą w trans-

porcie zwrotnym cholesterolu (RCT, ang. rewers cholesterol

transport) [8,17,28]. Już w 1627 roku Gaspard Asselli we

Włoszech opisał biały płyn, który płynie „mlecznymi ży-

łami” (ang. milky veins) z jelit u psów po ich nakarmieniu

[1]. Chociaż transport lipidów z jelit był jedną z pierwszych

funkcji, jakie przypisano układowi chłonnemu, dotychczas

przeprowadzono niewiele badań dotyczących molekular-

nego poznania tego procesu [29].

Wykazano niedawno, że prawie wszystkie tłuszcze z jelit

dostają się do krwi przez układ chłonny, początkowo przez

wyspecjalizowane naczynia chłonne, zwane naczyniami

mleczowymi (ang. lacteals), znajdującymi się w kosmkach

jelitowych. Komórki jelita, enterocyty, wydzielają do blasz-

Rycina 1. Schemat budowy naczyń chłonnych włosowatych i zbiorczych oraz specyficznych dla nich

połączeń międzykomórkowych pomiędzy LEC.

Postępy Biochemii 59 (4) 2013

383

ki właściwej błony śluzowej jelita (lamina propria) chylo-

mikrony, będące lipoproteinami o średnicy 100-2000 nm,

bogatymi w trójglicerydy. W lamina propria chylomikrony

mają styczność z naczyniami chłonnymi. Dostają się do ich

światła, a następnie są nimi transportowane do układu żyl-

nego [30].

Nadal nie ma pewności, w jaki sposób chylomikrony do-

stają się przez warstwę LEC do światła naczyń chłonnych.

Do niedawna wśród naukowców panowała zgoda, że pro-

ces ten odbywa się poprzez transport bierny, przez otwory

międzykomórkowe pomiędzy LEC. Badania ostatnich lat

wskazują jednak na aktywny udział LEC w tym transpor-

cie. W kilku badaniach udowodniono, że chylomikrony

przechodzą przez warstwę LEC głównie poprzez transport

wewnątrzkomórkowy. Poznanie dokładnej, molekular-

nej charakterystyki tego procesu wymaga jednak dalszych

prac [29]. Zaburzenia transportu chylomikronów do układu

chłonnego mogą leżeć u podstawy patogenezy zespołu nie-

dożywienia i niedoboru witamin [30].

Naczynia chłonne biorą również udział w RCT. Polega

on na przekazywaniu lipoprotein o dużej gęstości (HDL,

ang. high density lipoproteins) z tkanek obwodowych do wą-

troby, najpierw drogą naczyń chłonnych, a potem naczynia-

mi krwionośnymi. W wątrobie HDL są metabolizowane do

cholesterolu i soli żółciowych, wydalanych z kałem. Proces

RCT zapewnienia homeostazę przestrzeni pozakomórko-

wej i stanowi ochronę przed miażdżycą naczyń [28,31].

Do niedawna uważano, że cholesterol z przestrzeni po-

zakomórkowej przechodzi do światła naczyń chłonnych

pasywnie, poprzez przestrzenie międzykomórkowe po-

między LEC. Wykazano, że komórki LEC działają w tym

transporcie aktywnie. HDL z przestrzeni pozakomórkowej

dostają się do światła naczyń chłonnych głównie drogą

przezkomórkową, po związaniu z receptorem SR-BI (ang.

scavenger receptor class B type I), obecnym na powierzchni

LEC. Transport zwrotny cholesterolu jest zatem procesem

kontrolowanym przez LEC [31].

ZNACZENIE LEC W METABOLIZMIE HIALURONIANU

I KONTROLI CIŚNIENIA TĘTNICZEGO

Hialuronian, inaczej kwas hialuronowy (HA, ang. hy-

aluronic acid), to glikozaminoglikan, który jest podstawo-

wym składnikiem ECM wszystkich tkanek. Pomimo prostej

struktury chemicznej, HA bierze udział w wielu ważnych

procesach w organizmie człowieka, przede wszystkim w

utrzymywaniu właściwego środowiska pozakomórkowe-

go, w tym, wiązaniu wody i sodu w tej przestrzeni. Wyka-

zano, że właściwości HA zależą od długości jego łańcucha.

Długi łańcuch HA sprawia, że działa on przeciwzapalnie,

natomiast krótsze jego formy są prozapalne. Produkty roz-

kładu HA, wytwarzane w odpowiedzi na stan zapalny w

tkance, mogą aktywować LEC i podwyższać w nich poziom

syntezy cząsteczek adhezyjnych (np. ICAM-1, VCAM-1), co

zwiększa rekrutację leukocytów i ewentualnych komórek

nowotworowych do odprowadzających naczyń limfatycz-

nych [32].

W organizmie człowieka zachodzi duży obrót HA, około

jedna trzecia całości HA jest wymieniana w ciągu jednego

dnia. W stanach zapalnych obrót HA dodatkowo wzrasta.

Szczególnie dużo HA znajduje się w skórze. Uważa się, że

zawiera ona ponad 50% całkowitej ilości HA znajdującej

się w organizmie człowieka. W tkankach HA jest metabo-

lizowany przez fibroblasty i makrofagi, ale również jest

on usuwany przez naczynia chłonne, które kierują go do

metabolizujących go węzłów chłonnych. Na komórkach

śródbłonka w obrębie zatok rdzeniowych w węzłach chłon-

nych znajduje się receptor HARE (ang. hyaluronan receptor

for endocytosis), zwany również stabiliną-2. Jest on głównym

receptorem dla glikozaminoglikanów, zapoczątkowuje ich

metabolizm i występuje nie tylko w węzłach chłonnych, ale

również w wątrobie i śledzionie. W narządach tych również

odbywa się metabolizm HA, jednakże o mniejszym ilościo-

wo znaczeniu niż w tkankach i węzłach chłonnych. LYVE-1

jest także receptorem dla HA, jednakże jego rola w metabo-

lizmie HA jest obecnie kwestionowana [32].

Dotychczas nie określono dokładnie jak duża część HA

jest w organizmie człowieka wychwytywana przez układ

chłonny i metabolizowana w węzłach chłonnych. Ostat-

nie badania wskazują jednak, że znaczenie LEC jest w tym

względzie mniejsze niż początkowo zakładano, a najwięk-

szy udział w obrocie HA wydają się mieć miejscowe makro-

fagi i fibroblasty [32].

Naczynia limfatyczne w skórze mogą mieć także znacze-

nie w regulacji ciśnienia tętniczego. W badaniach na sodow-

rażliwych szczurach (DSS, ang. Dahl’s salt sensitive rats) wy-

kazano, że glikozaminoglikany w skórze wiążą nieaktywny

osmotycznie sód. W sytuacji dużego nagromadzenia sodu

w skórze zostaje uruchomiona kaskada zdarzeń z udziałem

makrofagów, które wydzielają VEGF-C i stymulują limfan-

giogenezę. Nowo powstałe naczynia limfatyczne są uważa-

ne za mechanizm buforowy, który pozwala na zwiększony

drenaż tkanek bogatych w sód i chroni przed wystąpieniem

sodowrażliwego nadciśnienia tętniczego. Dotychczas nie

wiadomo jednak czy taki mechanizm obronny działa u czło-

wieka. Potrzebne są w tym względzie dalsze badania [33].

ZNACZENIE LEC W PATOFIZJOLOGII

CHOROBY NOWOTWOROWEJ

Znaczenie LEC w chorobach nowotworowych jest obec-

nie najbardziej intensywnie badanym obszarem dotyczącym

naczyń chłonnych. Coraz więcej badań wskazuje na silną

korelację pomiędzy nasileniem procesu limfangiogenezy w

obrębie guza a przerzutami komórek nowotworowych do

węzłów chłonnych, do odległych narządów i krótszym cza-

sem przeżycia chorych [3,8,34]. Przez długie lata układ chłon-

ny był traktowany jako bierny uczestnik procesu nowotwo-

rowego. Obecnie wiadomo już, że naczynia limfatyczne to

nie tylko proste kanały, do których komórki nowotworowe

wchodzą biernie, razem z płynem śródmiąższowym, a po-

tem są przekazywane wraz z chłonką do węzłów chłonnych.

Badania wykazują, że LEC aktywnie przyczyniają się do roz-

przestrzeniania się choroby nowotworowej [34,35].

384

www.postepybiochemii.pl

LEC, aktywowane przez cytokiny i czynniki wzrostu wy-

dzielane przez komórki nowotworowe, produkują chemoki-

ny, które ułatwiają komórkom nowotworowym wejście do

światła naczyń chłonnych, a następnie do węzłów chłonnych.

Komórki nowotworowe są wówczas traktowane jak komór-

ki odpornościowe. Przykładem są produkowane przez LEC

cytokiny CCL21 i CXCL12, które mogą łączyć się z komór-

kami nowotworowymi wykazującymi syntezę swoistych dla

nich receptorów, odpowiednio CCR7 (np. komórki czerniaka,

raka piersi, raka żołądka, niedrobnokomórkowego raka płuc)

i CXCR4 (np. komórki czerniaka i raka piersi). Te chemokiny

i ich receptory odgrywają kluczową rolę w ułatwianiu prze-

rzutów komórkom nowotworowym [34-37]. Co więcej, cyto-

kiny wydzielane przez guz nowotworowy mogą wpływać

na zwiększenie przepuszczalności naczyń chłonnych oraz na

zwiększenie syntezy cząsteczek adhezyjnych na powierzch-

ni LEC, takich jak np. MR1 i CLEVER-1. Zmiany te również

mogą odgrywać rolę w zwiększaniu ryzyka przerzutów no-

wotworowych przez układ limfatyczny [38].

ZESPOŁY GENETYCZNE W WYNIKU

MUTACJI GENÓW ANTYGENÓW LEC

Mutacje wykryte w genach antygenów LEC pozwoliły zi-

dentyfikować genetyczną przyczynę wielu wrodzonych ze-

społów niewydolności naczyń limfatycznych. Mutacje genu

czynnika transkrypcyjnego SOX18 (region determinujący

płeć Y, SRY-box 18, indukujący bezpośrednio gen Prox1,

który jest głównym czynnikiem warunkującym fenotyp

LEC) zostały niedawno zidentyfikowane jako przyczyna

rzadkiego zespołu brak owłosienia — obrzęk — poszerzenie

naczyń chłonnych (ang. hypotrichosis-lymphedema-teleangiec-

tasia). W zależności od rodzaju mutacji zespół ten dziedzi-

czy się w sposób dominujący lub recesywny. Objawy wy-

stępują już u dzieci pod postacią utraty włosów na głowie,

braku rzęs i brwi, obrzęków limfatycznych, obejmujących

kończyny dolne i powieki, oraz teleangiektazji, występują-

cych głównie na dłoniach, nogach i podeszwach stóp [39].

Heterozygotyczne mutacje punktowe zmiany sensu w ge-

nie kodującym VEGFR-3 stwierdzono u kilku rodzin z choro-

bą Milroya. Jest to rzadka choroba, dziedziczona autosomalnie

dominująco. Jej istotą jest hipoplazja naczyń chłonnych skóry.

Klinicznie charakteryzuje się wystąpieniem obrzęku limfatycz-

nego, dotyczącego najczęściej jednej kończyny dolnej. Defekt

może również dotyczyć naczyń chłonnych jelit z objawami

biegunki tłuszczowej, występującej na skutek upośledzonego

transportu chylomikronów [40].

Mutacje w genie FOXC2 (czynnik transkrypcyjny z domeną

forkhead, ang. forkhead box protein C2, będący głównym regu-

latorem limfangiogenezy na etapie przebudowy i dojrzewania

nowo utworzonych naczyń) są przyczyną zespołu, nazwane-

go obrzękiem limfatycznym z podwójnym rzędem rzęs (ang.

lymphedema-distichiasis syndrome). Jest to choroba dziedziczo-

na autosomalnie dominująco, cechująca się występowaniem

obrzęku limfatycznego kończyn dolnych i podwójnym rzę-

dem rzęs (klinicznie — od kliku dodatkowych rzęs do całego

dodatkowego rzędu rzęs). Innymi objawami mogą być: meta-

plazja gruczołów Meiboma, żylaki, opadanie powiek, rozsz-

czep podniebienia i wrodzone wady serca [41].

Mutacje typu zmiany sensu (ang. missense mutation) w

genie integryny α9β1, warunkującej wykształcenie prawidło-

wych zastawek w zbiorczych naczyniach chłonnych, są zwią-

zane z wystąpieniem wrodzonego chylothorax u płodu [42].

Mutacje w genie CCBE1 (domeny EGF łączące kolagen i

wapń, ang. collagen and calcium-binding EGF domain-containing

protein 1, warunkujące pączkowanie i migrację nowych LEC

z pierwotnej żyły głównej) mogą powodować jedną z postaci

obrzęku limfatycznego dziedzicznego w sposób autosomalny

recesywny — zespół Hennekama (ang. lymphedema-lymphan-

giectasia-mental retardation syndrome). W zespole tym pacjenci

mają obrzęki limfatyczne kończyn, limfangiektazje w obrębie

jelit oraz różnego stopnia niesprawność intelektualną [43].

PIŚMIENNICTWO

1. Loukas M, Bellary SS, Kuklinski M, Ferrauiola J, Yadav A, Shoja MM,

Shaffer K, Tubbs RS (2011) The lymphatic system: a historical perspec-

tive. Clin Anat 24: 807-816

2. Choi I, Lee S, Hong YK (2012) The new era of the lymphatic system:

no longer secondary to the blood vascular system. Cold Spring Harb

Perspect Med 2: a006445

3. Van der Auwera I, Cao Y, Tille JC, Pepper MS, Jackson DG, Fox SB,

Harris AL, Dirix LY, Vermeulen PB (2006) First international consen-

sus on the methodology of lymphangiogenesis quantification in solid

human tumours. Br J Cancer 95: 1611-1625

4. Baluk P, McDonald DM (2008) Markers for microscopic imaging of

lymphangiogenesis and angiogenesis. Ann N Y Acad Sci 1131: 1-12

5. Bruyere F, Noel A (2010) Lymphangiogenesis: in vitro and in vivo mo-

dels. FASEB J 24: 8-21

6. Shin WS, Rockson SG (2008) Animal models for the molecular and me-

chanistic study of lymphatic biology and disease. Ann N Y Acad Sci

1131: 50-74

7. Banerji S, Ni J, Wang SX, Clasper S, Su J, Tammi R, Jones M, Jackson

DG (1999) LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a

lymph-specific receptor for hyaluronan. J Cell Biol 144: 789-801

8. Alitalo K, Tammela T, Petrova TV (2005) Lymphangiogenesis in deve-

lopment and human disease. Nature 438: 946-953

9. Wigle JT, Oliver G (1999) Prox1 function is required for the develop-

ment of the murine lymphatic system. Cell 98: 769-778

10. Karpanen T, Alitalo K (2008) Molecular biology and pathology of lym-

phangiogenesis. Annu Rev Pathol 3: 367-397

11. Achen MG, Jeltsch M, Kukk E, Makinen T, Vitali A, Wilks AF, Alitalo

K, Stacker SA (1998) Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D)

is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF

receptor 3 (Flt4). Proc Natl Acad Sci USA 95: 548-553

12. Sabin F (1902) On the origin of the lymphatics system from the veins

and the development of the lymph hearts and thorarcic duct in the pig.

Am J Anat 1: 367-391

13. Lee S, Choi I, Hong YK (2010) Heterogeneity and plasticity of lympha-

tic endothelial cells. Semin Thromb Hemost 36: 352-361

14. Norrmen C, Vandevelde W, Ny A, Saharinen P, Gentile M, Haraldsen

G, Puolakkainen P, Lukanidin E, Dewerchin M, Alitalo K, Petrova TV

(2010) Liprin (beta)1 is highly expressed in lymphatic vasculature and

is important for lymphatic vessel integrity. Blood 115: 906-909

15. Ran S, Montgomery KE (2012) Macrophage-Mediated Lymphangioge-

nesis: The Emerging Role of Macrophages as Lymphatic Endothelial

Progenitors. Cancers (Basel) 4: 618-657

16. Religa P, Cao R, Bjorndahl M, Zhou Z, Zhu Z, Cao Y (2005) Presence

of bone marrow-derived circulating progenitor endothelial cells in the

newly formed lymphatic vessels. Blood 106: 4184-4190

17. Albrecht I, Christofori G (2011) Molecular mechanisms of lymphan-

giogenesis in development and cancer. Int J Dev Biol 55: 483-494

Postępy Biochemii 59 (4) 2013

385

Lymphatic endothelium

Angelika Chachaj, Andrzej Szuba



Department of Internal Medicine, 4th Military Hospital in Wroclaw, 5 Weigla St., 50-981 Wroclaw, Poland



e-mail: szubaa@yahoo.com

Key words: lymphatic vessels, lymphangiogenesis, PROX1, VEGFR-3, VEGF-C, congenital lymphatic insufficiency

ABSTRACT

Compared to the knowledge about the structure and function of endothelial cells of blood vessels, which was heavily developed over the

past few decades, advance in the knowledge of lymphatic endothelial cells (LECs) for many years has been impossible, because of the lack

of specific methods that allow histological visualization of lymphatic vessels in the tissues. The last years have brought significant progress

in this field. Identification of specific markers of LECs and the development of new experimental animal models have allowed to recognize a

number of antigens and growth factors of LECs and to isolate pure LECs populations. Studies indicate heterogeneity and plasticity of LECs

and their active participation in the extracellular homeostasis, lipid transport, immune response and in the pathophysiology of acute and

chronic inflammatory diseases, graft rejection and cancer. The article presents the current knowledge on the importance and regulation of

LECs, both in health and disease.

18. Baluk P, Fuxe J, Hashizume H, Romano T, Lashnits E, Butz S, Vestwe-

ber D, Corada M, Molendini C, Dejana E, McDonald DM (2007) Func-

tionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic

vessels. J Exp Med 204: 2349-2362

19. Schulte-Merker S, Sabine A, Petrova TV (2011) Lymphatic vascular

morphogenesis in development, physiology, and disease. J Cell Biol

193: 607-618

20. Chen J, Alexander JS, Orr AW (2012) Integrins and their extracellular

matrix ligands in lymphangiogenesis and lymph node metastasis. Int J

Cell Biol 2012: 853703

21. Danussi C, Spessotto P, Petrucco A, Wassermann B, Sabatelli P, Mon-

tesi M, Doliana R, Bressan GM, Colombatti A (2008) Emilin1 deficiency

causes structural and functional defects of lymphatic vasculature. Mol

Cell Biol 28: 4026-4039

22. Huggenberger R, Siddiqui SS, Brander D, Ullmann S, Zimmermann

K, Antsiferova M, Werner S, Alitalo K, Detmar M (2011) An important

role of lymphatic vessel activation in limiting acute inflammation. Blo-

od 117: 4667-4678

23. Kim H, Kataru RP, Koh GY (2012) Regulation and implications of in-

flammatory lymphangiogenesis. Trends Immunol 33: 350-356

24. Maby-El Hajjami H, Petrova TV (2008) Developmental and patholo-

gical lymphangiogenesis: from models to human disease. Histochem

Cell Biol 130: 1063-1078

25. Jurisic G, Detmar M (2009) Lymphatic endothelium in health and dise-

ase. Cell Tissue Res 335: 97-108

26. Baluk P, Tammela T, Ator E, Lyubynska N, Achen MG, Hicklin DJ,

Jeltsch M, Petrova TV, Pytowski B, Stacker SA, Yla-Herttuala S, Jack-

son DG, Alitalo K, McDonald DM (2005) Pathogenesis of persistent

lymphatic vessel hyperplasia in chronic airway inflammation. J Clin

Invest 115: 247-257

27. Dietrich T, Bock F, Yuen D, Hos D, Bachmann BO, Zahn G, Wiegand S,

Chen L, Cursiefen C (2010) Cutting edge: lymphatic vessels, not blood

vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation. J

Immunol 184: 535-539

28. Chachaj A, Drozdz K, Szuba A (2008) [Reverse cholesterol transport

processes and their role in artherosclerosis regression]. Postepy Bio-

chem 54: 301-307

29. Dixon JB (2010) Mechanisms of chylomicron uptake into lacteals. Ann

N Y Acad Sci 1207 Suppl 1: E52-57

30. Nordskog BK, Phan CT, Nutting DF, Tso P (2001) An examination of

the factors affecting intestinal lymphatic transport of dietary lipids.

Adv Drug Deliv Rev 50: 21-44

31. Lim HY, Thiam CH, Yeo KP, Bisoendial R, Hii CS, McGrath KC, Tan

KW, Heather A, Alexander JS, Angeli V (2013) Lymphatic vessels are

essential for the removal of cholesterol from peripheral tissues by SR-

-BI-mediated transport of HDL. Cell Metab 17: 671-684

32. Jackson DG (2009) Immunological functions of hyaluronan and its re-

ceptors in the lymphatics. Immunol Rev 230: 216-231

33. Machnik A, Dahlmann A, Kopp C, Goss J, Wagner H, van Rooijen N,

Eckardt KU, Muller DN, Park JK, Luft FC, Kerjaschki D, Titze J (2010)

Mononuclear phagocyte system depletion blocks interstitial tonici-

ty-responsive enhancer binding protein/vascular endothelial growth

factor C expression and induces salt-sensitive hypertension in rats.

Hypertension 55: 755-761

34. McAllaster JD, Cohen MS (2011) Role of the lymphatics in cancer me-

tastasis and chemotherapy applications. Adv Drug Deliv Rev 63: 867-

875

35. Li T, Yang J, Zhou Q, He Y (2012) Molecular regulation of lymphangio-

genesis in development and tumor microenvironment. Cancer Micro-

environ 5: 249-260

36. Shields JD, Kourtis IC, Tomei AA, Roberts JM, Swartz MA (2010) In-

duction of lymphoidlike stroma and immune escape by tumors that

express the chemokine CCL21. Science 328: 749-752

37. Pepper MS, Tille JC, Nisato R, Skobe M (2003) Lymphangiogenesis

and tumor metastasis. Cell Tissue Res 314: 167-177

38. Irjala H, Alanen K, Grenman R, Heikkila P, Joensuu H, Jalkanen S

(2003) Mannose receptor (MR) and common lymphatic endothelial

and vascular endothelial receptor (CLEVER)-1 direct the binding of

cancer cells to the lymph vessel endothelium. Cancer Res 63: 4671-4676

39. Irrthum A, Devriendt K, Chitayat D, Matthijs G, Glade C, Steijlen PM,

Fryns JP, Van Steensel MA, Vikkula M (2003) Mutations in the tran-

scription factor gene SOX18 underlie recessive and dominant forms of

hypotrichosis-lymphedema-telangiectasia. Am J Hum Genet 72: 1470-

1478

40. Irrthum A, Karkkainen MJ, Devriendt K, Alitalo K, Vikkula M (2000)

Congenital hereditary lymphedema caused by a mutation that inacti-

vates VEGFR3 tyrosine kinase. Am J Hum Genet 67: 295-301

41. Dagenais SL, Hartsough RL, Erickson RP, Witte MH, Butler MG,

Glover TW (2004) Foxc2 is expressed in developing lymphatic vessels

and other tissues associated with lymphedema-distichiasis syndrome.

Gene Expr Patterns 4: 611-619

42. Ma GC, Liu CS, Chang SP, Yeh KT, Ke YY, Chen TH, Wang BB, Kuo

SJ, Shih JC, Chen M (2008) A recurrent ITGA9 missense mutation in

human fetuses with severe chylothorax: possible correlation with poor

response to fetal therapy. Prenat Diagn 28: 1057-1063

43. Alders M, Hogan BM, Gjini E, Salehi F, Al-Gazali L, Hennekam EA,

Holmberg EE, Mannens MM, Mulder MF, Offerhaus GJ, Prescott TE,

Schroor EJ, Verheij JB, Witte M, Zwijnenburg PJ, Vikkula M, Schul-

te-Merker S, Hennekam RC (2009) Mutations in CCBE1 cause general-

ized lymph vessel dysplasia in humans. Nat Genet 41: 1272-1274