1
Techniki molekularne wykład nr 12 18.01.2011
Z jednego genu może powstawać wiele transkryptów przy udziale:
- alternatywnych promotorów
- alternatywnych miejsc poliadenylacji
- alternatywnego splicingu
Wycinanie intronów z Euc. pre-rRNA i pre-tRNA.
5S rRNA – ulega transkrypcji przez pol. III i nie dojrzewa.
Pozostałe rRNA: 5.8S i 28S powstają w wyniku transkrypcji przez polimerazę I z jednej jednostki
transkrypcyjnej, jako pre-rRNA, który tak jak DNA bakteryjne, podlega dojrzewaniu przez cięcie i
docinanie końców przez nukleazy.
Geny tRNA występują pojedynczo lub jako wielogenowe jednostki transkrypcyjne i podlegają dojrzewaniu
w sposób podobny, jak u bakterii.
Główna różnica to obecność intronów w niektórych Euc. rRNA i tRNA . Żaden z tych intronów nie jest
podobny do intronów GU-AG lub AU-AC w pre-mRNA,
Introny w Euc. pre-rRNA występują rzadko i należą do grupy I intronów. Ten typ intronów zaleziono
również w genomach mitochondrialnych i chloroplastowych w pre-mRNA i pre-tRNA.
Ich wycinaniu towarzyszą dwie reakcje transestryfikacji:
1/. Pierwsza jest indukowana przez wolny nukleozyd lub nukleotyd: guanozynę, a nie nukleotyd w
obrębie intronu.
Grupa 3’OH tego kofaktora atakuje wiązanie fosfodiestrowe w miejscu składania po stronie 5’ intronu
przecinając je z przeniesieniem G na koniec 5’ intronu.
2/. Druga transestryfikacja, w której bierze udział grupa 3’OH eksonu atakuje wiązanie fosfodiestrowe po
stronie 3’intronu. Powoduje to przecięcie, połączenie dwóch eksonów i uwolnienie intronu.
Uwolnione introny mają formę liniową, a nie lassa, jak w przypadku intronów z pre-mRNA. Ulegają
dodatkowym transestryfikacjom prowadzącym do powstania form kolistych , co jest jednym z etapów
ich degradacji. Istotna cechą wycinania intronów grupy I jest to, że przebiega ono bez obecności białek, w
sposób autokatalityczny. RNA ma aktywność enzymatyczną- pierwszy przykład rybozymu.
Usuwanie intronów z eukariotycznych pre- tRNA
Introny w tRNA są dość powszechne u niższych Euc., mniej u kręgowców, u człowieka zaledwie w 6%.
Mają długość 14-60nt i występują zazwyczaj w pętli antykodonu, tuz za antykodonem.
Sekwencje intronów są zmienne, ale komplementarne częściowo do antykodonu oraz 1-2nt sąsiednich.
Tworzą się pętle poprzedzające wycięcie intronu. Podczas wycinania intronów z pre-tRNA nie maja
miejsca transestryfikacje. Cięcia dokonuje rybonukleaza, łączenia ligaza.
Pozostałe introny:
- grupy II – głównie u grzybów i roślin w pre- mRNA i pre-rRNA, sporadycznie u Proc. Autokatalityczny
mechanizm wycinania podobny do intronów w pre-rRNA i prawdopodobnie wspólne pochodzenie
ewolucyjne tych intronów. Niektóre SA elementami ruchomymi i ulegają transpozycji.
- grupy III- samowycinanie, jak u intronów grupy II, ale inna struktura drugorzędowa- pokrewieństwo
ewolucyjne do grupy II i intronów w pre- rRNA.
2
- introny piętrowe – twintrons- skomplikowane struktury tworzone przez dwa lub więcej intronów gr. II
i/lub III, położone jeden w obrębie drugiego, wycinane kolejno od środka.
-introny Archeonów- w genach tRNA i rRNA wycinane przez rybonukleazę podobna do tej, która wycina
introny z pre- tRNA.
Modyfikacje chemiczne Euc. RNA:
tRNA i rRNA u Euc. podlegają takim samym typom modyfikacji jak u Proc.
W przypadku tRNA enzymy modyfikujące rozpoznają struktury par zasad tworzone przez RNA, podobnie
jak egzonukleazy wycinające introny z tRNA.
Małe jąderkowe RNA (snoRNA) działają jako sekwencje naprowadzające przy modyfikacji euc. rRNA.
Np. ludzki pre-rRNA ulega 106 metylacjom i 95 pseudourydynylacjom.
Uczestniczą w tym procesie cząsteczki snoRNA – specyficzne dla każdej modyfikowanej pozycji w
RNA.
Charakterystyczny jest tylko motyw w obrębie snoRNA, który rozpoznawany jest przez enzym
dokonujący modyfikacji .
Oddziaływanie na zasadzie komplementarności snoRNA z miejscem docelowym wyznacza nukleotyd, który
ma być zmodyfikowany.
Redagowanie RNA
Ponieważ rRNA i tRNA są sekwencjami niekodującymi to konsekwencją ich chemicznych modyfikacji jest
jedynie zmiana struktury cząsteczek.
W przypadku mRNA chem. mody. zmieniają właściwości kodujące i zmieniają sekwencje aminokwasową
kodowanego białka- redagowanie RNA.
Redagowanie RNA nie jest zjawiskiem powszechnym, ale istotnym np. u człowieka jest to jeden z procesów
umożliwiających tworzenie różnorodnych przeciwciał. Zazwyczaj polega on na zmianie pojedynczego
nukleotydu w jednej pozycji, ewent, kilku w wybranych cząsteczkach mRNA ( z wyjątkiem
hiperredagowania np. cząsteczek wirusowych – redagowanie w wielu pozycjach np. 50% adenozyn
przekształcana w inozynę).
Redagowanie mRNA ludzkiej apolipoproteiny B.
W wyniku przekształcenia C w U tworzy się kodon terminacyjny, co prowadzi do powstania skróconej
formy apolipoproteiny B syntetyzowanej w komórkach jelita.
Inne typy redagowania :
- na dużą skalę- włączanie nukleotydów do krótkich RNA kodowanych przez kryptogeny- sekwencje, w
których brak wielu nukleotydów. Przebiega z udziałem RNA naprowadzających.
-redagowanie insercyjne- nukleotydy dodawane są przez polimerazę RNA w trakcie syntezy mRNA.
- przez poliadenylację- mRNA w mitochondriach zwierząt, na końcu transkryptu ( U lub UA) w wyniku
poliadenylacji tworzy się kodon terminacyjny UAA(AAAA)
Transport RNA w obrębie komórek eukariotycznych
Jedyna droga z i do jądra prowadzi przez kompleksy porów jądrowych w błonie i przebiega przy udziale
białek transportujących nazywanych karioferynami – specyficznymi dla białek towarzyszących
transkryptom.
snRNA i snoRNA- wracają do jądra po opłaszczeniu odpowiednimi białkami.
3
Degradacja RNA u Eucaryota
Euc. mRNA – dłuższy okres półtrwania aniżeli bakteryjne, 10-20 min. – drożdże; do kilku godz.-ssaki.
Szlaki degradacji mRNA:
- z udziałem egzosomu- degraduje transkrypty w kierunku 3’-5’- zawiera nukleazy, rozpoznaje czy
cząsteczki wychodzące z jądra mają łańcuch poli(A).
- Usuwanie czapeczki zależnie od deadenylacji- usuwanie czapeczki poprzedzone usunięciem łańcucha
poli(A), degradacja z udziałem egzonukleaz od końca 5’
-rozpad RNA zależny od kodonu nonsens (NMD)- kompleks białek rozpoznaje nieprawidłowe kodony
terminacyjne i indukuje odcięcie czapeczki, a następnie degradację 5’-3’ bez uprzedniego odcięcia poli A
Translacja
Translacja przebiega w czterech etapach:
1. Dołączanie aminokwasu do tRNA.
2. Inicjacja.
3. Elongacja:
a) łączenie tRNA do rybosomy
b) formowanie wiązania peptydowego
c) przesunięcie rybosomu do kolejnego kodonu
4. Terminacja
Translacja
1. Synteza białek zachodzi na rybosomach w cytoplazmie
2. mRNA ulega translacji w kierunku 3’-5’
3. Białka SA syntetyzowane od końca N do C
4. Aminokwasy są przyłączanie do tRna i dostarczane do rybosomy
- specyficzne tRNA wiążą określone aa
- komplementarne parowanie kodonu i antykodonu
Właściwości kodu genetycznego:
1. Triplety nukleotydów kodują jedne aminokwas.
2. mRNA koduje polipeptyd w sposób ciągły – brak przerw.
3. Niezachodzący.
4. Uniwersalny – prawie.
5. Zdegenerowany 18 z 20 aa jest kodowanych przez więcej niż jeden kodon.. Wyjątki: Met i Trp.
Degeneracja w trzeciej pozycji kodonu.
6. Kodon kodujący Met jest kodonem – start, kodony stop: TAA, TAG, i TGA
7. Pierwsza pozycja antykodonu (5’) /ostatnia kodonu (3’) paruje mniej specyficznie- wobble.
5’ anti-codon 3’codon
G pairs with U or C
C pairs with G
A pairs with U
4
U pairs with A or G
I( Inosine) pairs with A, U, or C
I = post- transcription modified
pourine
tRNA
Bakterie zawierające 30-45, a Euc. do 50 różnych rodzajów cząsteczek tRNA. Ponieważ w kodzie
genetycznym zapisanych jest tylko 20 aminokwasów oznacza to występowanie tRNA izoakceptorowych.
tRNA izoakceptorowe – różniące się od siebie cząsteczki tRNA, które są specyficzne dla tego samego
aminokwasu.
Cząsteczki tRNA mają długość 74-90 nt. zbudowane są nie tylko z NT: A, C, G, i U, ale również z
nukleotydów zmodyfikowanych ( 5-10 na cząsteczkę – około 50 typów modyfikacji).
Struktura tRNA określana jest jako liść koniczyny, a w jej skład wchodzą następujące elementy:
-ramię akceptorowe – 7 par zasad, z 5’ i 3’ końca cząsteczki, aminokwas przyłączony jest na końcu 3’
tRNA wchodzącej w skład sekwencji CCA,
- ramię D – zawiera zawsze nt: dihydrourydynę
- ramię antykodonowi – antykodon – 3 nt., które w trakcie translacji łączą się z mRNA
- pętla zmienna ( pętla V) – 3-5 nt w cząsteczkach tRNA klasy I lub 13-21 a tRNA klasy 2.
- ramię TΨC – zawiera sekwencję tymina- pseudourydyna- cytozyna
Syntetazy amino- acylo tRNA przyłączają aminokwasy do tRNA. Aminoacylacja przebiega w dwóch
etapach:
- w reakcji z ATP następuje aktywacja aminokwasu
- aa przenoszony jest na koniec 3’tRNA; wytwarzane jest wiązanie między grupą - COOH aa i grupą –OH
połączoną z C2’ lub C3’ reszty cukrowej ostatniego nukleotydu, którym jest zawsze adenina.
Każdy organizm ma około 20 syntetaz aminoacylotRNA, po jednej dla każdego aminokwasu, czyli
aminoacylacja izoakceptorowych tRNA jest prowadzona przez jedną syntetazę.
Syntetazy dzieli się na dwie grupy ze względu na to gdzie przyłączają aa:
- do grupy 2’OH (klasa I)
- do 3’OH (klasa II).
Zasada tolerancji redukuje liczbę niezbędnych komórce cząsteczek tRNA, bo jedna odczytuje 2 lub 3
kodony. Bakterie maja 30 różnych tRNA, a człowiek 48 ( 16- rozpoznaje po 2, a pozostałe po jednym
kodonie).
Oddziaływanie kodon (mRNA) – antykodon( tRNA)
1. Rybosom kontroluje topologię umożliwiając tworzenie par z antykodonem tylko jednej trójce
nukleotydów w mRNA.
2. mRNA jest zawsze odczytywany w kierunku 5’ – 3’.
3. Proces rozpoznawania kodonu jest skomplikowany z powodu zasady tolerancji – wynika ona z
tego, że pierwszy nukleotyd antykodonu jest zmodyfikowany, stąd możliwe jest tworzenie
nietypowych par zasad.
Rybosomy:
- występują wolno w cytoplazmie
- połączone są z błonami retikulum endoplazmatycznego
5
Rola rybosomów w procesie syntezy białek polega na:
1. Umieszczeniu we właściwych pozycjach względem siebie:
- mRNA
- aminoacylo- tRNA
- białkowych czynników translacyjnych
2. katalizowaniu reakcji chemicznych zachodzących w czasie translacji.
Rybosomy zbudowane SA z dwóch podjednostek:
- u bakterii (70S) – 50S i 30S
- u Euc. (80S) – 60S i 40S.
Duża podjednostka ryb. Euc. (60S) zawiera: 28S, 5.8S i 5S rRNA.
Duża podjednostka u Proc. (50S) zawiera: 23S i 5S. Bakteryjny odpowiednik 5.8S wchodzi w skład
23S.
U Euc. i Proc. mała podjednostka zawiera tylko jedną cząsteczkę rRNA: odpowiednio
18S i 16S rRNA.
W skład obu podjednostek wchodzą różne białka rybosomowe oznaczane S1, S2 itd.
( małej podjednostki) i L1, L2 itd. ( dużej).
Różnice w procesie translacji między Euc. a Proc.
Najważniejsze z nich dotyczą składania rybosomy na mRNA.
U bakterii translacyjny kompleks inicjacyjny jest składany bezpośrednio w rejonie kodonu
inicjacyjnego- miejsca rozpoczęcia syntezy białek. Mała podj. rybosomu połączona z czynnikiem
translacyjnym IF-3 przyłącza się do miejsca wiązania rybosomy na mRNA, nazywanego sekwencją
Shine – Dalgarno 5’ – AGGAGGU – 3’ położonego w odległości 3-10 nukleotydów powyżej kodonu
inicjacyjnego, miejsca rozpoczęcia translacji. Miejsce wiązania rybosomu jest komplementarne do
końca 3’ 16S rRNA małej podjednostki.
U bakterii kodonem inicjacyjnym jest AUG kodujący metioninę, rzadziej GUG lub UUG – rozpoznawane
przez tą samą cząsteczkę inicjatorowego tRNA niosącą N- formylometioninę.
W tworzeniu wiązania peptydowego może uczestniczyć tylko grupa karboksylowa inicjatorowej metioniny,
co wymusza kierunek syntezy białka N-C.
tRNA
1
fMet
jest dostarczany do małej podjed. rybosomu przez IF-2 połączony z GTP.
Etap inicjacji translacji kończy się w momencie związania czynnika IF-1.
Przyłączenie dużej podjednostki prowadzi do uwolnienia czynników inicjacyjnych z udziałem energii z
hydrolizy GTP.
Inicjacja translacji u Eucaryota
Najbardziej powszechny jest mechanizm party na skanowaniu mRNA:
Początkowo składany jest kompleks preinicjacyjny:
- podjednostka 40S
- kompleks potrójny: tRNA
1
Met
, eIF-2, GTP
- eIF-1, eIF-1A i eIF-3.
Inicjatorowi tRNA przenosi zwykłą metioninę, a nie jej formylowaną pochodną.
6
Po złożeniu kompleksu preinicjacyjnego łączy się on z końcem 5’ mRNA, w procesie tym bierze udział
kompleks wiążący czapeczkę (eIF- 4A, eIF-4E, eIF-4G).
Na przyłączanie kompleksu reinicjacyjnego do mRNA ma wpływ również ogon poli(A) na końcu 3’
mRNA i związane z nim białko wiążące poli(A) – PABP.
Stwierdzono, że długość poli(A) koreluje z wydajnością inicjacji.
Po połączeniu się z końcem 5’mRNA kompleks inicjacyjny skanuje cząsteczkę mRNA w celu znalezienia
kodonu inicjacyjnego.
mRNA lider poprzedzający kodon inicjacyjny może mieć kilkadziesiąt lub nawet kilkaset nukleotydów i
często zawiera struktury drugorzędowe, np. spinki.
U Euc. kodon inicjacyjny, którym przeważnie jest kodon 5’-AUG-3’ wchodzi w skład konserwatywnej
sekwencji zwanej sekwencją Kozak 5’ – ACCAUGG- 3’.
Po zlokalizowaniu przez kompleks inicjacyjny rejonu zawierającego kodon inicjacyjny następuje
przyłączenie dużej podjednostki rybosomu, co wymaga hydrolizy GTP i prowadzi do odłączenia
czynników inicjacyjnych.
Regulacja inicjacji translacji:
-ogólna- hamuje inicjację translacji zależną od czapeczki poprzez fosforylację czynnika eIF-2.
Fosforylacja uniemożliwia przyłączenie GTP i przeniesienie inicjatorowego tRNA do rybosomu.
-specyficzna- regulacja konkretnych transkryptów lub grup transkryptów kodujących pokrewne białka.
Lidery cząsteczek mRNA zawierają sekwencję wiążącą jedno z kodowanych przez nie białek. Przyłączenie
zsyntetyzowanego białka wyłącza dalszą syntezę poprzez blokowanie inicjacji.
U bakterii inicjacja translacji pewnych mRNA jest regulowana poprzez przyłączanie krótkich odc. RNA
wewnątrz mRNA, co może powodować zarówno zahamowanie, jak i aktywację translacji. Np. Odys u
E.coli to krótkie RNA, które aktywują translację ok. 40-stu białek chroniących komórkę przed
uszkodzeniem w warunkach stresu oksydacyjnego.
W wyniku przyłączenia dużej podjednostki rybosomu powstają dwa miejsca, z którymi może się wiązać
aminoacylo-tRNA. Pierwsze z nich to miejsce peptydowe (P), zajęte przez inicjatorowi tRNA, drugie to
miejsce akceptorowe (A), obejmujące drugi kodon otwartej ramki odczytu.
Oddziaływanie kodon – antykodon zachodzi na powierzchni małej podjednostki rybosomu, a
aminoacylowany koniec tRNA oddziałuje z dużą podjednostką.
Miejsce A zajmuje odpowiedni aminoacylo –tRNA.
Tylko właściwy tRNA może zostać umieszczony w miejscy A.
Po wejściu aminoacylo-tRNA w miejsce A następuje utworzenie wiązania peptydowego między
aminokwasami sąsiadujących cząsteczek tRNA. Reakcję ta katalizuje enzym peptydyoltransferaza,
która odłącza aminokwas od inicjatorowego tRNA i tworzy wiązanie z aminokwasem połączonym z
sąsiednim tRNA. Reakcja ta wymaga energii z GTP.
U bakterii peptydyoltransferaza jest rybozymem – jest to część 23S rRNA.
U Euc. nie zidentyfikowano rejonu rRNA, który wykazywałby aktywność peptydyoltransferazy.
Dipeptyd odpowiadający pierwszym dwóm kodonom jest teraz łączony z tRNA znajdującym się w miejscu
A. Następny etap translacji to translokacja – rybosom przesuwa się o trzy nukleotydy na mRNA tak, że
nowy kodon wchodzi w miejsce A, a dipeptydylo-tRNA przesuwa się na miejsce P wypychając z niego
deacylowany tRNA- u bakterii przesuwa się na trzecie miejsce- miejsce wyjścia- E. Miejsce to jest ważne w
zapobieganiu zmianie fazy odczytu.
Translokacja wymaga energii z hydrolizy GTP. Prowadzi do zwolnienia miejsca A, co umożliwia wejście
nowego aminoacylo-tRNA. Cykl elongacyjny jest powtarzany aż do końca otwartej ramki odczytu.
7
Standardowy mechanizm syntezy białka polega na przesuwaniu się rybosomu po mRNA kodon za
kodonem, ale czasem mają miejsce zjawiska nietypowe:
zmiana fazy odczytu – rybosom zatrzymuje się i przesuwa o jeden nukleotyd do tyłu- rzadziej do przodu i
kontynuuje translację. Spontaniczna zmiana fazy odczytu zdarza się rzadko, ale niekiedy jest
zaprogramowana.
poślizg rybosomu- umożliwia translację mRNA zawierającego kopie 2 lub 3 genów, rybosom dochodzi do
końca jednej sekw. Kodującej, uwalnia zsyntetyzowane białko i ślizga się do następnego kodonu
inicjacyjnego i rozpoczyna syntezę kolejnego białka.
pominięcie translacyjne – skrajny przypadek poślizgu- pomijana jest część transkryptu, ale elongacja
translacji danego białka zachodzi w sposób ciągły, wówczas można z jednego transkryptu uzyskiwać dwa
rodzaje białek- ze zwykłej translacji i translacji z pominięciem translacyjnym.
Terminacja translacji:
Proces syntezy białka kończy się w momencie napotkania jednego z trzech kodonów terminacyjnych. W
miejsce A wchodzi teraz nie cząsteczka tRNA, ale białkowy czynnik uwalniający.
Bakterie mają trzy takie czynniki:
RF-1 rozpoznający kodony terminacyjne: 5’UAA-3’ i 5’-UAG-3’,
RF-2 rozpozn. 5’-UAA-3’ i 5’-UGA-3’ oraz
RF-1 i RF-2 z rybosomu po terminacji translacji (reakcja ta wymaga energii z GTP).
U Euc. dwa czynniki uwalniające:
eRF-1 rozpoznający trzy kodony terminacyjne
i eRF-3, który prawdopodobnie stymuluje uwolnienie czynnika eRF-1.
Czynniki uwalniające umożliwiają zakończenie translacji, ale nie wpływają na rozdysocjonowanie
podjednostek rybosomu. Rolę ta pełni czynnik recyklingu rybosomów (RRF).
Rozdysocjonowanie również wymaga energii z GTP uwalnianej przez czynnik elongacyjny EF-2; potrzebny
jest również czynnik IF-3 by zapobiec ponownemu łączeniu podjednostek.
U Euc. nie znaleziono odpowiednika RRF, być może jego funkcje pełni jeden z czynników uwalniających.
Proces ekspresji genomu nie kończy się na etapie translacji. Polipeptyd uwalniany z rybosomu jest
nieaktywny , dopóki nie zostanie sfałdowany w prawidłową strukturę
III-rzędową.
Niekiedy do osiągnięcia aktywności potrzebne są kolejne etapy obróbki potranslacyjnej:
- cięcie proteolityczne – przez proteazy, skracanie lub cięcie na segmenty
- modyfikacje chemiczne- przyłączanie grup chemicznych do aminokwasów
- wycinanie intern- odpowiedników intronów- łączenie ekstern.
Często te różne typy obróbki białka zachodzą równocześnie – polipeptyd może być cięty, modyfikowany i
fałdowany w tym samym czasie.