Ćwiczenie 7

Ćwiczenie 7

Mechanizmy bakteryjnej oporności na antybiotyki i chemioterapeutyki

1. Typy oporności

Bakterie mogą być oporne na antybiotyki i chemioterapeutyki w sposób:



naturalny



nabyty

Oporność naturalna – jest stałą cechą gatunku, rodzaju, rodziny drobnoustrojów i może ona wynikać:

-  z  braku  lub  niskiego  powinowactwa  do  struktury  będącej  celem  działania  leku
przeciwbakteryjnego,  np.  antybiotyki  β-laktamowe  nie  działają  na  Mycoplasma  pneumoniae,
Chlamydia  pneumoniae  (brak  struktury  ściany  komórkowej);  cefalosporyny  i  penicyliny
izoksazolowe nie działają na Enterococcus spp.
-  z  braku  lub  niskiej  penetracji/transportu  antybiotyku  przez  ścianę  komórkową,  np.  makrolidy,
glikopeptydy nie działają na Enterobacteriaceae, aminoglikozydy nie działają na Enterococcus spp.
- z wytwarzania enzymu inaktywującego antybiotyk, np. β-laktamaza o aktywności karbapenemazy u
Stenotrophomonas maltophilia powoduje rozkład karbapenemów.

Oporność nabyta – rozwija się w wyniku wielu procesów genetycznych, które zachodzą u bakterii w wyniku
presji selekcyjnej, związanej z powszechnym stosowaniem antybiotyków. Oporność drobnoustrojów na
antybiotyki i chemioterapeutyki może być determinowana informacją genetyczną zawartą w chromosomie
i/lub elementach ruchomych jak: plazmidy, transpozony, integrony.
W obrębie oporności nabytej wyróżnia się więc oporność chromosomalną i oporność plazmidową.
Oporność chromosomalna powstaje w wyniku:

-  mutacji  –  spontanicznej  zmiany  fragmentu  sekwencji  DNA  genomu  bakteryjnego,  np.  mutacje  w
genie  gyrazy  i  wynikająca  z  tego  oporność  na  chinolony  szczepów  Staphylococcus  aureus,
Pseudomonas aeruginosa
-  nabycia  genu  oporności,  np.  w  wyniku  procesu  transformacji  obcogatunkowego  DNA  –  nabycie
genu oporności na penicyliny przez Streptococcus pneumoniae na drodze transformacji od szczepów
paciorkowca zieleniącego jamy ustnej.

Oporność plazmidowa powstaje w wyniku przeniesienia plazmidów (lub mniejszych ruchomych
fragmentów DNA – transpozony, integrony) z komórki na komórkę tego samego lub odrębnego
taksonomicznie gatunku drobnoustrojów na drodze:

- koniugacji – bezpośrednie przeniesienie genów oporności przez kontakt komórka-komórka
- transdukcji – przeniesienie genów oporności przez wirus bakteryjny (bakteriofag)
- transformacji – bezpośrednie wnikanie DNA komórki dawcy ulegającej lizie na komórkę biorcy.

Plazmidy  są  to  dodatkowe,  ruchome  fragmenty  kolistego  DNA,  zlokalizowane  poza  chromosomem,
charakteryzujące  się  niezależną  od  chromosomu  replikacją  oraz  zdolnością  do  przenikania  do  innych
komórek. Informacja zawarta w plazmidach związana jest najczęściej z syntezą czynników zjadliwości lub
opornością  na  antybiotyki.  Transpozony,  mniejsze  od  plazmidów  nośniki  genów  oporności,  mogą  się
przemieszczać  z  chromosomem  na  plazmid,  stanowiąc  z  nim  część  integralną.  Jeśli  lokalizują  się  na
plazmidzie  koniugacyjnym  mogą  być  przenoszone  razem  z  nim  na  inne  komórki.  Transpozony  mogą  być
przenoszone również odwrotnie, tj. z plazmidu na chromosomalne DNA.

2. Ekspresja fenotypowa oporności na antybiotyki

Komórka bakteryjna po nabyciu genu oporności na antybiotyki bądź grupę antybiotyków manifestuje nowo
nabytą cechę przez:



syntezę enzymu, który inaktywuje lub modyfikuje lek przed lub po jego przedostaniu się do
komórki bakteryjnej, np.

enzym rozkładający antybiotyk - β-laktamaza rozkładająca β-laktamy

enzym modyfikujący antybiotyk – acetylotransferaza, adenylotransferaza, fosfotransferaza –
modyfikujące aminoglikozydy



antybiotyk wnika do komórki; najczęściej dotyczy całej grupy antybiotyków, np. oporność
Pseudomonas aeruginosa na aminoglikozydy



modyfikacja miejsca docelowego działania antybiotyków (receptora wiążącego antybiotyk),
np. białek wiążących penicyliny PBP u Streptococcus pneumoniae, warunkująca oporność na
β-laktamy



synteza nowego białka wiążącego penicyliny PBP, które nie ma powinowactwa i nie wiąże
antybiotyku – oporność na metycylinę Staphylococcus aureus.



ominięcie ogniwa zablokowanego przez chemioterapeutyk (sulfonamidy)



aktywne usuwanie antybiotyku z komórki na zasadzie „pompy” (active efflux) – oporność
niskiego stopnia na chinolony

3. Przykłady oporności

a) Oporność enzymatyczna

- oporność na antybiotyki β-laktamowe
Jest wynikiem syntezy przez bakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie enzymu β-laktamazy
odpowiedzialnej za oporność na penicyliny i cefalosporyny

CH

S CH

R R

N C HN
CH

β-laktamaza

COOH

OH COOH

pierścień β-laktamowy

wiązanie amidowe



β-laktamazy  bakterii  Gram-dodatnich  są  najczęściej  kodowanymi  plazmidowo  enzymami  o
profilu penicylinaz. Są wytwarzane przez gronkowce, znacznie rzadziej przez enterokoki. Oporność
ta  związana  jest  z  syntezą  β-laktamazy,  która  niszczy  antybiotyk  β-laktamowy  w  środowisku
zewnątrzkomórkowym,  czego  konsekwencją  jest  spadek  stężenia  aktywnej  postaci  leku  w  tym
środowisku.  Oporność  ta  jest  zjawiskiem  populacyjnym  –  liczna  populacja  jest  znacznie  bardziej
oporna  niż  mała,  a  gen  odpowiedzialny  za  syntezę  enzymu  jest  indukcyjny,  co  oznacza,  że  w
obecności leku ilość wytwarzanego enzymu znacznie wzrasta.

Wykrywanie  penicylinazy  gronkowcowej  przeprowadzić  można  testem  cefinazowym  z  krążkiem  wysyconym
nitrocefiną.  Umieścić  na  szkiełku  podstawowym  zwilżony  jałową  wodą  destylowaną  krążek  z  nitrocefiną.
Rozetrzeć następnie na krążku kilka kolonii zebranych ze świeżej 18-24 godzinnej hodowli badanego szczepu
(z  podłoża  stałego  lub  z  obrzeża  strefy  zahamowania  wzrostu  szczepu  w  metodzie  dyfuzyjno-krążkowej  z
penicyliną  1U).  Szkiełko  umieścić  w  pustej  płytce  Petriego  i  pozostawić  w  temperaturze  pokojowej  do  30
minut.  Powstanie  różowoczerwonego  zabarwienia  na  krążku  świadczy  o  wytwarzaniu  penicylinazy  (β-
laktamazy) przez badany szczep.
W metodzie dyfuzyjno-krążkowej z penicyliną 1U: S ≥ 26 mm

R ≤ 26 mm.

Gronkowce penicylinazo-dodatnie są oporne na: penicyliny naturalne, amino-, karboksy- i ureidopenicyliny.



β-laktamazy  bakterii  Gram-ujemnych  podzielono  na  kilka  grup  w  zależności  od  wielu  różnych
cech. Niektóre są aktywne tylko wobec penicylin, inne wobec cefalosporyn, a jeszcze inne oddziałują
na obydwie grupy leków. Zewnętrzna warstwa ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych opóźnia
wnikanie  antybiotyków  do  komórki,  a  β-laktamaza  pozostaje  w  przestrzeni  okołoplazmatycznej,
każda  więc  komórka  jest  odpowiedzialna  za  swoją  własną  ochronę.  Niewielka  ilość  bakterii  może
być  więc  tak  samo  oporna  jak  duża.  Geny  odpowiedzialne  za  ich  syntezę  mogą  znajdować  się  na
plazmidach

(plazmidowe

β-laktamazy) lub w chromosomie bakterii (chromosomalne

cefalosporynazy).

- Chromosomalne cefalosporynazy mogą być wytwarzane przez wszystkie bakterie Gram-ujemne
za wyjątkiem szczepów Salmonella. Wyróżnia się dwa główne typy cefalosporynaz: konstytutywne –
synteza enzymu odbywa się na tym samym niskim poziomie i jest niezależna od obecności
antybiotyku w środowisku (często u Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae)

indukcyjne – typowe dla szczepów Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Proteus indolo (+). Synteza
enzymu  ulega  przyspieszeniu  lub  zwiększeniu  w  obecności  antybiotyku  –  induktora.  Po  usunięciu
induktora  synteza  enzymu  wraca  do  poziomu  podstawowego  z  wyjątkiem  szczepów,  u  których
doszło  do  trwałej  derepresji  genu  chromosomalnej  cefalosporynazy.  Szczepy  te  są  oporne  na
wszystkie  antybiotyki  β-laktamowe  z  wyjątkiem  karbapenemów  (chociaż  opisano  już  tzw.
chromosomalne  cefalosporynazy  o  rozszerzonym  spektrum,  zdolne  także  do  inaktywacji
karbapenemów).

β-laktamazy

MBL

plazmidowe

penicylinazy

cefalosporynazy

β-laktamazy

o szerokim spektrum

KPC

plazmidowe

plazmidowe chromosomalne

chromosomalne

klasyczne

enzymy o poszerzonym

(S. aureus)

(Bacteroides

(Pseudomonas

(TEM, SHV) spektrum

Moraxella)

Enterobacter

substratowym

Serratia

Proteus indolo (+))

plazmidowe

(Haemophilus

(Klebsiella

Enterobacteriaceae Escherichia coli)

Pseudomonas)

Rycina 1. Wykrywanie indukcyjnych cefalosporynaz chromosomalnych

-  Plazmidowe  β-laktamazy  to  enzymy  o  szerokim  spektrum  substratowym,  wytwarzane  głównie
przez pałeczki Gram-ujemne, w niewielkim stopniu przez Gram-dodatnie. Plazmidowe β-laktamazy
o  szerokim  spektrum  substratowym  dzielą  się  na  klasyczne  typu  TEM-1,  SHV-1,  OXY-1  oraz  na
enzymy  o  rozszerzonym  spektrum  substratowym  ESβL  (extender  spectrum  β-lactamase),  które  są
zmutowanymi formami enzymów klasycznych.

 Klasyczne β-laktamazy TEM, SHV rozkładają wszystkie antybiotyki β-laktamowe z

grupy penicylin (penicylinę, ampicylinę – w wysokim stopniu, karbenicyliny – słabiej,
ureidopenicyliny: mezlocylinę, azlocylinę, piperacylinę – znacznie słabiej) i w mniejszym
stopniu z grupy cefalosporyn I generacji.

Aktywność  wobec  szczepów  wytwarzających  ten  enzym  wykazują:  cefalosporyny  II,III,IV  generacji,
monobaktamy, karbapenemy, penicyliny z inhibitorami β-laktamaz.
Ten  typ  enzymu  spotyka  się  najczęściej  u  opornych  na  ampicylinę  szczepów  Escherichia  coli,
Salmonella  spp.,  Shigella  spp.,  Proteus  mirabilis  a  także  u  Haemophilus  influenzae  i  Neisseria
gonorrhoeae.

Rycina 2. Wykrywanie klasycznych β-laktamaz typu TEM, SHV. Charakterystyczna oporność na tikarcylinę (TIC), ale wrażliwość
na skojarzenie tikarcyliny z inhibitorem β-laktamaz (kwas klawulanowy)- TIM

            Tikarcylina (TIC) – penicylina o szerokim      Tikarcylina + inhibitor (kw. klawulanowy = Timentin (TIM))
     spektrum substratowym



β-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym ESβL wykazują oporność na

wszystkie penicyliny, cefalosporyny, monobaktamy, przy zachowanej wrażliwości na
karbapenemy i blokujące działanie inhibitorów β-laktamaz (wykorzystywane jako cecha
diagnostyczna).

Enzymy  te  wytwarzają  szczepy  występujące  przede  wszystkim  w  środowisku  szpitalnym,  głównie
Klebsiella  pneumoniae  i  Escherichia  coli,  ale  należy  rutynowo  oznaczać  wytwarzanie  ESβL  u
wszystkich  pałeczek  Enterobacteriaceae,  wykonując  przeglądowy  test  wstępny  z  antybiotykami
należącymi  do  III  generacji  cefalosporyn  (ceftazydym,  cefotaksym,  ceftriakson)  i  monobaktamem
(aztreonam)  –  zmniejszenie  strefy  zahamowania  wzrostu  poza  wyznaczoną  granicę  zobowiązuje  do
wykonania testów potwierdzających (test dwóch krążków, E-testy ESβL, testy automatyczne).

TIC
C

TIM

wrażliwy (W)

oporny (O)

- Test dwóch krążków jest klasyczną metodą wykrywania β-laktamazy ESβL i polega na wykorzystaniu
zjawiska  dyfuzji  antybiotyku  w  żelu  agarowym.  Na  podłożu  Mueller-Hinton  z  posianym  badanym
szczepem  umieszcza  się  w  odległości  20  mm  od  penicyliny  z  inhibitorem  β-laktamaz
(amoksycylina/kwas  klawulanowy)  2  krążki  zawierające  cefalosporyny  III  generacji:  ceftazydym  i
cefotaksym.
Pojawienie  się  dodatkowej  strefy  świadczącej  o  wzroście  aktywności  cefalosporyny  od  strony
działania inhibitora, pozwala wnioskować o wytwarzaniu przez szczep β-laktamazy ESβL (ryc. 3).

-  stosowane  są  także  testy  (tylko  dla  E.coli,  Klebsiella  spp.)  wykorzystujące  różnicę  w  strefie  zahamowania
wzrostu  wokół  krążka  z  samą  cefalosporyną  III  generacji  (cefotaksym,  ceftazydym)  a  krążkiem  zawierającym
łącznie  cefalosporynę  III  generacji  i  inhibitor  β  -  laktamaz  (ceftazydym  +  kw.klawułanowy,  cefotaksym  +  kw.
klawulanowy). Jeśli szczep wytwarza ESBL to średnica strefy wokół krążka zawierającego ceafalosporynę III gen +
inhibitor jest większa o 5mm od średnicy wokół krążka z samą cefalosporyną.

- E - testy pozwalające wykrywać ESβL
Pasek E-test ESβL jest nośnikiem gradientu stężeń dwóch antybiotyków: ceftazydymu (TZ) (cefalosporyna III
generacji) i ceftazydymu z kwasem klawulanowym (TZL) oraz cefotaksymu (CT) (cefalosporyna III generacji) i
cefotaksymu z kwasem klawulanowym (CTL).
Przyjmuje się że:

ESβL jest ujemny (-) jeśli stosunek MIC TZ/TZL<8 i CT/CTL<8

ESβL  jest  dodatni  (+)  jeśli  MIC  dla  CT≥0.5  i  stosunek  CT/CTL  ≥8  lub  MIC  dla  TZ≥  1  i
stosunek  TZ/TZL≥8.  Niewyraźna  strefa  zahamowania  wzrostu  lub  zniekształcenie  elipsy  CT
lub TZ wskazuje na   produkcję ESBL.

- metoda półautomatyczna – test ATB BLSE (bio Merieux)

- metoda automatyczna – test VITEK GNS-NT (bio Merieux), test Phoenix Panel Gram-negative NMIC/5
ID (Becton Dickinson)

DROBNOUSTROJE WYTWARZAJĄCE β-LAKTAMAZY

-Gronkowce koagulazo (+) i koagulazo (-) - 80-85% szczepów

-Enterococcus faecalis

-Moraxella catarrhalis- 70-90% szczepów

-Neisseria gonorrhoeae (występowanie regionalnie zróżnicowane)

-Haemophilus influenzae 10-40 % szczepów

-Pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae - ok. 60% szczepów

Inhibitory β-Iaktamaz (nazywane,, cząsteczkami samobójcy „)

Inhibitory

-laktamaz mają strukturę antybiotyków

β-

laktamowych, nie wykazują aktywności przeciwbakteryjnej,

potęgują natomiast aktywność antybiotyków

-laktamowych. Inhibitory

-laktamaz mają zdolność blokowania aktywności

enzymów plazmidowych, w tym penicylinaz gronkowcowych i enterokokowych, natomiast nie hamują cefalosporynaz
chromosomalnych (z wyjątkiem wytwarzanych przez pałeczki beztlenowe Bacteroides fragilis). Skojarzone z
antybiotykiem

-laktamowym chronią go przed hydrolizą i sprawiają, że może być aktywny wobec szczepów opornych

wytwarzających

-laktamazy plazmidowe. Do inhibitorów

-laktamaz należy:

•  kwas klawulanowy
•  tazobaktam
•  sulbaktam

Metaloenzymy - Karbapenemazy (MBL - metallo-

-lactamase).

-laktamzy o specyficznej strukturze, zawierające w swym miejscu aktywnym metal (najczęściej Zn

Hydrolizują penicyliny, penicyliny z inhibitorami, cefalosporyny (niższa aktywność wobec  IV generacji i cefsulodyny) i
karbapenemy.  Produkcji  karbapenemaz  MBL  możemy  spodziewać  się  u  opornych  na  karbapenemy  szczepów
Pseudomona  aeruginosa,  innych  szczepów  pałeczek  Gram  -  ujemnych  za  wyjątkiem  Stenotrophomonas  matophilia,
który syntetyzuje karbapenemazy naturalnie.

Wykrywanie karbapenemaz

• metoda dyfuzyjno - krążkowa

Test wykonuje się na dwóch płytkach z podłożem Meuller-Hinton:

- na pierwszą z płytek z posianym szczepem badanym nakłada się dwa krążki: z ceftazydymem w odległości około 4 cm,
następnie w odległości około 2 cm od środków krążków nakładamy jałowy krążek bez antybiotyku, na który nakrapia się
2μl kwasu 2-merkaptopropionowego
- na drugą płytkę z posianym jak wyżej szczepem badanym nakłada się analogicznie dwa krążki z imipenemem, a
na jałowy krążek nakrapia się l0 μl 0,5 M roztworu EDTA

O produkcji MBL świadczy pojawienie się wyraźnie powiększonej strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z
ceftazydymem/imipenemem od strony krążka zawierającego inhibitor karbapenemaz (kw. 2-merkaptopropionowy, 0,5 M
EDTA)

• E - testy MBL

Pasek E-test MBL jest nośnikiem gradientu stężeń dla impenemu IP (karbapenem) oraz imipenemu i stałego stężenia
EDTA (inhibitor karbapenemaz) —IPI . Wynik jest dodatni dla MBL kiedy stosunek MIC IP/IPI wynosi >8. Deformacja
elipsy IP również oznacza obecność MBL. E-test MBL jest akceptowaną metodą wykrywania MBL, jednakże wszystkie
pozytywne fenotypy MBL należy przesłać do laboratorium referencyjnego w celu potwierdzenia testem
genotypowym.

Rycina 4. Wykrywanie ESBL przy pomocy E-testu: a) MIC IP IPI=16 <1= 16- >MBL(+)

b) deformacja elips dla IP świadczy o MBL(+)



β-laktamazy – karbapenemazy KPC – to enzymy hydrolizujące wszystkie karbapenemy

(imipenem, meropenem, ertapenem, doripenem), a więc antybiotyki uważane za leki ostatniej
szansy w leczeniu  zakażeń wywoływanych przez pałeczki  Gram-ujemne,  a także wszystkie
pozostałe antybiotyki β-laktamowe (penicyliny, cefalosporyny, monobaktamy). Enzymy te są
stosunkowo  słabo  hamowane  przez  inhibitory  β-laktamaz  (kwas  klawulanowy,  sulbaktam,
tazobaktam),  dlatego  połączenia  inhibitorów  z  β-laktamami  nie  znajdują  żadnego
zastosowania.

Enzymy te wytwarzane są najczęściej przez szczepy Klebsiella pneumoniae, ale zaobserwowano już
ich  wytwarzanie  przez  szczepy  Klebsiella  oxytoca,  Raoultella  spp.,  Escherichia  coli,  Citrobacter
freundii,  Enterobacter  spp.,  Serratia  marcescens,  Salmonella  enterica,  a  nawet  Pseudomonas
aeruginosa  i  Pseudomonas  putida.  Szczepy  Klebsiella  pneumoniae  KPC+  są  zazwyczaj  wrażliwe
jedynie na kolistynę, tygecyklinę,  gentamycynę i niekiedy na  amikacynę. Brak jest jednak obecnie
badań klinicznych udowadniających skuteczność tych antybiotyków w leczeniu zakażeń wywołanych
przez szczepy KPC+ (są one stosowane z powodu braku innych opcji terapeutycznych).

- Oporność na aminoglikozydy wynikająca z enzymatycznej modyfikacji leku

Niektóre drobnoustroje mają zdolność wytwarzania enzymów: acetylotransferazy, fosforylazy, nukleotydazy,

które modyfikują aminoglikozydy, czyniąc je niezdolnymi do wiązania się z docelowym rybosomem. Enzymy
modyfikujące znajdują się na powierzchni błony cytoplazmatycznej, modyfikacji ulegają więc tylko te cząsteczki
leku, które są transportowane przez błonę cytoplazmatyczną.

2. Oporność na antybiotyki β-laktamowe związana ze zmianą powinowactwa miejsca docelowego
działania antybiotyku

Mechanizm działania antybiotyków β-laktamowych polega na zahamowaniu syntezy ściany komórkowej.

Enzymy, które biorą udział w syntezie (karboksypeptydazy, transpeptydazy) z uwagi na zdolność wiązania się z
antybiotykami β-laktamowymi nazwano białkami wiążącymi penicyliny PBP. Liczba PBP w komórce jest różna i

charakterystyczna dla określonego gatunku, a poszczególne antybiotyki wykazują zróżnicowane do nich
powinowactwo. Oporność na antybiotyk może być skutkiem pojawienia się w komórce nowego białka PBP, o
niskim powinowactwie do antybiotyków β-laktamowych, ale nadal zachowanej funkcji biologicznej w syntezie

ściany komórkowej. Białko takie (PBP 2a określne również PBP 2’) występuje u tzw. metycylinoopornych

szczepów Staphylococcus aureus (MRSA - Methicillin Resistant S. aureus) i gronkowców koagulazo-
ujemnych (MRCNS - Methicillin Resistant Coagulase-Negative Staphylococci)

Szczepy gronkowców o takim mechanizmie oporności na metycylinę są oporne:

na wszystkie antybiotyki β-laktamowe: penicyliny, cefalosporyny, cefamycyny, karbapenemy, penicyliny

skojarzone z inhibitorami

Szczepy te mogą być również krzyżowo oporne z:

• makrolidami, linkozamidami, aminoglikozydami, chinolonami

Wykrywanie gronkowców opornych na metycylinę

Metoda dyfuzyjno-krążkowa

• Przygotować zawiesinę badanego szczepu gronkowca o gęstości odpowiadającej 0,5 jednostek w skali Mc

Farlanda

• Nanieść na podłoże Mueller-Hinton (MHA) badany szczep (jałową wymazówką nanieść badany szczep na

całą powierzchnie płytki 3-krotnie obracając ją o 60° ). Nałożyć krążek z cefoksytyną (30ug)

•

Po 24 godzinnej inkubacji zmierzyć strefę zahamowania wzrostu gronkowca (odczyt w przepuszczonym świetle w
świetle odbitym), którą należy porównać z podanymi kryteriami.

Wykazano, że cefoksytyna może być lepszym wskaźnikiem oporności na metycylinę. Krążkiem z cefoksytyną mogą być
wykrywane również tzw. szczepy preMRSA, które posiadają gen mec A, natomiast są

wrażliwe in vitro na metycylinę. Na

podstawie wyniku oznaczenia uzyskanego z zastosowaniem cefoksytyny (30ug) można identyfikować oporność na

metycylinę u wszystkich gatunków gronkowców.

Dla innych niż Staphylococcus epidermidis gronkowców koagulazo - ujemnych metoda dyfuzyjno-

krążkowa może dawać wyniki fałszywej oporności (pomimo braku obecności genu mec A szczep wykazuje

oporność na metycylinę). W związku z tym zalecane jest, aby dla szczepów MRCNS opornych na metycylinę

wykonywać identyfikacje genu mec A metodą PCR.

Metoda przeglądowa z oksacyliną (tylko dla Staphylococcus aureus)

Na podłoże MHA z oksacyliną w stężeniu 6mg/l i dodatkiem 4% NaCl nanieść zawiesinę bakteryjną o gęstości 0,5

McFarlanda. Wzrost więcej niż jednej kolonii oznacza oporność na metycylinę. Odczytywać w świetle przechodzącym!

Testy polegające na wykrywaniu białka PBP 2A (PBP2') - testy pozwalają na wykrycie nowego

białka, produktu genu mec A, warunkującego oporność na metycylinę.
• MRSA - Screen - Denka Seiken (Innogenetics)
• Slidex MRSA Detection (bio Merieux)
• Oxoid PBP2' - DR900M (Oxoid)
-

Metody automatyczne

• test ATB OXA lub ATB STAPH (bio Merieux)
• test Cristal MRSA ID
• test Phoenix Panel Gram Positive PMIC/5 ID(Becton Dickinson)

Oporność na glikopeptydy

Oprócz drobnoustrojów naturalnie opornych na glikopeptydy (Pałeczki Gram - ujemne, Pediococcus,

Lactobacillus, Neisseria) coraz częściej spotyka się szczepy Enterococcus oporne na glikopeptydy (VRE) oraz
szczepy gronkowców o obniżonej wrażliwości na wankomycynę VISA (vancomycin - intermediate

Staphylococcus aureus). Geny oporności zlokalizowane są na chromosomie lub plazmidach, transpozonach i
wyróżniamy:

- Gen Van A - wysoka oporność indukowana na wankomycynę i oporność na teikoplaninę (gen

przenoszony na plazmidzie dotyczy enterokoków, gronkowców, paciorkowców, Listerii)

- Gen Van B - średnia oporność na wankomycynę i wrażliwość na teikoplaninę
- Gen Van C - oporność konstytuowana (wrodzona) na wankomycynę i wrażliwość na teikoplaninę

(E.gallinarum, E. casseliflavus, E. flavescens)

- Gen Van D - konstytutywna oporność na wankomycynę i oporność na małe stężenia teikoplaniny

- Gen Van E - niska oporność na wankomycynę i wrażliwość na teikoplaninę

Oporność ma makrolidy, linozamidy i streptograminy
Trzy grupy wymienionych antybiotyków, chociaż maja inną strukturę chemiczną, działają identycznie na

komórkę bakterii i mają wspólny mechanizm oporności. U bakterii Gram-dodatnich występują aż trzy odrębne
mechanizmy oporności oznaczające krzyżową oporność na makrolidy, linkozamidy, streptograminy. Oporność
MLS może być konstytuowana lub indukcyjna i składa się na nią:

-  modyfikacja miejsca docelowego działania
-  enzymatyczna modyfikacja antybiotyku
-  aktywne usuwanie antybiotyku z komórki

Identyfikacja fenotypu oporności na makrolidy i linkozamidy

Erytromycyna W

Erytromycyna O

Klindamycyna W

Klindamycyna O

Klindamycyna W KlindamycynaW

spłaszczenie strefy brak spłaszczenia trefy

zahamowania wzrostu

Szczep wrażliwy

L-fenotyp lub błąd oznaczenia

mechanizm oporności mechanizm oporności mechanizm oporności

(zalecane powtórzenie badania)

MLS

konstytutywny MLS

indukcyjny

nie stosować linkozamidów nie stosować makrolidów nie stosować makrolidów nie stosować

i linkozamidów i linkozamidów makrolidów

14 i 15-węglowych

Wykrywanie MLS

Metoda dyfuzyjno - krążkowa
Na  posianą  płytkę  z  badanym  szczepem  klinicznym  nakłada  się  w  odległości  około  2  cm  krążek  z
erytromycyną  (15μg)  i  klindamycyną  (2μg).  Jeżeli  badany  Gram-dodatni  szczep  jest  oporny  na
erytromycynę  i  widoczne  jest  ścięcie  strefy  zahamowania  wzrostu  dla  klindamycyny  od  strony
erytromycyny, można przypuszczać oporność typu MLS

Coraz częściej stosuje się do wykrywania genu oporności sondy genetyczne. Ma to szczególne znaczenie u

drobnoustrojów wolno rosnących, u których w trakcie terapii pojawia się oporność (np. Mycobacterium tuberculosis -
prątki gruźlicy) lub u drobnoustrojów, u których mamy wątpliwości co do występującego mechanizmu oporności.
Warto pamiętać, że w komórce bakteryjnej mogą funkcjonować dwa lub trzy różne mechanizmy oporności na
antybiotyki z tej samej grupy

Rycina 5. Szczep Staphylococcus aureus wykazujący mechanizm oporności typu MLS

L – linkomycyna (linkozamid)

E – erytromycyna (makrolid)

Widoczne ścięcie strefy zahamowania
wzrostu dla linkomycycny

Część praktyczna

1. Wykonaj test cefinazowy dla wykrycia penicylinazy gronkowcowej.
Nałóż na szkiełko podstawowe krążek z nitrocefną, zwilż go jałową wodą destylowaną, rozetrzyj kilka
kolonii z 18-24-godzinnej hodowli badanego szczepu. Szkiełko umieść w pustej płytce Petriego i
inkubuj w temperaturze pokojowej 10-30 minut. Powstanie różowo-czerwonego zabarwienia świadczy o
wytwarzaniu

β-laktamazy (penicylinazy). Wynik zapisz w tabeli punktu 2.

2. Wykonaj badanie wrażliwości gronkowców na metycylinę metodą dyfuzyjno-krążkową z cefoksytyną

(30 μg).

Przygotuj zawiesinę szczepu gronkowca

o gęstości 0,5 jMcF w 0,9% jałowym roztworze NaCl (porównaj

zmętnienie z wzorcem). Jałową wymazówkę zanurz w zawiesinie, odciśnij nadmiar płynu o ściankę
probówki, a następnie wykonaj posiew drobnoustrojów na podłożu Mueller-Hinton (trzy razy obracając
płytkę o 60

). Odczekaj 15 minut i nanieś przy pomocy pęsety krążek z cefoksytyną. Po 15 minutowej

preinkubacji w temperaturze pokojowej, płytki włóż do cieplarki nastawionej na temperaturę 35

Odczytaj średnicę strefy zahamowania wzrostu bakterii po 24- godzinnej inkubacji. Strefę zahamowania
wzrostu oglądaj w świetle odbitym.
Wpisz uzyskane średnice do tabeli i zinterpretuj wynik w oparciu o zamieszczone poniżej kryteria

Strefa

zahamowania

wzrostu w mm

Interpretacja*

Obecność

penicylinazy

Wnioski

Szczep 1

Szczep 2

* O – oporny (resistant)

W – wrażliwy (susceptible)

„+” – wytwarza penicylinazę

„-” – nie wytwarza penicylinazy

Kryteria interpretacji dla szczepu badanego Staphylococcus aureus.

Antybiotyk/stężenie

Średnica strefy zahamowania wzrostu w mm

Wrażliwy

MSSA

średnio

wrażliwy

Oporny

MRSA

Cefoksytyna 30 μg

≥ 22

< 22

3. Odczytaj i zinterpretuj wyniki badania wrażliwości szczepu Staphylococcus aureus na

makrolidy, linkozamidy (podane antybiotyki wchodzą w skład antybiogramu
podstawowego dla Staphylococcus aureus).

Antybiotyk

Oporny (o)

Wrażliwy (w)

Wynik w mm

Interpretacja*

Erytromycyna 15 μg

< 18

≥ 21

Klindamycyna 2 μg

< 18

≥ 21

* O – oporny (resistant)   W – wrażliwy (susceptible)
Wynik  oznaczenia  wrażliwości  na  erytromycynę  jest  reprezentatywny  dla  roksytromycyny,
klarytromycyny,  azytromycyny.  Krążek  z  linkozamidem  (klindamycyną  2

μg) należy układać

obok krążka z erytromycyną w celu identyfikacji indukowanej oporności na makrolidy, linkozamidy,
streptograminy MLS