Biochemia: Ćw. 11 – Kwasy nukleinowe
1
Ćwiczenie 11
K
WASY
N
UKLEINOWE
Wyciąg z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych:
amoniak
– C, N
azotan srebra
– C, N
błękit metylenowy
– Xn
chlorek żelaza
– Xn
difenyloamina
– T
etanol, 96%, 70%
– F
kwas azotowy(V),65% – C
kwas octowy, 96%
– R10
kwas siarkowy, 95%
– C
kwas solny
– C
wodorotlenek sodu
– C
siarczan dodecylu sodu – F
siarczan miedzi
– Xn
Tris
– Xi
1.
B
ADANIE WŁAŚCIWOŚCI FIZYKOCHEMICZNYCH KWASÓW NUKLEINOWYCH
1.1.
R
OZPUSZCZALNOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH
Kwasy nukleinowe, dzięki zawartości reszt kwasu fosforowego, wykazują odczyn kwasowy. Rozpuszczają się dobrze w środowisku
zasadowym, trudniej w wodzie i rozcieńczonym kwasie octowym. W roztworach wodnych tworzą układy koloidalne, z których można je
wytrącić za pomocą czynników odwadniających. Znaczne obniżenie pH roztworu przez dodanie mocnych kwasów lub czynników
odwadniających doprowadza do ich wytrącenia z roztworu. Dwie nici DNA ulegają rozdzieleniu po inkubacji w roztworach o pH>12 i pH<2,
ze względu na jonizację zasad. Jonizacja powoduje zmianę właściwości tworzenia wiązań wodorowych przez zasady, co prowadzi do
zaburzenia wiązań wodorowych pomiędzy A i T oraz C i G. Ponadto przy bardzo wysokim lub niskim pH powłoka hydratacyjna otaczająca
cząsteczkę DNA ulega zaburzeniu, powodując destabilizację nakładania się par zasad. Traktowanie DNA kwasem prowadzi do
depurynacji i depirymidyzacji – utraty zasad przez trawienie wiązania glikozydowego. Wiązanie fosfodiestrowe w miejscach pozbawionych
zasad staje się bardziej podatne na hydrolizę, co prowadzi do degradacji DNA. Ze względu na to, że pojedyncze nici DNA są stosunkowo
stabilne w odczynie zasadowym, wykonuje się najczęściej denaturację pod wpływem kwasów.
Wykonanie:
Przygotować dwie szklane, krótkie probówki. Do pierwszej dodać 1 ml 0.5% roztworu RNA a następnie 2 – 3
krople 2 M HCl. Wytraca się biały osad RNA. Po dodaniu 200 – 300 µl 10% roztworu NaOH osad ulega rozpuszczeniu. Do
drugiej probówki dodać 1 ml 5% RNA, 200 µl CH
3
COONa oraz 1 ml 96% etanolu – roztwór mętnieje, ponieważ wytrąca się
osad RNA.
1.2.
T
WORZENIE KOMPLEKSÓW KWASÓW NUKLEINOWYCH Z BARWNIKAMI
W środowisku kwaśnym kwasy nukleinowe wiążą barwniki zasadowe, tworząc połączenia typu soli, co wykorzystuje się m.in. do
histochemicznego barwienia jąder komórkowych.
Wykonanie:
Do szklanej krótkiej probówki dodać 1 ml 0.5% RNA a następnie 300 µl 1 M CH
3
COOH oraz 5 – 6 kropli 0.1%
błękitu metylenowego (używając pipety do 100 µl). Zawartość szklanej probówki przenieść do probówki typu Eppendorf i
zwirować. Po wirowaniu widoczny jest niebieski osad kompleksów RNA z błękitem metylenowym.
1.3.
T
WORZENIE KOMPLEKSÓW KWASÓW NUKLEINOWYCH Z BIAŁKAMI
Kwasy nukleinowe tworzą z białkami zasadowymi oraz niektórymi białkami obojętnymi kompleksowe połączenia, zwane sztucznymi
nukleoproteidami. Do oddzielenia białka od kwasu nukleinowego stosuje się nasycone roztwory NaCl.
Wykonanie:
Do szklanej krótkiej probówki dodać 1 ml 0.5% RNA oraz 300 µl 1 M CH
3
COOH a następnie 100 µl 3%
roztworu BSA. Wytrąca się osad kompleksowego połączenia białka z RNA. W celu rozpuszczenia osadu dodać 1 ml
nasyconego roztworu NaCl.
Biochemia: Ćw. 11 – Kwasy nukleinowe
2
2.
P
REPARATYKA ORAZ ANALIZA SKŁADU
RNA
2.1.
I
ZOLACJA
RNA
Z DROŻDŻY
Opisana poniżej metoda izolowania RNA polega na rozbiciu komórek drożdży, usunięciu z roztworu białek i DNA za pomocą anionowego
detergentu - siarczanu dodecylu sodu (SDS) a następnie wytrąceniu RNA za pomocą etanolu.
Wykonanie: W zlewce o poj. 200 ml ogrzać do wrzenia 30 ml 5% roztworu SDS stale mieszając. Do wrzącego roztworu SDS
dodać 10 g rozdrobnionych drożdży piekarskich i kontynuować ogrzewanie przez 5 min. Zlewkę ochłodzić pod bieżącą wodą
a następnie zawartość zlewki przenieść do probówki wirowniczej o poj. 50 ml i zwirować (3000 RCF*, 10 min, 4°C). Nadsącz
zebrać i dodać do 60 ml schłodzonego 96% etanolu. Po 10 min precypitacji w lodzie roztwór przenieść ponownie do
probówki wirowniczej i zwirować (3000 RCF, 10 min, 4°C). Osad wytraconego RNA rozpuścić w 50 ml wody destylowanej.
2.2.
H
YDROLIZA KWASOWA
RNA
Kwasy nukleinowe są polimerami nukleotydów połączonych wiązaniami fosfodiestrowymi w łańcuch polinukleotydowy. Nukleotyd składa
się z cząsteczki cukru (rybozy w RNA, deoksyrybozy w DNA), zasady azotowej (purynowej: adeniny, guaniny lub pirymidynowej: cytozyny,
tyminy, uracylu) oraz reszty fosforanowej. Nukleotydy to fosforany nukleozydów. Większość reakcji charakterystycznych dla
poszczególnych składników kwasów nukleinowych zachodzi dopiero po hydrolizie makrocząsteczki. Kwasy nukleinowe ogrzewane z
kwasami nieorganicznymi (np. 1 M HCl, 10% H
2
SO
4
) ulegają stopniowej hydrolizie do monofosforanów nukleozydów. Przy wystarczająco
długo prowadzonym ogrzewaniu w hydrolizacie uzyskujemy wolne zasady azotowe, pentozy i kwas fosforowy.
Wykonanie: Przygotować kolbę stożkową o poj. 200 ml. Do roztworu RNA wyizolowanego z drożdży dodać 10% H
2
SO
4
w
stosunku 1:2 i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 30 min. Po ostudzeniu hydrolizat RNA przefiltrować a następnie
przeprowadzić na nim reakcje pozwalające na identyfikację poszczególnych składników (pkt. 2.3).
2.3.
I
DENTYFIKACJA SKŁADNIKÓW
RNA
2.3.1.
W
YKRYWANIE PENTOZY
–
REAKCJA
T
OLLENSA
W obecności stężonych kwasów mineralnych z pentozy powstaje z furfural (patrz: Ćw.9 Analiza monosacharydów), który kondensując z
floroglucyną (fenol) tworzy związek barwy czerwonej. Reakcja Tollensa, podobnie jak próba Taubera, służy do odróżniania pentoz od
heksoz.
Wykonanie: Przygotować długą szklaną probówkę. Do 1 ml hydrolizatu RNA dodać 1 ml stęż. HCl i kilka kryształków
floroglucyny. Roztwór ogrzać do wrzenia w łaźni wodnej. Powstaje czerwone zabarwienie świadczące o obecności pentoz w
hydrolizacie RNA.
2.3.2.
W
YKRYWANIE RESZTY FOSFORANOWEJ
Obecny w hydrolizacie RNA kwas fosforowy reaguje z molibdenianem amonu w obecności HNO
3
, co prowadzi do powstania żółtego
osadu fosfomolibdenianu amonu.
Wykonanie: Przygotować długą szklaną probówkę. 0.5 ml hydrolizatu RNA zobojętnić amoniakiem (150 – 200 µl,
kontrolować papierkiem wskaźnikowym). Dodać 0.5 ml stęż. HNO
3
oraz 2 ml 2.5% molibdenianu amonowego. Zawartość
probówki ogrzać do wrzenia w łaźni wodnej. Powstający fosfomolibdenian amonowy wytrąca się przy większym stężeniu w
postaci żółtego osadu.
*RCF (ang. Relative Centrifugal Force) – względna siła odśrodkowa wyrażająca wartość przyśpieszenia stosowaną do
wirowania próbek
Biochemia: Ćw. 11 – Kwasy nukleinowe
3
2.3.3.
W
YKRYWANIE ZASAD AZOTOWYCH
Zasady azotowe – heterocykliczne związki pierścieniowe – reagują z jonami Ag
+
lub Cu
+
tworząc nierozpuszczalne sole kompleksowe.
Wykonanie: Przygotować dwie krótkie szklane probówki. Do pierwszej dodać 1 ml hydrolizatu RNA oraz stężonego
amoniaku do uzyskania słabo alkalicznego odczynu (kontrolować papierkiem wskaźnikowym). Jeżeli roztwór nie jest
klarowny, należy go przesączyć. Następnie do klarownego przesączu dodać 0.5 ml 1% AgNO
3
. Wytrąca się osad
nierozpuszczalnych soli srebrowych puryn.
Do drugiej probówki dodać 1 ml hydrolizatu RNA a następnie 1 M NaOH od słabo kwaśnego odczynu (kontrolować
papierkiem wskaźnikowym). Po zagotowaniu roztworu dodać 0.5 ml 2% CuSO
4
a następnie wprowadzić kroplami nasycony
NaHSO
3
aż do wytrącenia osadu nierozpuszczalnych soli miedziawych. Kwaśny siarczyn sodowy redukuje jony Cu
2+
do Cu
+
,
które z purynami tworzą nierozpuszczalne sole miedziawe.
3.
O
DRÓŻNIANIE
RNA
OD
DNA
Reakcje pozwalające zidentyfikować i odróżnić roztwór RNA od DNA bazują na obecności różnych cukrów w cząsteczkach tych kwasów
nukleinowych: DNA zawiera deoksyrybozę, RNA – rybozę. Ryboza w odróżnieniu od deoksyrybozy zawiera grupę hydroksylową przy
węglu C2.
3.1.
M
ETODA ORCYNOWA
–
PRÓBA
B
IALA
Próba Biala jest kolejną reakcją stosowaną do odróżniania pentoz od heksoz. Pentozy (wolne oraz związane w nukleozydach) ogrzewane
ze stęż. HCl ulegają cyklizacji do furfuralu (patrz: Ćw. 9 Analiza monosacharydów), który w obecności jonów Fe
3+
kondensuje z orcyną,
tworząc związek barwy zielonej. Kwas DNA zawierający deoksyrybozę w próbie Biala daje wynik ujemny.
Wykonanie:
Przygotować dwie długie szklane probówki. Do pierwszej dodać 1 ml 0.1% RNA, do drugiej 1 ml 0.1% DNA, a
następnie do każdej po 1 ml świeżo przygotowanego odczynnika orcynowego*. Probówki umieścić we wrzącej łaźni wodnej
na 15 min. Roztwór RNA barwi się na oliwkowozielono.
3.2.
M
ETODA Z DIFENYLOAMINĄ
–
PRÓBA
D
ISCHEGO
Deoksyryboza (wolna i związana w nukleotydach purynowych) tworzy z difenyloaminą związek barwny. RNA, zawierający rybozę oraz
deoksyryboza związana w nukleotydach pirymidynowych dają wynik ujemny w tej reakcji.
Wykonanie:
Przygotować dwie długie szklane probówki. Do pierwszej dodać 1 ml 0.1% RNA, do drugiej – 1 ml 0.1 % DNA, a
następnie do każdej po 1 ml 1% odczynnika difenyloaminowego** i umieścić probówki we wrzącej łaźni wodnej na 10 minut.
W probówce zawierającej roztwór DNA powstaje niebieskie zabarwienie.
*
odczynnik orcynowy: nietrwały, bezpośrednio przed użyciem zmieszać: 1 ml roztworu A (6% orcyna w 96% etanolu) oraz 15 ml
roztworu B
(10% FeCl
3
w stęż. HCl). Objętość wystarczająca na 3 podgrupy do doświadczenia 3.1 oraz 4 (ślepa oraz próbki badane).
**
odczynnik difenyloaminowy: 1 g difenyloaminy rozpuścić w 100 ml lodowatego CH
3
COOH zawierającego 2.75 ml stęż. H
2
SO
4
.
Biochemia: Ćw. 11 – Kwasy nukleinowe
4
4.
A
NALIZA ILOŚCIOWA
RNA
METODĄ KOLORYMETRYCZNĄ Z ORCYNĄ
Stężenie RNA można oznaczyć mierząc ilość rybozy uwolnionej podczas ogrzewania RNA ze stęż. HCl. Zawartość powstałego w
obecności jonów Fe
3+
kompleksu furfural-orcyna barwiącego roztwór na kolor oliwkowozielonej mierzy się przy dł. fali 660 nm.
Wykonanie: przygotować pięć krótkich szklanych probówek. Do pierwszej z nich dodać 0.6 ml wody (próba ślepa, Ø), w
pozostałych przygotować po dwa rozcieńczenia próbek badanych P1 (P1.1, P1.2) i P2 (P2.1, P2.2) wg Tabeli 2. Do każdej
probówki dodać po 0.6 ml odczynnika orcynowego przygotowanego bezpośrednio przed użyciem (str.3), zamieszać. W celu
uzyskania hydrolizatu RNA probówki inkubować 20 min we wrzącej łaźni wodnej (łaźni nie przykrywać!). Probówki oziębić w
zlewce z zimną wodą. Oznaczoną pipetą automatyczną przenieść po 200 µl roztworu z każdej szklanej probówki do dołków
w płytce titracyjnej. W czytniku do płytek titracyjnych zmierzyć absorbancję próbek P1 i P2 wobec ślepej odczynnikowej przy
dł. fali 660 nm (płytkę przed wyciągnięciem spod dygestorium przykryć pokrywką, pomiaru dokonywać nie odkrywając płytki).
Po wykonaniu pomiaru absorbancji, wartości OD dla próbek badanych pomniejszyć o wartość OD dla ślepej korzystając z
opcji: "OD – blank" w programie KC4.
Do sporządzenia próbek wzorcowych użyto 1% roztworu RNA, który rozcieńczono zgodnie z Tabelą 1. W tabeli podano
również trzy różne zestawy wartości absorbancji do wykreślenia krzywej kalibracyjnej przez każdą z podgrup.
Tab. 1.
p
ró
b
k
i
w
z
o
rc
o
w
e
symbol
obj. wody
[ml]
obj. r-ru
wzor. RNA
[ml]
ilość RNA
w obj. 0.6 ml
[mg]
stężenie RNA
[mg/ml]
OD
660
I
II
III
Ø
0
0
0
0
0
W1
0.5
0.1
0.205
0.197
0.211
W2
0.4
0.2
0.428
0.384
0.404
W3
0.3
0.3
0.673
0.706
0.723
W4
0.2
0.4
0.904
0.883
0.912
W5
0.1
0.5
1.125
1.009
1.112
W6
0
0.6
1.341
1.184
1.295
Przed przygotowaniem obydwu powtórzeń dla próbki badanej P2 zgodnie z Tab.2, próbkę należy rozcieńczyć dwukrotnie.
Tab. 2.
p
ró
b
k
i
b
a
d
a
n
e
symbol
obj. wody
[ml]
obj. próbki
[ml]
OD
660
ilość RNA w
próbce badanej
odczytana z
krzywej [mg]
rozcieńczenie
próbki przed
pomiarem
stężenie białka
[mg/ml]
średnie
stężenie białka
[mg/ml]
P1.1
0.5
0.1
P1.2
0.1
0.5
P2.1
0.5
0.1
P2.2
0.1
0.5
Na podstawie wartości absorbancji uzyskanej dla obydwu powtórzeń próbek badanych P1 i P2 z krzywej wzorcowej należy
odczytać ilość RNA oraz obliczyć stężenie RNA w P1 i P2.
Biochemia: Ćw. 11 – Kwasy nukleinowe
5
5.
P
RECYPITACJA
DNA
Precypitacja (strącanie) kwasów nukleinowych z użyciem środków odwadniających jest jednym ze sposobów zagęszczenia roztworów tych
związków. Najczęściej do precypitacji używa się alkoholi: etanolu lub izopropanolu. Przy małych stężeniach wydajność precypitacji kwasu
nukleinowego zwiększa użycie schłodzonego alkoholu; samą precypitację też wykonuje się w niskiej temperaturze (4
°
C lub -20
°
C).
Wykonanie: Przygotować sterylną probówkę typu Eppendorf o poj. 0.5 ml. Do 100 µl 0.1% roztworu wyjściowego DNA
dodać 10 µl 3M CH
3
COONa, pH 5.2 (RT*) oraz 250 µl 96% etanolu (z -20°C). Wymieszać dokładnie i inkubować przez 30
min w temp. -20°C. Wytrącone DNA wirować przez 10 min, 13000 RCF, RT. Zebrać dokładnie nadsącz końcówką kapilarną
a peletę przemyć 250 µl 70% etanolu (RT). Ponownie zwirować przez 10 min, 13000 RCF, RT. Po dokładnym zebraniu
nadsączu końcówką kapilarną peletę wysuszyć na powietrzu (ok.10 min) a następnie rozpuścić w 10 µl wody dejonizowanej.
6.
O
KREŚLENIE STĘŻENIA
DNA
METODĄ SPEKTROFOTOMETRYCZNĄ
W celu określenia odzysku DNA zmierzyć jego stężenie metodą spektrofotometryczną w świetle UV w roztworze wyjściowym oraz
roztworze 10-krotnie zagęszczonym po precypitacji.
Wykonanie: Przygotować trzy probówki typu Eppendorf o poj. 0.5 ml. Do pierwszej (próby ślepej) dodać 100 µl wody wolnej
od RNaz a do drugiej i trzeciej po 99 µl wody wolnej od RNaz. Do drugiej dodatkowo 1 µl roztworu wyjściowego DNA (przed
precypitacją), do trzeciej - 1 µl roztworu DNA po precypitacji. Zmierzyć absorbancję względem próby ślepej przy dł. fali 260
nm (spektrofotometr Bio-Rad). Spektrofotometr w oparciu o zadaną wartość współczynnika konwersji (ang. conversion
factor, zwykle 1:50 µg/ml) oraz rozcieńczenie przelicza zmierzoną wartość absorbancji na stężenie wyrażone w [µg/ml].
Policzyć ilość DNA [µg] w 100 µl roztworu wyjściowego oraz 10 µl 10-krotnie zagęszczonego roztworu po precypitacji
.
Na zajęciach obowiązuje strój ochronny: chałat, rękawiczki jednorazowe oraz okulary ochronne. Każda podgrupa zobowiązana
jest do przyniesienia na zajęciach zestawu do wykreślenia krzywej kalibracyjnej: papieru milimetrowego, linijki, krzywki, ołówka,
kalkulatora.
*RT (ang. Room Temperature) – temperatura pokojowa
W sprawozdaniu należy zamieścić:
Wyznaczenie stężenia RNA metodą orcynową w próbkach badanych P1 i P2.
Zalecana literatura:
"Biochemia" J.M. Berg, J.L.Tymoczko, L. Stryer, PWN; W-wa 2005, rozdział pt. "DNA, RNA i przepływ informacji
genetycznej"
(lub
odpowiedni rozdział we wcześniejszych wydaniach).