plik

Postępy Biochemii 59 (3) 2013

305

Radosław Kitel

Joanna Czarnecka

Aleksandra Rusin

2,

Katedra Chemii Organicznej, Bioorga-

nicznej i Biotechnologii, Wydział Che-

miczny, Politechnika Śląska w Gliwicach

Centrum Badań Translacyjnych i Biologii Mo-

lekularnej Nowotworów, Centrum Onkologii

Instytut im. Marii Skłodowskiej – Curie, Od-

dział w Gliwicach



Centrum Badań Translacyjnych i Biologii

Molekularnej

Nowotworów,

Centrum

Onkologii Instytut im. Marii Skłodowskiej-

Curie, Oddział w Gliwicach, ul. Wybrzeze AK

15, 44-100 Gliwice; e-mail: arusin@io.gliwice.

tel.: (32) 27 89 844

Artykuł otrzymano 18 grudnia 2012 r.

Artykuł zaakceptowano 23 kwietnia 2013 r.

Słowa kluczowe: hodowle 3D, hodowle trój-

wymiarowe, sferoidy,

Wykaz skrótów: 2D (ang. two-dimensional) —

dwuwymiarowe; 3D (ang. three-dimensional)

— trójwymiarowe; BAL (ang. bioartificial liver)

— sztuczna biologiczna wątroba; CSC (ang.

cancer stem cells) — nowotworowe komórki

macierzyste; EGF (ang. epidermal growth factor)

— naskórkowy czynnik wzrostu; EMT (ang.

epithelial-mesenchymal transition) — przejście

nabłonkowo-mezenchymalne; PHEMA — po-

limetakrylan 2-hydroksyetylu; PLGA — kopo-

limer kwasu mlekowego i kwasu glikolowego;

RGD — sekwencja aminokwasów: argininy,

glicyny i kwasu asparaginowego

Podziękowania: Praca ta powstała podczas

wykonywania projektu finansowanego przez

FNP (Grant VENTURES/2012-9/6 przyznany

R.K). A.R. składa podziękowania dr Piotrowi

Filipczakowi za cenne uwagi dotyczące maszy-

nopisu.

Trójwymiarowe hodowle komórek — zastosowania

w badaniach podstawowych i inżynierii tkankowej

STRESZCZENIE

echnika hodowli komórek

in vitro jest powszechnie stosowana w badaniach bioche-

micznych i molekularnych i wykazuje wiele zalet w porównaniu do hodowli organów

i wycinków tkanek

in vitro, zapewniając łatwy dostęp do materiału biologicznego, wysoką

powtarzalność wyników oraz wysokoprzepustowy format analiz. Jednakże dwuwymiarowe

hodowle (hodowle 2D) słabo odzwierciedlają mikrośrodowisko tkanki i są coraz częściej

zastępowane hodowlami trójwymiarowymi (hodowlami 3D), wykazującymi podobieństwo

do tkanki pod względem kontaktów międzykomórkowych, ścieżek sygnałowych i ekspresji

genów. Niniejsza praca omawia biologię hodowli sferycznych (sferoidów), ich zastosowanie

w badaniach podstawowych i biotechnologii oraz przedstawia metody otrzymywania tych

struktur.

WPRoWADZENIE

Hodowla komórek in vitro jest techniką powszechnie stosowaną w różnych

dyscyplinach naukowych, od biologii molekularnej po badania środowiskowe.

Jest także wykorzystywana w biotechnologii, między innymi w procesach pro-

dukcji szczepionek czy przeciwciał monoklonalnych. Przez wiele lat rutynowo

hodowano komórki wykazujące zdolność do przywierania do dna naczynia

(komórki adherentne) w postaci pojedynczej warstwy przykrytej pożywką, co

zapewniało im optymalne warunki wzrostu. Należy podkreślić, że brak kontak-

tu komórek z macierzą zewnątrzkomórkową na plastikowych powierzchniach

naczyń hodowlanych, a także wysoka zawartość surowicy w pożywce prowadzi

do zmiany stanu zróżnicowania komórek, utraty ich polaryzacji oraz komunika-

cji międzykomórkowej. W kulturze zaczynają dominować procesy promujące

proliferację i przypominające zjawiska zachodzące podczas gojenia ran oraz wy-

stępujące w ogniskach zapalnych.

Taki typ hodowli stwarza wiele ograniczeń jako model tkanki [1]. Od dawna

znany jest fakt, że prawidłowe komórki nabłonkowe w hodowli utrzymywa-

nej w postaci monowarstwy wykazują wiele cech komórek nowotworowych,

łącznie z ograniczeniem ich zdolności do różnicowania [2,3]. Badania zapocząt-

kowane przez Sutherlanda w latach siedemdziesiątych ubiegłego wieku poka-

zały, że trójwymiarowe hodowle komórek nowotworowych przypominają pod

wieloma względami guzy lite i są ich doskonałym modelem in vitro [4]. Autorzy

ci pokazali przewagę trójwymiarowych hodowli nad tradycyjną hodowlą 2D w

badaniach odpowiedzi biologicznej komórek na promieniowanie [5,6].

W ostatnich latach znacznie ulepszono techniki otrzymywania i hodow-

li trójwymiarowych agregatów komórkowych o powtarzalnych rozmiarach i

strukturze. Coraz częściej stosuje się trójwymiarowe hodowle (hodowle 3D),

obejmujące więcej niż jeden typ komórek, odzwierciedlające oddziaływania he-

terotypowe, charakterystyczne dla tkanek. Trójwymiarowe hodowle komórek

in vitro znajdują zastosowanie w badaniach biologii komórek nowotworowych,

oddziaływań międzykomórkowych, procesów różnicowania, ocenie toksycz-

ności substancji i skuteczności terapeutycznej potencjalnych leków, a także w

inżynierii tkankowej.

MIKRośRoDoWISKo SfERoIDóW

Jednym z modelowych układów 3D in vitro są sferyczne agregaty komórkowe

(sferoidy). Mają one charakter samoorganizujących się skupisk, powstających w

warunkach uniemożliwiających przyczepianie się komórek do podłoża. Sfero-

idy tworzą się, gdy oddziaływania komórka-komórka dominują nad oddziały-

waniami komórka–substancje macierzy zewnątrzkomórkowej [7]. Twory te nie

stanowią kolonii (nie powstają w wyniku podziałów pojedynczej komórki).

306

www.postepybiochemii.pl

Podobnie jak podczas prawidłowej embriogenezy i mor-

fogenezy tkanek, tak i podczas formowania sferoidu za-

sadniczą rolę odgrywają właściwości adhezyjne komórek.

Początkowo skupianie komórek zachodzi dzięki oddziały-

waniu integryn obecnych w błonach komórek z białkami

macierzy wydzielanymi przez komórki do pożywki lub

dodawanymi sztucznie jako jej składnik (Ryc. 1) [7]. Włók-

na macierzy międzykomórkowej bogate w motywy RGD

rozpoznawane przez integryny błonowe ułatwiają szybkie

skupianie się rozproszonych komórek. Różnice w zdolno-

ści do agregowania różnych komórek zależą zarówno od

zawartości białek macierzy wydzielanych do pożywki jak

i zawartości integryn w błonach komórek [8]. Przyleganie

komórek do siebie za pośrednictwem integryny α5β1 może

być znacznie silniejsze niż oddziaływania za pośrednic-

twem kadheryn. Ponieważ integryna α5β1 nie wykazuje

oddziaływania homofilowego, łączenie komórek następuje

za pośrednictwem włókien fibronektyny [9]. Aktywacja in-

tegryn na skutek przyłączenia ligandu jakim jest fibronek-

tyna prowadzi do uruchomienia kaskady sygnałowej obej-

mującej kinazy FAK Src, PI3K, RhoA, kinazę Rho (ROCK)

oraz fosforylację lekkiego łańcucha miozyny (MLCK). Ten

ciąg wydarzeń wpływa na aktywność kurczliwą cytoszkie-

letu aktynowego. Dynamiczna reorganizacja cytoszkieletu

aktomiozynowego w odpowiedzi na różnorodne bodźce,

leżąca u podstaw wszystkich zjawisk związanych z ruchli-

wością komórek jest zależna od wiążących GTP białek z

rodziny Rho [10,11]. Komórki rakowe tworzące zbite struk-

tury charakteryzują się wyższą kurczliwością aktomiozyny

w porównaniu do komórek tworzących luźne agregaty.

W sferoidach komórek raka jajnika charakteryzujących się

formowaniem zbitej architektury, ścieżki sygnałowe Rho/

ROCK ulegają aktywacji, prowadząc do nasilenia aktyw-

ności kurczliwej aktomiozyny [11]. W kolejnym etapie do-

chodzi do wzmożonej syntezy kadheryn i stopniowo do

powstania sferoidu o zbitej budowie [7].

Chociaż oddziaływania międzykomórkowe za pośred-

nictwem integryn i kadheryn postrzegane są jako główne

siły decydujące o przyleganiu komórek w sferoidach, inne

struktury komórkowe mają także udział w tworzeniu się

oddziaływań międzykomórkowych. Integralność mecha-

niczną sferoidu zapewniają białka cytoszkieletu, odpowia-

dające za generowanie naprężeń mechanicznych, prze-

noszonych przez wiele komórek w obrębie agregatu [12].

Białka połączeń szczelinowych (komunikacyj-

nych), koneksyny, które dotychczas uważano

jedynie za struktury uczestniczące w komuni-

kacji międzykomórkowej pełnią ważną funk-

cję także w rozpoznawaniu komórek [13].

Krytyczną wielkością sferoidu umożliwia-

jącą przeżycie komórek w jego wnętrzu jest

średnica 500–800 µm [14]. Po przekroczeniu

tego rozmiaru składniki odżywcze i tlen nie

docierają do środka struktury, co skutkuje po-

wstaniem mniej lub bardziej rozległej nekro-

zy centralnej. Martwica wewnętrzna otoczo-

na jest warstwą komórek żywych o grubości

100–300 µm. W zależności od czasu hodowli,

obserwuje się wyraźne różnice w wielkości

komórek sferoidu. Komórki znajdujące się

bliżej środka sferoidu są znacznie mniejsze od komórek

brzeżnych.

Symulacje komputerowe pokazują rozkład gradientów

stężenia metabolitów (na przykładzie mleczanu), substan-

cji odżywczych (glukozy) oraz energii (ATP) w zależności

od odległości od środka sferoidu (Ryc. 2) [15]. Założenia

teoretyczne oparto na wynikach badań eksperymental-

nych wykonanych za pomocą mikroelektrod, rezonansu

magnetycznego i wskaźników pH. Sferoidy w tym ujęciu

są traktowane jak tkanka nieunaczyniona, w której niefek-

tywny transport dyfuzyjny tlenu i drobnocząsteczkowych

substancji prowadzi do niedoboru substancji odżywczych i

akumulacji metabolitów w centralnej części.

Ukształtowane sferoidy charakteryzują się obecnością

białek macierzy zewnątrzkomórkowej, wydzielanej do

przestrzeni międzykomórkowych, międzykomórkowych

połączeń mechanicznych, takich jak desmosomy i strefy

przylegania (łac. zonula adherens) [12] oraz połączeń szcze-

linowych (komunikacyjnych), umożliwiających bezpośred-

nią sygnalizację między komórkami [16,17]. Lokalne stęże-

nie substancji macierzy zewnątrzkomórkowej, czynników

wzrostowych oraz cytokin wydzielanych przez komórki

nowotworowe sferoidu jest wyższe i dlatego sygnalizacja

parakrynna w tych tworach jest wzmocniona w porówna-

niu do kultur dwuwymiarowych.

Rycina 1. Powstawanie sferoidu. Agregacja komórek zachodzi dzięki oddziaływaniu integryn bło-

nowych z białkami macierzy obecnymi w pożywce. Następnie dochodzi do wzmożenia syntezy E-

-kadheryny, dzięki czemu sferoid przyjmuje coraz bardziej zbitą formę.

Rycina 2. Zależność między stężeniem glukozy (kolor niebieski), ATP (kolor

czerwony) oraz mleczanu (kolor zielony), a odległością od środka sferoidu. Na

podstawie [15].

Postępy Biochemii 59 (3) 2013

307

PRZyKłADy ZASToSoWANIA SfERoIDóW

W bADANIACh PoDSTAWoWyCh

SFEROIDy JAKO MODEL DO BADANIA

KANCEROGENEZy

Wielokomórkowe hodowle sferoidów komórek nowo-

tworowych są dobrym modelem in vitro guzów litych po-

zbawionych naczyń krwionośnych [7]. Gradienty stężeń

związków odżywczych, pH i tlenu, zależne od upakowania

sferoidu sprawiają, że efekty działania chemioterapeuty-

ków są niejednorodne w obrębie struktury (Ryc. 3) [14,18],

a sferoidy odznaczają się podwyższoną opornością na che-

mo- i radioterapię w porównaniu do hodowli dwuwymia-

rowych [19,20]. Dzięki pracy wielu grup badawczych poja-

wiły się w ostatnich kilku latach wiarygodne testy do oceny

efektów biologicznych w sferoidach. Dostosowano do tego

typu hodowli testy oceniające przeżycie komórek, zdolność

do przerzutowania, inwazji, migracji, udoskonalono także

techniki obrazowania [21]. Obecnie, kilkaset artykułów na-

ukowych opisuje sferoidy jako trójwymiarowy model guza

nowotworowego stosowany do oceny wpływu leków czy

radioterapii, badania procesu angiogenezy, zdolności ko-

mórek do inwazji i mikroprzerzutowania, różnicowania

komórek nowotworowych oraz biologii nowotworowych

komórek macierzystych.

SFEROIDy W BADANIACH BIOLOGII

NOWOTWOROWyCH KOMóREK MACIERZySTyCH

Hodowle sferyczne w odróżnieniu od hodowli jedno-

warstwowych, sprzyjają utrzymaniu fenotypu nowotwo-

rowych komórek macierzystych (CSC) [22]. Nowotworowe

komórki macierzyste stanowią subpopulację komórek guza,

o zdolności do samoodnawiania i różnicowania do innych

typów komórek nowotworu. Są także motorem wzrostu no-

wotworu. CSC dzielą się stosunkowo rzadko, z czego wy-

nika ich oporność na działanie cytostatyków. Wiele modeli

doświadczalnych wskazuje, że zawartość nowotworowych

komórek macierzystych w populacji komórkowej koreluje

z przerzutami do węzłów chłonnych oraz skróconym cza-

sem przeżycia zwierząt, u których wykonano przeszczep

komórek nowotworowych. Utrzymywanie fenotypu ma-

cierzystego w komórkach izolowanych z nowotworów jest

ograniczone w hodowli dwuwymiarowej. Podwyższoną

zawartość komórek o charakterze nowotworowych komó-

rek macierzystych obserwuje się w sferoidach otrzymanych

z komórek różnych nowotworów: raka gruczołu krokowe-

go [23], jelita grubego [24], piersi [25] i w glejakach [26]. Co

ciekawe, komórki o takich cechach obserwuje się także w

sferoidach otrzymanych z komórek zarodkowych prawi-

dłowej nerki, a ich zawartość wykazuje dodatnią korelację z

tumorogennością [27].

Dotychczas nie znaleziono uniwersalnego markera, na

podstawie obecności którego można zidentyfikować CSC

każdego nowotworu. W zależności od pochodzenia, mar-

kerem nowotworowych komórek macierzystych mogą być

markery powierzchniowe należące do grupy CD (ang. clu-

ster of differentiation), jak CD133 (ostra białaczka B limfobla-

styczna dzieci; rak jelita grubego, endometrium, wątroby,

płuc, kości, jajnika, trzustki, gruczołu krokowego, mięsak

Ewinga), CD44 (rak piersi, jelita grubego, żołądka, głowy

i szyi, wątroby, jajnika, trzustki, gruczołu krokowego),

enzym cytoprotekcyjny — dehydrogenaza aldehydowa

ALDH (rak piersi, jelita grubego, głowy i szyi, kości) czy

transportery z grupy ABC, pełniące główną rolę w oporno-

ści wielolekowej. Lista markerów nowotworowych komó-

rek macierzystych wciąż się wydłuża.

Podwyższoną zawartość komórek charakteryzujących

się markerami komórek macierzystych obserwuje się za-

równo w sferoidach otrzymanych z komórek izolowanych

z guzów jak i z komórek linii ustalonych, w porównaniu do

hodowli 2D [28-32].

Coraz częściej pojawia się pogląd, że CSC mogą być in-

dukowane przez odpowiednie warunki z komórek bardziej

zróżnicowanych. Badania wskazują, że CSC mogą powsta-

wać z komórek pozbawionych charakteru macierzystego w

procesie określanym jako przejście nabłonkowo-mezenchy-

malne (EMT, ang. epithelial mesenchymal transition) [33-35].

Proces EMT został zaobserwowany w trójwymiarowych

kulturach in vitro komórek nowotworowych [36,37].

Uważa się, że podwyższona zawartość CSC w hodow-

lach sferycznych związana jest z istnieniem we wnętrzu

sferoidu mikrośrodowiska regulującego ich samoodnowę

i różnicowanie, przynajmniej częściowo przypominającego

niszę nowotworowych komórek macierzystych. Obszar ten

charakteryzuje się obecnością substancji macierzy zewnątrz-

komórkowej, czynników wzrostowych i cytokin [38], ma

odpowiednie dla CSC warunki pH i zmniejszoną dostęp-

ność tlenu (hipoksja) [39].

Wiadomo, że warunki hipoksyjne prowadzą do zwięk-

szenia zawartości komórek wykazujących ekspresję CD133

w badanej populacji [40]. Hipoksja zwiększa zdolność ko-

mórek glejaka wykazujących obecność CD133 do samood-

nowy. Utrzymywanie tych komórek w stanie hipoksji przy-

czynia się także do wzrostu zawartości komórek wykazu-

jących obecność innych markerów CSC, takich jak CXCR4

(CD184), i A2B5 oraz niską zawartość CD44 (CD44

low

Wzmożona zdolność do samoodnowy tych komórek po-

przedzona jest wzrostem poziomu czynnika transkrypcyj-

nego indukowanego hipoksją 1α (HIF-1α). Hipoksja odgry-

wa kluczową rolę w regulacji fenotypu CSC także poprzez

czynnik transkrypcyjny indukowany przez hipoksję 2α

(HIF-2α) i związaną z nim indukcję syntezę różnych genów

tworzących sygnaturę CSC [41]. Czynniki HIF prowadzą

Rycina 3. Gradienty stężenia tlenu, składników pokarmowych, leków i intensyw-

ność podziałów w dużych sferoidach. Strzałki wskazują malejące wartości.

308

www.postepybiochemii.pl

też do wzmożenia ekspresji genów związanych z procesem

EMT, takich jak Twist1 [42] i oksydaza lizylowa (LOX, ang.

lysyl oxidase) [43].

Powyższe przykłady wskazują, że sferoidy stwarzają

właściwe środowisko dla utrzymywania w hodowli feno-

typu komórek macierzystych, związane przede wszystkim

z hipoksją. Niewątpliwie modelowanie in vitro niszy komó-

rek nowotworowych wymaga dalszego wzbogacenia ukła-

du badawczego i dodanie do hodowli komórek podścieli-

ska. Oddziaływania komórek nienowotworowych z komór-

kami nowotworowymi w sferoidach powstałych w wyniku

kokultury różnych typów komórek zostaną omówione w

kolejnym rozdziale.

SFEROIDy W BADANIACH ODDZIAłyWAń MIęDZy

KOMóRKAMI NOWOTWOROWyMI I PRAWIDłOWyMI

Zastosowanie różnych populacji komórek do tworzenia

sferoidów, na przykład komórek nowotworowych i fibro-

blastów [44], monocytów [45], czy komórek śródbłonko-

wych [46] pozwala otrzymać hodowle naśladujące guz

nowotworowy in vivo pod względem heterogenności ko-

mórkowej. Dzięki kokulturom możliwe jest badanie in vitro

relacji między komórkami nowotworowymi a komórkami

podścieliska, pełniącymi ważne funkcje wydzielnicze i sy-

gnalizacyjne, przyspieszającymi wzrost guza, indukujący-

mi angiogenezę i wpływającymi na przerzutowanie oraz

warunkujące odpowiedź na terapię. Kokultury komórek

nowotworowych i innych typów komórek charakteryzują

się przyspieszonym wzrostem sferoidów i utrzymywaniem

komórek macierzystych w hodowli dzięki sygnalizacji pa-

rakrynnej. Sferoidy otrzymane z komórek meduloblastomy

i ependymomy o wysokiej produkcji CD133, rosnące w ko-

kulturze z pierwotnymi komórkami endotelialnymi osiąga-

ły pięciokrotnie większe rozmiary po 2 tygodniach hodowli

w porównaniu do sferoidów kontrolnych [47]. Obecność

trzustkowych komórek gwiaździstych wydzielających

morfogeny zarodkowe ułatwia powstawanie sferoidów

komórek raka trzustki in vitro oraz ich zdolność do inwazji

[48]. Tworzenie mammosfer w hodowli in vitro, charakte-

ryzujących się wysoką zawartością CSC ułatwia obecność

mezenchymalnych komórek macierzystych wydzielających

substancje sygnałowe [49].

Kokultury komórek nowotworowych z makrofagami lub

komórkami cytotoksycznymi NK pozwalają na badanie ak-

tywności komórek układu odpornościowego i ich zdolności

do migracji pomiędzy komórki nowotworowe [50].

Ciekawym modelem badania inwazyjności komórek

nowotworowych jest hodowla na podłożu powleczonym

kolagenem pary sferoidów, z których jeden złożony jest z

komórek nowotworowych, a drugi z prawidłowych komó-

rek płuc [7]. Czas penetrowania komórek nowotworowych

do sfer utworzonych z komórek prawidłowych jest miarą

ich inwazyjności.

Sferoidy komórek nowotworowych są dobrym mode-

lem do badania procesów angiogenezy zachodzącej w po-

czątkowo nieunaczynionej tkance [51]. Proces formowania

włosowatych struktur z komórek endotelialnych może być

analizowany w sferoidach otrzymanych w wyniku kokultu-

ry komórek linii ludzkiego raka piersi MDA-MB-231, śród-

błonka ludzkiej żyły pępowinowej HUVEC oraz prawidło-

wych ludzkich fibroblastów skóry NHDF. Proces angioge-

nezy może być hamowany za pomocą związków znajdują-

cych się w leczeniu klinicznym lub stymulowany za pomo-

cą odpowiednich czynników wzrostowych. Zastosowanie

tego modelu pozwoliło odkryć nową rolę fibroblastów w

angiogenezie, związaną z wytwarzaniem metaloproteina-

zy MT1-MMP, umożliwiającej wnikanie kapilar pomiędzy

komórki nowotworowe. Model ten, ze względu na wysoką

powtarzalność i łatwość kontroli warunków eksperymen-

talnych, może okazać się niezwykle sprawnym narzędziem

w badaniu procesu angiogenezy w guzie nowotworowym

w warunkach in vitro.

HODOWLA SFEROIDóW Z PRAWIDłOWyCH

KOMóREK MACIERZySTyCH

Ponad 30 lat temu zaobserwowano, że komórki zarod-

kowe izolowane z blastocysty hodowane na warstwie od-

żywczej zbudowanej z mysich fibroblastów zarodkowych

(MEF) z dodatkiem czynnika hamującego białaczkę (LIF,

ang. leukemia inhibitory factor), jako czynnika zapobiegające-

go różnicowaniu zachowują swój potencjał do samoodnowy

i pluripotencjalne właściwości. Brak warstwy odżywczej i

LIF w pożywce prowadzi do spontanicznego agregowania

komórek i powstawania tak zwanych embrioidów, czyli

agregatów, których komórki zdolne są w odpowiednich

warunkach podjąć różnicowanie do różnych typów bardziej

zróżnicowanych komórek. Do otrzymywania embrioidów

stosuje się kolby rotacyjne, technikę wiszącej kropli lub po

prostu płytki bakteryjne o dnie nieprzystosowanym do ho-

dowli adherentnej [52].

W ostatnich kilku dekadach podejmowano próby mno-

żenia mezenchymalnych komórek macierzystych w warun-

kach in vitro w celu wykorzystania ich potencjału regenera-

cyjnego do leczenia różnych urazów i chronicznych chorób.

Komórki mezenchymalne selekcjonuje się w hodowli in vi-

tro dzięki ich zdolności do przylegania do dna plastikowe-

go naczynia. Chociaż komórki te zachowują plastyczność

przez kilka pasaży, ostatecznie tracą swoją zdolność do sa-

moodnowy i ulegają różnicowaniu. Znacznie dłużej można

utrzymywać potencjał macierzysty komórek mezenchymal-

nych w hodowlach sferycznych w porównaniu do tradycyj-

nej hodowli 2D [53].

Podobnie, utrzymywanie potencjału macierzystego ko-

mórek nerwowych jest możliwe dzięki warunkom panują-

cym w hodowli 3D [54]. Komórki o charakterze macierzy-

stym mają tendencje do samoczynnego tworzenia sfer w od-

powiednich pożywkach. Zdolność komórek otrzymanych z

dysypacji sfer do tworzenia kolejnych sfer wykazujących

zróżnicowanie na różne typy komórek jest uważane za wy-

znacznik ich „macierzystości”.

UTRZyMANIE FENOTyPU ZRóżNICOWANEGO

KOMóREK W HODOWLACH SFERyCZNyCH

Komórki utrzymywane w hodowli 3D odróżnia od ko-

mórek w hodowli tradycyjnej zdolność do różnicowania.

Istnieje wiele przykładów pokazujących zarówno utratę fe-

notypu zróżnicowanego komórek w hodowli 2D jak i uzy-

Postępy Biochemii 59 (3) 2013

309

skiwanie bardziej zróżnicowanego fenotypu przez komórki

w hodowli 3D.

Niezwykle ciekawych informacji dotyczących morfoge-

nezy prawidłowej tkanki gruczołowej oraz mechanizmów

związanych z nowotworzeniem dostarcza model sferoidów

utworzonych z nietransformowanych, immortalizowanych

komórek linii MCF-10A, rosnących w środowisku bogatym

w składniki błony podstawowej [55]. Warstwa zewnętrzna

(ściana sferoidu) utworzona jest ze spolaryzowanych komó-

rek nabłonkowych, których powierzchnia szczytowa (api-

kalna) skierowana jest do pozbawionego komórek wnętrza

sferoidu. Wielokomórkowe agregaty powstają z pojedyn-

czych komórek zanurzonych w białkach macierzy w wyniku

podziałów. Po 4–5 dniach w hodowli zewnętrzne komórki

będące w kontakcie z macierzą zewnątrzkomórkową ulega-

ją polaryzacji i zatrzymują swoje podziały, a po 7–8 dniach

komórki znajdujące się we wnętrzu agregatu podejmują

proces apoptozy [56]. Podjęcie apoptozy przez te komórki

zależne jest od białka BIM, które może pełnić funkcję czuj-

nika rozpoznającego czy komórka ma kontakt z podłożem.

Dodatkowo, białko to jest indukowane w warunkach ogra-

niczonej sygnalizacji poprzez naskórkowy czynnik wzrostu

(EGF). Przypuszczalnie brak kontaktu komórek we wnętrzu

agregatu z macierzą i osłabienie sygnalizacji poprzez EGF

w sposób synergistyczny indukuje programowaną śmierć

komórek. Utrata zdolności podejmowania apoptozy przez

komórki wnętrza rozwijającego się pęcherzyka in vivo jest

typową oznaką zmian nowotworowych.

Kluczową role w utrzymywaniu polarności komórek

odgrywa białko p73. Brak tego białka lub występowanie

jego onkogennej formy DNp73 powoduje utratę polarności

komórek i nasilenie procesu przejścia nabłonkowo-

mezenchymalnego [57].

Podobne różnicowanie komórek w hodowli in vitro pole-

gające na tworzeniu światła pęcherzyka obserwuje się przy

użyciu innej nienowotworowej linii nabłonka piersi 3522 S1

[58]. Na uwagę zasługują także procesy różnicowania ob-

serwowane w sferoidach zbudowanych z komórek wywo-

dzących się z ludzkich gruczolaków okrężnicy, które two-

rzą pęcherzykowe struktury, nieobecne w hodowli 2D [59].

Brak zdolności niektórych linii komórkowych do formowa-

nia tego typu spolaryzowanych struktur może odzwiercie-

dlać utratę ich zdolności do różnicowania.

Na poziomie ultrastrukturalnym polarność komórek w

rozwijającym się pęcherzyku MCF10 jest wyrażona apikal-

ną lokalizacją aparatu Golgiego [60]. Po wyciszeniu ekspre-

sji genów białek związanych z utrzymywaniem polarności

komórek, takich jak Scribble i Pard3 komórki nie wykazują

polarności, widocznej jako apikalne umiejscowienie apara-

tu Golgiego. Co ciekawe, badane komórki nowotworowe

(nawet te, które wytwarzają pęcherzyki w hodowli) tak-

że nie wykazują apikalnej lokalizacji aparatu Golgiego, co

wskazuje na brak polarności. Dodatkową cechą komórek

niewykazujących zróżnicowania bazalno-apikalnego jest

brak zdolności do rotacyjnego ruchu. Wpływa to na niepra-

widłowe formowanie macierzy, zwłaszcza na niewłaściwe

odkładanie lamininy i przypuszczalnie ma konsekwencje

dla zdolności komórek do różnicowania [60].

Z pewnością dalsze badania z wykorzystaniem hodowli

in vitro pomogą wyjaśnić różnice w zdolności do różnico-

wania komórek prawidłowych i transformowanych nowo-

tworowo.

Zastosowanie hodowli trójwymiarowej w celu utrzyma-

nia fenotypu zróżnicowanego komórek w hodowli in vitro

jest użyteczne w badaniach funkcji wydzielniczych komó-

rek. Od dawna wiadomo, że większość komórek endokryn-

nych hodowanych w postaci monowarstwy charakteryzuje

się krótkim czasem aktywności hormonalnej, w odróżnie-

niu od hodowli komórek w postaci agregatów. Przykładem

hodowli tego typu są sferoidy wyprowadzone z komórek

szyszynki [61], gonad [62] i przysadki [63]. Utrzymywanie

komórek szyszynki w hodowli trójwymiarowej pozwala

przedłużyć zdolność do sekrecji melatoniny przez 3 tygo-

dnie [61]. Sferoidy otrzymane z komórek gonad mogą słu-

żyć do badania długotrwałego wpływu hormonów i czyn-

ników wzrostu na funkcje wydzielnicze [62]. Sferoidy utwo-

rzone z komórek przysadki mają zastosowanie w badaniach

nad wydzielaniem hormonów gonadotropowych oraz

wpływem hormonów podwzgórza na funkcje wydzielnicze

[63]. Niedawno okazało się, że zarodkowe komórki macie-

rzyste mogą tworzyć w kulturach trójwymiarowych in vitro

strukturę, która po przeszczepieniu do zwierząt doświad-

czalnych jest funkcjonalną przysadką [64]. Funkcje wy-

dzielnicze in vitro udało się także indukować w komórkach

izolowanych ze ślinianek podżuchwowych hodowanych

następnie w postaci sfer. Komórki pozyskane ze sferoidów

wykazywały zdolność do różnicowania w komórki przewo-

dów wyprowadzających oraz w komórki surowicze, produ-

kujące mucynę i amylazę [65].

Okazuje się także, że hodowle trójwymiarowe komórek

wątroby pozwalają na utrzymanie wielu funkcji detoksy-

kacyjnych, zanikających w hodowlach dwuwymiarowych

[66]. Dzięki temu możliwe jest zastąpienie w badaniach

toksykologicznych modeli zwierzęcych modelami komór-

kowymi.

PRZyKłADy ZASToSoWANIA hoDoWlI

TRóJWyMIARoWyCh W INżyNIERII TKANKoWEJ

Podobieństwa strukturalne i funkcjonalne hodowli trój-

wymiarowych i tkanek organizmu dają nadzieję na zasto-

sowanie odpowiednio uformowanych hodowli trójwymia-

rowych jako materiału do rekonstrukcji narządów. Wysił-

ki różnych zespołów skupione są na otrzymaniu hodowli

przestrzennych hepatocytów do wytworzenia sztucznej

biologicznej wątroby (ang. bioartificial liver) [67], kardiomio-

cytow do odbudowy mięśnia sercowego po stanie zawa-

łowym [68,69], osteocytow i chondrocytów do odbudowy

tkanki kostnej i chrzęstnej [70], a także tworzenia sztucznej

skóry [71]. Ponieważ piśmiennictwo dotyczące tworzenia

sztucznej skóry i chrząstki in vitro jest szczególnie obszer-

ne, a wiele artykułów przeglądowych dobrze prezentuje ten

temat w niniejszym artykule postanowiliśmy bliżej przed-

stawić jedynie hodowle trójwymiarowe komórek wątroby i

mięśnia sercowego.

310

www.postepybiochemii.pl

PROJEKT SZTUCZNEJ WąTROBy

Od wielu lat trwają badania nad wytworzeniem urządze-

nia określanego biologiczną sztuczną wątrobą (BAL, ang.

bioartificial liver) do wykorzystania w celu detoksykacji pa-

cjentów oczekujących na przeszczep wątroby [67]. Korzyst-

ne wyniki prób klinicznych pierwszej fazy stymulują dalsze

prace nad poprawą wydajności funkcjonowania aparatu

[72]. Bioreaktory tego typu zawierają warstwowo ułożone

hodowle hepatocytów w łożysku sztucznych włośniczek.

Urządzenie to wymaga dużej ilości żywych i wysoce ak-

tywnych hepatocytów. Najczęściej stosowane są pierwotne

hepatocyty świni. Ograniczeniem wydajności urządzenia

jest jednak utrata funkcji przez komórki utrzymywane w

warunkach, które nie promują różnicowania. Pewne na-

dzieje nad ulepszeniem bioreaktora niesie zastosowanie

trójwymiarowej hodowli hepatocytów, osadzonych w żelu

kolagenowym, wykazujących znacznie wyższą aktywność

wielu specyficznych dla wątroby enzymów w porównaniu

do hepatocytów rosnących w monowarstwie [73]. Wyniki

te wskazują potencjalną możliwość zastąpienia w projekcie

BAL hodowli monowarstwowej przez hodowlę trójwymia-

rową [67].

KARDIOSFERy JAKO źRóDłO KOMóREK DO

REGENERACJI MIęŚNIA SERCOWEGO

Hodowle sferyczne znajdują także zastosowanie w kar-

diologii eksperymentalnej. Wyniki badań ostatniej dekady

obalają obraz serca jako organu postmitotycznego, ukazu-

jąc, że przez całe życie człowieka podlega ono intensywnej

regeneracji, której nieodłącznie towarzyszą podziały ko-

mórkowe [74,75]. Odkrycie to stanowiło podstawę do pod-

jęcia próby wykorzystania technik inżynierii tkankowej do

odbudowy miokardium uszkodzonego na skutek zawału.

Procedura otrzymywania sferoidów z komórek sercowych

polega na pozyskaniu niewielkiej ilości nieuszkodzonego

miokardium na drodze biopsji i przeprowadzeniu kilkueta-

powej hodowli in vitro, w wyniku której uzyskuje się tak

zwane kardiosfery [76]. Są to heterogenne struktury komór-

kowe, wzbogacone w unikalne dla serca komórki macie-

rzyste (ang. Cardiac Stem Cells). Komórki te charakteryzują

się zdolnością do samoodtwarzania, wykazują potencjał

klonogenny oraz posiadają zdolność do różnicowania w

trzy podstawowe klasy komórek tworzących funkcjonalne

miokardium: kardiomiocyty, komórki mięśni gładkich na-

czyń i komórki śródbłonka [77]. Kardiosfery utworzone są

z różnorodnych populacji sercowych komórek progenito-

rowych i prekursorowych na różnym etapie zróżnicowania

oraz mezenchymalnych komórek macierzystych. Opisane

klasy wspomagają funkcje właściwych sercowych komórek

macierzystych i pomagają im zachować niezróżnicowany

fenotyp [78].

Wewnętrzna część kardiosfery wzbogacona jest w ko-

mórki wykazujące silną proliferację i równocześnie ekspre-

sję markerów macierzystości, wśród których najczęściej wy-

różnianymi są c-kit (CD117), sca-1 oraz CD34. Peryferyczne

części kardiosfery zbudowane są z komórek znajdujących

się w różnym stadium różnicowana w typy histologiczne

charakterystyczne dla miokardium i wykazujących syntezę

markerów takich jak troponina I, ANP (ang. atrial natriuretic

peptide) i CD31. Poprzez tworzenie specyficznego mikro-

środowiska wewnątrz sfery, przede wszystkim warunków

hipoksyjnych, jak również poprzez tworzenie bezpośred-

nich oddziaływań z komórkami macierzystymi (połączenia

komunikacyjne z udziałem koneksyny 43), komórki pery-

feryczne zapewniają warunki niezbędne dla podtrzymania

niezróżnicowanego fenotypu komórek macierzystych znaj-

dujących się wewnątrz kardiosfery [79].

Po wszczepieniu do serca pacjenta autologicznych ko-

mórek tworzących w hodowli in vitro kardiosferę komórki

macierzyste serca wbudowują się w pobliżu uszkodzonego

miokardium, po czym, dzięki intensywnym podziałom i

towarzyszącemu im różnicowaniu, odbudowują jego struk-

turę. Opublikowane wyniki prób klinicznych pozwalają

przypuszczać, iż techniki wykorzystujące komórki macie-

rzyste serca poprawiają wydolność tego organu, zwiększa-

jąc komfort i długość życia osób cierpiących na komplikacje

pozawałowe [68,69].

METoDy oTRZyMyWANIA SfERoIDóW

HODOWLE ROTACyJNE

Jedną z metod otrzymywania sferoidów jest hodowla

zawiesiny komórek w butelce z mieszadłem (Ryc. 4A). W

tych warunkach komórki nie mogą przyczepiać się do pod-

łoża, zaczynają agregować i tworzyć sferoidy. Jest to jedna z

najprostszych metod uzyskania sferoidów na większą ska-

lę. Zdecydowaną wadą tej metody jest długi czas hodow-

li, znaczne różnice w rozmiarach powstałych sferoidów i

mechaniczne niszczenie komórek. Odmianą tej metody jest

system rotacyjnej hodowli komórkowej, wykorzystujący

urządzenie, w którym kolba hodowlana obraca się wokół

osi poziomej. Symulowanie mikrograwitacji przy mini-

malnych siłach hydrodynamicznych sprawia, że komórki

zawiesiny nie są niszczone. System ten pozwala na otrzy-

Rycina 4. Metody otrzymywania sferoidów w hodowlach zawiesinowych. A.

Kultura w butelce z mieszadłem. Komórki poddane mieszaniu skupiają się two-

rząc sferoidy; B. Kultura na podłożu pokrytym gęstą siatką o właściwościach

przeciwadhezyjnyh. Komórki mogą poruszać się po podłożu, jednak nie mogą

się do niego przyczepiać, co prowadzi do ich agregowania; C. Przyspieszone

tworzenie sferoidów dzięki ułatwionemu skupianiu komórek na nanowłóknach

polimerowych PLGA; D. Metoda wiszącej kropli. Komórki zawiesiny komórko-

wej tworzą sferoidy na skutek grawitacyjnego opadania na dół wiszącej kropli.

Krople zawiesiny komórkowej naniesione są na wieczko standardowej płytki

hodowlanej (górny schemat) lub do specjalnych wkładek w płytkach wielodoł-

kowych (dolny schemat).

Postępy Biochemii 59 (3) 2013

311

mywanie sferoidów o stosunkowo dużych rozmiarach i

mniejszym zróżnicowaniu morfologicznym w porównaniu

do sferoidów pochodzących z kolby z mieszadłem.

HODOWLA NA PODłOżU NIEADHEZyJNyM

Równie prostą metodą otrzymywania sferoidów jest ho-

dowla komórek w naczyniu o dnie pokrytym materiałem

nieadhezyjnym (ang. Liquid overlay), na przykład agarem,

agarozą lub różnego rodzaju polimerami syntetycznymi

[80-82]. Przykładem materiału zastosowanego do pokrycia

komercyjnie dostępnych płytek w celu zapobiegania adhe-

zji komórek jest obojętny hydrożel, a płytki te są dostępne

pod nazwą płytki o nadzwyczaj słabej przyczepności (ang.

ultra-low attachment plates).

Za pomocą tej metody wiele linii komórkowych ulega

spontanicznej agregacji, jednak powstałe sferoidy są zróż-

nicowane pod względem kształtu i rozmiaru. Zastosowanie

płytek wielodołkowych o wklęsłym lub stożkowym dnie

pokrytym polimetakrylanem 2-hydroksyetylu (PHEMA)

pozwala otrzymać pojedyncze sferoidy o jednakowych

rozmiarach i morfologii [82]. Płytki z zawiesiną komórek

poddaje się wirowaniu i po 24 godzinach w każdym doł-

ku formują się sferoidy. Czas hodowli jest krótki, jednak

w przypadku wielu typów komórek konieczne jest doda-

nie do pożywki białek macierzy zewnątrzkomórkowej, aby

powstałe agregaty miały postać okrągłych, zwartych sfero-

idów o równych i jednolitych brzegach.

Odmianą metody liquid overlay jest zastosowanie na dnie

naczyń hodowlanych specjalnej siatki po której komórki mi-

grują [83]. Dostępne są płytki w formacie wielodołkowym,

pokryte polimerowymi siatkami o okach w kształcie kwa-

dratów lub sześciokątów, produkowane przez firmę Scivax

(Ryc. 4B). Komórki mogą migrować po siatce, jednak nie

mogą przyczepiać się do podłoża, przez co oddziaływania

międzykomórkowe powodują agregowanie komórek.

Należy dodać, że niektóre komórki tworzą sferoidy w po-

żywce pozbawionej surowicy, zawierającej specjalny doda-

tek B27 i czynniki wzrostowe, takie jak fibroblastowy czyn-

nik wzrostu, bFGF i naskórkowy czynnik wzrostu, EGF.

Taka pożywka jest rutynowo stosowana do otrzymywania

neurosfer (agregatów komórek nerwowych), mammosfer

(agregatów komórek nabłonka piersi) i sferoidów komórek

raka jajnika, charakteryzujących się wysoką zawartością ko-

mórek macierzystych, CSC.

ZASTOSOWANIE DODATKU NANOWłóKIEN

POLIMEROWyCH DO ZAWIESINy KOMóRKOWEJ

Ciekawym rozwiązaniem sprzyjającym agregowaniu ko-

mórek w zawiesinie jest dodanie do pożywki nanowłókien

zbudowanych z biodegradowalnego oraz biokompatybil-

nego kopolimeru kwasu mlekowego i kwasu glikolowego

(PLGA) [84] (Ryc. 4C). Po 12 godzinach hodowli można

zaobserwować agregowanie komórek na nanonitkach poli-

merowych i stopniowe powstawanie sferoidów. Wydajność

tworzenia sferoidów w tej metodzie jest znacznie wyższa

w porównaniu do zawiesiny pozbawionej włókien PLGA.

Czynnikiem ułatwiającym formowanie sferoidów jest ad-

sorbowanie na powierzchni nanowłókien fibronektyny po-

chodzącej z surowicy, co sprzyja przyłączaniu komórek.

METODA WISZąCEJ KROPLI

W ostatnich latach ponownie zainteresowano się metodą

wiszącej kropli, jako sposobem otrzymywania hodowli sfe-

rycznych (Ryc. 4D) [85]. W najprostszym wydaniu polega

ona na naniesieniu kropli zawiesiny komórek na wewnętrz-

ną stronę pokrywki płytki hodowlanej. Po odwróceniu

płytki krople utrzymywane są dzięki napięciu powierzch-

niowemu, a mikrograwitacja powoduje skupianie komó-

rek na dole kropli. Metoda ta pozwala uzyskać w krótkim

czasie dużą liczbę sferoidów o jednorodnych rozmiarach,

nie wymaga użycia skomplikowanej aparatury i przede

wszystkim jest tania. Metoda charakteryzuje się prawie

100% wydajnością, z jednej wiszącej kropli powstaje jeden

sferoid o równych brzegach (obserwacje własne autorów).

Przepustowość metody można zwiększyć stosując specjalne

płytki hodowlane (Ryc. 4D), dostępne w formacie 96 lub 384

otworowym, ułatwiające wymianę pożywki. Płytki te pro-

dukowane są przez InSphero oraz Biomatrix.

OTRZyMyWANIE SFEROIDóW NA RUSZTOWANIACH

Bardzo popularnym typem rusztowań są żele białkowe

lub peptydowe, w których zawieszone są komórki. żele

tego typu mogą być utworzone z kolagenu [86], mieszaniny

białek macierzy zewnątrzkomórkowej określanej jako Ma-

trigel [87,88] lub nanowłókien powstałych dzięki samozło-

żeniu syntetycznych oligopeptydow tworzących hydrożel

[89,90]. Niekiedy hydrożele stosuje się jako dodatek obniża-

jący lepkość pożywek i tym samym ułatwiający skupianie

komórek w agregaty. Technologia ta jest zastosowana w

dodatku HappyCell (ASM) i jest rozwiązaniem pośrednim

między kulturą zawiesinową a rusztowaniem żelowym.

Często do otrzymywania sferoidów stosowane są ruszto-

wania o charakterze gąbki. Trójwymiarowa geometria rusz-

towania sprawia, że znajdujące się w nim komórki mogą

wchodzić w kontakt z innymi komórkami w przestrzeni.

Gąbki tego typu wykonane są z materiałów syntetycznych

lub naturalnych, takich jak na przykład polistyren [91], algi-

nian [92], kompozyty kolagenu z chitozanem, glikozamino-

glikanami lub elastyną [93] i innymi dodatkami.

Niekiedy powierzchnie kontaktu z komórkami pokrywa-

ne są dodatkowo białkami macierzy lub peptydami zawie-

rającymi motywy RGD [94].

W przypadku zastosowania prefabrykowanych gąbek

zawiesinę komórek wylewa się do dołków, na których

dnie umieszczone są krążki o porach wielkości od 100 do

500 uM. Pory wypełniane są przez dzielące komórki za-

wiesiny wylanej na gąbkę i stopniowo tworzące hodowle

trójwymiarowe.

PoDSuMoWANIE

Możliwość odtwarzania i modyfikowania oddziaływań

międzykomórkowych w układzie modelowym, jakim jest

hodowla in vitro pozwala na znacznie lepsze i szybsze zro-

312

www.postepybiochemii.pl

zumienie procesów biologicznych zachodzących podczas

nowotworzenia i różnicowania w organizmie. Trójwymia-

rowe hodowle in vitro stanowią kompromis między trady-

cyjnymi hodowlami dwuwymiarowymi, zapewniającymi

łatwy dostęp do materiału biologicznego i wysokoprzepu-

stowy format doświadczeń, ale słabo oddającymi warunki

w tkankach, a hodowlami fragmentów pierwotnych tkanek

czy organów, które co prawda stanowią model dobrze od-

twarzający rzeczywiste warunki, w jakich komórki znajdu-

ją się in vivo, jednak nie znajdują szerokiego zastosowania

ponieważ wycinki tkanek szybko obumierają w hodowli, a

dostęp do nich jest ograniczony. Równocześnie, wraz z roz-

wojem technik hodowli 3D otwierają się nowe możliwości

dla inżynierii tkankowej, przede wszystkim w dziedzinie

rekonstrukcji narządów, ponieważ kultury 3D zapewniają

optymalne warunki dla różnicowania tkanek in vitro.

PIśMIENNICTWo

1. Pampaloni F, Reynaud EG, Stelzer EH (2007) The third dimension

bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell

Biol 8: 839-845

2. Petersen OW, Ronnov-Jessen L, Howlett AR, Bissell MJ (1992) Interac-

tion with basement membrane serves to rapidly distinguish growth

and differentiation pattern of normal and malignant human breast

epithelial cells. Proc Natl Acad Sci USA 89: 9064-9068

3. Bissell MJ (1981) The differentiated state of normal and malignant cells

or how to define a “normal” cell in culture. Int Rev Cytol 70: 27-100

4. Sutherland RM, McCredie JA, Inch WR (1971) Growth of multicell

spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas. J Natl

Cancer Inst 46: 113-120

5. Sutherland RM, Inch WR, McCredie JA, Kruuv J (1970) A multi-com-

ponent radiation survival curve using an in vitro tumour model. Int J

Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med 18: 491-495

6. Sutherland RM, Durand RE (1976) Radiation response of multicell

spheroids — an in vitro tumour model. Curr Top Radiat Res Q 11: 87-

139

7. Lin RZ, Chang Hy (2008) Recent advances in three-dimensional multi-

cellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J 3: 1172-

1184

8. Lin RZ, Chou LF, Chien CC, Chang Hy (2006) Dynamic analysis of

hepatoma spheroid formation: roles of E-cadherin and beta1-integrin.

Cell Tissue Res 324: 411-422

9. Robinson EE, Zazzali KM, Corbett SA, Foty RA (2003) Alpha5beta1

integrin mediates strong tissue cohesion. J Cell Sci 116: 377-386

10. Klopocka W, Baranska J (2005) The role of Rho family proteins in con-

trolling the migration of crawling cells. Postepy Biochem 51: 36-43

11. Sodek KL, Ringuette MJ, Brown TJ (2009) Compact spheroid forma-

tion by ovarian cancer cells is associated with contractile behavior and

an invasive phenotype. Int J Cancer 124: 2060-2070

12. Salvatori L, Caporuscio F, Verdina A, Starace G, Crispi S, Nicotra MR,

Russo A, Calogero RA, Morgante E, Natali PG, Russo MA, Petrange-

li E (2012) Cell-to-cell signaling influences the fate of prostate cancer

stem cells and their potential to generate more aggressive tumors.

PLoS One 7: e31467

13. Bao B, Jiang J, yanase T, Nishi y, Morgan JR (2011) Connexon-media-

ted cell adhesion drives microtissue self-assembly. FASEB J 25: 255-264

14. Walenta S, Doetsch J, Mueller-Klieser W, Kunz-Schughart LA (2000)

Metabolic imaging in multicellular spheroids of oncogene-transfected

fibroblasts. J Histochem Cytochem 48: 509-522

15. Milotti E, Chignola R (2010) Emergent properties of tumor microenvi-

ronment in a real-life model of multicell tumor spheroids. PLoS One 5:

e13942

16. Westhoff MA, Zhou S, Bachem MG, Debatin KM, Fulda S (2008) Iden-

tification of a novel switch in the dominant forms of cell adhesion-me-

diated drug resistance in glioblastoma cells. Oncogene 27: 5169-5181

17. Cottin S, Ghani K, de Campos-Lima PO, Caruso M (2010) Gemcitabine

intercellular diffusion mediated by gap junctions: new implications for

cancer therapy. Mol Cancer 9: 141

18. Hirschhaeuser F, Menne H, Dittfeld C, West J, Mueller-Klieser W,

Kunz-Schughart LA (2010) Multicellular tumor spheroids: an undere-

stimated tool is catching up again. J Biotechnol 148: 3-15

19. Dufau I, Frongia C, Sicard F, Dedieu L, Cordelier P, Ausseil F, Ducom-

mun B, Valette A (2012) Multicellular tumor spheroid model to evalu-

ate spatio-temporal dynamics effect of chemotherapeutics: application

to the gemcitabine/CHK1 inhibitor combination in pancreatic cancer.

BMC Cancer 12: 15

20. Khaitan D, Chandna S, Arya MB, Dwarakanath BS (2006) Establish-

ment and characterization of multicellular spheroids from a human

glioma cell line; Implications for tumor therapy. J Transl Med 4: 12

21. Vinci M, Gowan S, Boxall F, Patterson L, Zimmermann M, Court W,

Lomas C, Mendiola M, Hardisson D, Eccles SA (2012) Advances in es-

tablishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based

functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biol

10: 29

22. Robertson FM, Ogasawara MA, ye Z, Chu K, Pickei R, Debeb BG, Wo-

odward WA, Hittelman WN, Cristofanilli M, Barsky SH (2010) Ima-

ging and analysis of 3D tumor spheroids enriched for a cancer stem

cell phenotype. J Biomol Screen 15: 820-829

23. Rybak AP, He LZ, Kapoor A, Cutz JC, Tang D (2011) Characteriza-

tion of sphere-propagating cells with stem-like properties from DU145

prostate cancer cells. Biochim Biophys Acta 1813: 683-694

24. Wei B, Han Xy, Qi CL, Zhang S, Zheng ZH, Huang y, Chen TF, Wei

HB (2012) Coaction of spheroid-derived stem-like cells and endothe-

lial progenitor cells promotes development of colon cancer. PLoS One

7: e39069

25. Ponting C, Jackson AP (2005) Evolution of primary microcephaly ge-

nes and the enlargement of primate brains. Curr Opin Genet Dev 15:

241-248

26. Pellegatta S, Poliani PL, Corno D, Menghi F, Ghielmetti F, Suarez-Me-

rino B, Caldera V, Nava S, Ravanini M, Facchetti F, Bruzzone MG, Fi-

nocchiaro G (2006) Neurospheres enriched in cancer stem-like cells are

highly effective in eliciting a dendritic cell-mediated immune response

against malignant gliomas. Cancer Res 66: 10247-10252

27. Debeb BG, Zhang X, Krishnamurthy S, Gao H, Cohen E, Li L, Rodrigu-

ez AA, Landis MD, Lucci A, Ueno NT, Robertson F, Xu W, Lacerda L,

Buchholz TA, Cristofanilli M, Reuben JM, Lewis MT, Woodward WA

(2010) Characterizing cancer cells with cancer stem cell-like features in

293T human embryonic kidney cells. Mol Cancer 9: 180

28. Fang DD, Kim yJ, Lee CN, Aggarwal S, McKinnon K, Mesmer D,

Norton J, Birse CE, He T, Ruben SM, Moore PA (2010) Expansion of

CD133(+) colon cancer cultures retaining stem cell properties to enable

cancer stem cell target discovery. Br J Cancer 102: 1265-1275

29. Saadin K, White IM (2013) Breast cancer stem cell enrichment and iso-

lation by mammosphere culture and its potential diagnostic applica-

tions. Expert Rev Mol Diagn 13: 49-60

30. Guttilla IK, Phoenix KN, Hong X, Tirnauer JS, Claffey KP, White BA

(2012) Prolonged mammosphere culture of MCF-7 cells induces an

EMT and repression of the estrogen receptor by microRNAs. Breast

Cancer Res Treat 132: 75-85

31. yeung TM, Gandhi SC, Wilding JL, Muschel R, Bodmer WF (2010)

Cancer stem cells from colorectal cancer-derived cell lines. Proc Natl

Acad Sci USA 107: 3722-3727

32. Qi L, Bellail AC, Rossi MR, Zhang Z, Pang H, Hunter S, Cohen C, Mo-

reno CS, Olson JJ, Li S, Hao C (2011) Heterogeneity of primary gliobla-

stoma cells in the expression of caspase-8 and the response to TRAIL-

-induced apoptosis. Apoptosis 16: 1150-1164

33. May CD, Sphyris N, Evans KW, Werden SJ, Guo W, Mani SA (2011)

Epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cells: a dangero-

usly dynamic duo in breast cancer progression. Breast Cancer Res 13:

202

34. Polyak K, Weinberg RA (2009) Transitions between epithelial and

mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nat

Rev Cancer 9: 265-273

Postępy Biochemii 59 (3) 2013

313

35. Mani SA, Guo W, Liao MJ, Eaton EN, Ayyanan A, Zhou Ay, Brooks M,

Reinhard F, Zhang CC, Shipitsin M, Campbell LL, Polyak K, Brisken

C, yang J, Weinberg RA (2008) The epithelial-mesenchymal transition

generates cells with properties of stem cells. Cell 133: 704-715

36. Chen C, Wei y, Hummel M, Hoffmann TK, Gross M, Kaufmann AM,

Albers AE (2011) Evidence for epithelial-mesenchymal transition in

cancer stem cells of head and neck squamous cell carcinoma. PLoS

One 6: e16466

37. Giarnieri E, De Vitis C, Noto A, Roscilli G, Salerno G, Mariotta S, Ricci

A, Pierdonato B, Russo G, Laurenzi A, Giovagnoli MR, Ciliberto G,

Mancini R (2013) EMT markers in lung adenocarcinoma pleural effu-

sion spheroid cells. J Cell Physiol 228: 1720-1726

38. Borovski T, De Sousa EMF, Vermeulen L, Medema JP (2011) Cancer

stem cell niche: the place to be. Cancer Res 71: 634-639

39. Lock FE, McDonald PC, Lou y, Serrano I, Chafe SC, Ostlund C, Apari-

cio S, Winum Jy, Supuran CT, Dedhar S (2012) Targeting carbonic an-

hydrase IX depletes breast cancer stem cells within the hypoxic niche.

Oncogene

40. Soeda A, Park M, Lee D, Mintz A, Androutsellis-Theotokis A, McKay

RD, Engh J, Iwama T, Kunisada T, Kassam AB, Pollack IF, Park DM

(2009) Hypoxia promotes expansion of the CD133-positive glioma

stem cells through activation of HIF-1alpha. Oncogene 28: 3949-3959

41. Seidel S, Garvalov BK, Wirta V, von Stechow L, Schanzer A, Meletis K,

Wolter M, Sommerlad D, Henze AT, Nister M, Reifenberger G, Lunde-

berg J, Frisen J, Acker T (2010) A hypoxic niche regulates glioblastoma

stem cells through hypoxia inducible factor 2 alpha. Brain 133: 983-995

42. yang MH, Wu MZ, Chiou SH, Chen PM, Chang Sy, Liu CJ, Teng SC,

Wu KJ (2008) Direct regulation of TWIST by HIF-1alpha promotes me-

tastasis. Nat Cell Biol 10: 295-305

43. Schietke R, Warnecke C, Wacker I, Schodel J, Mole DR, Campean V,

Amann K, Goppelt-Struebe M, Behrens J, Eckardt KU, Wiesener MS

(2010) The lysyl oxidases LOX and LOXL2 are necessary and sufficient

to repress E-cadherin in hypoxia: insights into cellular transformation

processes mediated by HIF-1. J Biol Chem 285: 6658-6669

44. Osterholm C, Barczyk MM, Busse M, Gronning M, Reed RK, Kusche-

-Gullberg M (2009) Mutation in the heparan sulfate biosynthesis enzy-

me EXT1 influences growth factor signaling and fibroblast interactions

with the extracellular matrix. J Biol Chem 284: 34935-34943

45. Ksiazkiewicz M, Gottfried E, Kreutz M, Mack M, Hofstaedter F, Kunz-

-Schughart LA (2010) Importance of CCL2-CCR2A/2B signaling for

monocyte migration into spheroids of breast cancer-derived fibrobla-

sts. Immunobiology 215: 737-747

46. Ho DN, Kohler N, Sigdel A, Kalluri R, Morgan JR, Xu C, Sun S (2012)

Penetration of endothelial cell coated multicellular tumor spheroids by

iron oxide nanoparticles. Theranostics 2: 66-75

47. Calabrese C, Poppleton H, Kocak M, Hogg TL, Fuller C, Hamner B,

Oh Ey, Gaber MW, Finklestein D, Allen M, Frank A, Bayazitov IT, Za-

kharenko SS, Gajjar A, Davidoff A, Gilbertson RJ (2007) A perivascular

niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell 11: 69-82

48. Lonardo E, Frias-Aldeguer J, Hermann PC, Heeschen C (2012) Pancre-

atic stellate cells form a niche for cancer stem cells and promote their

self-renewal and invasiveness. Cell Cycle 11: 1282-1290

49. Klopp AH, Lacerda L, Gupta A, Debeb BG, Solley T, Li L, Spaeth E,

Xu W, Zhang X, Lewis MT, Reuben JM, Krishnamurthy S, Ferrari M,

Gaspar R, Buchholz TA, Cristofanilli M, Marini F, Andreeff M, Wo-

odward WA (2010) Mesenchymal stem cells promote mammosphere

formation and decrease E-cadherin in normal and malignant breast

cells. PLoS One 5: e12180

50. Gottfried E, Kunz-Schughart LA, Andreesen R, Kreutz M (2006) Brave

little world — Spheroids as an in vitro model to study tumor-immune-

-cell interactions. Cell Cycle 5: 691-695

51. Correa de Sampaio P, Auslaender D, Krubasik D, Failla AV, Skepper

JN, Murphy G, English WR (2012) A heterogeneous in vitro three di-

mensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting

angiogenesis. PLoS One 7: e30753

52. Kurosawa H (2007) Methods for inducing embryoid body formation:

in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng

103: 389-398

53. Baraniak PR, McDevitt TC (2012) Scaffold-free culture of mesenchy-

mal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage poten-

tial. Cell Tissue Res 347: 701-711

54. Kornblum HI (2007) Introduction to neural stem cells. Stroke 38: 810-

816

55. Debnath J, Muthuswamy SK, Brugge JS (2003) Morphogenesis and

oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-

-dimensional basement membrane cultures. Methods 30: 256-268

56. Mailleux AA, Overholtzer M, Brugge JS (2008) Lumen formation du-

ring mammary epithelial morphogenesis: insights from in vitro and in

vivo models. Cell Cycle 7: 57-62

57. Zhang y, yan W, Jung yS, Chen X (2012) Mammary epithelial cell po-

larity is regulated differentially by p73 isoforms via epithelial-to-me-

senchymal transition. J Biol Chem 287: 17746-17753

58. Plachot C, Chaboub LS, Adissu HA, Wang L, Urazaev A, Sturgis J,

Asem EK, Lelievre SA (2009) Factors necessary to produce basoapical

polarity in human glandular epithelium formed in conventional and

high-throughput three-dimensional culture: example of the breast epi-

thelium. BMC Biol 7: 77

59. Verayannont P, Hagg U, Wong RW, McGrath C, yeung S (2010) Asses-

sment of maxillary position. Implant vs cephalometric methods. Angle

Orthod 80: 876-883

60. Wang H, Lacoche S, Huang L, Xue B, Muthuswamy SK (2013) Rota-

tional motion during three-dimensional morphogenesis of mammary

epithelial acini relates to laminin matrix assembly. Proc Natl Acad Sci

USA 110: 163-168

61. Khan NA, Shacoori V, Havouis R, Querne D, Moulinoux JP, Rault B

(1995) Three dimensional culture of pineal cell aggregates: a model of

cell-cell co-operation. J Neuroendocrinol 7: 353-359

62. Gregoraszczuk EL (1990) The advantage of the aggregate culture of

isolated ovarian cell types over the monolayer culture. Cytotechnolo-

gy 4: 195-200

63. Shacoori V, Saiag B, Girre A, Rault B (1995) Stimulatory effect of perhe-

xiline maleate on the basal and LHRH-stimulated luteinizing hormone

release from rat pituitary cell aggregates in vitro. Res Commun Mol

Pathol Pharmacol 87: 115-123

64. Suga H, Kadoshima T, Minaguchi M, Ohgushi M, Soen M, Nakano T,

Takata N, Wataya T, Muguruma K, Miyoshi H, yonemura S, Oiso y,

Sasai y (2011) Self-formation of functional adenohypophysis in three-

-dimensional culture. Nature 480: 57-62

65. Lombaert IM, Brunsting JF, Wierenga PK, Faber H, Stokman MA, Kok

T, Visser WH, Kampinga HH, de Haan G, Coppes RP (2008) Rescue

of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated

glands. PLoS One 3: e2063

66. Ma M, Xu J, Purcell WM (2003) Biochemical and functional changes

of rat liver spheroids during spheroid formation and maintenance in

culture: I. morphological maturation and kinetic changes of energy

metabolism, albumin synthesis, and activities of some enzymes. J Cell

Biochem 90: 1166-1175

67. Chamuleau RA (2009) Future of bioartificial liver support. World J Ga-

strointest Surg 1: 21-25

68. Bolli R, Chugh AR, D’Amario D, Loughran JH, Stoddard MF, Ikram S,

Beache GM, Wagner SG, Leri A, Hosoda T, Sanada F, Elmore JB, Go-

ichberg P, Cappetta D, Solankhi NK, Fahsah I, Rokosh DG, Slaughter

MS, Kajstura J, Anversa P (2011) Cardiac stem cells in patients with

ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised

phase 1 trial. Lancet 378: 1847-1857

69. Makkar RR, Smith RR, Cheng K, Malliaras K, Thomson LE, Berman D,

Czer LS, Marban L, Mendizabal A, Johnston PV, Russell SD, Schuleri

KH, Lardo AC, Gerstenblith G, Marban E (2012) Intracoronary cardio-

sphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction

(CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet 379:

895-904

70. Tortelli F, Cancedda R (2009) Three-dimensional cultures of osteoge-

nic and chondrogenic cells: a tissue engineering approach to mimic

bone and cartilage in vitro. Eur Cell Mater 17: 1-14

314

www.postepybiochemii.pl

Three-dimensional cell cultures. Applications

in basic science and biotechnology

Radosław Kitel

, Joanna Czarnecka

, Aleksandra Rusin

2,

Department of Organic Chemistry, Bioorganic Chemistry and Biotechnology, Faculty of Chemistry, Silesian Technical University, 4 Krzywo-

ustego St., 44-100 Gliwice, Poland

Center for Translational Research and Molecular Biology of Cancer, Maria Sklodowska-Curie Memorial Cancer Center and Institute of Oncolo-

gy, Branch Gliwice, ul. Wybrzeze AK 15, 44-100 Gliwice, Poland



e-mail: arusin@io.gliwice.pl

Key words: 3D culture, three-dimensional culture, spheroids

AbSTRACT

The tissue culture technique is widely used in biochemical and molecular studies, offering accessibility to biological material, high reproduc-

ibility of results and high throughput format, comparing with organ cultures. however, traditional, two-dimensional cultures (2D cultures)

poorly represent the microenvironment of a tissue, and they are gradually replaced with 3D cultures, that enable formation of intercellular

contacts, signaling pathways and gene expression characteristic for tissue

in vivo. This paper presents the biology of three-dimensional cul-

tures (spheroids), their applications in basic science and biotechnology and methods of spheroids formation.

71. Brohem CA, Cardeal LB, Tiago M, Soengas MS, Barros SB, Maria-En-

gler SS (2011) Artificial skin in perspective: concepts and applications.

Pigment Cell Melanoma Res 24: 35-50

72. yu CB, Pan XP, Li LJ (2009) Progress in bioreactors of bioartificial li-

vers. Hepatobiliary Pancreat Dis Int 8: 134-140

73. Kim y, Rajagopalan P (2010) 3D hepatic cultures simultaneously ma-

intain primary hepatocyte and liver sinusoidal endothelial cell pheno-

types. PLoS One 5: e15456

74. Kajstura J, Rota M, Cappetta D, Ogorek B, Arranto C, Bai yN, Fer-

reira-Martins J, Signore S, Sanada F, Matsuda A, Kostyla J, Caballero

MV, Fiorini C, D’Alessandro DA, Michler RE, del Monte F, Hosoda T,

Perrella MA, Leri A, Buchholz BA, Loscalzo J, Anversa P (2012) Car-

diomyogenesis in the aging and failing human heart. Circulation 126:

1869-U1238

75. Kajstura J, Gurusamy N, Ogorek B, Goichberg P, Clavo-Rondon C,

Hosoda T, D’Amario D, Bardelli S, Beltrami AP, Cesselli D, Bussani

R, del Monte F, Quaini F, Rota M, Beltrami CA, Buchholz BA, Leri A,

Anversa P (2010) Myocyte turnover in the aging human heart. Circu-

lation Res 107: 1374-1386

76. Smith RR, Barile L, Cho HC, Leppo MK, Hare JM, Messina E, Gia-

comello A, Abraham MR, Marban E (2007) Regenerative potential of

cardiosphere-derived cells expanded from percutaneous endomy-

ocardial biopsy specimens. Circulation 115: 896-908

77. Leri A, Kajstura J, Anversa P (2011) Role of cardiac stem cells in cardiac

pathophysiology: a paradigm shift in human myocardial biology. Cir-

culation Res 109: 941-961

78. Davis DR, Zhang y, Smith RR, Cheng K, Terrovitis J, Malliaras K, Li

TS, White A, Makkar R, Marban E (2009) Validation of the cardiosphe-

re method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue.

PLoS One 4: e7195

79. Loughran JH, Elmore JB, Waqar M, Chugh AR, Bolli R (2012) Cardiac

stem cells in patients with ischemic cardiomyopathy: discovery, trans-

lation, and clinical investigation. Curr Atheroscler Rep 14: 491-503

80. Ho Wy, yeap SK, Ho CL, Rahim RA, Alitheen NB (2012) Development

of multicellular tumor spheroid (MCTS) culture from breast cancer cell

and a high throughput screening method using the MTT assay. PLoS

One 7: e44640

81. Kunz-Schughart LA, Schroeder JA, Wondrak M, van Rey F, Lehle K,

Hofstaedter F, Wheatley DN (2006) Potential of fibroblasts to regulate

the formation of three-dimensional vessel-like structures from endo-

thelial cells in vitro. Am J Physiol Cell Physiol 290: C1385-1398

82. Ivascu A, Kubbies M (2006) Rapid generation of single-tumor sphe-

roids for high-throughput cell function and toxicity analysis. J Biomol

Screen 11: 922-932

83. yoshii y, Waki A, yoshida K, Kakezuka A, Kobayashi M, Namiki H,

Kuroda y, Kiyono y, yoshii H, Furukawa T, Asai T, Okazawa H, Ge-

lovani JG, Fujibayashi y (2011) The use of nanoimprinted scaffolds as

3D culture models to facilitate spontaneous tumor cell migration and

well-regulated spheroid formation. Biomaterials 32: 6052-6058

84. Shin Jy, Park J, Jang HK, Lee TJ, La WG, Bhang SH, Kwon IK, Kwon

OH, Kim BS (2012) Efficient formation of cell spheroids using polymer

nanofibers. Biotechnology Lett 34: 795-803

85. Foty R (2011) A simple hanging drop cell culture protocol for genera-

tion of 3D spheroids. J Vis Exp 51: pii: 2720, doi: 10.3791/2720

86. Meng D, Erol M, Boccaccini AR (2010) Processing technologies for 3D

nanostructured tissue engineering scaffolds. Advanced Biomaterials

12: B467-B487

87. Harma V, Virtanen J, Makela R, Happonen A, Mpindi JP, Knuuttila M,

Kohonen P, Lotjonen J, Kallioniemi O, Nees M (2010) A comprehen-

sive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer

growth, invasion and drug responses. PLoS One 5: e10431

88. Sodunke TR, Turner KK, Caldwell SA, McBride KW, Reginato MJ,

Noh HM (2007) Micropatterns of Matrigel for three-dimensional epi-

thelial cultures. Biomaterials 28: 4006-4016

89. Nagai y, yokoi H, Kaihara K, Naruse K (2012) The mechanical stimu-

lation of cells in 3D culture within a self-assembling peptide hydrogel.

Biomaterials 33: 1044-1051

90. Nagayasu A, yokoi H, Minaguchi JA, Hosaka yZ, Ueda H, Takehana

K (2012) Efficacy of self-assembled hydrogels composed of positively

or negatively charged peptides as scaffolds for cell culture. J Biomater

Appl 26: 651-665

91. Knight E, Murray B, Carnachan R, Przyborski S (2011) Alvetex(R): po-

lystyrene scaffold technology for routine three dimensional cell cultu-

re. Methods Mol Biol 695: 323-340

92. Ahn SH, Lee HJ, Puetzer J, Lawrence J, Geun B, Kim H (2012) Fabrica-

tion of cell-laden three-dimensional alginate-scaffolds with an aerosol

cross-linking process. J Mater Chem. 22: 18735-18740

93. Parenteau-Bareil R, Gauvin R, Berthod F (2010) Collagen-Based Bio-

materials for Tissue Engineering Applications. Materials 3: 1863-1887

94. Danesin R, Brun P, Roso M, Delaunay F, Samouillan V, Brunelli K,

Iucci G, Ghezzo F, Modesti M, Castagliuolo I, Dettin M (2012) Self-

assembling peptide-enriched electrospun polycaprolactone scaffolds

promote the h-osteoblast adhesion and modulate differentiation-asso-

ciated gene expression. Bone 51: 851-859