1) Technika mikroskopowa
* stanowi podstawowe narzędzie badań struktur komórkowych
* nie umożliwia uzyskania dokładnych informacji o składzie chemicznym i funkcjach organelli komórkowych
2) Metody i techniki pracy sprawdzone w fizyce, chemii i medycynie, wykorzystywane do badania komórek i tkanek
* delikatne rozbijanie komórek lub tworzenie za pomocą detergentów porów w błonie komórkowej (w ten drugi sposób uwalniane są
białka czy DNA bez zniszczenia komórek)
* uzyskuje się wówczas homogenat – zawiesinę komórkową
* techniki frakcjonowania – techniki rozdzielania zawartości komórek
* ultrawirówka – urządzenia stosowane w technikach frakcjonowania, w którym badane próbki poddaje się działaniu siły odśrodkowej
* poszczególne organelle różnią się masą i gęstością, więc stosuje się wirowanie różnicowe, tzn. ze wzrastającą szybkością (do 100tys
obrotów/min) i w określonym czasie
- najcięższe organelle opadają na dno próbówki, tworząc osad
- ponad nimi pozostaje roztwór, który po przelaniu do następnej próbówki nadal poddawany jest wirowaniu
* uzyskane frakcje komórkowe można dalej oczyszczać za pomocą wirowania równowagowego w gradiencie gęstości
- osad do wirowania nanosi się (nawarstwia) na powierzchnię odpowiedniego roztworu (np. fikolu o zróżnicowanym stężeniu), rosnącym w
kierunku dna próbówki i następnie wiruje
- podczas wirowania w gradiencie gęstości składniki komórki wędrują do rejonów o gęstości, która jest równa ich własnej, tworząc tam
pasma zawierające oczyszczone frakcje
* frakcje zbiera się oddzielnie i poddaje dalszym badaniom
3) autoradiografia – pozwala na kontrolowanie przebiegu reakcji po uprzednim oznakowaniu radioizotopami uczestniczących w niej
związków
* substancje promieniotwórcze występują w organizmie w ilościach śladowych i jeśli zostaną wprowadzone do organizmu, wbudowuje je on
do swoich związków chemicznych
* przemiany RNA
- aby śledzić przemiany RNA w komórkach embrionalnych (zarodkowych), można inkubować komórki z radioaktywnym
prekursorem tego związku, znakowanym np. izotopem wodoru
3
H
- po inkubacji materiał poddaje się rutynowej technice histologicznej: sporządza się skrawki, umieszcza na szkiełkach podstawowych,
preparaty pokrywa się emulsją fotograficzną zawierającą AgBr i pozostawia w ciemności (nawet na kilka miesięcy)
- w tym czasie promieniowanie emitowane przez izotop promieniotwórczy trafia na AgBr i powoduje pojawienie się w nim metalicznego
srebra
- po wywołaniu autoradiogramu można np. dokładnie określić lokalizację „promieniotwórczego” RNA w komórce albo rozpoznać określone
sekwencje DNA
- przy zastosowaniu bardzo cienkich skrawków można oglądać autoradiogramy pod mikroskopem elektronowym
4) chromatografia – metoda pozwalająca rozdzielać jednorodne mieszaniny związków, np. białek, aminokwasów lub barwników
asymilacyjnych
- wykorzystuje się siły oddziaływania rozdzielanych składników z fazą ruchomą i nieruchomą
* chromatografia bibułkowa
- stosowana np. w rozdzielaniu barwników roślinnych
- ekstrakt barwników, uzyskiwany przez roztarcie (np. w moździerzu) liści wybranej rośliny z odpowiednim rozpuszczalnikiem
(np. alkoholem), stanowi mieszaninę składników, które należy rozdzielić
- bibuła chromatograficzna to faza nieruchoma (stacjonarna), a mieszanina rozpuszczalników (np. eteru i benzenu lub benzyny i
benzenu) to faza ruchoma
- na bibułę chromatograficzną nanosi się w linii startu przesączony ekstrakt barwników i całość suszy
- do szklanego naczynia (komory chromatograficznej) wlewa się mieszaninę rozpuszczalników (układ rozwijający), przykrywa i zostawia
- po wysyceniu wnętrza komory chromatograficznej oparami rozpuszczalników umocowuje się w niej pasek bibuły, zanurzając go poniżej linii
startu w układzie rozwijającym
- mieszanina rozpuszczalników wsiąka w bibułę dzięki jej woskowatości i unosi się ku górze, a wraz z nią przemieszczają się barwniki
- szybkość przemieszczania się barwników jest różna
- barwnik najłatwiej rozpuszczalny i najsłabiej absorbowany przez bibułę przesuwa się najszybciej, co w efekcie prowadzi do rozdzielenia
wszystkich barwników na pasku bibuły
- zajmują one określone miejsca na chromatografie
- stężenie barwników można mierzyć na powierzchni, jaką zajmują na pasku bibuły, a przede wszystkim można je ekstrahować (robić
wyciąg) z bibuły za pomocą czystego rozpuszczalnika i poddać dalszej analizie
* chromatografia kolumnowa
* chromatografia cienkowarstwowa
5) elektroforeza – metoda rozdzielania jednorodnych mieszanin
- możliwa do zastosowania w polu elektrycznym – dzięki wędrującym cząsteczkom obdarzonym ładunkiem elektrycznym
- wykorzystuje się ją głównie do rozdzielania i oczyszczania mieszanin białek, aminokwasów i kwasów nukleinowych (w warunkach, w
których sumaryczny ładunek elektryczny cząsteczek jest różny od zera)
* immunoelektoforeza
* elektroforeza bibułowa
* elektroforeza żelowa – znalazła szerokie zastosowanie w medycynie klinicznej w analizie białek osocza krwi i badaniach odchyleń od
normy tych związków
BIOFIZYCZNE I BIOCHEMICZNE METODY BADANIA KOMÓREK
