WYBRANE ZAGADNIENIA Z ENZYMOLOGII
Z ELEMENTAMI BIOCHEMII
DLA STUDENTÓW II ROKU STUDIÓW
NIESTACJONARNYCH II-GO STOPNIA
część II
α
α
α
α
-amylaza
Magdalena Zielińska-Dawidziak
Dorota Piasecka-Kwiatkowska
Poznań 2006
Regulamin pracowni
1. W pracowni należy zachować ostrożność, porządek i czystość.
2. W pracowni należy nosić bezpieczne obuwie i fartuch laboratoryjny, a przy pracy
z substancjami szkodliwymi rękawiczki gumowe. Okrycia wierzchnie należy
pozostawić w szatni.
3. Opuszczając stanowisko należy sprawdzić czy wszystkie niepotrzebne urządzenia
elektryczne, gaz i woda zostały wyłączone, drobny sprzęt odłożony na miejsce,
a użyte naczynia laboratoryjne umyte i odłożone do suszenia.
4. Studenci nie mogą pracować w pracowni bez opieki pracownika dydaktycznego.
5. W pracowni nie wolno palić tytoniu, spożywać posiłków i napojów, aplikować
kosmetyków.
6. Odczynniki należy przechowywać w odpowiednim porządku. Nie wolno trzymać
żadnych substancji w nieopisanych naczyniach. Łatwopalne rozpuszczalniki, a także
stężone kwasy i zasady można przechowywać w pracowniach pod wyciągiem tylko
w ilościach zaspokajających bieżące potrzeby.
7. Prace z rozpuszczalnikami organicznymi należy prowadzić przy sprawnie działającej
wentylacji. Podczas pracy nie wolno używać otwartego ognia.
8. Prace z kwasami i zasadami należy prowadzić pod sprawnie działającym wyciągiem
chemicznym.
9. Nigdy nie należy pipetować ustami substancji trujących, żrących i innych szkodliwych
dla zdrowia.
10. Odpadów substancji w ilościach, które mogą stanowić zagrożenia dla środowiska
naturalnego nie wolno wylewać do zlewów. Należy je zlewać do szczelnych
podpisanych butelek i przechowywać pod wyciągiem, skąd okresowo będą usuwane.
11. Odpady innych stężonych substancji można wylewać do zlewu po ich znacznym
rozcieńczeniu, obficie spłukując wodą z kranu.
12. Okna w pracowni można tylko uchylać w pozycji pionowej.
13. W razie zaistnienia nawet najmniejszego wypadku niezwłocznie powiadomić
opiekującego się pracownią pracownika dydaktycznego.
ĆWICZENIE 1
Wstęp
Metody izolacji i oczyszczania enzymów
Wykonanie szybkiej i wydajnej izolacji enzymu wymaga spełnienia kilku podstawowych
warunków:
♦ Wybór dobrego źródła enzymu (tkanki roślinne, zwierzęce, komórki
mikroorganizmów), przy zwróceniu uwagi na:
• łatwość i wydajność separacji interesującego enzymu
• dostępność oraz koszt uzyskania surowca
• właściwości otrzymywanego enzymu (np. enzymy o dużej termostabilności
musimy izolować najczęściej z organizmów termofilnych)
Obecnie coraz częściej w celu uzyskania potrzebnych białek doprowadza się do
ich nadprodukcji w komórkach bakteryjnych, drożdżowych lub w hodowlach komórek
ssaczych. Otrzymane w ten sposób białka nazywane są białkami rekombinowanymi.
Zaletą tych technik jest możliwość otrzymania dużej ilości potrzebnego białka, a jego
oczyszczanie do homogenności jest stosunkowo proste.
♦ Zachowanie warunków pozwalających na otrzymanie enzymu bez utraty jego
aktywności katalitycznej, tj. :
• utrzymanie odpowiedniej temperatury (najczęściej ok. 0
o
C) i pH (najczęściej
w granicach 5-9),
• ograniczenie denaturacji powierzchniowej (tj. pienienia roztworów) oraz
inaktywacji przez metale ciężkie
• zabezpieczenie przed działaniem proteaz
• zapewnienia wysokiej czystości pracy, aby nie doprowadzać do wtórnego
zanieczyszczenia proteazami i innymi substancjami hamującymi aktywność
(p.w.)
Dla każdego enzymu powinno się zastosować indywidualny schemat oczyszczania
wykorzystujący jego własności fizykochemiczne.
Pierwszym krokiem przy oczyszczaniu białek jest przeprowadzenie ich do roztworu,
chyba że izolujemy je z płynnego źródła (np. z krwi, śliny itp.). Stosuje się w tym celu
techniki doprowadzające do zniszczenia ścian, błon komórkowych lub struktury całych
komórek, takie jak: degradacje ścian komórkowych przez lizozym, rozrywanie komórek pod
wpływem ciśnienia osmotycznego, sonifikację (pękanie komórek pod wpływem wibracji
wywołanych ultradźwiękami) oraz homogenizację, rozcieranie z piaskiem lub perełkami
szklanymi i inne metody mechaniczne.
Enzymy rozpuszczalne łatwo poddają się procesowi ekstrakcji wodą lub
rozcieńczonymi roztworami soli i buforami. Natomiast związane z błonami wymagają użycia
roztworów detergentów lub rozpuszczalników organicznych, które rozpuszczają lipidy.
Dalsze metody stosowane w celu otrzymania preparatu enzymatycznego są bardzo
różnorodne i ich stosowanie zależy od aktualnego i pożądanego stopnia oczyszczenia
enzymu.
Najczęściej stosowanymi wstępnymi procesami oczyszczania są:
♦ frakcjonowanie roztworami soli (np. siarczanem amonu)
♦ ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi (np. etanolem, acetonem lub eterem).
Metody te opierają się na odciąganiu wody z roztworów koloidalnych, jakie tworzą białka
(w tym enzymy). Ponieważ białka są cząsteczkami zawierającymi rożne ilości grup
kwasowych i zasadowych, ich rozpuszczalność zależy od stężenia rozpuszczonej soli,
polarności i pH rozpuszczalnika oraz temperatury. Dlatego pewne białka wypadają
z roztworu, podczas gdy inne w tych samych warunkach nadal tworzą roztwór koloidalny.
Przez odpowiedni dobór stężenia soli odwadniających można przeprowadzić ich stopniowe
wytrącanie, np. odwodnienie globulin nastąpi już przy 50 %-wym wysyceniu roztworu
siarczanem amonu, a albumin dopiero przy całkowitym wysyceniu roztworu siarczanem
amonu.
Mieszające się z wodą rozpuszczalniki organiczne, takie jak etanol czy aceton, obniżają
zdolność działania wody jako rozpuszczalnika, dzięki czemu bardzo dobrze strącają białka.
Mieszaninie z wodą w różnych proporcjach pozwalają na wybiórcze strącanie białek. Proces
ten należy prowadzić w temperaturze 0
o
C lub niższej, ponieważ w wyższych temperaturach
nastąpi ich denaturacja.
Otrzymane osady białkowe oddzielane są metodami filtracji lub wirowania. Następnie są
rozpuszczane, a w przypadku wykorzystywania procesów wysalania mogą być poddawane
dializie.
Dializę stosuje się w celu usunięcia niskocząsteczkowych związków (np. soli) z roztworu
białka, umieszczonego wewnątrz półprzepuszczalnej membrany. Na zewnątrz znajduje się
roztwór o niskiej sile jonowej. Niskocząsteczkowe substancje, dążąc do wyrównania ciśnień
osmotycznych po obu stronach membrany dializacyjnej, migrują przez nią do otaczającego
roztworu.
Kolejnymi
etapami,
stosowanymi
dla
dalszego
oczyszczania
preparatów
enzymatycznych, mogą być:
♦ chromatografia
♦ elektroforeza
♦ ultrawirowanie
Współczesne
procesy
oczyszczania
bardzo
często
bazują
na
technikach
chromatograficznych. W każdej z nich mieszanina rozdzielanych substancji jest rozpuszczana
w ciekłym lub gazowym nośniku, nazywanym fazą ruchomą. Otrzymany roztwór migruje
przez stałą matrycę (fazę stałą), która powiązana jest w zależności od typu chromatografii
z różnymi ciekłymi lub stałymi substancjami, pozwalającymi na separację rozpuszczonych
składników.
Przy oczyszczaniu białek najczęściej wykorzystujemy chromatografię kolumnową.
Kolumna to rurka szklana, plastikowa lub metalowa wypełniona złożem (faza stacjonarna)
równoważonym buforem o odpowiednim składzie jonowym i pH. Mieszaninę rozdzielanych
białek wprowadzamy na kolumnę w buforze fazy ruchomej. Im większa zdolność
oddziaływania białka z fazą stacjonarną tym wolniej przesuwa się ono przez kolumnę. Białka
są eluowane (wymywane) z kolumny kolejnymi porcjami buforu w zależności od siły ich
oddziaływań ze złożem – najsłabiej reagujące pojawią się w eluacie jako pierwsze, najsilniej
– jako ostatnie.
W zależności od rodzaju stałej i ruchomej fazy wyróżniamy różne typy
chromatografii, np. w chromatografii cieczowej fazy stanowią dwie niemieszające się ciecze,
z których jedna związana z nieruchomym nośnikiem stanowi fazę nieruchomą, a druga fazę
ruchomą. Ponieważ różnice pomiędzy rozdzielanymi związkami dotyczą wielu ich
właściwości (hydrofobowości, rozpuszczalności w wybranych rozpuszczalnikach, kształtu
cząsteczek itd.), wśród metod chromatograficznych wykorzystywanych w procesach
oczyszczania wyróżniamy:
♦ chromatografię wymiany jonowej – wykorzystuje różnice w sumarycznym ładunku na
powierzchni białka
♦ chromatografię adsorpcyjną – opartą na różnicach współczynnika adsorpcji adsorbenta
w stosunku do poszczególnych składników mieszaniny
♦ chromatografię podziałową – wykorzystuje różnice współczynników podziału
składników mieszaniny pomiędzy dwie niemieszające się fazy
♦ sączenie molekularne (chromatografia sitowa) – rozdziela cząsteczki w zależności od
ich kształtu i wielkości
♦ chromatografię afinitywną – opartą na sile powinowactwa cząsteczek białka do
ligandu wiązanego z fazą stałą. Jest to szczególny typ chromatografii powinowactwa.
Szczególnymi przypadkami tej chromatografii są:
chromatografia kowalencyjna – wykorzystująca zdolność związków
zawierających grupy tiolowe do wiązania z grupami tiolowymi złoża
chromatografia chelatująca – oparta na zdolności odwracalnego wiązania metali
przez białka.
chromatografia oddziaływań hydrofobowych – wykorzystująca różnicę sił
oddziaływań białek z bardzo hydrofobowymi ligandami związanymi z
nośnikiem. Należy przy tym pamiętać, że duże stężenia soli stosowane w trakcie
wysalania powodują wzrost hydrofobowości oczyszczanych białek.
Chromatografia fazy odwróconej – nie znajduje praktycznie zastosowania w
preparatywnym oczyszczaniu enzymów, ponieważ wymaga stosowania
niepolarnych rozpuszczalników (denaturujących cząsteczkę) do elucji białek
związanych z silnie hydrofobowym ligandem.
Dokładnie z technikami chromatograficznymi zapoznali się państwo na ćwiczeniach
„Wykorzystanie wybranych metod do rozdziału i oznaczania form koenzymatycznych
witamin z grupy B”.
Duże znaczenie w procesach oczyszczania białek mają techniki elektroforetyczne.
Podobnie jak metody chromatograficzne mają one zastosowanie w przypadku wykonywania
badań analitycznych (np. określania stopnia czystości izolowanych enzymów) jak i badań
preparatywnych, wykonywanych w celu oczyszczenia białka.
W metodzie tej roztwory białek migrują w polu elektrycznym ze stałą
i charakterystyczną w danych warunkach szybkością uzależnioną od ich sumarycznego
ładunku, a także kształtu i wielkości cząsteczek oraz lepkości (lub porowatości) nośnika. Im
większa masa cząsteczkowa białka tym wolniej porusza się w polu elektrycznym, im bardziej
naładowane – tym szybciej. Jeżeli białko w danych warunkach przyjmuje ładunek ujemny,
migruje do anody.
Wśród metod elektroforetycznych wyróżniamy:
♦ elektroforezę bibułową (omawianą na ćwiczeniach „Wykorzystanie wybranych metod
do rozdziału i oznaczania form koenzymatycznych witamin z grupy B”)
♦ elektoroforezę żelową (w żelu poliakrylamidowym lub agarozowym,)
♦ elektroforezę swobodną (bez nośnika).
Obecnie najczęściej stosuje się elektroforetyczny rozdział białek zależny tylko od ich
masy cząsteczkowej. Polega on na rozdziale białek w żelu poliakrylamidowym z SDS (SDS-
PAGE). SDS (dodecylosiarczan sodu) jest detergentem anionowym denaturującym
i opłaszczającym białko, nadając mu ładunek ujemny. W związku z tym że w obecności SDS
wszystkie białka mają ładunek ujemny, to szybkość migracji w żelu zależy wyłącznie od ich
wielkości, ponieważ pory otrzymywanego żelu pełnią funkcję sita. Najczęściej dodatkowo
przeprowadza się redukcję wiązań dwusiarczkowych i w wyniku tego poszczególne łańcuchy
polipeptydowe białka migrują oddzielnie.
Białka na ogół są bezbarwne. W związku z tym po przeprowadzonym rozdziale żel
trzeba zabarwić, aby uwidocznić obecne na nim białka. W tym celu stosuje się najczęściej
barwienie błękitem Coomasiego lub związkami srebra, rzadziej znaczniki fluorescencyjne lub
autoradiografię.
Żel poliakrylamidowy wykorzystuje się szczególnie jako nośnik w elektroforezie
analitycznej do oceny czystości preparatu, wyznaczania masy cząsteczkowej (przez
porównanie z wielkością białek wzorcowych) i liczby podjednostek polipeptydowych.
Jednak zastosowanie elektroforezy w żelu poliakrylamidowym w wydaniu
preparatywnym pozwala często na otrzymanie wysoko oczyszczonego preparatu białkowego.
Najczęściej wykonuje się wtedy tzw. elektroforezę natywną, w której białko nie podlega
denaturacji (bez SDS, działania wysokiej temperatury). Metoda ta jednak nie pozwala na
oznaczenie mas cząsteczkowych i stwierdzenie homogenności białek, ponieważ białka
różniące się masą cząsteczkową z jednakowym ładunkiem nie zostaną rozdzielone.
Zmiana nośnika w elektroforezie żelowej (np. zamiana poliakrylamidu na agarozę)
najczęściej podyktowana jest wielkością rozdzielanych cząsteczek, ponieważ usieciowanie
poliakrylamidu, które pozwalałoby na rozdział białek o masie >200 kDa, jest tak słabe, że
operowanie takim żelem jest zbyt trudne. Dodatkowo żel agarozowy pozwala na rozdział
białek nieróżniących się wielkością, lecz kształtem.
Rys.1. Schemat ilustrujący budowę aparatu i zasadę prowadzenia elektroforezy pionowej
(A) oraz przykład elektroforezy SDS-PAGE, wykonanej dla białek ekstrahowanych
z różnych tkanek zwierzęcych i ryb (B).
Aktywność enzymatyczną pasm białkowych uzyskanych w wyniku elektroforezy
określa się na podstawie zymogramów. Za pomocą tej metody można określić masę
cząsteczkową oraz występowanie izoenzymów w preparatach.
Zymogramy wykonać można się w różny sposób
elektroforezę białek prowadzi się w żelu zawierającym substrat rozdzielanego
enzymu, a następnie żel barwi się barwnikiem mającym powinowactwo do
substratu
wykonuje się odcisk żelu uzyskanego w wyniku rozdziału elektroforetycznego na
drugi żel zawierający substrat oznaczanego enzymu; następnie barwi drugiego żel
w substancji dającej barwne połączenia z substratem
Pasma białkowe wykazujące aktywność enzymatyczną rozkładają substrat znajdujący
się w żelu uwalniając produkty nie wiążące się z barwnikiem. Po wybarwieniu widoczne są
w postaci przejaśnień na ciemnym tle.
W
ostatnich
latach
jako
technika
rozdziału
białek
znaczenia
nabiera
elektrochromatografia (elektroforeza kapilarna), która jest kombinacją elektroforezy
i chromatografii. Ruch cząsteczek jest wynikiem zarówno działania mechanicznego
A
B
przepływu rozpuszczalnika, jak i działania sił elektrycznych. Metoda ta ma tylko analityczne
znaczenie.
Kolejną techniką pozwalającą na izolację enzymów (a także innych białek, kwasów
nukleinowych, fragmentów komórkowych) jest ultrawirowanie.
Wirowanie prowadzone przy niskich przeciążeniach (zazwyczaj do 20 000xg)
stosowane jest do rozdzielania niehomogennych płynów (np. oddzielania osadu wysolonych
białek od roztworu pozostałych). Ultrawirowanie wykorzystuje znacznie wyższe przeciążenia
(nawet powyżej 600 000 xg). W przypadku stosowania ultrawirowania w celach
preparatywnych zazwyczaj prowadzi się ten proces w obecności substancji, która pozwala na
otrzymanie gradientu gęstości. W obecności CsCl lub sacharozy gęstość roztworu wzrasta od
powierzchni do dna naczyń wirówkowych, co pozwala na zwiększenie wydajności rozdziałów
prowadzonych metodami ultrawirowania.
Przy omawianiu technik separacji białek należy wspomnieć o ich krystalizacji. Jest to
metoda, dzięki której można otrzymać białka w najczystszej i homogennej formie. Niestety
bardzo często proces ten należy prowadzić z roztworów białek o wysokim stopniu
oczyszczenia. Białko może krystalizować w obecności substancji strącających omawianych
powyżej, w czasie od kilku minut do kilku miesięcy. Otrzymane kryształy mogą mieć
wielkość od mikroskopowej do 1 mm. Otrzymanie kryształu nie daje gwarancji czystości
białka i jednocześnie wiele białek o wysokim stopniu oczyszczenia nie poddaje się procesowi
krystalizacji.
Proces oczyszczania enzymów wymaga ciągłej kontroli zarówno jakościowej
(wzrastająca czystość białka), jak i ilościowej (badanie stężenia interesującego enzymu i/lub
jego
aktywności).
Kontrolę
jakościową
wykonuje
się
wykorzystując
techniki
elektroforetyczne
(zwłaszcza
SDS-PAGE).
Do
oznaczania
stężenia
enzymów
wykorzystywane są natomiast zazwyczaj techniki spektrofotometryczne, takie jak:
♦ metoda Whitakera i Granuma - pomiar stężenia białka w ultrafiolecie opiera się na
założeniu, że w białkach enzymatycznych zawartość tyrozyny i tryptofanu, które
wykazują maksimum absorpcji w 280 nm jest stała
♦ metoda Bradforda - wykorzystuje zdolność wiązania błękitu Coomasiego
z białkiem dzięki oddziaływaniom elektrostatycznym
♦ metoda Lowry’ego - oparta na zdolności aminokwasów aromatycznych do
redukcji jonów Mo
6+
/W
6+
, a wiązań peptydowych do kompleksowania miedzi
♦ metoda biuretowa
♦ metoda z kwasem BCA (bis-cynchoninowym)
Oznaczanie aktywności enzymów wykonuje się w oparciu o ich zdolności
katalityczne. Analizuje się szybkość ubytku substratu lub tworzenia produktu w danej
temperaturze i przy znanym początkowym stężeniu substratu reakcji.
Monitorowanie procesu izolacji i oczyszczania enzymów pozwala na wykonanie
bilansów białka.
Bilans białka ogólnego (całkowitego stężenia białka w roztworze) opisuje jaką część
białka ogólnego stanowi oczyszczany enzym i ile białka odrzuca się na poszczególnych
etapach oczyszczania. Natomiast bilans aktywności informuje o wzroście aktywności enzymu
w roztworach na poszczególnych etapach oczyszczania, a co się z tym wiąże zagęszczaniu
enzymu i usuwaniu jego inhibitorów. Najlepszy obraz uzyskuje się przy zestawieniu obu
bilansów, czyli porównanie zmian aktywności do zmian stężenia białka ogólnego podczas
procesów oczyszczania.
Otrzymywanie ekstraktów α-amylazy.
1\ Materiały i odczynniki
materiały: słód jęczmienny
trzustka wieprzowa
odczynniki:
(1) 1 mM CaCl
2
(2) 1 mM CaCl
2
w 20 mM CH
3
COONa
(3) krystaliczny (NH
4
)
2
SO
4
(4) bufor uniwersalny:
dla amylazy trzustkowej o pH 7,0
dla amylazy zbożowej o pH 5,5
(5) odczynnik Bradforda
1A\ Ekstrakcja α-amylazy z trzustki wieprzowej.
Pokroić 1 g trzustki wieprzowej. Odmierzyć w cylindrze 40 ml roztworu 1 mM CaCl
2
(1) i dodać około 30 ml do odważonej trzustki.
Homogenizować 6 razy po 30 s z przerwami po około 30 s. Opłukać nóż
homogenizatora pozostałymi 10 ml roztworu 1 mM CaCl
2
(1). Odwirować przez 15 min przy
9000g w temp. 4
o
C. Klarowny płyn zdekantować, zmierzyć jego objętość. Uzupełnić do 40
ml roztworem 1 mM CaCl
2
(1).
Otrzymany roztwór jest ekstraktem, który stanowi podstawę do otrzymywania
preparatu α-amylazy wieprzowej. Pobrać z niego 5 ml, opisać pobraną próbkę jako roztwór
A1 i przechować w 4
o
C.
1B\ Ekstrakcja α-amylazy ze słodu.
Do 2 g zmielonego słodu dodać 40 ml roztworu 1 mM CaCl
2
w 20 mM CH
3
COONa
(2). Wytrząsać przez 15 min, a następnie odwirować przez 15 min przy 9000g w temp. 4
o
C.
Klarowny płyn zdekantować, zmierzyć jego objętość. Uzupełnić do 40 ml roztworem 1 mM
CaCl
2
w 20 mM CH
3
COONa (2).
Otrzymany roztwór jest ekstraktem, który stanowi podstawę do otrzymywania
preparatu α-amylazy słodowej. Pobrać z niego 5 ml, opisać pobraną próbkę jako roztwór A2
i przechować w 4
o
C.
2\ Oczyszczanie α-amylazy przez wysalanie
Do 35 ml otrzymanych ekstraktów dodawać stopniowo (np. po 1 łyżeczce)
krystaliczny (NH
4
)
2
SO
4
(3) do otrzymania roztworu 1,5 M (NH
4
)
2
SO
4
, czyli 6,93 g. Mieszać
na mieszadle magnetycznym przez 20 min. Następnie odwirować przez 10 min przy 9000g
w temp. 4
o
C.
Klarowny roztwór zdekantować i zmierzyć jego objętość. Uzupełnić do 35 ml 1 mM
CaCl
2
(1) (dla amylazy trzustkowej) lub 1 mM CaCl
2
w 20 mM CH
3
COONa (2) (dla amylazy
słodowej). Pobrać próbkę o objętości 5 ml, opisać jako roztwór „B” i przechować w temp.
4
o
C. Osad odrzucić.
Do pozostałej części roztworu dodawać stopniowo krystaliczny (NH
4
)
2
SO
4
(3), tak aby
jego końcowe stężenie wyniosło 4 M (10 g na 30 ml ml roztworu). Mieszać na mieszadle
magnetycznym przez 35 min i ponownie odwirować przez 10 min przy 9000g w temp. 4
o
C.
Zlać supernatant, zmierzyć jego objętość. Pobrać 5 ml i opisać próbkę jako roztwór
„C”, przechować w temp. 4
o
C, a pozostałą część supernatantu odrzucić.
Otrzymany osad wysolonych białek rozpuścić w 20 ml buforu uniwersalnego
odpowiedniego dla danego enzymu. Pobrać próbkę o objętości 5 ml, opisać jako roztwór „D”.
Pozostałą część roztworu opisać jako α-amylaza trzustkowa lub słodowa i zamrozić
w porcjach po 5 ml.
Zamrożony materiał będzie wykorzystywany do wykonania kolejnych ćwiczeń.
3\ Oznaczanie stężenia białka ogólnego metodą Bradforda
Oznaczenie stężenia białka ogólnego w roztworach wykonywane będzie dla
roztworów: A otrzymanego podczas ekstrakcji α-amylazy (punkt 1A\ lub1B\) oraz roztworów
B-D otrzymanych podczas wykonywania procedury wysalania (punkt 2).
Do 10 probówek (ustawionych w dwóch rzędach) odmierzyć po 5 ml odczynnika
Bradforda (5). Do dwóch dodać po 100 µl roztworu A, do kolejnych dwóch po 100 µl
roztworu B itd. Do 9- i 10-ej, które stanowić będą próbą zerową, dodać 100 µl wody
destylowanej. Zmierzyć absorbancję próbek wobec próby zerowej przy długości fali
λ=495 nm. Z krzywej wzorcowej odczytać stężenia białka w otrzymanym roztworze.
4\ Obliczenia
Wykonać bilans białka otrzymywanego na poszczególnych etapach otrzymywania
roztworów amylazy oraz obliczyć, jaka jest zawartość białka w 10 µl próbek A-D.
Do kolejnych ćwiczeń przechować w temp. –18
o
C próbki wskazane przez
prowadzącego ćwiczenia.
ĆWICZENIE 2
Immobilizacja enzymów
Enzymy są biokatalizatorami, które charakteryzuje:
♦ wysoka specyficzność działania
♦ kierunkowość działania
♦ zdolność do obniżania w istotny sposób energii aktywacji reakcji chemicznych.
Dzięki temu znalazły szerokie zastosowanie w wielu gałęziach przemysłu
spożywczego, farmaceutycznego, kosmetycznego, chemicznego i w analityce medycznej.
Często jednak stosowanie enzymów w formie natywnej wiąże się z wysokimi kosztami
prowadzenia procesów, szczególnie wtedy gdy konieczne jest stosowanie preparatu
enzymatycznego o wysokim stopniu oczyszczenia, jak np. w farmacji, a także wówczas gdy
proces prowadzony jest cyklicznie. Dlatego od 60-ych lat XX wieku coraz większym
zainteresowaniem cieszą się enzymy immobilizowane.
Pierwszą technologią, która wykorzystała unieruchomiony biokatalizator, była
mikrobiologiczna produkcja kwasu octowego. Dziś stosuje się unieruchamianie zarówno
pojedynczych enzymów, kompleksów dwóch lub większej ilości enzymów, jak i całych
komórek czy struktur komórkowych.
Najczęściej stosowanymi metodami unieruchamiania enzymów są:
A\ Metody z wykorzystaniem oddziaływań fizycznych
• immobilizacja oparta na adsorpcji i adhezji, które wykorzystują siły jonowe,
wiązania wodorowe, oddziaływania van der Waalsa i inne słabe oddziaływania
fizykochemiczne do związania enzymu z nośnikiem, takim jak: drewno,
celuloza, polimery syntetyczne, antracyt, tlenki metali, szkło porowate, ziemia
okrzemkowa, węgiel aktywny, pumeks czy jonity (DEAE-Sephadex, CM-
celuloza itp.)
• pułapkowanie
biokatalizatora
wewnątrz
struktury
naturalnych
lub
syntetycznych polimerów; przykładowymi nośnikami są: agar, alginian,
kolagen, poliakrylamid, poliuretan, polistyren, żywice sieciowane energią
świetlną
• immobilizacja z wykorzystaniem półprzepuszczalnych membran lub układów
fazowych,
gdzie
membrana
lub
granica
faz
stanowi
przegrodę
uniemożliwiającą migrację enzymu
o zamykanie w komórkach naturalnych, np. w erytrocytach
o kapsułkowanie i mikrokapsułkowanie (liposomy, kapsułki nylonowe,
polimocznikowe, pochodne celulozowe)
o zamykanie pomiędzy półprzepuszczalnymi membranami lub w wężach
(np. silikonowych, nylonowych)
• pułapkowanie we włóknach (włókna z octanu celulozy)
B\ Metody z wykorzystaniem oddziaływań chemicznych
• immobilizacja poprzez tworzenie wiązań kowalencyjnych (peptydowego,
estrowego, węgiel-węgiel, węgiel-azot i in.); nośniki i odczynniki wiążące to
np.: hydroksyalkilometakrylan - aldehyd glutarowy, CM-celuloza –
karbodiimid, szkło porowate lub silikażel – aldehyd glutarowy, a także:
diaminy, kwasy dikarboksylowe, bromocyjan, izomocznik
• unieruchamianie bez makroskopowego nośnika mechanicznego, np.
sieciowanie
przestrzenne,
kopolimeryzacja
enzymów
z
nośnikami
rozpuszczalnymi przy użyciu odczynników dwufunkcyjnych) oraz sieciowanie
kryształów i agregatów białek enzymatycznych (enzym pełni rolę matrycy i
biokatalizatora)
Zaletami metod fizycznych jest zachowanie struktury enzymu oraz łatwość i niski
koszt przeprowadzenia procesu immobilizacji. Często jednak następuje wymywanie
biokatalizatora ze złoża, zwłaszcza w przypadku stosowania prostej adsorpcji białka na
powierzchni matrycy.
Metody chemiczne zapewniają stabilność układu, ale w wielu przypadkach wiąże się
to z częściową utratą aktywności enzymu, spowodowaną zmianą konformacji białka.
Wiązanie kowalencyjne z nośnikiem jest łatwą metodą i daje stabilny układ, lecz jest
kosztowne. Pułapkowanie w żelu jest tanie, ale nie można stosować go do enzymów
hydrolitycznych, działających na substraty wielkocząsteczkowe, czyli mogących degradować
żel. Kapsułkowanie stosuje się przede wszystkim w farmacji, jest jednak trudne w kontroli
i znajduje zastosowanie jedynie do przemian niskocząsteczkowych, podobnie jak membrany
półprzepuszczalne. Natomiast wzajemne sieciowanie jest łatwe i tanie, zapewnia dużą
aktywność i stabilność chemiczną, jednak przy tym niską stabilność mechaniczną.
Przydatność immobilizowanego biokatalizatora zależy od wielu czynników, które
przedstawiono na poniższym schemacie.
Rys.1. Czynniki wpływające na przydatność immobilizowanego biokatalizatora w
procesach przemysłowych.
Podstawowym parametrem technologicznym, który pozwala ocenić celowość
stosowania wybranej metody immobilizacji, jest stabilność operacyjna enzymu. Określa ona
czas pracy, po którym zachodzi utrata połowy początkowej aktywności biokatalizatora.
W czasie procesu technologicznego immobilizowany biokatalizator stopniowo traci
swoją produktywność, co spowodowane jest:
Enzym
Nośnik
Właściwości biochemiczne
Typ i kinetyka reakcji
Charakterystyka chemiczna
Właściwości mechaniczne
Metoda
immobilizacji
Opory ruchu
masy
[η]
Stabilność
operacyjna
[liczba cykli]
Produktywność
[kg produktu/U enzymu]
♦ wymywaniem enzymu ze złoża oraz rozpuszczaniem się lub ścieraniem matrycy
♦ utratą aktywności na skutek zatruwania lub denaturacji enzymu
♦ pogorszeniem się warunków kontaktu substratu z enzymem w wyniku
zanieczyszczenia i zatkania się porów złoża lub mechanicznego zgniatania
matrycy
♦ zanieczyszczeniem mikrobiologicznym
Wady stosowania immobilizacji enzymów są następujące:
♦ wysoki koszt, związany głównie z otrzymaniem czystego preparatu
enzymatycznego
♦ utrata aktywności wywołana zmianą warunków fizykochemicznych środowiska,
w porównaniu do warunków, jakie panowały wewnątrz komórki przed izolacją
♦ utrata aktywności podczas prowadzenia procesu immobilizacji (w tym ilościowe
straty enzymu)
Większość wyżej wymienionych wad można usunąć przez dobór prawidłowej metody
immobilizacji dla potrzeb konkretnego procesu technologicznego.
Zalety unieruchamiania enzymów:
♦ immobilizacja może stabilizować strukturę białek, dzięki czemu zwiększona jest
ich termostabilność i odporność na działanie czynników denaturujących
♦ możliwość stosowania enzymów w środowisku organicznym
♦ łatwe oddzielenie od mieszaniny reakcyjnej po zakończeniu procesu, dzięki czemu
otrzynujemy produkt o wysokiej czystości
♦ możliwość wielokrotnego wykorzystywania biokatalizatora
♦ ograniczenie inhibicji enzymu, zarówno przez substrat jak i przez produkt, podnosi
wydajność procesu biokatalizy
♦ możliwość pracy w systemach ciągłych (np. z wykorzystaniem reaktora
przepływowego)
Tabela 1. Przemysłowe zastosowanie unieruchomionych enzymów.
Enzym
Zastosowanie
izomeraza glukozowa
przemysł spożywczy
(przetwórstwo skrobii)
glukoamylaza
przemysł spożywczy
(przetwórstwo skrobii)
lipaza
przemysł spożywczy
(produkcja tłuszczów jadalnych)
inwertaza
przemysł spożywczy
(produkcja cukru inwertowanego)
termolizyna
przemysł spożywczy
(produkcja aspartamu)
amidaza penicylinowa
przemysł farmaceutyczny
(produkcja kwasu 6-
aminopenicylanowego – półproduktu do
produkcji penicylin półsyntetycznych)
β-tyrozynaza
przemysł farmaceutyczny
(produkcja L-DOPA)
nitrylaza
przemysł chemiczny
(produkcja akrylamidu)
Należy przy tym pamiętać, że immobilizowane katalizatory w porównaniu do ich form
natywnych mogą mieć zmienione pewne właściwości, takie jak optymalne pH i temperatura
działania, kinetykę katalizowanej reakcji, a nawet specyficzność substratową. Zmiany te
w pewnych warunkach mogą być bardzo pożądane, natomiast w innych mogą stanowić wadę
procesu immobilizacji.
Przykłady przemysłowego zastosowania immobilizowanych enzymów przedstawia
tabela 1.
Ogólna charakterystyka amylaz
Wśród enzymów katalizujących konwersję skrobi wyróżniamy:
• endoamylazy (amylazy dekstrynujące, tzw. α-amylazy), rozcinające
przypadkowo
wewnętrzne
wiązania
α,1-4
glikozydowe
amylozy
i amylopektyny. Wskutek działania α-amylazy silnie spada lepkość produktów
skrobiowych, gdyż rozkłada ona skrobię do α-dekstryn o małych
cząsteczkach, oligosacharydy o różnej długości łańcucha w konfiguracji
α w tym niewielkiej ilość maltozy
• egzoamylazy (amylazy scukrzające), rozkładające skrobię od końca łańcucha.
Wśród nich wyróżnia się β-amylazy, które rozkładają wyłącznie wiązanie
α, 1-4 glikozydowe lub takie, które rozkładają zarówno wiązanie α,1-4-, jak
i α,1-6 glikozydowe (amyloglukozydazy i glukoamylazy).
W wyniku działania β-amylazy powstają dekstryny o dużych cząsteczkach,
tzw. amylodekstryny oraz znaczna ilość maltozy. β-amylazy nie hydrolizują
nieuszkodzonych ziarenek skrobi (np. roztarcie lub zgniecenie ziarenek skrobi
podczas przemiału zwiększa ich podatność na działanie tego enzymu).
Glukoamylaza rozkłada dlugołańcuchowe polisacharydy do glukozy,
a glukozydaza – maltooligosacharydy
• enzymy rozkładające wyłącznie wiązanie α,1-6 glikozydowe: izoamylaza
i pullulanaza typu I
• transferazy rozcinające wiązanie α,1-4 i przenoszące uzyskany w wyniku
rozkładu sacharydu fragment do glikozydowego akceptora z utworzeniem
nowego wiązania glikozydowego
Amylazy są olbrzymią rodziną enzymów, które wykazują katalityczną aktywność
w stosunku do wiązania glikozydowego skrobi i produktów jej rozpadu. Zostały
zakwalifikowane do trzech grup na podstawie różnic w ich strukturze.
W przemyśle znaczącą rolę odgrywają przede wszystkim α-amylazy, począwszy od
przemysłu spożywczego, fermentacyjnego, lekkiego, a skończywszy na papierniczym.
Żródłem enzymów dla tych przemysłów mogą być zarówno rośliny (w tym przede
wszystkim ziarniaki zbóż), jak i mikroorganizmy. Chociaż technologia żywności jest również
zainteresowana amylazami zwierzęcymi, które należą do grupy enzymów trawiennych
człowieka, zwierząt hodowlanych i szkodników magazynowych, nie zostaną jednak one bliżej
zaprezentowane.
Enzymy amylolityczne ziarna
Enzymy amylolityczne ziarna znajdują się głównie w warstwie bielma przylegającej
bezpośrednio do warstwy komórek aleuronowych, oraz w tarczce ziarna. Warstwa komórek
aleuronowych i okrywa owocowo-nasienna nie zawierają amylaz.
α- i β- amylazy roślinne mają odmienne optymalne warunki działania, tj. temperaturę
i pH środowiska. α-amylaza jest najbardziej aktywna w środowisku mało kwaśnym (pH 4,7 –
5,0) i w temp. 51 – 66
o
C, natomiast β-amylaza jest aktywniejsza w środowisku bardziej
kwaśnym, ale w niższej temperaturze (48 – 51
o
C).
Zawartość enzymów w normalnym ziarnie jest niewielka (szczególnie brak α-amy-
lazy). Natomiast w ziarnie porośniętym zawartość i aktywność tych enzymów jest bardzo
duża, co powoduje nadmierny rozkład skrobi i daje chleb o złej strukturze miękiszu, tj. lepki i
z zakalcem.
Wszystkie α-amylazy zbożowe są aktywne do 70
o
C, powyżej tej temperatury ulegają
dezaktywacji. Znaczenie amylaz w technologii zbóż jest duże przy produkcji pieczywa, a
także przy produkcji piwa. β-amylaza jest czynnikiem katalizującym rozkład skrobi do
cukrów niezbędnych podczas fermentacji. Od jej aktywności zależy w głównej mierze siła
fermentacyjna mąki, warunkująca odpowiednie spulchnienie pieczywa. Przy niesprzyjających
warunkach pogodowych podczas zbioru zbóż, ziarno w skutek podwyższonej wilgotności
może kiełkować już na polu w snopkach lub później w magazynie, jeśli uprzednio nie zostało
podsuszone. Zachodzi w tym przypadku zjawisko tzw. porastania, przy czym zostaje
uaktywniona α-amylaza. Porośnięcie w początkowej jego fazie może nie być widoczne gołym
okiem i może być wykazane tylko metodą chemiczną (tzw. porost ukryty). W późniejszym
stadium porośnięcie jest już widoczne w postaci kiełka.
Mikrobiologiczne amylazy
Ze względu na koszt, wydajność produkcji i możliwość uzyskania enzymów o
pożądanych właściwościach kinetycznych na coraz większą skalę prowadzone są badania nad
amylazami wydzielanymi przez mikroorganizmy. Źródłem tych enzymów mogą być pleśnie,
drożdże, bakterie i promieniowce, jednak przemysłowe zastosowanie znajdują głównie
amylazy pleśniowe i bakteryjne.
W tabeli 2 dla zobrazowania zróżnicowania amylaz wytwarzane przez drobnoustroje
przedstawiono wybrane właściwości kilku amylaz wytwarzanych przez mikroorganizmy.
Amylazy wytwarzane przez drobnoustroje znalazły zastosowanie w przemyśle piekarniczym i
cukierniczym (w tym także dodatkowo jako czynnik zapobiegający czerstwieniu), przy
produkcji syropów maltozowych i glukozowych, w przemyśle fermentacyjnym, owocowo-
warzywnym (klaryfikacja soków), lekkim (wpływają na prawidłowe zaginanie włókien),
papierniczym (produkcja papieru powlekanego skrobią), paszowym (wstępna hydroliza
składników pasz), jako składnik detergentów i w analityce medycznej oraz farmacji.
Źródło
M.
cz.
[kDa]
Optymalne
pH
Optymalna
temperatura
inhibitory
stabilizatory
A. avamori
A. usamii
B. licheniformis
B. subtilis
Pseudomonas stutzeri
Streptococcus bovis
Pyrococcus furiossus
54,0
54,0
28,0
48,0
12,5
77,0
b. danych
4,8-5,0
3,0-5,5
9,0
6,5
8,0
5,0-6,0
b. danych
50
o
C
60- 70
o
C
90
o
C
50
o
C
47
o
C
50
o
C
130
o
C
Hg
2+
, Pb
2+
, maltoza
-
Hg
2+
, Cu
2+
, Ni
2+
, Zn
2+
Hg
2+
, Fe
3+
, Al
3+
-
Hg
2+
, kwas chlorortę-
ciowobenzoesowy
jony metali
Skrobia
-
Na
2+
, Ca
2+
, azydek, F
-
Mn
2+
, Co
2+
Ca
2+
-
Ca
2+
Tab. 2. Porównanie właściwości
α
-amylaz produkowanych przez wybrane
mikroorganizmy.
Analiza elektroforetyczna oraz identyfikacja enzymów amylolitycznych.
Odczynniki
(1) Roztwór obciążający:
20% sacharoza
0,1% błękit bromofenolowy w buforze Tris-glicyna, pH 9,1
(2) Bufor rozwijający: 0,05 M bufor Tris-glicynowy pH 9,1
(3) Barwnik z błękitem brylantowym Coomasiego : lodowaty kwas octowy (9,07 %)
metanol (45,43 %)
woda
redest.
(45,43 %)
błękit brylantowy Coomasiego (0,091%)
(4) Odbarwiacz: lodowaty kwas octowy (9,09 %)
metanol (45,45 %)
woda
redest.
(45,45 %)
(5) 1% roztwór skrobi
(6) 0,2 M bufor octanowy pH 5,5
(7) Roztwór I w KI (0,3% I
2
w 3% KI)
1\ Przygotowanie próbek
Rozmrozić i rozcieńczyć wskazane przez prowadzącego ćwiczenia próbki
(z ćwiczenia 1), tak aby 10 µl roztworu zawierało 5-7,5 µg białka. Pobrać 10 µl próbki, dodać
10 µl roztworu obciążającego (1), dokładnie wymieszać.
2\ Nanoszenie próbek i rozdział elektroforetyczny
Ze spolimeryzowanego żelu usunąć grzebień i dokładnie przepłukać powstałe
studzienki buforem rozwijającym (2). Napełnić naczynie elektrodowe buforem rozwijającym
(2), umieścić w nim statyw z żelami i nanieść do studzienek za pomocą mikropipety próbki
w kolejności ustalonej z prowadzącym ćwiczenie.
Aparat do elektroforezy złożyć i prowadzić rozdział elektroforetyczny przy napięciu
120 V do wyjścia barwnika z żelu.
3\ Wybarwianie żelu i prowadzenie reakcji enzymatycznej
Żele wyjąć z aparatu. Pierwszy żel, poddawany analizie elektroforetycznej w celu
scharkteryzowania składu białkowego analizowanych roztworów, zanurzyć na 20 min
w barwniku z błękitem brylantowym (3), a następnie odbarwiać, płucząc kolejnymi porcjami
odbarwiacza (4).
Drugą część żelu inkubować 15 min w temp. 30
o
C na szalce Petriego w buforze
octanowym (6). Następnie zanurzyć w 1%-owym roztworze skrobi (5) i inkubować w temp.
20
o
C przez 20 min. Żel umieścić w roztworze I w KI (7) na około 20 s. Po tym czasie
przepłukać wodą.
4\ Podsumowanie
Zlokalizować enzymy amylolityczne i przedstawić graficznie ich położenie na
schemacie zymogramu. Zinterpretować stopień oczyszczenia amylazy w poszczególnych
próbkach i na poszczególnych etapach oczyszczania. Wyznaczyć współczynniki Rf dla
enzymów amylolitycznych.
Immobilizacja amylazy
.
1\ Odczynniki
(8) 1,5 % CaCl
2
(9) 4 % alginian sodu
2\ Przygotowanie preparatu zimmobilizowanej α
α
α
α
- amylazy
Na mieszadle magnetycznym umieścić zlewkę z 500 ml 1,5% CaCl
2
. W 50 ml zlewce
zmieszać 5 ml otrzymanego preparatu α- amylazy z 5 ml 4%-go roztworu alginianu sodu
(odmierzyć strzykawką). Pobrać 5 ml otrzymanej mieszaniny do strzykawki i umocować w
statywie nad zlewką z CaCl
2
. Powoli wkrapiać mieszaninę do roztworu CaCl
2
, ustalając
prędkość mieszania ok. 500 obr/min. Pozostawić na mieszadle przez 30 min, następnie
oddzielić na sitku zimmobilizowaną α- amylazę. Przepłukać najpierw pod silnym
strumieniem wody bieżącej, następnie kilka razy wodą destylowaną, w celu usunięcia z
powierzchni nośnika niezwiązanego enzymu.
Oznaczyć aktywność enzymu imobilizowanego i wolnego.
Oznaczanie aktywności α
α
α
α
- amylazy w otrzymanych preparatach
1\ Odczynniki
(10) bufor uniwersalny:
dla amylazy trzustkowej o pH 7,0
dla amylazy zbożowej o pH 5,5
(11) kleik skrobiowy (odczynnik do samodzielnego przygotowania)
(12) DNS
1\ Przygotowanie kleiku skrobiowego
Odmierzyć 100 ml odpowiedniego buforu (10). Odważyć 1 g skrobi i przygotować
zawiesinę w ok. 10 ml buforu (10), 80 ml buforu (10) zagotować. Do wrzącego buforu wlać
zawiesinę skrobiową, przepłukać zlewkę od zawiesiny pozostałą częścią buforu, zagotować i
szybko schłodzić otrzymany 1 % kleik skrobiowy (11).
2\ Oznaczanie aktywności enzymu wolnego
Przygotować rozcieńczenie enzymu 1:24, mieszając w kolbie miarowej 1 ml
otrzymanego preparatu enzymatycznego „D” z 24 ml buforu uniwersalnego (10)
o odpowiednim dla danego enzymu pH.
Z rozcieńczenia pobrać 100 µl roztworu i dodać do 1000 µl 1% skrobi (13). Zamieszać
i inkubować przez 5 min w temp. 35
o
C. W ten sam sposób przygotować próbę zerową,
zamiast enzymu dodając wodę. Próby wykonać w dwóch powtórzeniach.
Reakcję zatrzymać przez dodanie 1000 µl DNS (12) i ogrzewanie we wrzącej łaźni wodnej
przez 5 min. Gwałtownie schłodzić próbki i dodać po 10 ml H
2
O
dest
. Odczytać absorbancję
przy 530 nm.
3\ Oznaczanie aktywności enzymu immobilizowanego
Otrzymany preparat immobilizowanej w alginianie sodu amylazy zważyć. Obliczyć
jaka część zimmobilizowanego preparatu (w gramach) zawiera 100 µl wyjściowego roztworu
enzymu. Odważyć taką ilość zimmobilizowanego preparatu (z dokładnością do 0,01 g,
w dwóch powtórzeniach). Odważone porcje umieścić w kolbach stożkowych 50-cm
3
, dodać
25 ml 1% skrobi (13). Zamieszać i inkubować przez 5 min w temp. 35
o
C.
Reakcję zatrzymać poprzez przeniesienie po 1000 µl próbki do probówek
zawierających po 1000 µl DNS (12) oraz 5-minutowe ogrzewanie we wrzącej łaźni wodnej.
Gwałtownie schłodzić próbki i dodać po 10 ml H
2
O
dest
. Odczytać absorbancję przy 530 nm
wobec poprzednio przygotowanej próby zerowej.
7\ Obliczenia.
Wyznaczyć aktywność α- amylazy, przyjmując jako jednostkę aktywności (JAA) ilość
maltozy (µM) uwolnionej podczas 1-minutowej hydrolizy 1 %-owej skrobi prowadzonej
w temp. 35
o
C przy odpowiednim dla danego enzymu pH.
JAA=
5
1
558
,
0
1
100
1000
1
1
×
×
×
=
×
×
×
E
t
Em
Vpr
V
E
gdzie:
V – objętość, w której wyrażamy aktywność enzymu (1000 µl)
V pr – objętość próbki enzymu (100 µl)
t – czas inkubacji (5 min)
E – odczytana wartość ekstynkcji
Em – wartość ekstynkcji dla 1 µM maltozy
Obliczyć stratę aktywności amylazy podczas immobilizacji na 1 ml otrzymanego
preparatu enzymatycznego.
Ćwiczenie 3
Aktywność enzymu
Charakterystyczną cechą wszystkich enzymów jest ich specyficzność działania i duża
aktywność katalityczna. Przyspieszają reakcje chemiczne co najmniej milionkrotnie, a przy
ich braku reakcje te zachodziłyby tak wolno, że praktycznie niezauważalnie. Enzymy
obniżają wymaganą ilość energii aktywacji, dzięki czemu zwiększa się szybkość reakcji.
Wpływają jedynie na takie procesy chemiczne, które są termodynamicznie możliwe,
przyspieszając osiągnięcie stanu końcowej równowagi chemicznej, do którego dąży dana
reakcja. Jednocześnie działają specyficznie zarówno pod względem rodzaju katalizowanej
reakcji, jak i substratów.
Ogólny schemat reakcji katalizowanej przez enzym jest następujący:
E+S ES E+P
1. Enzym łączy się z substratem w miejscu nazywanym centrum aktywnym enzymu,
tworząc przejściowy, nietrwały kompleks enzym-substrat. Następują wówczas
przesunięcia w układzie elektronów zgrupowanych dookoła określonych wiązań
chemicznych w substracie, sprzyjające rozluźnieniu tych wiązań, dlatego substrat staje się
bardziej aktywny.
2. Kompleks enzym-substrat rozpada się, czemu towarzyszy powstawanie produktów reakcji
i zregenerowanie enzymu.
Zdolność katalityczna enzymu, czyli jego aktywność, wyraża wzrost szybkości rekcji
w ściśle określonych warunkach. Zazwyczaj szybkość reakcji jest wyrażana jako zmiana
stężenia substratu lub produktu w jednostce czasu [mol/( l
x
s)].
Jednostką aktywności enzymatycznej stosowaną w układzie SI jest katal. Odpowiada
on przekształceniu 1 mola substratu lub wytworzenia 1 mola produktu w ciągu 1s.
Standardowo stosowaną jednostką jest jednak międzynarodowa jednostka aktywności
enzymu (IU). Jest to taka ilość enzymu, która katalizuje przemianę jednego µM substratu
w ciągu jednej minuty w temperaturze 30
o
C w standardowych warunkach (1 IU = 16,7 nkat).
Na szybkość przebiegu reakcji enzymatycznej wpływają:
♦ temperatura
♦ pH
♦ siła jonowa
♦ stężenie substratu
♦ stężenie enzymu
♦ obecność aktywatorów
♦ obecność inhibitorów
Wpływ temperatury na aktywność enzymów
Wzrost temperatury zwiększa szybkość reakcji enzymatycznych, ale tylko w pewnym
zakresie. Ponieważ enzym jest substancją białkową, wzrost temperatury powyżej temperatury
optymalnej dla jego działania powoduje stopniową denaturację i zanik zdolności
katalitycznych.
Optymalna temperatura dla działania enzymów zależy od ich pochodzenia, np. dla
enzymów zwierzęcych zbliżona jest do temperatury ciała.
Wpływ odczynu środowiska na aktywność enzymów.
Do utrzymania aktywności katalitycznej enzymy wymagają odpowiedniego odczynu pH
środowiska. Dla większości enzymów optymalne jest pH 5,5 – 7,4. Znane są jednak enzymy,
które działają najlepiej w środowisku kwaśnym (np. pepsyna w pH 1,5 – 2,7) lub zasadowym
( trypsyna, chymotrypsyna – pH 8 – 9 ).
Środowisko silnie kwaśne i silnie zasadowe z reguły działa denaturująco, niszcząc
nieodwracalnie aktywność enzymów. Niewielkie zmiany pH nie dezaktywują enzymu, ale
obniżają szybkość reakcji, ponieważ wpływając na stopień jonizacji enzymu i substratu,
zmieniają warunki tworzenia się kompleksu enzym-substrat.
Dla większości enzymów optymalne jest środowisko obojętne lub słabo kwaśne.
Rys. 2. Wpływ temperatury i pH środowiska na aktywność enzymu.
Wpływ stężenia substratu i stężenia enzymu na szybkość reakcji enzymatycznej
Szybkość reakcji enzymatycznych opisuje równanie Michaelisa – Menten:
]
[
]
[
max
S
Km
S
V
V
+
×
=
gdzie: K
m
– stała Michaelisa, równa takiemu stężeniu substratu [S], przy którym szybkość
reakcji V jest połową szybkości maksymalnej V
max
.
Stała Michaelisa stanowi wartość charakterystyczną dla danego enzymu w odpowiednich
warunkach pH i temperatury. Określa powinowactwo enzymu do substratu. Znając wartość
K
m
można tak dobierać stężenie substratu, aby osiągnąć stan nasycenia enzymu substratem.
Wpływ aktywatorów i inhibitorów na aktywność enzymów
Enzymy mogą podlegać zarówno inhibicji, jak i aktywacji przez różne specyficzne
cząsteczki lub jony. Ma to szczególnie istotne znaczenie dla kontroli fizjologicznej ich
Temperatura (
o
C)
enzym
zdenaturowany
wzrost
aktywności
denaturacja
aktywny
enzym
udział
Wpływ temperatury i pH środowiska na aktywność enzymu
udział
działania w układach biologicznych. W ten sam sposób działa również wiele leków
i czynników toksycznych.
Jak już wspomniano, aktywność enzymu w organizmie podlega kontroli
fizjologicznej. Niektóre z enzymów są syntezowane w postaci nieczynnych prekursorów
i ulegają aktywacji w pożądanym czasie oraz miejscu, np. enzym trawienny – trypsyna
syntezowana jest w trzustce jako trypsynogen, a jako czynny enzym pojawia się w jelicie
cienkim dopiero po hydrolizie wiązania peptydowego.
Enzymy mogą również podlegać modyfikacji kowalencyjnej. Aktywność jest
wówczas regulowana przez przyłączenie małej grupy chemicznej do cząsteczki enzymu
Większość enzymów wymaga dla zachowania swojej aktywności aktywatorów.
Aktywatorami nazywamy związki niskocząsteczkowe, których obecność w miejscu katalizy
enzymatycznej przyspiesza przebieg reakcji. Aktywatorami enzymów mogą być jony metali
(np. Mn
2+
, Co
2+
, Zn
2+
), aniony współdziałające z białkami (np. Cl
-
), a także związki
regulujące potencjał oksydoredukcyjny środowiska, od których zależy budowa centrów
aktywnych.
Substancje hamujące działanie enzymów to inhibitory reakcji enzymatycznych.
Inhibicja cząsteczki enzymu może zachodzić pod wpływem małych cząsteczek lub jonów,
zarówno nieodwracalnie jak i odwracalnie.
W inhibicji nieodwracalnej inhibitor wiąże się kowalencyjnie z enzymem tak silnie, że
jego dysocjacja jest bardzo powolna (np. działanie gazów paraliżujących na układ nerwowy)
W inhibicji odwracalnej szybko osiągany jest układ enzym-inhibitor. Podstawowe
typy odwracalnej inhibicji, to:
♦ Inhibicja kompetycyjna, kiedy inhibitor jest podobny do substratu i wiąże się
w miejscu aktywnym enzymu, blokując wiązanie substratu. Wówczas inhibitor
współzawodniczy z enzymem o centrum aktywne. Często taki typ inhibicji
występuje, gdy produkt reakcji jest podobny do substratu. Wówczas reakcja
enzymatyczna hamowana jest przez produkt.
♦ Inhibicja niekompetycyjna, kiedy inhibitor wiąże się z cząsteczką enzymu
w innym miejscu niż centrum aktywne enzymu. Wtedy następuje zmiana
konformacji enzymu, która pociąga za sobą zmianę konformacji centrum
aktywnego.
W ćwiczeniu ostatnim z cyklu analizowana będzie aktywność wyizolowanych
i oczyszczonych amylaz oraz wpływ różnorodnych, wyżej wymienionych czynników na ich
aktywność.
Metody oznaczania aktywności amylaz opierają się najczęściej na wyznaczaniu ilości
cukrów redukujących, powstających podczas hydrolizy skrobi. Wykorzystuje się w tym celu
reakcję z kwasem 3,5-dinitrosalicylowym (DNS), który w obecności cukrów redukujących
przekształcany jest do kwasu 3-amino-5-nitrosalicylowego, tworząc barwne kompleksy
z fenolem. Pomiar absorbancji następuje przy długości fali λ= 530 nm. Stężenie cukrów
redukujących odczytuje się z krzywej wzorcowej sporządzonej dla glukozy.
Badanie wpływu temperatury, pH, inhibitorów, aktywatorów, czasu
przechowywania na aktywność enzymu.
1\ Odczynniki
(1)
bufor uniwersalny:
dla amylazy trzustkowej o pH 7,0
dla amylazy zbożowej o
pH 5,5
(2)
1% roztwór skrobi (odczynnik do samodzielnego przygotowania)
(3)
DNS
(4)
bufor uniwersalny z 20 mM Cl
-
(jako CaCl
2
)
(5)
bufor uniwersalny z 4 mM mocznikiem
(6)
0,2 M Na
2
HPO
4
(7)
0,1 M kwas cytrynowy
(8)
roztwór I w KI (0,3% I
2
w 3% KI)
(9)
roztwór 1% NaCl
2\ Przygotowanie kleiku skrobiowego
Odmierzyć 50 ml odpowiedniego buforu (1). Odważyć 0,5 g skrobi i przygotować
zawiesinę w ok. 5 ml buforu (1), 40 ml buforu (1) zagotować. Do wrzącego buforu wlać
zawiesinę skrobiową, przepłukać zlewkę od zawiesiny pozostałą częścią buforu, zagotować
i szybko schłodzić otrzymany 1 % kleik skrobiowy (2).
3\ Bilans aktywności dla wykonanego procesu oczyszczania
Rozmrozić próbkę A, B, C i D. Próbki A, B i D rozcieńczyć 10 razy, dodając do 1 ml
roztworu enzymu 9 ml odpowiedniego dla danego enzymu buforu (1). Próbki C nie
rozcieńczać.
Z otrzymanych rozcieńczeń i próbki C pobrać po 100 µl i dodać do 1000 µl 1% skrobi
(2). Zamieszać i inkubować przez 5 min w temp. 35
o
C. W ten sam sposób przygotować próbę
zerową, zamiast enzymu dodając bufor (1). Próby wykonać w dwóch powtórzeniach.
Reakcję zatrzymać przez dodanie 1000 µl DNS (12) i ogrzewanie we wrzącej łaźni
wodnej przez 5 min. Gwałtownie schłodzić próbki i dodać po 10 ml H
2
O
dest
. Odczytać
absorbancję przy 530 nm.
4\ Działanie inhibitorów i aktywatorów na aktywność enzymu.
Równolegle do próbek przygotowywanych w celu oznaczenia bilansu aktywności α- amylazy
przygotować próbki do wyznaczenia aktywności enzymu w obecności inhibitora (mocznika)
i aktywatora (jonów chlorkowych).
W tym celu rozcieńczyć w kolbach miarowych 1 ml enzymu dodając:
A\ 9 ml buforu uniwersalnego z Cl
-
(4)
B\ 9 ml buforu uniwersalnego z mocznikiem (5)
Pobrać z rozcieńczeń po 100 µl, dodać probówek zawierających po 1000 µl roztworu skrobi
(2). Dalszy tok postępowania jest analogiczny do metody w punkcie 3\.
5\ Wpływ temperatury na aktywność enzymu
Do 5-u probówek dodać po 500 µl roztworu skrobi (2), 500 µl odpowiedniego dla
danego enzymu buforu (1) oraz 10 kropli 1% NaCl (9). Zamieszać i inkubować przez 5 min
w temp. 4, 25, 35, 60 i 100
o
C. Następnie do każdej probówki dodać po 100 µl enzymu D
(nierozcieńczonego) zmieszać i inkubować dalszych 10 min. Do wszystkich probówek dodać
po 1-2 kropli roztworu I w KI (8), zmieszać. Określić temperaturę, w której amylaza
wykazuje największą aktywność.
6\ Wyznaczanie pH optymalnego dla działania α
α
α
α
-amylazy
Do dziesięciu probówek wlać 0,2 M roztwór Na
2
HPO
4
(6) oraz 0,1 M roztwór kwasu
cytrynowego (7) w ilościach przedstawionych w tabeli 1. Otrzymuje się roztwory buforowe o
pH od 4,4 do 8,0. Do każdej probówki dodać 10 kropli 1% NaCl (9) oraz 10 kropli roztworu
skrobi (2). Po zmieszaniu wlać do każdej probówki po 100 µl próbki D (nierozcieńczonej).
Roztwory zmieszać i umieścić na 10 min w łaźni o temp. 35
o
C. Do wszystkich probówek
dodać po 1-2 kropli roztworu I w KI (8), zmieszać.
Określić pH, przy którym amylaza wykazuje największą aktywność.
Lp. 0,2 M Na
2
HPO
4
[ml]
0,1 M roztwór kwasu cytrynowego
[ml]
pH mieszaniny
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0,44
0,49
0,56
0,59
0,63
0,69
0,77
0,87
0,94
0,97
0,56
0,51
0,44
0,41
0,37
0,31
0,23
0,13
0,06
0,03
4,4
4,8
5,2
5,6
6,0
6,4
6,8
7,2
7,5
8,0
Tab.1. Przygotowanie buforu Mc Ilvaine’a w zakresie pH 4,4-8,0.
7\ Obliczenia.
Wyznaczyć aktywność α- amylazy, przyjmując jako jednostkę aktywności (JAA) ilość
maltozy (µM) uwolnionej podczas 1-minutowej hydrolizy 1 %-owej skrobi prowadzonej
w temp. 35
o
C przy odpowiednim dla danego enzymu pH.
JAA=
5
1
558
,
0
1
100
1000
1
1
×
×
×
=
×
×
×
E
t
Em
Vpr
V
E
gdzie:
V – objętość, w której wyrażamy aktywność enzymu (1000 µl)
V pr – objętość próbki enzymu (100 µl)
t – czas inkubacji (5 min)
E – odczytana wartość ekstynkcji
Em – wartość ekstynkcji dla 1 µM maltozy
Wyznaczyć bilans aktywności dla procesu oczyszczania α- amylazy oraz wpływ aktywatorów
i inhibitorów na aktywność enzymu.
Podsumowanie ćwiczeń
Porównać wyniki z ćwiczeń 1-3 dla amylazy trzustkowej i zbożowej, zestawić
w tabelach.