PROCESY MEMBRANOWE 

W PRZEMYŚLE SPOśYWCZYM 

 
 

OPRACOWANIE: P. KRÓLICZAK, T. JANKOWSKI 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 

 

2 

 

Współczesna  technologia  zna  wiele  metod  oczyszczania  produktów,  jak  np.  chromatografię  wielko-

składnikową,  wytrącanie,  krystalizację,  wirowanie,  destylację,  sedymentację  i  inne.  Membranowe  techniki 
rozdzielania  mieszanin  przez  długi  okres  czasu  traktowane  były  jako  pomocnicze  metody  separacyjne  w  skali 
laboratoryjnej. Ostatnie lata sprawiły, Ŝe moŜliwym stało się stosowanie technik membranowych na duŜą skalę. 
Związane  to  jest  z  rozwojem  chemii  tworzyw  sztucznych,  szczególnie  polimerów  syntetycznych,  z  których 
zbudowana jest większość wysoce przepuszczalnych i selektywnych membran. 

W  technologii  Ŝywności  stosuje  się  z  powodzeniem  takie  odmiany  technik  membranowych,  jak: 

mikrofiltracja,  ultrafiltracja,  odwrócona  osmoza,  elektrodializa,  nanofiltracja.  Korzyści  wynikające  ze 
stosowania wyŜej wymienionych metod to przede wszystkim: 

-

 

moŜliwość jednoczesnego zagęszczania, frakcjonowania i oczyszczania roztworów 

-

 

redukcja do minimum termicznej degradacji składników Ŝywności i mikroorganizmów 

-

 

niskie zuŜycie energii 

-

 

eliminacja przemian fazowych rozdzielanych składników (jak np. przy destylacji) 

-

 

prosta, modułowa budowa urządzeń. 

 

PODSTAWOWE POJĘCIA I PARAMETRY OPISUJĄCE TECHNIKI MEMBRANOWE 

 
Permeat  –  filtrat;  roztwór  przenikający  przez  membranę  filtracyjną,  zawierający  rozpuszczalnik  wraz 
z cząstkami, które nie zostały zatrzymane na filtrze. 
 
Retentat – roztwór zawierający zatrzymane na filtrze cząstki. 
 
Polaryzacja  stęŜeniowa  membrany  –  zjawisko  adsorpcji  drobin  na  powierzchni  membrany,  powodujące 
zalepianie  się  por.  pod  wpływem  adsorpcji  na  powierzchni  membrany,  powodujące  zlepianie  się  por.  pod 
wpływem  działającego  na  membranę  ciśnienia,  zatrzymane  na  niej  cząstki  akumulują  się  tworząc  warstwę 
Ŝ

elową lub tzw. Wtórną membranę. Powoduje to spadek szybkości filtrowania.  

 
Strumień objętości (flux rate) 
 

WyraŜa  objętość  otrzymanego  permeatu  na  jednostkę  powierzchni  filtra.  W  początkowym  etapie 

filtracji, gdy filtr nie jest jeszcze zapchany, przyjmuje wartość: 
 

  

∆  ∆



 



 

gdzie:  

∆

P – transmembranowa róŜnica ciśnień 

∆Π

 - róŜnica ciśnień osmotycznych filtrowanego roztworu i permeatu 

R

g

 – opór hydraulityczny warstwy Ŝelu 

R

m

 – opór hydraulityczny membrany. 

 
PoniewaŜ ciśnienie osmotyczne dla makromolekuł w roztworze jest bardzo niskie i rośnie dopiero w przypadku 
wysokiej koncentracji warstwy Ŝelowej na membranie, to wzór ma postać: 
 

 

∆



 



 

 
Gdy membrana ulega polaryzacji, tworzy się na niej warstwa Ŝelu, wówczas strumień objętości wyraŜamy jako: 
 

  







 

 

 

gdzie: 
K – współczynnik przenikania masy 
C

g

 – koncentracja warstwy Ŝelu 

C

s

 – koncentracja filtrowanego roztworu. 

 
Współczynnik  odrzucenia  R  –  wyraŜa  ilość  materiału,  który  przechodzi  przez  membranę  lub  jest  przez  nią 
odrzucany.  Gdy  R  ma  wartość  równą  1,  to  100 %  materiału  jest  odrzucane,  gdy  wartość  ta  wynosi  0,  to 
membrana jest całkowicie przepuszczalna. WyraŜa to wzór: 
 

 

3 

 





/









/





 

 

gdzie: 
C

f

 – końcowa koncentracja roztworu w retentacie 

C

0

 – początkowa koncentracja roztworu 

V

0 

– początkowa objętość roztworu 

V

f

 – końcowa objętość retentatu. 

 
Równanie to jest prawidłowe przy załoŜeniu, Ŝe retentat jest całkowicie homogenny, co jest jednak warunkiem 
do osiągnięcia z powodu tworzącej się na  membranie  warstwy Ŝelowej. Wartość współczynnika R jest funkcją 
molekularnej wielkości i kształtu rozdzielonych cząstek. 
 
Punkt  odcięcia  (cut-off)  –  masa  molekularna,  przy  której  co  najmniej  90 %  cząstek  globularnych  o  tej  właśnie 
masie jest na danym filtrze zatrzymywane. W wielu przypadkach punkt odcięcia jest właśnie tą wielkością, którą 
producent podaje na opakowaniu, jako róŜnicującą poszczególne filtry. 
 

MODYFIKACJE PROCESÓW MEMBRANOWYCH 

 

 

Przeciwdziałanie  zjawiskom  powodującym  zanieczyszczenia  membran  spowodowało  duŜy  postęp 

w dziedzinie  konfiguracji  modułów  membranowych,  materiałów  membran  i  optymalizacji  dynamiki  cieczy 
w sąsiedztwie  membrany.  Wydajność  procesów  membranowych  znacznie  się  zwiększyła  po  opracowaniu 
systemu wykorzystującego przegrody (cross-flow). Zasadę filtracji stycznej opisuje rysunek: 

 

 

 

 

 

 
Jednym  z  parametrów  charakterystycznych  dla  filtracji  stycznej  jest  ciśnienie  transmembranowe,  które 
przyjmuje tu wartość: 
 

∆ 





 



2  



 

 

gdzie: 
P

i

 – ciśnienie na wejściu 

P

0

 – ciśnienie na wyjściu 

P

f

 – ciśnienie filtratu 

 
 

Zaletą  tego  układu  jest  stosunkowo  wolniejsze  niŜ  w  typowej  filtracji  zapychanie  się  membrany,  a  to 

dzięki  temu,  iŜ  styczny  ruch  cieczy  nieustannie  zmywa  tworzącą  się  na  powierzchni  filtra  warstwę 
zanieczyszczeń.  Wydajność  i  efektywność  procesów  membranowych  jest  dodatkowo  polepszana  poprzez 
niewielkie wymiary przekrojów przepływu zawiesin i roztworów. Zapewnia to burzliwy ruch cieczy i duŜe siły 
ś

cinające  na  powierzchni  membrany.  Znane  są  teŜ  rozwiązania  konstrukcyjne  mikrofiltrów  z  wirującymi 

 

4 

powierzchniami  filtrującymi,  a  takŜe  układy,  w  których  zachodzi  przepływ  pulsacyjny  lub  teŜ  kierunek 
przepływu  zawiesiny  jest  co  pewien  czas  odwracalny  tak,  aby  zakłócić  ustalony  profil  polaryzacji  stęŜeniowej 
i usunąć cząstki z powierzchni membrany. 
 

RODZAJE FILTRÓW STOSOWANYCH W PROCESACH MEMBRANOWYCH 

 
 

Filtry  stosowane  w  procesach  membranowych  są  zwykle  wykonane  z  materiałów  ceramicznych  lub 

syntetycznych polimerów, takich jak polisulfon, teflon czy octan celulozy. Materiały te nie są cytotoksyczne, ani 
teŜ w Ŝaden inny sposób nie wpływają na filtrowany roztwór. 
 

 

 

Ś

ciany 

membran 

filtrów 

charakteryzują 

się 

anizotropową strukturą, tzn.  kanały por rozszerzają się 
od powierzchni membrany w głąb jej struktury. Dzięki 
temu  cząsteczki,  które  są  zatrzymywane  przez  daną 
membranę,  zatrzymują  się  na  jej  powierzchni  i  nie 
zapychają światła kapilar w jej wnętrzu. 
 

 

 
Stosowane są 3 podstawowe typy filtrów: 

-

 

płaskie 

-

 

spiralne 

-

 

kapilarne. 

-

 

 

Filtry płaskie (flat disc) stosuje się często w konfiguracji z innymi rodzajami separatorów, np. wirowaniem 

komórek.  

Filtry kapilarne zbudowane są z wiązki cienkich rurek umieszczonych  w cylindrycznym pojemniku. Ciecz 

zawierająca  oddzielane  cząstki  przepływa  przez  kapilary,  gdzie  ulega  rozdzieleniu:  cząsteczki  małe  przenikają 
przez ściany membrany na zewnątrz do przestrzeni między-kapilarnej, zaś cząsteczki duŜe opuszczają kapilary. 

Filtry spiralne zbudowane są z membran nawiniętych spiralnie na cylindryczny przewód odbierający filtrat. 

 
Wybór  stosowanej  membrany  zaleŜy  od  wielu  czynników,  np.  strumienia  objętości  przepływu,  masy 
molekularnej odcinanych cząstek, lepkości roztworu, stopnia adsorpcji białek, itp.  
 

PODZIAŁ I CHARAKTERYSTYKA PROCESÓW MEMBRANOWYCH 

 

 

Podział procesów membranowych przedstawiony poniŜej opiera się na wielkości rozdzielanych w danej 

metodzie  cząstek  za  pomocą  tradycyjnych  metod  separacji  moŜna  rozdzielić  cząstki  o  wielkości  nie  mniejszej 
niŜ  2 

µ

m.  Wszystkie  mniejsze  cząstki  mogą  być  wydzielane  z  roztworów  za  pomocą  technik  membranowych. 

Wielkość rozdzielanych cząstek jest podstawą przedstawionego poniŜej podziału. 
 
Mikrofiltracja (MF) 
 

W  mikrofiltracji  uŜywa  się  membran  o  porach  rzędu  0,1-5 

µ

m.  Za  pomocą  mikrofiltracji  usuwa  się 

z roztworu  drobne  zawiesiny,  komórki  bakteryjne,  niektóre  wirusy,  drobiny  surowców  roślinnych,  cząstki 
tłuszczu w emulsjach (np. mleka). Wizualnym efektem tego procesu moŜe być zmiana barwy filtratu, obniŜenie 
się  mętności,  spadek  intensywności  rozpraszania  światła.  Głównym  zastosowaniem  mikrofiltracji  jest  więc 
klasyfikacja roztworów, wydzielanie biomas komórkowych, a takŜe sterylizacja poŜywek (tzw. Sterylizacja „na 
zimno”). 

Siła napędową procesu mikrofiltracji jest róŜnica ciśnień hydrostatycznych po obu stronach przegrody, 

rzędu  0,05-0,5 MPa.  Mikrofiltrację  prowadzi  się  często  w  układzie  stycznym  (filtracja  styczna,  ang.  „cross-
flow”, „tangential flow”, co w większej mierze zapobiega odkładaniu się osadu na powierzchni membrany. 
 
Ultrafiltracja (UF) 

Membrany  stosowane  w  ultrafiltracji  mają  pory  rzędu  0,005-0,1 

µ

m  (5-100 nm),  a  róŜnica  ciśnień  na 

membranie w tym procesie wynosi 0,2-1,0 MPa. 

 

5 

Proces  UF  umoŜliwia  jednoczesne  frakcjonowanie  i  zagęszczanie  wybranych  składników  cieczy. 

Permeat  po  UF  nie  zawiera  juŜ  białek,  polisacharydów,  wirusów,  niektórych  barwników,  enzymów  i  witamin, 
natomiast  pozostają  w  nim  proste  cukry,  kwasy  organiczne,  zdysocjowane  jony  nieorganiczne  i  większość 
produktów  degradacji  cieplnej.  Mętność  ultrafiltratu  całkowicie  zanika  i  nie  obserwuje  się  juŜ  zjawiska 
rozpraszania światła. 
 
Nanofiltracja (NF) 
 

 
Nanofiltracja to proces, który obejmuje zakres separacji o wymiarach w granicach 0,001-0,005 

µ

m (1-

5 nm).  Zatrzymywane  są  tu  aminokwasy,  proste  cukry,  enzymy  i  niektóre  jony.  Frakcja  ta  zawiera  więc 
większość substancji pochłaniających promieniowanie ultrafioletowe (cukry i produkty ich rozpadu), substancje 
odpowiedzialne  za  smak  i  zapach,  substancje  zabarwiające.  Permeat  jest  jasno  zabarwiony,  klarowny,  zawiera 
tylko niektóre sole i cząstki o małej masie cząsteczkowej (np. alkohole). 

Sposób separacji składników w procesie NF jest połączeniem przepływu kapilarnego, typowego dla MF 

i  UF,  z  mechanizmem  rozpuszczająco-dyfuzyjnym,  charakterystycznym  dla  odwróconej  osmozy  (RO). 
Membrany  nanofiltracyjne  posiadają  róŜne  zakresy  selektywności,  począwszy  od  przegród  o  wysokiej 
nieprzepuszczalności  dla  NaCl,  poprzez  membrany  wybiórczo  zatrzymujące  niektóre  jony,  do  takich,  które 
zatrzymują cząsteczki kwasów. 
 
Odwrócona osmoza (RO) 
 

 
Proces  ten  przebiega  na  membranach  o  średnicy  por  0,0001-0,001 

µ

m  (0,1-1,0 nm).  Przez  taką 

przegródkę przenika wyłącznie rozpuszczalnik, tak więc RO moŜe być uwaŜana bardziej za proces zagęszczania 
niŜ separacji. Przepływ rozpuszczalnika następuje przeciwnie do ciśnienia osmotycznego, toteŜ, aby proces RO 
mógł zajść musi być wytworzona duŜa róŜnica ciśnień po obu stronach membrany, rzędu 1-10 MPa. Mechanizm 
selektywnego  działania  membran  RO  tłumaczy  się  modelem  rozpuszczająco-dyfuzyjnym,  gdzie  znaczenie  ma 
powinowactwo  membrany  i  składników  roztworu  oraz  szybkość  ich  transportu  w  membranie.  Składniki 
o większym  powinowactwie  do  materiału  membrany,  rozpuszczają  się  w  niej  łatwiej  od  innych  składników, 
a membrana  spełnia  funkcję  fazy  ekstrakcyjnej.  W  dalszym  etapie  procesu  zachodzi  transport  składników 
w membranie  na  zasadzie  dyfuzji  molekularnej,  zaś  róŜnice  w  dyfuzyjności  danego  składnika  decydują 
o przepuszczalności  membrany.  Selektywność  membran  RO  jest  więc  połączonym  efektem  rozpuszczalności 
i dyfuzyjności składników zagęszczonego roztworu. 

Membrany stosowane w RO mają strukturę niesymetryczną, z warstewką selektywną o submikronowej 

grubości,  wykonaną  najczęściej  z  octanu  i  innych  estrów  celulozy  oraz  z  poliamidów,  naniesioną  na  2-gą, 
grubszą warstwę podporową o większej porowatości. 

Proces RO stosuje się od wielu lat na duŜą skalę do otrzymywania wody pitnej z wód morskich i wód 

zasolonych oraz do uzdatniania wody w przemyśle farmaceutycznym i elektronicznym. 
 
Perwaporacja (PV) 

 
Perwaporacja  pozwala  na  rozdzielenie  ciekłej  mieszaniny  z  częściowym  jej  odparowaniem  –  permeat 

występuje w postaci pary. 
Membrany  stosowane  w  PV  mają  porowatość  podobną  jak  w  RO,  a  transport  masy  zachodzi  na  zasadzie 
mechanizmu sorpcyjno-dyfuzyjnego. Tak więc, po 1 stronie membrany następuje adsorpcja i rozpuszczanie się 
składników danego roztworu; następnie rozpuszczone cząsteczki dyfundują w membranie i z jej strony ulegają 
desorpcji („odparowaniu”). 

Efekt rozdzielania składników roztworu wynika, podobnie jak w RO, z róŜnic sorpcji i rozpuszczalności 

w  membranie.  RóŜnice  te  są  natomiast  efektem  specyficzności  oddziaływań  układu  membrana-ciecz  lub  teŜ 
wynikiem uprzywilejowanej sorpcji cząstek o mniejszym rozmiarze. 

Praktyczne zastosowanie procesu perwaporacji zmierza do zastąpienia tym procesem konwencjonalnej 

destylacji. 
 
Elektrodializa (ED) 

 
Elektrodializa  to  proces  membranowego  rozdzielania  roztworów  ciekłych,  których  składniki  jonowe 

(sole,  kwasy,  zasady)  przenikają  przez  membrany  pod  wpływem  róŜnicy  potencjałów  zewnętrznego  pola 
elektrycznego.  W  procesie  tym  membrany  są  jonowymienne,  mają  albo  ładunek  dodatni  (przepuszczalne  dla 
anionów – anionity), albo ładunek  ujemny (przepuszczalne dla kationów  -  kationity). Kationity  wytwarzane  są 
poprzez  fizyczne  lub  chemiczne  unieruchomienie  w  cienkich  foliach  wykonanych  z  polimerów,  grup 
sulfonowych  o  właściwościach  silnie  kwaśnych  lub  grup  karboksylowych  o  właściwościach  słabo  kwaśnych. 

 

6 

Anionity natomiast mają unieruchomione grupy amoniowe, silnie zasadowe lub słabo zasadowe grupy aminowe 
czy  teŜ  fenolowe.  W  ostatnich  opracowano  juŜ  membranę  dwupolarną,  umoŜliwiającą  elektrodializę 
w pojedynczej membranie. 
 

Proces  ED  ma  zastosowanie  do  odsalania  morskiej  oraz  uzdatniania  wody  technologicznej,  a takŜe 

do innych procesów demineralizacji. 
 

Omówione  wyŜej  procesy  membranowe  przedstawiono  na  schemacie,  uwzględniając  wymiarowe 

spektrum róŜnych substancji występujących w ciekłych artykułach Ŝywnościowych. 
 

 

 
 

ZASTOSOWANIE PROCESÓW SEPARACJI MEMBRANOWEJ W PRZEMYŚLE SPOśYWCZYM 

 

 

Procesy  membranowe  są  w  technologii  Ŝywności  atrakcyjną  alternatywą  do  tradycyjnie  stosowanych 

metod separacyjnych, a to ze względu na niedestrukcyjne oddziaływanie na produkt i niskie zuŜycie energii. 

W  tabeli  zestawiono  przykłady  zastosowania  procesów  membranowych  w  róŜnych  działaniach 

towarzyszących produkcji Ŝywności. 
 
Zastosowanie 

Produkt 

Proces membranowy 

„Zimna” sterylizacja 

Piwo, 

wino, 

mleko, 

moszcze, 

poŜywki fermentacyjne 

MF 

Klarowanie 

Piwo, wino, soki owocowe 

MF, UF 

Zagęszczanie 

Białka, 

soki 

owocowe, 

kawa, 

barwniki, enzymy 

UF, RO 

Usuwanie alkoholu 

Piwo, wino 

RO, PV 

Frakcjonowanie 

Białka, 

węglowodany, 

produkty 

biotechnologii 

UF, RO 

Odzysk produktu 

Kwas  mlekowy,  kwas  cytrynowy, 
ocet, alkohol etylenowy 

UF, ED, PV 

Poprawa jakości produktu 

Substancje smakowo-zapachowe 

RO, PV 

Odsalanie, demineralizacja 

Woda, serwatka 

RO, NF, ED 

 
Przemysł mleczarski 
 
             Pierwsze  zastosowania  procesów  ultrafiltracji  w  mleczarstwie  dotyczyły  utylizacji  serwatki.  Serwatkę 
najpierw  poddawano  procesowi  UF,  w  którym  oddzielano  frakcję  białkową,  a  następnie  RO,  otrzymując 
zagęszczony roztwór laktozy oraz permeat o niskim BZT. Korzyści wynikające zatem ze stosowania procesów 
membranowych,  w  tym  przypadku  polegają  na  moŜliwości  otrzymywania  30-80 %  koncentratów  białkowych 
pozbawionych  laktozy,  zagęszczonego  do  ok.  25 %  roztworu  laktozy,  a  przy  tym  powstający  ściek  ma  niskie 
BZT. 
             Stosując dalej odpowiednio dobrane membrany, białka moŜna jeszcze rozdzielić na 

α

-laktoalbuminę i 

β

-

laktoglobulinę, laktoferynę, laktoperoksydazę i glikomakropeptyd. 
 

 

7 

 

 

Frakcjonowanie białek serwatkowych w procesie UF 

 
               W serowarstwie powszechną praktyką jest wstępne zagęszczanie mleka przy uŜyciu UF, poprzedzające 
koagulację. Poprzez to wartość odŜywcza sera jest wyŜsza dzięki wzbogaceniu go w białka, witaminy i niektóre 
substancje mineralne, tracone w serwatce w tradycyjnym procesie. 
               WaŜną  zaletą  technik  membranowych  jest  moŜliwość  „zimnej”  sterylizacji.  Mleko  poddawane 
procesowi  MF  jest  nikrobiologicznie  czyste  i  nie  jest  wówczas  wymagana  typowa  pasteryzacja.  Pojawiają  się 
jednak doniesienia mówiące o tym, Ŝe przy stosowaniu membran, które pozwalają na zachowanie przez mleko 
wszystkich jego białkowych składników, w permeacie zostaje część drobnoustrojów. 
 
Przemysł owocowo-warzywny 
 

W przemyśle tym procesy membranowe stosuje się do klarowania i zagęszczania soków, moszczów 

oraz  wina,  do  wydzielania  substancji  aromatycznych  z  ekstraktów  owocowych,  do  zagęszczania  barwników 
roślinnych oraz do usuwania alkoholu z wina. 

Dzięki technologiom membranowym moŜna wyeliminować tak uciąŜliwe procesy jak filtracja przy  

uŜyciu  ziemi  okrzemkowej,  bentonitu,  zolu  krzemionkowego  i  Ŝelatyny.  Jednocześnie,  stosując  instalacje 
membranowe,  mniejsza  jest  powierzchnia  produkcyjna,  mniejsze  jest  zuŜycie  energii  czy  teŜ  preparatów 
enzymatycznych. 

Połączone systemy UF i RO stosowane do odzyskiwania substancji aromatycznych zawartych 

w skórkach owoców cytrusowych, w duŜej mierze wpływają na lepszą jakość produktu i wydajność procesu.  
Ultrafiltrację  stosuje  się  teŜ  do  pozyskiwania  i  zagęszczania  naturalnych  barwników  tj.  antocyjany  i  betanina. 
Zawartość  tych  składników  w  roztworach  wodnych  jest  bardzo  niska  (ok.  0,1 %),  a  w  przewadze  występują 
pektyny, białka i cukry. W tradycyjnym procesie  sok lub ekstrakt jest  filtrowany, zagęszczany  na  wyparkach i 
suszony rozpyłowo. Natomiast juŜ jednokrotna UF pozwala 2-krotnie zwiększyć zawartość barwników a suchej 
masie. 

W produkcji winiarskiej zastosowanie MF i UF moszczów lub gotowego wina zapewnia z jednej strony  

usunięcie  niepoŜądanej  mikroflory,  zaś  z  2 pozbawienie  wina  związków  powodujących  jego  mętność.  W  ten 
sposób  eliminuje  się  z  procesu  produkcyjnego  uciąŜliwe  etapy  filtracji  z  uŜyciem  środków  klarujących  oraz 
siarkowanie,  jako  czynnik  niszczący  mikroflorę.  Z  kolei  uŜycie  membran  RO  umoŜliwia  częściowe  lub 
całkowite  usunięcie  alkoholu  z  wina  lub  teŜ  jego  zagęszczenie.  Otrzymuje  się  produkt  o  bardziej  intensywnej 
barwie i zwiększonej zawartości alkoholu. 
 
Biotechnologia 
 

Biotechnologia, jako szeroka dziedzina, stwarza teŜ bardzo szerokie moŜliwości stosowania technik  

membranowych.  Począwszy  od  „zimnej”  sterylizacji  poŜywek  przy  uŜyciu  MF,  moduły  membranowe  są 
zastosowane  w  reaktorach  z  recyrkulacją  komórek  i  ciągłym  odbieraniem  produktów  oraz  do  separacji 
i zagęszczania produktów fermentacji. 
Na  rysunku  przedstawiono  schemat  tradycyjnego  bioreaktora  z  dołączonym  modułem  membranowym 
i moŜliwością recyrkulacji komórek. 
 

 
 
 
 

 

8 

 

 

Fermentor z recyrkulacją komórek. 

 
Taki  układ  umoŜliwia  ciągłość  pracy  fermentatora, 
gdyŜ  produkty  procesu  są  w  kontrolowany  sposób 
odprowadzane  i  ich  wzrastająca  koncentracja  nie 
inhibuje  przebiegu  prowadzonej  reakcji.  Dodatkowo 
teŜ  następuje  ciągłe  zawracanie  komórek  do  reaktora, 
co  zwiększa  ich  stęŜenie  i  powoduje  tym  samym 
wzrost wydajności procesu.  
Według  podanego  obok  schematu  przeprowadza  się 
produkcję etanolu z surowców skrobiowych i serwatki, 
a takŜe kwasu mlekowego, octowego i propionowego. 
Selektywne przegrody o róŜnych konfiguracjach,  

Z unieruchomionymi  komórkami  lub  enzymami,  słuŜą  do  budowy  fermentorów  nazywanych  reaktorami 
membranowymi.  Reaktory  takie  mogą  być  stosowane  do  prowadzenia  fermentacji  alkoholowej,  mlekowej, 
octowej  oraz  do  enzymatycznej  hydrolizy  sacharozy.  W  fermentacji  alkoholowej  aplikacją  zyskuje  proces 
perwaporacji.  Etanol  odprowadzany  w  ten  sposób  z  cieczy  fermentacyjnej  ma  stęŜenie  ok.  40 %,  a  koszt 
produkcji jest o 29 % niŜszy od produkowanego tradycyjnie. 
 

Fermentacja alkoholowa z ciągłym usuwaniem etanolu za pomocą perwaporacji i recyrkulacją komórek. 

 

 

Przy  uŜyciu  PV  moŜna  teŜ  odprowadzać  z  cieczy 
fermentacyjnej substancje zapachowe. 
Opracowana  w  ostatnich  latach  membrana  2-polarna, 
stosowana w elektrodializie, pozwala na otrzymywanie 
kwasu mlekowego bez konieczności jego oczyszczania, 
co jest wymagane w tradycyjnych metodach. 

 
Inne zastosowania procesów membranowych. 
 
 

Techniki  membranowe, przede  wszystkim UF, stosuje się do zagęszczania białka jaja kurzego. Proces 

ten  stosuje  się  teŜ  do  odsalania  białka  jaja.  Pozyskane  w  ten  sposób  czyste  białko  nie  róŜni  się  wskaźnikami 
jakościowymi od białka negatywnego. 

UF  stosuje  się  teŜ  w  produkcji  koncentratów  białkowych  z  roślin  oleistych.  Dzięki  technice 

membranowej,  moŜna  usunąć  z  ekstraktu  białkowego  niepoŜądane  niskocząsteczkowe  składniki  (przede 
wszystkim fenole), odpowiedzialne za nieprzyjemny zapach. 

Przemysł spoŜywczy stosuje teŜ w niektórych przypadkach techniki membranowe na rzecz OŚ. Znane 

są  przykłady  poddawania  procesowi  MF  solanek  peklujących,  w  celu  ich  wielokrotnego  uŜycia,  a  takŜe 
przykłady membranowego oczyszczania wód odpadowych. 
 

 

9 

Tlenowe hodowle mikroorganizmów na przykładzie tlenowej hodowli droŜdŜy 

 

Celem ćwiczenia jest: 

•

 

zapoznanie się z przebiegiem tlenowej hodowli droŜdŜy 

•

 

ocena wykorzystania składników poŜywki podczas hodowli droŜdŜy 

•

 

obliczanie bilansu masowego hodowli 

 
WARUNKI HODOWLI DROśDśY 
 
 

Do  osiągnięcia  właściwego  przyrostu  biomasy  w  odpowiednim  czasie  konieczna  jest  obecność 

podstawowych  składników  poŜywki  we  właściwych  proporcjach.  Niezbędne  są:  woda,  źródła  węgla  i  azotu, 
magnezu,  mikroelementów,  witamin  i  innych  substancji  wzrostowych.  DroŜdŜe  najlepiej  rozwijają  się  na 
poŜywkach zawierających cukry proste. Podstawowymi monosacharydami wykorzystywanymi przez droŜdŜe są 
D-glukoza,  D-fruktoza,  D-mannoza.  Disacharydem  powszechnie  metabolizowanym  w  warunkach  tlenowych 
i beztlenowych jest sacharoza. Niektóre gatunki droŜdŜy mają zdolność wykorzystywania laktozy, rafinozy,  
L-sorbozy,  D-ksylozy,  L-arabinozy  czy  celobiozy.  Źródłem  węgla  mogą  być  takŜe:  skrobia  rozpuszczalna, 
pektyna,  etanol,  metanol,  etanodiol,  glicerol,  niektóre  kwasy  organiczne  i  in.  Do  prawidłowego  wzrostu 
wymagają obecności substancji stymulujących m.in.: biotyny, kwasu pantenowego, mezoinozytu. Bazę podłoŜa 
do  hodowli  droŜdŜy  stanowi  melasa  buraczana  lub  trzcinowa  oraz  brzeczka  słodowa.  Optymalne  pH  poŜywki 
wynosi 4-5, zawartość wody 30 % min. 
 

Większość  gatunków droŜdŜy najszybciej rozmnaŜa  się  w  temperaturach 25-32 

°

C, chociaŜ  występują 

gatunki,  dla  których  optymalna  temperatura  wzrostu  wynosi  37  (gat.  termofilne)  lub  20 

°

C  (gat.  psychrofilne). 

NajniŜsza  temperatura,  w  której  zaobserwowano  rozmnaŜanie  się  droŜdŜy  wynosi  2 

°

C  a  najniŜsza  46 

°

C 

i wartości te przyjmuje się, jako punkty krytyczne.  
 
Charakterystyka wzrostu mikroorganizmów 
 
 

Wzrost  mikroorganizmów  moŜna  przedstawić  na  wykresie  zaleŜności  logarytmu  liczby  komórek  do 

czasu  hodowli.  Powstanie  krzywa  wzrostu,  na  której  moŜna  wyróŜnić  6 podstawowych  faz  wzrostu:  faza 
wzrostu  utajonego,  faza  początku  rozmnaŜania,  faza  logarytmiczna  (wykładnicza),  faza  wzrostu  zwolnionego, 
faza stacjonarna i faza zamierania.  

Faza  wzrostu  utajonego  –  okres  adaptacji  komórek  do  nowego  środowiska.  Następuje  w  niej 

energetyczna  adaptacja  do  środowiska  i  uruchomienie  mechanizmów  umoŜliwiających  transportowanie 
składników poŜywki do wnętrza komórek. Następują syntezy enzymów, białek budujących odpowiednie kanały 
transportowe  itp.  Istnieje  zasada  oszczędności  energetycznej,  tzn.,  Ŝe  komórka  adaptuje  swój  metabolizm  do 
asymilacji najłatwiej dostępnego źródła węgla. Ilość komórek nie zmienia się tzn. x = x

0 

= const. 

 
Efektywność procesów tlenowych zaleŜy od: 

-

 

szybkości mieszanie poŜywki 

-

 

ilość doprowadzenia gazu 

-

 

temperatura hodowli 

-

 

stęŜenie substancji rozpuszczalnych 

-

 

obecność substancji zmniejsza lub zwiększa napięcie powierzchniowe. 

 

Faza  początku  rozmnaŜania  się  komórek  (x 

>

 x

0

)  –  opanowanie  środowiska  jest  tym  szybsze  im 

większe było inokulum komórkowe. Ilość i szybkość podziałów zaleŜy od warunków hodowli (pH, temperatury, 
potencjału  red-ox,  siły  jonowej  i  koncentracji  O

2

).  W  sprzyjających  warunkach  hodowla  przechodzi  do  fazy 

3 faza wzrostu utajonego i faza początku rozmnaŜania są czasami ujmowane w 1 fazę, tzw. lagfazę. 
 

Faza  logarytmiczna  (wykładnicza)  –  charakteryzuje  się  stałym  minimalnym  czasem  generacji  a  tym 

samym  maksymalną  szybkością  wzrostu  mikroorganicznego.  Często  wielkość  komórek  i  zawartość  w  nich 
białek  w  tej  fazie  jest  stała,  co  umoŜliwia  stosowanie  pośrednich  metod  pomiaru  biomasy.  O  takiej  hodowli 
mówi się, Ŝe zawiera ona „komórki standardowe”. 
 





 



· 2         



      2 

 
gdzie: 
x

k

 – końcowa masa komórek 

n – ilość podziałów 
 
W tej fazie szybkość wzrostu populacji (

µ

) jest stała i jest funkcją logarytmiczną: 

 

10 

    

!"

 

 

  

#

#$ ·

1



 

 
t - czas 
 
Faza logarytmiczna trwa tak długo, dopóki nie nastąpi wyczerpanie jakiegoś składnika poŜywki lub dopóki nie 
wzrośnie  stęŜenie  toksycznych  metabolitów  do  wartości  krytycznej  (do  pojawienia  się  czynnika  limitującego 
wzrost). Określa to zaleŜność Monoda: 
 

    

!"

·

&

'



 &(

 

 
gdzie: 

µ

max

 – maksymalna właściwa szybkość wzrostu 

K

s

 – stała półnasycenia (stała hamowania), czyli stęŜenie substratu, przy którym: 

 

   0,5 ·  

!"

 

S – stęŜenie substratu ograniczającego: 
 

    

!"

·





,

 

 

 
gdzie: 

µ

max

 – maksymalna właściwa szybkość wzrostu 

K

p

 – stęŜenie produktu toksycznego, przy którym 

µ

 = 0,5 

⋅

 

µ

max

  

P - stęŜenie produktu toksycznego. 
 
W  momencie  pojawienia  się  czynnika  ograniczającego  następuje  zmniejszenie 

µ

  i  przejście  do  fazy  wzrostu 

zwolnionego. 
 
 

Faza wzrostu zwolnionego (właściwa szybkość  wzrostu maleje aŜ do momentu, kiedy ilość komórek 

jest  stała)  i  faza  stacjonarna  –  rozpoczyna  się  w  momencie,  gdy  komórki  nie  mogą  się  juŜ  rozmnaŜać. 
PoniewaŜ  szybkość  wzrostu  zaleŜy  m.in.  od  stęŜenia  substratów,  (które  maleje  podczas  hodowli),  szybkość 
wzrostu  hodowli  zaczyna  się  zmniejszać  jeszcze  przed  całkowitym  wyczerpaniem  substratu.  Dlatego  przejście 
od  fazy  logarytmicznej  do  stacjonarnej  jest  zazwyczaj  stopniowe.  Poza  ograniczeniem  ilości  substratu.  TakŜe 
inne  czynniki,  tj.  duŜa  gęstość  populacji,  niskie  ciśnienie  parcjalne  tlenu  czy  nagromadzenie  toksycznych 
produktów  metabolizmu  (np.  etanol  dla  droŜdŜy),  mogą  prowadzić  do  spowolnienia  szybkości  wzrostu 
i zainicjowania fazy stacjonarnej. 
 

W  wielu  produkcyjnych  procesach  biotechnologicznych  nastawionych  na  wytwarzanie  wtórnych 

metabolitów (np. produkcja penicyliny) faza stacjonarna jest główną fazą produkcyjną. Dlatego w biotechnologii 
rozróŜnia  się  trofofazę,  czyli  fazę  wzrostu  i  idiofazę  –  fazę  produkcji.  Mimo,  Ŝe  w  idiofazie  komórki  juŜ  nie 
rosną,  potrafią  one  wykorzystywać  podawany  substrat  oraz  włączać  związki  prekursorowe  do  produktu 
końcowego. 
 
 

Faza  zamierania  –  po  pewnym  czasie  hodowli  komórki  zaczynają  zamierać.  Często  przyczyną  jest 

nagromadzenie  w  poŜywce  hodowlanej  toksycznych  metabolitów.  W  niektórych  wypadkach  następuje  liza 
(autoliza) komórek wskutek działania wydzielanych przez mikroorganizmy do podłoŜa enzymów. 
 
PARAMETRY CHARAKTERYZUJĄCE WZROST KOMÓREK 
 

*właściwa szybkość wzrostu:  

 

  

-.

/0

/1

2

     34

56

7 

 
X

k

 – końcowe stęŜenie komórek 

X

0

 – początkowe stęŜenie komórek 

 

*czas generacji:   

 

 

$ 

-.8

9

    347 

 

11 

Dla bakterii czas generacji wynosi ok. 30 min., dla droŜdŜy 2-3 h 
 

*czas podziałów komórkowych:    

 

-

2

3h

56

7 

 
TLENOWA HODOWLA DROśDśY 
 
 

Bardzo  waŜny  jest  odpowiedni  poziom  natleniania  i  stęŜenia  cukru  w  poŜywce.  Ludwik  Pasteur 

wykazał, Ŝe w obecności tlenu wydajność biomasy ze zuŜytej glukozy jest znacznie wyŜsza oraz, Ŝe tlen silnie 
hamuje fermentację alkoholową. Dotyczy to mikroorganizmów, które mogą rozwijać się zarówno w warunkach 
tlenowych jak i beztlenowych (np. E. coli, S. cerevisiae). Od nazwiska odkrywcy zjawisko to nosi nazwę efektu 
Pasteura. Jego mechanizm polega na represji i hamowaniu enzymów szlaku EMP (Embden-Meyrhofa-Parnasa) 
w  obecności  tlenu.  W  warunkach  tlenowych  następuje  represja,  a  w  warunkach  beztlenowych  indukcja,  m.in. 
fosfofruktokinazy,  aldolazy  i  kinazy  pirogronianowej.  Przy  mniejszej  podaŜy  tlenu  zachodzi  fermentacja 
etanolowa. 
 

 W  tlenowych  hodowlach  drobnoustrojów  obserwuje  się  takŜe  częściowe  hamowanie  oddychania 

komórek  w  warunkach  stęŜenia  glukozy  ponad  1-2 [g/dm

3

].  Jest  to  tzw.  Efekt  Crabtree.  Wysokie  stęŜenie 

glukozy  wzmaga  glikolizę,  przy  równoczesnym  ograniczeniu  szlaków  metabolicznych  związanych 
z oddychaniem  tlenowym  (np.  cykl  Krebsa  czy  cykl  pentozofosforanowy  –  PP),  zwłaszcza  podczas  hodowli 
drobnoustrojów  w  podłoŜu  kompleksowym.  Represji  i  hamowaniu  mogą  podlegać  u  róŜnych  drobnoustrojów 
m.in.  dehydrogenaza  NADH  i  elementy  pierwszej  fosforylacji  w  łańcuchu  oddechowym  oraz  dehydrogenazy 
funkcjonujące w cyklu Krebsa, np. izocytrynianowa, bursztynianowa i inne. Indukowana jest natomiast synteza 
enzymów szlaku EMP (fermentacja alkoholowa). 
 

Wykazano,  Ŝe  nie  tylko  wysokie  stęŜenie  glukozy,  ale  duŜa  szybkość  wzrostu  droŜdŜy  sprzyja 

procesowi  fermentacji  alkoholowej.  Przykładowo  –  przy  właściwej  szybkości  wzrostu 

µ

  =  0,1 h

-1

  fermentacja 

tlenowa zachodzi powyŜej 2 g  glukozy  w litrze, przy 

µ

  =  0,2 h

-1

 ten sam efekt  fizjologiczny  uzyskuje się przy 

stęŜeniu glukozy 1g w litrze. UwaŜa się, Ŝe nie sama glukoza, jako związek chemiczny, lecz szybkość przemian 
katabolicznych decyduje o kierunku jej metabolizmu. Wynika z tego, Ŝe  warunki natlenienia, stęŜenie glukozy 
i szybkość jej metabolizmu wpływają na wydajność masy komórkowej. Przy wysokim stęŜeniu glukozy i duŜej 
szybkości  wzrostu  droŜdŜy,  wydajność  biomasy  w  warunkach  tlenowych  ulega  redukcji,  gdyŜ  przy 
dostatecznym  poziomie  ATP,  zabezpieczającym  potrzeby  energetyczne  komórki,  nadmiar  substratu 
oddechowego  NADH  powoduje  hamowanie  procesów  związanych  z  pozyskiwaniem  energii  metabolicznej. 
Nadmiar  NADH  sprzyja  teŜ  redukcji  metabolitów  powstających  w  procesie  glikolizy.  W  wyniku  takiej 
gospodarki  równowaŜnikami  redukującymi,  w  warunkach  dobrego  natlenienia  i  duŜego  stęŜenia  glukozy, 
powstają  normalne  produkty  fermentacji,  np.  etanol,  czy  kwas  mlekowy,  analogicznie  jak  w  procesie 
beztlenowym.  Zjawisko  to  jest  wykorzystywane  w  początkowych  etapach  propagacji  droŜdŜy.  Produkcja 
niewielkich  ilości  etanolu  daje  dodatkowy  efekt  sterylizujący  i  zabezpiecza  przed  rozwojem  niepoŜądanej 
mikroflory. 
 

Natlenienie poŜywek 
Efektywność procesów tlenowych zaleŜy w duŜym stopniu od szybkości tranferu tlenu z fazy gazowej 

do ciekłej. Parametr ten jest determinowany przez następujące czynniki: 

-

 

stopień  dyspersji  pęcherzyków  powietrza  w  fazie  wodnej,  co  wpływa  na  powierzchnię  wymiany 
międzyfazowej 

-

 

szybkość  mieszania  cieczy,  co  wpływa  na  rozdrobnienie  pęcherzyków  oraz  czas  ich  przebywania 
w cieczy 

-

 

temperatura  cieczy;  zgodnie  z  prawem  Henry’ego,  rozpuszczalność  gazów  w  cieczy  maleje  w  miarę 
wzrostu  temperatury;  woda  o  temp.  25 

°

C  moŜe  przyjąć  max  20 mg  tlenu  na  litr;  poŜywki 

mikrobiologiczne ciekłe są zdolne do rozpuszczenie ok. 5-7 mg tlenu na litr 

-

 

obecność w cieczy substancji rozpuszczonych (sole, cukry, białka); im większe ich stęŜenie tym niŜsza 
rozpuszczalność tlenu w cieczy 

-

 

obecność substancji obniŜających napięcie powierzchniowe cieczy (niekorzystnie oddziałują na transfer 
tlenu do cieczy) 

-

 

stopień  nasycenia  tlenem  danej  cieczy;  im  większa  jest  róŜnica  między  stanem  nasycenia  tlenem 
a stanem faktycznym, tym szybszy jest transfer tlenu do cieczy. 

 
Zwiększenie transferu tlenu do cieczy moŜna technicznie osiągnąć przez: 

-

 

zwiększenie szybkości mieszania (zwiększenie powierzchni kontaktu gaz-ciecz) 

-

 

zwiększenie napowietrzania (tzn. dostarczenie większej ilości tlenu) 

 

 

12 

METODY HODOWLI MIKROORGANIZMÓW 
 
Hodowle  okresowe  (batch  culture)  –  są  najczęściej  stosowaną  metodą  hodowli  mikroorganizmów.  Metoda 
okresowa  ma  wady,  z  których  najwaŜniejszymi  są:  zmienność  środowiska  w  czasie  hodowli  wynikająca  ze 
zmiany  stęŜenia  składników  pokarmowych  i  nagromadzenia  toksycznych  metabolitów  oraz  stosunkowo  niską 
gęstość  kultury  komórkowej  i  tym  samym  niewielka  produktywność  objętościowa  bioreaktora.  W  procesach 
okresowych nie wykorzystuje się w pełni potencjału metabolicznego komórek, gdyŜ optymalne warunki dla ich 
rozwoju  utrzymywane  są  tylko  przez  krótki  czas  hodowli.  Jednym  ze  sposobów  redukcji  tego  problemu  jest 
zastosowanie okresowo-dolewowej, półciągłej lub ciągłej metody hodowli. 
 
Hodowle  ciągłe  –  polegają  na  stałym  zasilaniu  kultury  świeŜą  poŜywką  z  jednoczesnym  usuwaniem  zuŜytego 
medium  wraz  z  komórkami  lub  bez  komórek.  Metoda  ta  jest  dostosowana  głównie  do  produkcji  biomasy 
komórkowej lub jej pierwszorzędowych metabolitów. Wzrost komórek odbywa się cały czas w logarytmicznej 
fazie wzrostu, przy całkowitym braku ograniczających ich rozwój. 
Najprostszą technologią procesów ciągłych jest zastosowanie reaktora przepływowego ze stałym dostarczaniem 
ś

wieŜej  poŜywki  i  odbieraniem  zuŜytej  wraz  z  komórkami  przy  zachowaniu  stałej  objętości  roboczej 

bioreaktora.  Warunkiem  utrzymania  hodowli  ciągłej  jest  zachowanie  równowagi  pomiędzy  ilością  komórek 
wymywanych  i  ponownie  namnoŜonych  w  wyniku  podziałów  komórkowych.  Szybkość  poŜywki  powinna  być 
tak  dobrana,  by  zapewnić  stałą,  wysoką  koncentrację  komórek  w  bioreaktorze  i  utrzymanie  hodowli  w  stanie 
chemostatu.  W  tym  przypadku  gęstość  komórek  i  stęŜenie  substratu  mają  wartości  stałe,  a  więc  miernikiem 
właściwej szybkości wzrostu komórek jest szybkość rozcieńczania poŜywki. 
 
Hodowle  okresowo-dolewowe  (fed-batch  culture)  polega  na  wprowadzeniu  do  hodowli  pod  koniec  fazy 
logarytmicznego  wzrostu  świeŜej  poŜywki  lub  mieszaniny  najwaŜniejszych  jej  składników.  W  tym  przypadku 
początkowe  wypełnienie  bioreaktora  wynosi  30-50 %  a  kolejne  porcje  poŜywki  są  dostarczane  ze  stałą  lub 
zmienną  szybkością.  W  metodzie  FBC  występują  tylko  2 fazy  cyklu  komórkowego:  fazy  logarytmiczne 
oddzielone  krótkotrwałymi  fazami  adaptacyjnymi,  zapoczątkowanymi  przez  wprowadzenie  świeŜej  poŜywki. 
Dlatego,  hodowle  okresowo-dolewowe,  w  porównaniu  z  hodowlami  okresowymi,  pozwalają  na  uzyskanie 
kilkukrotnie większych gęstości komórek i produktywności bioreaktora. 
Innym sposobem prowadzenia hodowli okresowo-dolewowej jest metoda półciągła, która realizowana jest przez 
okresowe odbieranie części hodowli i zastępowanie jej porcją świeŜej poŜywki. 
 
Proces ciągły wyróŜnia się wieloma zaletami, do których naleŜą: 

-

 

wyeliminowanie wpływu czasu hodowli na zmiany warunków hodowli i fizjologię komórek 

-

 

moŜliwość prowadzenia hodowli dowolnie długo w ustalonych, najbardziej korzystnych warunkach 

-

 

moŜliwość  regulacji  stanu  fizjologicznego  komórek  przez  dobór  szybkości  zasilania  i  składu  podłoŜa 
zasilającego hodowlę 

-

 

stosunkowo duŜa jednorodność fizyczna i chemiczna hodowli 

-

 

moŜliwość automatyzacji procesów 

-

 

moŜliwość  maksymalnego  wykorzystania  aparatury  przy  jednoczesnym  równomiernym  jej  obciąŜeniu 
przez cały czas trwania procesu. 

W hodowlach ciągłych mogą pojawiać się problemy związane z niestałością czynnika biologicznego, np.: 

-

 

degeneracja szczepów lub pojawienie się niekorzystnych mutacji i opanowanie hodowli przez populacje 
komórek o pogorszonych właściwościach produkcyjnych 

-

 

trudności w utrzymaniu warunków aseptycznych procesu w bioreaktorze przez dłuŜszy czas 

-

 

niekorzystny  dla  hodowli  ciągłej  sposób  rozwoju  niektórych  droboustrojów,  tworzących  układy 
wielkokomórkowe, skupiska w postaci kłaczków i kuleczek a takŜe układy wielkokomórkowe, skupiska 
w  postaci  kłaczków  i  kuleczek  a  takŜe  tendencja  do  obrastania  przewodów  i  innych  elementów 
bioreaktora 

-

 

niekorzystna  relacja  pomiędzy  wzrostem  drobnoustrojów  a  tworzeniem  niektórych  produktów 
metabolizmu syntetyzowanych przez komórki nie rosnące 

-

 

niedostateczna znajomość dynamicznych właściwości drobnoustrojów w hodowli ciągłej. 

 

A = x

0

 = x 

A/B  x

f

>

x

0

 

B – x

f

 = x

0

 

⋅

 2n 

logx

f

 = logx

0

 + nlog2 

µ

 = 

µ

max

 = const 

wielkość komórek i zawartość białka = const 

µ

 = 

µ

max 

⋅

 S/(K

s

 + S) 

 

13 

właściwa szybkość wzrostu: 



"

;

"

1

 (stan końcowy/stan początkowy komórki); 

   3h

56

7 

czas generacji (by komórki podwoiły się) 

$ 

-.8

9

 

częstość podziałów komórkowych 

1 

6

<

=

 

 

 

 

 

14 

WYKONANIE ĆWICZENIA 

 
Zadanie 1: badanie przyrostu biomasy droŜdŜy. 

•

 

zwaŜyć naczynia wirówkowe 

•

 

do naczyń naleŜy odmierzyć po 25 ml brzeczki z hodowli początkowej i końcowej 

•

 

dla oddzielenia biomasy naczynia z zawartością wirować przy szybkości 5500 [obr./min] 10 min 

•

 

po wirowaniu supernatanty zlać do zlewek (do zad. 2) a pozostałość zwaŜyć (znad osadu, określić ilość 

glukozy i azotu, mokrą biomasę naleŜy wysuszyć) 

•

 

obliczenia: 

-

 

obliczyć suchą masę komórek w 100 ml brzeczki wiedząc, Ŝe Ŝywa komórka zawiera 25 % s.m. (75 % 
to woda);  

25 % - 100 ml 
x – 25 ml 
x = 6,25 % 

-

 

obliczyć masę i przyrost komórek droŜdŜy w pobranych próbach 

-

 

obliczyć masę i przyrost komórek droŜdŜy w 1000 ml brzeczki (D

25

)   

 
Zadanie 2: badanie stopnia odfermentowania glukozy. 

•

 

próby rozcieńczyć  

- hodowla końcowa – 5 i 10 

⋅

 (1 ml + 4 ml wody; 1 ml próby + 9 ml wody; po 2 próby) 

- hodowla początkowa – 100 i 150x  

•

 

z rozcieńczeń pobrać 0,5 ml próby i dodać 0,5 ml DNS-u. Oznaczenia wykonać w 2 powtórzeniach 

•

 

przygotować próbę „0” o składzie: 0,5 ml wody destylowanej i 0,5 ml DNS 

•

 

próby ogrzewać 10 min we wrzącej łaźni wodnej a następnie ostudzić w strumieniu zimnej wody 

•

 

dodać 5 ml wody destylowanej, dokładnie wymieszać 

•

 

zmierzyć  absorbancję  na  spektrofotometrze  przy  długości  fali 

λ

  =  530 nm  stosując  próbę  „0”  do 

kalibracji spektrofotometru 

•

 

stęŜenie glukozy odczytać z krzywej wzorcowej. 

 
Zadanie 3: badanie stopnia wykorzystania azotu z poŜywki. 

•

 

doświadczenie przeprowadzić z zastosowaniem aparatu Parnasa 

•

 

w rozgrzanym aparacie Parnasa naleŜy umieścić 10 ml badanej próby 

•

 

dodać ok. 20 ml 40 % NaOH (w obecności fenoloftaleiny – kolor róŜowy) 

•

 

destylować amoniak do 20 ml kwasu bornego z odczynnikiem Tashiro do zmiany barwy + 5 min 

•

 

zmiareczkować azot amonowy za pomocą 0,1 N H

2

SO

4

 do zmiany barwy z zielonej na fioletową 

•

 

obliczenia: 

-

 

stopień odfermentowania cukru: 

GLC

pobrana

 = GLC

początkowa

 – GLC

końcowa

 

SO

glc

 = (GLC

pobrana

/GLC

początkowa

) x 100 %  

-

 

wydajność przyrostu biomasy: 

dB (przyrost biomasy) = masa biomasy z końca hodowli – masa biomasy z początku hodowli 
WdB = (dB/GLC

pobrana

) 

⋅

 100 % 

-

 

azot NH

4

+

 pobrany z 1000 ml poŜywki: 

V

a

 = (V

0

 – V

k

) 

⋅

 100, gdzie: 

V

0

 – objętość 0,1N H

2

SO

4

 zuŜyta do zmiareczkowania próby początkowej 

Vk – objętość 0,1N H

2

SO

4

 zuŜyta do zmiareczkowania próby końcowej 

NH

4

+

pobrany

 = (V

a 

⋅

 0,0014 g 

⋅

 18 g)/14 g 

(1ml 0,1N H

2

SO

4

 odpowiada 0,0014 g N; 1M NH

4

+

 = 18g; 1MN = 14 g) 

-

 

przyrost biomasy na podstawie ubytku N z poŜywki: 

ilość powstałego białka (P) = NH

4

+

 pobrany 

⋅

 6,25 

przyrost biomasy (dB) = B 

⋅

 2 

 
mnoŜnik białka = 6,25 
Białko zawiera stałą ilość azotu = 16 % co stanowi 6,25 części wszystkich pierwiastków występujących w białku 
(100:16 = 6,25), mnoŜąc ilość azotu 

⋅

 6,25 otrzymujemy ilość powstałego białka. 

Biomasa droŜdŜowa zawiera duŜe ilości białka, ok. 50 %, dlatego, by je obliczyć mnoŜymy ilość białka 

⋅

 2. 

 

15 

Indukcja syntezy enzymów produkowanych przez Aspergillus niger 

 

1.

 

Cel  ćwiczenia  –  wykazanie  moŜliwości  indukowania  produkcji  poŜądanych  enzymów  przez 
drobnoustroje. 
 

2.

 

Wprowadzenie. 

 

2.1.

 

Indukcja syntezy enzymów przez drobnoustroje. 
 

Większość  enzymów  wykorzystywanych  w  procesach  biosyntezy  i  biotransformacji  produkowanych 

jest przez drobnoustroje. W przemyśle wykorzystuje się proteazy, 

α

-amylazy, amyloglukozydazę, aminoacytazę, 

dekstranazę,  katalazę.  W  celach  leczniczych  pozyskuje  się  enzymy  trawienne,  heparynę,  streptolizynę. 
W mniejszych ilościach produkuje się teŜ enzymy słuŜące do celów analitycznych w biologii molekularnej czy 
w inzynierii genetycznej (np. restryktazy). 

Część  enzymów  jest  syntetyzowana  wewnątrz  organizmu  konstruktywnie,  niezaleŜnie  od  warunków 

ś

rodowiskowych.  Dotyczy  to  głównie  enzymów  katalizujących  reakcje  przemian  centralnych  i  podstawowych 

syntez komórkowych. 

Większość  waŜnych  biotechnologicznie  enzymów  naleŜy  do  grupy  induktywnych,  tzn.  takich,  których 

synteza  wymaga obecności induktora  w  środowisku zewnętrznym. Induktorami są substraty, rzadziej produkty 
reakcji enzymatycznych albo teŜ ich analogi. 

Najlepiej  poznanym  przykładem  enzymu  jest  produkcja 

β

-galaktozydazy  przez  bakterie  Escherichia 

coli.  Komórki  tego  organizmu  mogą  rozwijać  się  na  wielu  substratach  nie  produkując  prawie  w  ogóle 

β

-

galaktozydazy.  JeŜeli  jednak  w  podłoŜu  hodowlanym  znajdzie  się  laktoza  –  substrat  dla 

β

-galaktozydazy  –  to 

aktywność tego enzymu moŜe wzrosnąć tysiąckrotnie. 

Synteza  indukowanego  enzymu  ulega  najczęściej  represji  w  obecności  końcowych  produktów  degradacji 

substratu. Represorami  mogą  więc być aminokwasy przy produkcji proteaz czy teŜ np. glukoza przy produkcji 
aminoglukozydazy czy izomerazy glukozowej. 

 

Mechanizmy  regulujące  powstawanie  enzymów  konstytutywnych  jak  i  induktywnych  działają  na 

poziomie  molekularnym,  przede  wszystkim  na  etapie  transkrypcji  DNA  i  w  mniejszym  stopniu  na  etapie 
translacji.  W  pierwszym  przypadku  regulacja  dotyczy  oddziaływań  białek  regulatorowych  (indukujących  lub 
represorowych)  na  geny  promotora  i  operatora,  które  umoŜliwiają  przyłączenie  się  polimerazy  RNA  do  nici 
DNA i tym samym na rozpoczęcie transkrypcji mRNA. 

Regulacja  na  etapie  translacji  polega  na  róŜnej  częstości  syntezy  białek  enzymatycznych  lub  teŜ 

związana  jest  z  translacyjnym  modyfikowaniem  białek,  ułatwiającym  ich  przejście  przez  błony 
wewnątrzkomórkowe (przez aparat Golgiego) i tym samym wyjście poza teren komórki. 

 
2.2 Separacja enzymów. 
 

 

Wyprodukowane  przez  drobnoustroje  enzymy  znajdują  się  bądź  to  wewnątrz  komórek,  lub  teŜ 

w podłoŜu hodowlanym. Enzymy wewnątrzkomórkowe są zazwyczaj mniej stabilne i charakteryzują się większą 
masą  cząsteczkową.  Proces  ich  separacji  naleŜy  rozpocząć  od  rozbicia  komórek,  co  wiąŜe  się  z  tym,  Ŝe  do 
roztworu  przechodzą  równieŜ  wszystkie  inne  białka  obecne  w  cytoplazmie,  a  takŜe  cały  kompleks  kwasów 
nukleinowych. 
 

Dalsze  postępowanie  zarówno  z  enzymami  wewnątrzkomórkowymi  jak  i  zewnątrzkomórkowymi  jest 

podobne.  Jedną  z  metod  pozyskiwania  enzymów  jest  ich  wydzielanie  z  roztworów  na  zasadzie  róŜnicy 
rozpuszczalności  białek.  Dodając  do  roztworu  sole  nieorganiczne  (np.  siarczan  amonowy,  magnezowy  lub 
sodowy), rozpuszczalniki organiczne (np. etanol, aceton) czy teŜ rozpuszczalne polimery niejonowe (np. glikol 
polietylenowy,  dekstran)  w  odpowiednim  stęŜeniu  powoduje  się  wypadanie  białka  z  tegoŜ  roztworu.  Tak 
uzyskaną  zawiesinę  odwirowuje  się,  a  z  otrzymanego  precypitatu  usuwa  się  czynnik  denaturujący,  przez  co 
enzym odzyskuje swą aktywność.  
 

Stosując wyŜej wymienione sposoby moŜna pozyskać 80-90 % poŜądanego enzymu. 

 

Oczyszczanie  enzymów  moŜna  prowadzić  równieŜ  poprzez  denaturację  termiczną;  ogrzewanie 

roztworu  oczyszczanego  enzymu  w  temperaturze  nieco  niŜszej  od  temperatury,  w  której  traci  on  aktywność, 
prowadzi  najczęściej  do  wytrącania  się  wieku  białek  towarzyszących.  Temperaturę  ogrzewania  moŜna 
podwyŜszyć nie powodując inaktywacji enzymu, gdy do roztworu zostanie dodany związek swoiście się z tym 
enzymem łączący. 
 

Zmiana  pH  roztworu  lub  teŜ  obniŜenie  jego  siły  jonowej  do  bardzo  niskich  wartości  moŜe  równieŜ 

doprowadzić do usunięcia wielu białek towarzyszących. 
 

Bardzo szeroko stosowanymi  metodami rozdziału białek są  metody chromatograficzne.  Obejmują one 

następujące sposoby frakcjonowania: 

 

16 

•

 

sączenie  molekularne  –  technika  wykorzystująca  róŜnice  w  wielkości  rozdzielanych  cząstek; 
mieszanina substancji o róŜnej masie cząsteczkowej przepływa przez kolumnę wypełnioną porowatym 
hydrofilnym Ŝelem o określonej wielkości porów, zrównowaŜonym odpowiednim buforem; cząsteczki 
zbyt  duŜe,  aby  wniknąć  do  ziaren  Ŝelu,  przepływają  między  nimi  i  pojawiają  się  w  eluacie  lako 
pierwsze,  substancje  o  niŜszej  masie  cząsteczkowej  wnikają  do  ziaren  Ŝelu,  są  więc  opóźniane  na 
kolumnie; pojawiają się w eluację w porządku od najmniejszych do największych 

•

 

chromatografia  jonowymienna  –  kolumna  chromatograficzna  wypełniona  jest  celulozowym 
wypełniaczem  jonowym,  do  którego  wiąŜą  się  białka  obdarzone  przeciwnym  niŜ  wymieniacz 
ładunkiem,  białka  obdarzone  tym  samym  ładunkiem  przepływają  swobodnie  przez  kolumnę.  Białka 
połączone  z  wypełniaczem  uwalnia  się  poprzez  wprowadzenie  do  układu  czynników  konkurujących 
z białkami o miejsce na wypełniaczu 

•

 

chromatografia 

adsorpcyjna 

– 

kolumna 

wypełniona 

jest 

nieorganicznym 

materiałem 

(np. hydroksyapatyt), który adsorbuje białko na zasadzie oddziaływań Van der Waals’a 

•

 

chromatografia  powinowactwa  –  rzadko  stosowana  na  większą  skalę  ze  wzgl.  na  wysokie  koszty 
i niestabilność  wypełniacza  kolumny,  który  powinien  być  specyficzny  dla  danego  enzymu,  gdyŜ 
ligandem,  do  którego  wiąŜe  się  pozyskiwany  enzym  jest  w  tym  przypadku  substrat  danego  enzymu, 
jego analog bądź teŜ inhibitor enzymu. 

 

W  ostatnich  latach  rozdział  enzymów  na  skalę  przemysłową  prowadzony  jest  przy  uŜyciu  technik 

membranowych,  do  których  naleŜy  ultrafiltracja.  Przepuszczając  oczyszczany  roztwór  przez  membranę 
o zdefiniowanej porowatości moŜna uzyskać zagęszczony enzym, nieposiadający zanieczyszczeń w postaci soli 
czy  niskocząsteczkowych  związków.  Frakcjonowanie  odbywa  się  tu  na  zasadzie  róŜnicy  w  rozmiarach 
cząsteczek, co ma odniesienie do ich masy cząsteczkowej. 
 
Wykonanie ćwiczenia 

•

 

indukcja syntezy amylazy i pektynazy przez Aspergillus niger 

Przygotować podłoŜe hodowlane o następującym składzie: 
 
MgSO

4 

⋅

 7H

2

O 

KH

2

PO

4

 

KCl 
NaNO

3

 

FeSO

4 

⋅

 7H

2

O 

MgSO

4

 

CaCl

2

 

0,5 [g/l] 
1,0 [g/l] 
0,5 [g/l] 
3,0 [g/l] 
0,01 [g/l] 
0,24 [g/l] 
0,15 [g/l] 

 
Jako substraty indukujące wytwarzanie enzymów do części podłoŜa dodać: 

-

 

10 g/l skrobi rozpuszczalnej (indukcja syntezy amylazy) 

-

 

0,01 g/l kwasu poligalakturonowego (indukcja syntezy pektynazy). 

Ustalić pH = 5,6 i sterylizować 117 

°

C pod ciśnieniem 0,8 atm. przez 0,5 h. 

Tak przygotowane podłoŜe zaszczepić grzybnią Aspergillus niger, hodowlę prowadzić w kolbach Erlenmayer’a 
250 ml w temperaturze 30 

°

C na wytrząsarce przy 150 [obr./min] przez 70 h. 

 

•

 

oznaczanie aktywności pektynolitycznej i emylolitycznej w płynach pohodowlanych 

Po  70 h  hodowli  zawartość  kolbek  odsączyć  na  lejku  w  celu  oddzielenia  komórek  grzybowych  od  roztworu 
zawierającego  enzymy.  W  otrzymanym  przesączu  sprawdzić  aktywność  obu  badanych  enzymów.  W  celu 
sprawdzenia  aktywności  pektynolitycznej  do  probówki  zawierającej  0,5 ml  0,5 %  kw.  poligalakturonowego 
dodać  0,5 ml  badanego  roztworu.  Całość  inkubować  30 min  w  50

°

C,  w  łaźni  wodnej.  Następnie  dodać  1 ml 

DNS,  gotować  przez  10 min.,  próbki  ochłodzić  pod bieŜącą  wodą,  dodać  10 ml  wody  destylowanej,  dokładnie 
wymieszać i prowadzić odczyt  na spektrofotometrze przy  długości fali  A = 530 nm.  Z  krzywej  wzorcowej dla 
kwasu  galakturonowego  odczytać  jego  zawartość  i  na  tej  podstawie  obliczyć  aktywność  badanego  enzymu, 
wyraŜając ją poprzez szybkość powstawania produktu (np. 

µ

g/ml/min.). 

W analogiczny sposób przeprowadzić oznaczenia aktywności amylolitycznej. 
Uwaga: aktywności obu enzymów sprawdzić we wszystkich płynach pohodowlanych) pochodzących z hodowli 
beŜ Ŝadnej indukcji, w przypadku indukcji syntezy amylazy oraz w przypadku indukcji syntezy pektynazy). 
 
Hodowla A. niger na podłoŜu: 

1.

 

bez induktora – hodowla kontrolowa 

2.

 

ze skrobią – indukcja syntezy amylazy 

3.

 

z kw. poligalakturonowym – induktorem syntezy pektynazy 

 

17 

Przygotowanie prób do analizy: 
Próby właściwe: 

2 

⋅

 0,5 ml skrobi + 0,5 ml (podłoŜa) enzymu 

2 

⋅

 0,5 ml kw. poligalakturonowego + 0,5 ml enzymu 

próby zerowe substratowe: 
 

 

1 

⋅

 0,5 ml skrobi + 0,5 ml H

2

O 

 

 

1 

⋅

 0,5 ml kw. + 0,5 ml H

2

O 

próba zerowa enymatyczna: 
 

 

1 

⋅

 0,5 ml enzymu + 0,5 ml H

2

O 

 
Indukcja ze wzgl. na miejsce grom.: 

-

 

konstytutywna – syntetyzowane niezaleŜnie od środowiska gromadzenie wewnątrz komórki; katalizują 
reakcje przemian centralnych i podstawowych syntez komórkowych 

-

 

induktywna – synteza jest uzaleŜniona od obecności induktora w środowisku zewnętrznym (mogą być 
substraty, produkty reakcji lub ich analogi). 

 

18 

KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH. 

INHIBICJA. TERMOSTABILNOŚĆ. 

 

 

Celem  badań  kinetyki  reakcji  enzymatycznych  jest  uzyskanie  informacji  o  ich  przebiegu  w  czasie, 

a więc  zaniku  substratów  i  powstawania  produktów,  liczby  i  kolejności  przyłączania  cząsteczek  substratów  do 
enzymu  i  odłączania  cząsteczek  produktów  z  kompleksu  aktywnego,  liczby  kompleksów  pośrednich  oraz 
o efektach  czynników  modyfikujących  przebieg  reakcji  –  inhibitorów  i  aktywatorów.  Badania  te  prowadzą  do 
stworzenia  modelu  kinetycznego  reakcji  uwzględniającego  wszystkie  etapy  reakcji.  KaŜdy  etap  charakteryzują 
2 wielkości, noszące nazwę stałych szybkości reakcji, które pozwalają sprawdzić, czy przyjęty model kinetyczny 
dobrze opisuje badany układ. Doświadczenie stałych szybkości reakcji jest bardzo uciąŜliwe. 
 

Przy  pomocy  modelu  kinetycznego  moŜna  przewidywać  szybkość  i  kierunek  przebiegu  danej  reakcji 

w łańcuchu  lub  cyklu  metabolicznym,  czyli  moŜe  on  być  podstawą  do  określenia  katalitycznej  sprawności 
enzymu w organizmie. 
 

Aktywność  enzymu  określa  nam  ilość  enzymu  niezbędną  do  wytworzenia  określonej  ilości  produktu 

reakcji  w  określonej  jednostce  czasu  przy  zachowaniu  standardowych  warunków  oznaczenia,  zwykle 
optymalnych dla działania enzymu. 
 

Oznaczanie aktywności enzymów prowadzi się róŜnymi metodami, opierającymi się na pomiarze ilości 

wytworzonego  produktu,  ilości  zuŜytego  substratu,  względnie  zmian  fizykochemicznych  w  środowisku 
reakcyjnym (np. zmiany lepkości, zmiany pH, zuŜycia tlenu). 
 

Szybkość  przebiegu  reakcji  enzymatycznej  zaleŜy  od  wielu  czynników  środowiskowych,  tj.  stęŜenie 

enzymu,  stęŜenie  substratu.  Temperatura,  pH,  siła  jonowa,  potencjał  oksyredukcyjny,  obecność  inhibitorów 
i aktywatorów. 
 

O  kierunku  przebiegu  reakcji  decydują  przede  wszystkim  stęŜenie  substratu  i  produktów  reakcji. 

Przy wysokim stęŜeniu substratu, a tak jest zwykle na początku reakcji, reakcja przebiega w kierunku tworzenia 
się produktów. Ilość reagującego substratu jest tym większa, im większa jest koncentracja enzymu na początku 
rekcji,  co  gwarantuje  natychmiastowy  kontakt  wszystkich  cząsteczek  enzymu  z  substratem.  Zaznaczyć  jednak 
naleŜy,  Ŝe  w  sytuacji,  gdy  cała  ilość  substratu  jest  związana  z  enzymem,  nadmiar  enzymu  jest  praktycznie 
bezuŜyteczny. 
 

Na początkową szybkość reakcji decydujący wpływ ma stęŜenie substratu. Wraz ze wzrostem stęŜenia 

krzywa  V-S  przybiera  formę  hiperboliczną,  co  oznacza,  ze  tempo  wzrostu  szybkości  reakcji  maleje  w  miarę 
wzrostu  stęŜenia substratu, dochodząc do  wartości  maksymalnej. Przy dalszym dodatku  substratu  wartość V

max

 

nie ulega zmianie, co związane jest z pełnym wysyceniem cząsteczek enzymu przez substrat. Wzrost V

max

 moŜe 

mieć  miejsce  wówczas,  gdy  w  mieszaninie  reakcyjnej  zostanie  zwiększone  stęŜenie  enzymu.  PowyŜszy  opis 
obrazuje następujący rysunek: 
 

 

 

 

•

 

Kinetyka hiperboliczna reakcji z 1 substratem.  
Nieodwracalna reakcja enzymatyczna przebiega wg schematu: 
 

A + E 

↔

 EA 

→

 E + P 

 

 

W schemacie tym A, E, P, i EA oznaczają kolejno substrat, enzym, produkt i kompleks przejściowy lub 

aktywny.  Substraty,  produkty,  inhibitory  i  inne  czynniki  biorące  udział  w  reakcji  nazywamy  reaktantami. 
Enzym,  po  rozpadzie  kompleksu  aktywnego  wchodzi  powtórnie  w  reakcję,  katalizując  przemianę  następnej 
cząsteczki substratu. 

Zmiany stęŜenia poszczególnych składników reakcji enzymatycznej przedstawiono na rysunku: 

 

19 

 

 

Na powyŜszym wykresie literami a, b i c oznaczono stany przebiegu reakcji. Litera „a” to stan prestacjonalny, tj. 
okres  początkowy  reakcji,  poprzedzający  ustalenie  stanu  stacjonarnego.  „b”  to  stan  stacjonarny,  w  którym 
stęŜenie kompleksu aktywnego EA jest wartością stałą. Później następuje stan poststacjonarny „c”, który posiada 
małe znaczenie w badaniach kinetyki reakcji enzymatycznych. 
 
Interpretacja kinetyki hipernolicznej w ujęciu Michaelis’a-Menten 
 
Interpretacja kinetyki hipernolicznej opiera się na załoŜeniu, Ŝe podczas przebiegu reakcji enzymatycznej istnieje 
taki stan, w którym stęŜenie kompleksu EA jest wielkością stałą. 
 

SCHEMAT NIEODWRACALNEJ REAKCJI ENZYMATYCZNEJ: 

 

>   ? 



@A

BC  >? 



@=

BC  ?    



DA

EF 

 

ZAŁOśENIE: Istnieje taki moment reakcji,  w  którym szybkość syntezy  kompleksu enzym-substrat równa się 
szybkości jego rozpadu ([EA] = const) 

 

k

+1

[A][E] = k

-1

[EA] + k

+2

 [EA] 

poniewaŜ:  

[E] = [E

0

] – [EA] 

to: 

k

+1

[A][E

0

] -  k

+1

[A][EA] = k

-1

[EA] + k

+2

 [EA] 

 

k

+1

[A][E

0

] = [EA] (k

+1

[A] + k

-1

 + k

+2

) 

 

3?>7 

G

H6

3>73?



7

G

H6

3>7   G

56

 G

H8

 

 

poniewaŜ szybkość powstawania produktu wynosi: V

0 

= k

+2

 [EA] 

 







G

H6

G

H8

3>73?



7

G

H6

3>7   G

56

 G

H8

 

 

zakładając, Ŝe: 

V

max

 = k

+2

[E

0

] 

 

 

20 

i: 









DA

H

@=



@A

 









!"

3>7

3>7   



 

 

Wartość K

m

 jest miarą powinowactwa enzymu do substratu;  większe K

m

 –  mniejsze powinowactwo. K

m

 jest to 

taka ilość substratu, przy której reakcja enzymatyczna przebiega z połową maksymalnej szybkości.  
 

Aby  uniknąć  trudności  w  określaniu  wartości  V

max

  i  K

m

  kinetykę  reakcji  przedstawia  się  w  formie 

wykresu  Lineweavera-Burka (linearyzacja Lineweavera-Burka – jest to odwrotność  końcowego  wzoru  w teorii 
Michaelis’a-Menten). 
 

 

I 

6

J

KLM

 



!"



6
N

 

 

O  0

⇒

 P Q

56

R

K

S   I  0

⇒

 





!
N

 

 

 

•

 

Metody relaksacyjne w badaniach mechanizmów reakcji enzymatycznych. 

Metody  relaksacyjne  opierają  się  na  wywołaniu  chwilowych  zaburzeń  w  układzie  znajdującym  się  w  stanie 
równowagi  termodynamicznej  i  następnie  obserwacji  kinetyki  ustalania  się  nowego  stanu  równowagi 
termodynamicznej,  czyli  relaksacji.  Szybkość  ustalania  się  nowego  stanu  jest  miarą  szybkości  reakcji 
przebiegających w badanym układzie. 
 

W badaniach biologicznych najczęściej stosowane są badania relaksacji ciśnieniowej i temperaturowej 

(metody skoku ciśnienia lub temperatury). 
 

•

 

Hamowanie reakcji enzymatycznych. 

Szybkość reakcji enzymatycznych moŜe być znacznie ograniczona przez czynniki środowiskowe. Ich działanie 
moŜna określić jako: 
niespecyficzne  –  pH,  temperatura,  metale  cięŜkie  itp.  powodują  najczęściej  nieodwracalną  inaktywację  białek 
enzymatycznych; 
specyficzne  –  niektóre  związki  modyfikują  cząsteczkę  enzymu  (blokada  centrum  aktywnego,  modyfikacja 
struktury przestrzennej), przy czym modyfikacja taka jest z reguły odwracalna. 
 

Temperatura  jest  jednym  z  czynników  istotnie  wpływających  na  szybkość  reakcji  enzymatycznych. 

Wraz  z  jej  wzrostem  wzrasta  szybkość  katalizowanych  przez  enzymy  reakcji.  JednakŜe  w  podwyŜszonej 
temperaturze  dochodzi  na  ogół  do  denaturacji  cieplnej  enzymów,  a  przez  to  do  ich  inaktywacji.  Większość 
enzymów  posiada  optimum  swojego  działania  w  temperaturze  30-50 

°

C.  Natomiast  juŜ  kilkuminutowa 

inkubacja w temp. 70 

°

C inaktywuje większość znanych do tej pory enzymów, choć istnieją teŜ takŜe enzymy, 

które pełnią aktywność nawet po inkubacji w 100 

°

C. 

 

W niektórych przypadkach te same enzymy, ale izolowane z 2 róŜnych organizmów charakteryzują się 

róŜną  termostabilnością. 

α

-amylaza  z  Bacillus  stearotermophilius  charakteryzują  swą  aktywność  po  inkubacji 

w 90 

°

C,  natomiast  ten  sam  enzym  izolowany  z  Aspergillus  oryzae  ulega  pełnej  inaktywacji  juŜ  po  15 min 

inkubacji w 60 

°

C.  

 

Denaturacja  termiczna  w  odniesieniu  do  niektórych  enzymów  jest  odwracalna.  Przykładem  jest  tu 

pirofosforaza  nukleotydowa  z  Proteus  vulgaris.  Enzym  ten  traci  całkowicie  aktywność  po  10 min  inkubacji 
w 70 

°

C, ale odzyskuje ją całkowicie po ochłodzeniu do 37 

°

C. 

 

Inaktywacja enzymów moŜe równieŜ następować w temperaturach poniŜej 10 

°

C. W tych przypadkach 

zjawisko  to  ma  charakter  bardziej  kompleksowy,  gdyŜ  szybkość  inaktywacji  zaleŜy  tu  równieŜ  od  stęŜenia 
enzymu,  stęŜenia  soli  i  pH  środowiska.  Taka  inaktywacja  dotyczy  prawdopodobnie  tylko  enzymów 
oligometrycznych,  które  w  obniŜonej  temperaturze  dysocjują  na  podjednostki,  a  po  ponownym  podwyŜszeniu 
temperatury podjednostki te nie asocjują się juŜ w aktywny enzym (np. dekarboksylacja glutaminowa z E. coli). 
 

Enzymów  inaktywujących  się  w  niskich  temperaturach  jest  jednak  bardzo  mało;  większość  enzymów 

ulega inaktywacji w podwyŜszonej temperaturze. 

 

21 

Istnieje  moŜliwość  wpływania  na  termo-stabilność  enzymów  poprzez  stosowanie  związków 

ochronnych, które wiąŜą się z enzymem, przez co obserwuje się mniejszy spadek jego aktywności. Stabilizująco 
działają  substraty  i  analogi  strukturalne,  jony  metali,  koenzymy,  a  takŜe  stabilizatory  nieswoiste  –  albuminy 
osocza, dekstran, glikol polietylenowy (PEG), glicerol. 

 

ŹRÓDŁA ENZYMÓW 

 

1.

 

Enzymy pochodzenia roślinnego: 

-

 

peroksydaza - chrzan 

-

 

proteinazy – fasola szparagowa 

-

 

α

-amylaza – jęczmień, słodkie ziemniaki 

2.

 

Enzymy pochodzenia zwierzęcego: 

-

 

katalaza – bydło 

-

 

lipaza – świnia 

-

 

lizozym – jaja kurze 

-

 

pepsyna – świnia 

-

 

α

-amylaza - świnia 

3.

 

Enzymy pochodzenia mikrobiologicznego: 

•

 

enzymy wytwarzane przez bakterie: 

-

 

katalaza – Micrococcus lysodeiktus 

-

 

proteazy – Bacillus sp., Streptomyces sp. 

-

 

kolagenaza – Clostridium histoliticum, Rydopseudomonas spheroides 

-

 

α

-amylaza – Bacillus sp. 

-

 

β

-galaktozydaza – Escherichia coli 

•

 

enzymy wytwarzane przez grzyby: 

-

 

glukozydaza – Aspergillus niger 

-

 

lipaza – Aspergillus sp., Mucor sp., Rhizopus sp. 

-

 

α

-amylaza - Aspergillus sp. 

-

 

β

-amylaza - Aspergillus sp. 

-

 

amyloglukooksydaza - Aspergillus niger 

-

 

β

-1,3-glukanaza – Basidomycete sp., Sclereltina libertiana 

-

 

pektynazy - Aspergillus niger 

-

 

celulazy – Trichoderma viride, Basidomyces sp. 

-

 

proteazy - Aspergillus sp., Tritirachium sp.  

 
Biorąc pod uwagę rodzaj oddziaływania między cząsteczkami enzymu i inhibitora inhibicję specyficzną 

dzielimy na 3 typy: 

 

1.

 

inhibicja współzawodnicza (kompetycyjna) – polega na konkurencji pomiędzy inhibitorem 

i substratem  o  centrum  aktywne  enzymu;  inhibitory  tego  typu  są  zwykle  podobne  pod  wzgl.  struktury 
chemicznej  do  substratu;  inhibicję  tego  typu  moŜna  zwykle  znieść  przez  zwiększenie  stęŜenia  substratu;  przy 
tego typu inhibicji zmniejsza się powinowactwo enzymu do substratu (K

m

 rośnie), V

max

 nie zmienia się 

 

2.

 

inhibicja niewspółzawodnicza (niekompetycyjna) – inhibitor tak wiąŜe się z enzymem, Ŝe zmienia 

jego aktywność katalityczną; maleje V

max

 powinowactwo pozostaje na tym samym poziomie  

(K

m

 = const) 

 

3.

 

inhibicja allosteryczna – inhibitor tak modyfikuje cząsteczkę enzymu, Ŝe zmienia się zarówno  

powinowactwo  enzymu  do  substratu  (K

m

)  jak  i  szybkość  maksymalna  (V

max

);  przykładem  tego  typu  inhibicji 

moŜe  być  inhibicja  przez  sprzęŜenie  zwrotne,  gdzie  produkt  reakcji  hamuje  jeden  z  pierwszych  etapów  tej 
reakcji. 

 

Na rysunku przedstawiono graficzną interpretację róŜnych typów inhibicji na wykresie Lineweavera-Burka. 

 

22 

 

 
Wykonanie ćwiczenia 

 

1.

 

Określić wpływ zmiennego stęŜenia substratu na szybkość reakcji enzymatycznej. 

Przeprowadzić  hydrolizę  enzymatyczną  skrobi  stosując  następujące  stęŜenia  substratu:  0,2 %,  0,4 %, 

0,6 %, 0,8 %, 1,0 %. Na podstawie otrzymanych wyników przedstawić graficznie przebieg reakcji (wg metody 
linearyzacji  Lineweavera-Burke’a)  oraz  wyznaczyć  kinetyczne  stałe  reakcji  K

m

  i  V

max

.  (inhibitor:  maltoza 

0,025%) 

2.

 

Określić przebieg hydrolizy skrobi w obecności inhibitorów (0,05 % maltoza). 

Przeprowadzić  hydrolizę  skrobi  (0,2 %,  0,4 %,  0,6 %,  0,8  %,  1,0 %)  w  obecności  0,05  %  maltozy. 

Otrzymane  wyniki  przedstawić  graficznie  w  formie  liniowej  na  rysunku  wykonanym  w  p.1.  Na  tej  podstawie 
określić typ inhibicji. 
Próby właściwe (2 

⋅

 ) 0,5 ml skrobi + 0,5 ml enzymu. 

Zerowe substratowe (1 

⋅

 ) 0,5 ml skrobi + 0,5 ml H

2

O. 

Zerowe enzymatyczne (1 

⋅

 ) 0,5 ml enzymu + 0,5 ml H

2

O. 

 

Oznaczanie aktywności amylolitycznej. 

 

W  celu  sprawdzenia  aktywności  amylolitycznej  do  probówki  zawierającej  0,5 ml  buforowanego 

roztworu  1 %  skrobi  wprowadzić  0,5 ml  badanego  enzymu.  Całość  inkubować  w  łaźni  wodnej  przez  30 min 

 

23 

w 50 

°

C.  Następnie  dodać  1 ml  DNS  (kwas  2,3,3-dinitrosalicylowy);  powstaje  barwny  kompleks  w  100 

°

C 

z cukrami od pomarańczowego do brązowego; i gotować przez 10 min. Po tym czasie reakcję przerwać poprzez 
schłodzenie  próby  pod  bieŜącą  wodą,  do  probówek  dodać  10 ml  wody  destylowanej  i  po  wymieszaniu 
prowadzić  odczyt  na  spektrofotometrze  przy  długości  fali  A  =  530 nm.  Z  krzywej  wzorcowej  odczytać 
zawartość  glukozy  w  próbce  i  na  tej  podstawie  określić  aktywność  enzymu  amylazy,  wyraŜając  ją  poprzez 
szybkość  przebiegu  reakcji,  czyli  w  tym  przypadku  jako  ilość  powstałej  glukozy  w  jednostce  objętości 
i w jednostce czasu (np. mg/l/min) 

 

IMMOBILIYACJA BIOKATALIYATORÓW 

 

Cel ćwiczenia: 

•

 

Zapoznanie się z metodami unieruchamiania enzymów i komórek mikroorganizmów 

•

 

Immobilizacja  komórek  droŜdŜy  Saccharomyces  ceresevisiae  w  Ŝelu  alganinianowym  oraz  poprzez 
mikrokapsułkowanie 

 
Wprowadzenie 
 

Większość  procesów  biotechnologicznych  polega  na  przeprowadzeniu  cyklu  reakcji  biochemicznych, 

w których  wyjściowy  substrat  jest  przekształcany  w  produkty  końcowe.  Procesy  takie  wymagają 
wieloskładnikowych  kompleksów  enzymatycznych,  które  mogą  być  wprowadzane  do  reakcji  w  formie 
handlowych  preparatów  enzymatycznych.  Najczęściej  reakcje  takie  wymagają  udziału  wielu  enzymów 
zastosowanych  w  ściśle  określonych  stęŜeniach  i  wzajemnych  proporcjach,  co  z  technologicznego  punktu 
sterowania takim procesem jest bardzo trudne, a takŜe kosztowne. 
 

Dlatego teŜ znacznie  korzystniejsze jest im  mobilizowanie całej komórki  mikroorganizmu jako źródła 

enzymów. Taki proces jest duŜo tańszy, gdyŜ pomija się etapy izolacji i oczyszczania enzymów. 
 

Immobilizacja  oznacza  zatem  fizyczne  lub  chemiczne  unieruchomienie  biokatalizatora  poprzez 

związanie go z nośnikiem lub umiejscowienie w określonej przestrzeni bez uŜycia makroskopowego nośnika. 
 
 

Systemy  oparte  na  wykorzystaniu  im  mobilizowanych  biokatalizatorów  wykazują  wiele  zalet 

w porównaniu z systemem wolnych komórek i enzymów. 

•

 

moŜliwość wielokrotnego uŜycia i wykorzystania w procesach ciągłych 

•

 

moŜliwość wprowadzenia do reakcji całego kompleksu enzymatycznego jednocześnie, co ułatwia 

przeprowadzenie  ciągów  katalizowanych  reakcji  i  polepsza  wykorzystanie  potrzebnych  ko  faktorów,  które  są 
regenerowane przez kompleks enzymatyczny 

•

 

łatwość wydzielania produktu i biokatalizatora z mieszaniny poreakcyjnej 

•

 

wyŜsza reaktywność, przedłuŜona trwałość katalityczna enzymu 

•

 

dodatni wpływ na biologiczne właściwości mikroorganizmów – komórki są wówczas mniej podatne na  

efekty  związków  hamujących,  mają  większą  stabilność  termiczną  i  chemiczną  a  powstające  tą  drogą  produkty 
nie są zanieczyszczone białkami pochodzącymi z lizy komórek 

•

 

moŜliwość wprowadzania do reakcji duŜej koncentracji komórek co przyspiesza tempo procesu 

•

 

moŜliwość zwiększania szybkości rozcieńczania bez obawy wymycia populacji mikroorganizmów, do 

którego dochodzi podczas procesów z komórkami wolnymi 

•

 

obniŜone koszty procesów biotechnologicznych. 

 
Typy immobilizowanych biokatalizatorów: 
- preparaty pojedynczych enzymów katalizujących proste reakcje biochemiczne 
- kompleksy 2 lub więcej enzymów (reakcje złoŜone) 
- całe komórki bez zachowania ich funkcji Ŝyciowych 
- Ŝywe komórki z zachowaniem i wykorzystaniem ich aktywności metabolicznej. 
 
Kryteria wyboru techniki immobilizacji Ŝywych komórek: 
- metoda immobilizacji powinna być wystarczająco łagodna, by zapewnić zdolność do regeneracji komórek 
- proces powinien zapewnić regenerację złoŜa podczas długiego czasu działania bioreaktora 
-  technika  immobilizacji  powinna  zapewnić  osiągnięcie  w  bioreaktorze  wysokiej  koncentracji  biomasy 
i utrzymywanie jej na równym poziomie przez wydłuŜony okres działania 
- technika ta powinna być prosta i realtywnie tania 
- system im mobilizowanych komórek powinien być trwały w danych warunkach pH i temperatury. 
 
PoŜądane cechy nośnika do immobilizacji komórek: 
- neutralność wobec mikroorganizmu i środowiska 
- odporność mechaniczna na działające w bioreaktorze: 

 

24 

•

 

siły ściskania(ciśnienie hydrostatyczne) 

•

 

siły ścinające (podczas mieszania) 

- odporność na atak mikrobiologiczny 
- odporność na czynniki fizyczne, np. temperaturę 
- odporność na czynniki chemiczne, np. kwasy, zasady, rozpuszczalniki organiczne, inhibitory, toksyny. 
 
Metody immobilizacji 

1.

 

Wiązanie na powierzchni nośnika: 

•

 

Adsorpcja i adhezja dzięki siłom jonowym, wiązaniom wodorowym i innym oddziaływaniom  

fizykochemicznym. Adsorpcja do podłoŜa związana jest z oddziaływaniem sił Van der Waalsa i potencjału zeta 
(powierzchniowy ładunek elektrostatyczny wynikający z rozdziału grup COOH i NH

2

 na powierzchni komórki: 

adsorpcja  następuje  w  wyniku  odmienności  ładunku  komórki  i  nośnika.  Adhezja  komórek  do  ciał  stałych 
związana  jest  z  naturalną  właściwością  mikroorganizmów,  dzięki  której  mogą  one  tworzyć  filmy  biologiczne; 
jest  to  zakodowana  genetycznie  zdolność  do  wytwarzania  substancji  klejących  i  cementujących  (najczęściej 
polisacharydów).  Największymi  zaletami  tej  metody  są  niskie  koszty  uŜywanych  materiałów  i  łatwość 
wykonania.  Wady:  metoda  mało  uniwersalna,  wiązanie  z  nośnikiem  słabe  i  wraŜliwe  na  zmiany  warunków 
ś

rodowiska,  np.  pH,  siły  jonowej,  temperatury.  Na  stopień  i  siłę  adhezji  duŜy  wpływ  ma  rodzaj  uŜytych 

mikroorganizmów  oraz  porowatość  nośników.  W  metodach  tych  stosuje  się  nośniki  organiczne,  np.:  węgiel, 
antracyt, sephadeks, drewno i in. oraz nieorganiczne: szkło, spieki szklane, cegła, ziemia okrzemkowa, materiały 
ceramiczne, kaolin, tlenki metali i inne. 

•

 

Wiązania kowalencyjne takie jak peptydowe, estrowe, węgiel-węgiel, węgiel-azot i inne pomiędzy np. 

aktywnymi grupami ściany komórkowej a uaktywnionym nośnikiem. W wiązaniu chemicznym wykorzystuje się 
wiązania  kowalencyjne  wprowadzając  do  środowiska  wielofunkcyjne  czynniki  sprzęgające  (aldehydy,  aminy), 
które  znacznie  ograniczają  stosowanie  tej  metody  ze  względu  na  swoją  toksyczność.  Stosuje  się  nośniki 
silikonowe i ceramiczne. 

2.

 

Wiązanie w matrycy nośnika: 

Metoda  ta  polega  na  otaczaniu  komórek  przez  usieciowaną  membranę  lub  matrycę  polimerową.  Jednym 
z podstawowych  kryteriów  jest  dobór  takiego  nośnika,  którego  wielkość  porów  jest  mniejsza  od  średnicy 
komórki, ale na tyle duŜa by substrat mógł penetrować do komórki. Jest to najpowszechniej stosowana metoda 
immobilizacji, zwłaszcza w przemyśle spoŜywczymi fermentacyjnym. 
System ten moŜna realizować następującymi metodami: 

•

 

pułapkowanie w Ŝelach naturalnych lub syntetycznych – przykłady nośników: agar, alginian, karagen, 

poliakrylamid,  poliuretan,  polistyren.  Wiązanie  w  matrycy  moŜe  następować  poprzez  powstawanie 
poprzecznych  wiązań  jonowych  w  polimerach  liniowych  np.  alginianu  w  obecności  kationów  poliwalentnych 
(Ca

2+

,  Al

3+

,  Ba,  Sr

2+

).  Związanie  biokatalizatora  z  nosnikiem  moŜna  uzyskać  poprzez  wytrącanie  nośnika  na 

skutek zmian temperatury, pH lub zmianami rozpuszczalnika (Ŝelatyna, karaginian). 

•

 

pułapkowanie na włóknach – jest odmianą Ŝelowania przez wytrącanie, lecz stosuje się tu polimery 

tworzące włókna, co daje bardziej rozwiniętą powierzchnię nośnika. 

3.

 

Zamykanie wewnątrz membran półprzepuszczalnych: 

•

 

zamykanie w komórkach naturalnych, np. erytrocytach 

•

 

kapsułkowanie i mikrokapsułkowanie: kapsułki alginianowe, liposomy, kapsułki nylonowe, 

polimocznikowe,  z  pochodnych  celulozy.  Metoda  ta  polega  na  sporządzeniu  emulsji  biokatalizatora  w 
odpowiednim  medium.  Taką  emulsję  rozpyla  się  w  specjalnym  roztworze  wywołującym  powstawanie  otoczki 
wokół biokatalizatora, która selektywnie przepuszcza substraty i produkty 

•

 

zamykanie pomiędzy membranami lub w węŜach półprzepuszczalnych. 

4.

 

Unieruchamianie bez makroskopowego nośnika mechanicznego: 

•

 

sieciowanie przestrzenne, kopolimeryzacja enzymów z nośnikami rozpuszczalnymi przy uŜyciu 

odczynników dwufunkcyjnych 

•

 

flokulacja komórek przy udziale – o wydajności tej metody decydują właściwości ściany komórkowej 

•

 

samoregulacja, czyli naturalna flokulacja oraz wzrost drobnoustrojów w postaci kuleczek lub kłaczków 

biomasy. 
 
Przyczyny zmniejszania produktywności złoŜa: 
1.

 

Wymywanie enzymu lub komórek ze złoŜa, rozpuszczanie lub ścieranie się złoŜa. 

2.

 

Utrata aktywności na skutek zatruwania lub denaturacji enzymu bądź lizy komórek. 

3.

 

Pogorszenie się warunków kontaktu substratu z enzymem w wyniku zanieczyszczenia i zatkania się 

złoŜa oraz zmiany charakterystyki przepływu roztworu substratu. 
4.

 

ZakaŜenia mikrobiologiczne. 

 

25 

Zastosowanie immobilizacji: 
W przemyśle farmaceutycznym: 
- produkcja antybiotyków – ponad 60 % światowej produkcji kwasu 6-aminopenicylinowego (6-APA), z którego 
metodami  chemicznymi  lub  enzymatycznymi  otrzymuje  się  16 róŜnych  antybiotyków  lak  tamowych, 
otrzymywanych jest przy zastosowaniu im mobilizowanych biokatalizatorów; 
- produkcja hormonów i witamin; 
- inne leki. 
Produkcja aminokwasów: 
-  kwas  asparaginowy  –  transformacja  Dumaranu  do  asparginianu  poprzez  komórki  E.  coli  immobilizowane 
w karaginianie, produkcja: L-alaniny, kwasu L-glutaminowego, L-argininy. 
W przemyśle spoŜywczym: 
- produkcja alkoholu etylowego, octu,  usuwanie  laktozy z  mleka,  hydroliza  kazeiny,  skrobii, białek, produkcja 
witaminy B

12

, syropu fruktozowego, klarowanie win i soków. 

W preparatyce i ochronie środowiska: 
- produkcja aktywnych białek, peptydów, 
- wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych, 
- w ochronie środowiska (oczyszczanie ścieków). 
 
WYKONANIE ĆWICZENIA 
 

1.

 

Sprzęt i odczynniki: 

- 200 mM CaCl

2

, 

- 0,7 % i 6 alginian sodu, 
- 6 skrobia rozpuszczalna, 
- zawiesina komórek Saccharomyces cerevisiae, 
- Kolbki Erlenmayera, zlewki, krystalizatory, pipety, 
- kulki szklane i ceramiczne, 
- strzykawka, lejek do immobilizacji, 
- mieszadło magnetyczne, 
 
Zadanie 1. Unieruchomienie komórek droŜdŜy w alginianie  

Wymieszać 6 % roztwór alginianu z zawiesiną komórek droŜdŜowych w proporcji 1:1, aŜ do uzyskania 

homogennej zawiesiny. Umieścić roztwór CaCl

2

 wraz z elementem mieszającym na mieszadle magnetycznym i 

wkraplać do niego przy uŜyciu strzykawki lub specjalnego lejka do immobilizacji, mieszaninę alginian-komórki 
droŜdŜowe. 

Pozostawić utworzone kulki w roztworze CaCl

2

 na ok. 5-10 min. celem ich utwardzenia. 

 

Zadanie 2. Unieruchomienie komórek w kapsułkach alginiuanowych. 
 

Komórki  zawiesić  w  6 %  roztworze  skrobii  rozpuszczalnej.  Tak  przygotowaną  mieszaninę  wkraplać 

strzykawką do mieszającego się 0,7 % roztworu alginianu sodu. 
 

Utworzone  kapsułki  przenieść  do  roztworu  utwardzającego  –  200 mM  roztwór  CaCl

2

  i  łagodnie 

mieszać przez około 10 min. 

 

26 

 

 

METODY HODOWLI 

DROBNOUSTROJÓW 

 

 

CEL ĆWICZENIA 

Zapoznanie się z metodami hodowli drobnoustrojów, ich 

zastosowaniem oraz sposobami monitorowania ich przebiegu 

 

 

 

1.

 

PODZIAŁ HODOWLI ZE WZGLĘDU NA 
KONSYSTENCJĘ STOSOWANYCH POśYWEK 
HODOWLANYCH 
 

•

 

hodowle na podłoŜach płynnych 

•

 

hodowle na podłoŜach stałych 

 

2.

 

METODY HODOWLI DROBNOUSTROJÓW 
 

•

 

hodowle okresowe 

•

 

hodowle ciągłe 

•

 

hodowle ciągłe z recyrkulacją komórek (hodowle 
modyfikowane) 

•

 

hodowle okresowo-dolewowe (hodowle z zasilaniem) 

 

 

 

2.1.

 

HODOWLE OKRESOWE 

 

 

 

Najprostsza i najczęściej stosowana metoda hodowli.  
Hodowle  prowadzone  do  momentu  wyczerpania  się  składników 
pokarmowych  w  podłoŜu  lub  nagromadzenia  się w nim  metabolitów 
toksycznych dla mikroorganizmów. 

 

 

 

27 

 

 

2.2.

 

HODOWLE CIĄGŁE 

 

 

 
Hodowle prowadzone z ciągłym dozowaniem świeŜej poŜywki 
i jednoczesnym odprowadzaniem poŜywki zuŜytej z analogiczną 
szybkością (hodowle prowadzone przy stałej objętości płynu 
hodowlanego) 
 

•

 



T,UVT!WX!.!

 

TY,łYT[

; 

UVNV]X!

 ^_$ 

 

•

 

stan równowagi dynamicznej ustala się, gdy: D = n  

 

 

 

ZALETY HODOWLI CIĄGYCH 

 

•

 

wyeliminowanie wpływu czasu hodowli na zmiany  
warunków hodowli i fizjologię komórek 

•

 

duŜa wydajność bioprocesorów 

•

 

dobre wykorzystanie sprzętu stosowanego do hodowli 

•

 

moŜliwość automatyzacji 

 

WADY HODOWLI CIĄGŁYCH 

 

•

 

moŜliwość mutacji i degradacji szczepów 

•

 

trudność utrzymania warunków aseptycznych 

•

 

moŜliwość zmiany warunków hodowli  
(agregacja drobnoustrojów, obrastanie przewodów) 
 

 

 

ZASTOSOWANIE HODOWLI CIĄGŁYCH 

 

•

 

produkcja etanolu, kwasu mlekowego, kwasu octowego 

•

 

produkcja biomasy (bakterii, droŜdŜy i glonów)  
wykorzystywanej następnie do otrzymywania kultur 
 starterowych lub jako źródło białka 

•

 

oczyszczanie ścieków metodą osadu czynnego 
 

 

 

28 

 

 

2.3.

 

HODOWLE CIĄGŁE Z RECYRKULACJĄ KOMÓREK 
(HODOWLE MODYFIKOWANE) 

 

 

 

•

 

hodowle z zastosowaniem technik dializacyjnych oraz technik 
mikro i ultra filtracyjnych 

•

 

hodowle o wysokiej koncentracji komórek 

•

 

hodowle z ciągłym dozowaniem świeŜej poŜywki i 
jednoczesnym odbieraniem permeatu zawierającego toksyny 
lub labilny produkt 
 

 

 

2.4.

 

HODOWLE OKRESOWO-DOLEWOWE 

 

 

 

•

 

hodowle z okresowym wprowadzaniem świeŜej poŜywki lub 
niektórych jej składników (FBC) 

•

 

hodowle z cyklicznym odbieraniem części hodowli (RFBC) 

•

 

hodowle z okresowym odbieraniem części płynu 
hodowlanego i uzupełnianiem go świeŜym podłoŜem 

 

 

 

ZASTOSOWANIE HODOWLI 

OKRESOWO-DOLEWOWYCH 

 

•

 

produkcja alkoholi, kwasów organicznych, antybiotyków, 
aminokwasów, witamin, alkaloidów 

•

 

produkcja białka jednokomórkowców 
 

 

 

29 

 

 

ZADANIA DO WYKONANIA 

 

•

 

OZNACZENIE LICZBY śYWYCH KOMÓREK 
W INOKULACIE 

•

 

obliczenie ilości inokulatu potrzebnego do uzyskania 
początkowego stęŜenia komórek 10

6

 jkt/ml 

•

 

OZNACZENIE ZAWARTOŚCI GLUKOZY W POśYWCE 
I PŁYNIE HODOWLANYM 

•

 

obliczenie stopnia odfermentowania glukozy 

•

 

OZNACZENIE STĘśENIA BIOMASY 

•

 

BILANSE MATERIAŁOWE HODOWLI CIĄGŁYCH 
 

 

 

OZNACZENIE LICZBY śYWYCH KOMÓREK  

W INOKULACIE 

↓

 

24-godzinny inokulat bakterii Lb. acidophilus 

↓

 

Rozcieńczenie 10-krotnie w wodzie destylowanej  

(0,1 ml zawiesiny bakterii + 0,9 ml wody) 

dokładne wymieszanie roztworu 

↓

 

naniesienie kropli rozcieńczonej zawiesiny bakterii w miejsce 

krzyŜujących się linii komory Thoma 

↓

 

przykrycie szkiełkiem nakrywkowym 

↓

 

policzenie komórek znajdujących się w 30 losowo wybranych 

kwadratach (obiektyw 40x) 

↓

 

obliczenie średniej liczby komórek występujących w 1 kwadracie (a) 

 
 
 

OBLICZENIE CAŁKOWITEJ LICZBY śYWYCH KOMÓREK 

W INOKULACIE 

 

`  4 · 10

b

· P · I 

 
X – całkowita liczba komórek w 1 ml inokulatu 
a – średnia liczba komórek w 1 kwadracie 
b – rozcieńczenie próby 

 
 

 

30 

  
 

OBLICZENIE ILOŚCI INOKULATU POTRZEBNEGO DO 

UZYSKANIA POCZĄTKOWEGO STĘśENIA KOMÓREK 

10

6

 JTK/ML 

 

objętość płynu w bioreaktorze wynosi 3000 ml 

 

w 1 jego ml ma być 10

6

 jtk 

czyli w 3000 ml musi być 3

⋅

10

9

 jtk 

 

1 ml inokulatu mamy – (wartość obliczona) 

X               – 3

⋅

10

9

 jtk 

 

` 

63-7·c·6

d

3efg7

T!U2Vść VN-]XV.! 3efg7

  

 
 
 

OZNACZANIE ZAWARTOŚCI GLUKOZY  

W POśYWCE I PŁYNIE HODOWLANYM 

KOLORYMETRYCZNĄ METODĄ MULLERA 

 

pobranie 10 ml płynu hodowlanego z bioreaktora 

↓

 

wirowanie 10 min przy 5,5 tys obr./min 

↓

 

zlanie superantantu do probówki 

↓

 

pobranie 0,5 ml superantantu + 0,5 ml DNS-u 

↓

 

ogrzewanie 5 min superantantu we wrzącej łaźni wodnej 

↓

 

schłodzenie w strumieniu wody + 5 ml wody destylowanej 

↓

 

pomiar ekstynkcji przy długości fali 530 nm za pomocą 

spektrofotometru 

 
 
 

OBLICZENIE ZAWARTOŚCI GLUKOZY  

W POśYWCE I PŁYNIE HODOWLANYM 

 

ZaleŜność pomiędzy ekstynkcją (y),  

a zawartością glukozy w badanych płynach (x)  

opisuje równanie 

 

O  1/2  

  2O  

 
 
 

OBLICZENIE STOPNIA ODFERMENTOWANIA FLUKOZY 

 

Znając zawartość glukozy w poŜywce (100 %) oraz zawartość glukozy 

w pobranym płynie (x %) oblicz stopień jej odfermentowania 

 
 

 

31 

 
 

OZNACZENIE STĘśENIA BIOMASY 

 

pobranie 10 ml płynu hodowlanego z bioreaktora 

↓

 

wirowanie 10 min przy 5,5 tys obr./min 

↓

 

zlanie superantantu do probówki 

(do oznaczenia zawartości glukozy) 

↓

 

zawieszenie biomasy w 10 ml wody destylowanej 

(przemycie biomasy) 

↓

 

wirowanie 5 min przy 5,5 tys obr./min 

↓

 

zawieszenie biomasy w 10 ml wody destylowanej 

dokładne wymieszanie 

↓

 

pomiar transmitacji światła przechodzącego przez próby przy długości 

fali 600 nm 

 

 

 

BILANSE MATERIAŁOWE HODOWLI CIĄGŁYCH 

SZYBKOŚĆ ROZCIEŃCZANIA – D [1/h] 

 

j 

klmĘokŚĆ rkŻtuRv urwku<xykz{m 3

K|

}

7

klmĘokŚĆ rkŻtuRv u z<~ytzv €kxku<zt‚ 'klm.wklk~y<(3-7

  

 

 
 

 

32 

TECHNOLOGIE KOMPOSTOWANIA. 

 

•

 

kompostowanie w warunkach naturalnych (w pryzmach na otwartym powietrzu) 

•

 

kompostowanie w warunkach sztucznych (w komorach, na płytach fermentacyjnych, w brykietach) ze 
wstępną obróbką odpadów. 

 
Innym ostatnio stosowanym podziałem technologii kompostowania jest podział na: 

•

 

kompostowanie odpadów zmieszanych 

•

 

kompostowanie wydzielonej frakcji odpadów organicznych. 

 

WYKORZYSTANIE ODPADÓW KOMUNALNYCH W POLSCE 

 

W  1996 r.  usunięto  46,45 mln m

3

  stałych  odpadów  komunalnych,  co  stanowi  55 %  ogólnej  masy 

wytwarzanych odpadów. Wykorzystanie odpadów komunalnych jest niewielkie i sprowadza się do: 
 

1.

 

wytwarzania kompostu (218,6 tys ton odpadów poddano kompostowaniu), 

2.

 

wykorzystania do celów energetycznych gazu wysypiskowego (produkcja energii elektrycznej),  

3.

 

wyselekcjonowania w systemie zbiórki i segregacji składników o charakterze surowców wtórnych: 

•

 

papier, makulatura, 

•

 

opakowania szklane, stłuczka szklana, 

•

 

metale Ŝelazne i nieŜelazne, 

•

 

tworzywa sztuczne. 

 
Ś

rednio w kraju wykorzystanie składników wyselekcjonowanych z odpadów komunalnych nie przekracza 0,5 % 

ogólnej masy usuwanych odpadów. 
 

MATERIAŁ WYKORZYSTYWANY DO PRODUKCJI KOMPOSTU. 

 

Surowiec do przygotowania kompostu powinien zawierać odpowiednio duŜą ilość substancji organicznej, która 
musi być większa niŜ 30 %, dostateczną ilość azotu, a takŜe brak związków toksycznych. 
 
 

Do kompostowania stosuje się: 

•

 

odpady komunalne 

Zawierają  35-50 %  składników  organicznych.  Pozostałą  część  masy  stanowią  róŜnorodne  odpady 

mineralne  i  tworzywa  sztuczne.  Szacuje  się,  Ŝe  w  odpadach  komunalnych  znajduje  się  ok.  1 mln  ton 
suchej masy organicznej, która moŜe być kompostowana. Zawiera ona średnio ok. 1,5 % azotu. 

•

 

masa roślinna z terenów zieleni miejskiej, rekreacyjnej i przemysłowej 
Zieleń  miejska  i  osiedlowa  zajmuje  ok.  65000 ha  na  terenie  całego  kraju.  Przyjmując  5 ton  rocznej 
produkcji masy roślinnej z hektara otrzymujemy ok. 325 tys. ton surowca o zawartości ok. 1,5 % azotu. 

•

 

odpady z zakładów przetwórstwa rolno-spoŜywczego 

•

 

odpady z zakładów produkcji drewna i wyrobów 

•

 

osady z biologicznego oczyszczania ścieków 

Głównymi źródłami osadów ściekowych są oczyszczalnie ścieków miejskich. Chemiczne  

właściwości  osadów  z  tych  oczyszczalni  są  zbliŜone  do  osadów  z  miejskich  oczyszczalni  ścieków. 
Do nawoŜenia gleb najkorzystniejsze są osady ze ścieków przemysłu rolno-spoŜywczego. Osady stanowią ok. 1-
2 %  oczyszczanych  ścieków.  Wymagają  one  obróbki:  zagęszczenia,  stabilizacji  i  odwodnienia.  Przeciętna 
zawartość  azotu  w  osadach  wynosi  ok.  3 %.  Mają  one  wyjątkowo  korzystną  zawartość  koloidalnej  substancji 
organicznej i składników pokarmowych dla roślin. Do tych wad zaliczamy nadmierną koncentrację składników 
szkodliwych  dla  środowiska,  w  tym  głównie  metali  cięŜkich,  ponadnormatywną  obecność  chorobotwórczych 
organizmów, płynną, mazistą konsystencję, uciąŜliwość zapachową.  
 

WARUNKI KOMPOSTOWANIA 

 

•

 

odpowiedni skład chemiczny materiału wyjściowego 

•

 

odpowiedni stosunek węgla organicznego do azotu (C:N) – materiał wyjściowy C:N=17-30:1, gotowy 
kompost C:N=20-30:1. 

•

 

temperatura – pryzma zagrzewa się do 60-70 

°

C.  

Utrzymywanie tej temperatury przez kilka dni gwarantuje pełną higienizację kompostu  

i zniszczenie organizmów chorobotwórczych. 

 

33 

•

 

wilgotność – optymalny poziom zwilgocenia masy kompostowej wynosi 40-50%, 

•

 

utrzymywanie odpowiedniego pH (6,5-7,5), 

•

 

napowietrznienie 

•

 

rozdrobnienie materiału 

 

PODSTAWOWE OPERACJE TECHNOLOGICZNE 

 

1.

 

WaŜenie i rejestracja (z archiwizacją) dowoŜonych odpadów z terenu miasta na składowisko. 

2.

 

Hala  przyjęć  i  segregacji  odpadów  na  platformę  przyjęć  oraz  ich  załadunek  za  pomocą  ładowarki 
kołowej na taśmę linii segregacji. Segregacja mechaniczna w sicie i ręczna z podziałem na strumienie, 

•

 

odpady mineralne o frakcji do 20 mm, kierowane na składowisko odpadów, 

•

 

odpady o frakcji 20-100 mm, głównie odpady organiczne przeznaczone do kompostowania, 

•

 

odpady  o  frakcji  powyŜej  100 mm,  głównie  odpady  surowcowe  i  balastowe,  kierowane  są  na 
sortowniczą segregacji pozytywnej i negatywnej skąd dalej na składowisko. 

Zagęszczenie  na  prasie  wysegregowanych  odpadów  nieorganicznych  bale  o  wymiarach  80x100 cm  do 
składowania. Rozdrabnianie  wysegregowanych odpadów organicznych. Mieszanie  wysegregowanych odpadów 
organicznych z osadami ściekowymi. 
Zagospodarowanie wysegregowanych strumieni odpadów: 

•

 

surowce  wtórne  (szkło,  metale)  –  układem  przenośników  taśmowych  kierowane  są  do  kontenerów 
i dalej okresowo wywoŜone do zagospodarowania na rynku surowcowym, 

•

 

odpady niebezpieczne ze strumienia odpadów organicznych (baterie, lekarstwa, farby, opakowania po 
ś

rodkach  chemicznych)  –  układem  przenośników  taśmowych  kierowane  są  do  kontenerów  i  dalej 

okresowo wywoŜone do zagospodarowania na rynku surowcowym, 

•

 

części  organiczne  ze  strumienia  o  frakcji  powyŜej  100 mm  –  dotyczy  przede  wszystkim  mokrych 
kartonów i opakowań papierowych z zawartością części organicznej – części organiczne kierowane są 
na linię odpadów organicznych, przeznaczonych do kompostowania. 

3.

 

Kompostowanie wysegregowanych i rozdrobnionych odpadów organicznych. 

Wysegregowane  odpady  organiczne  po  rozdrobnieniu  i  zmieszaniu  z  osadami  ściekowymi  przewiezione 
z oddziału  za  pomocą  ładowarki  kołowej  do  miejsca  kompostowania  pod  wiatą.  Miejsce  to  wyposaŜone  jest 
w instalację  do  nawadniania  i  napowietrzania  (metodą  rurową)  pryzm  oraz  odwodnienia  (zbierania 
i odprowadzania  odcieków).  Odpady  formowane  są  w  pryzmy  kompostowe  o  podstawie  ok.  6m,  wysokości 
2,8 m  i  długości  65 m.  Tak  uformowane  odpady  podlegają  procesowi  kompostowania  przez  okres  ok.  4-
6 tygodni. Ogółem jest 10 linii pryzmowych, w tym 2 rezerwowe na za i wyładunek kompostowni. Pojemność 
1 linii pryzmowej odpowiada tygodniowemu przerobowi odpadów organicznych. 

4.

 

Obróbka (uszlachetnianie) kompostu. 

•

 

sortowanie frakcyjne kompostu na sicie bębnowym o prześwicie 22 mm,  

•

 

oczyszczanie  mechaniczne  kompostu  na  stole  balistycznym  z  zanieczyszczeń  mineralnych  tzw. 
Twardych spręŜystych (szkło, kamienie, ceramikę, metale, itp.), 

•

 

oczyszczanie  kompostu  z  zanieczyszczeń  nieorganicznych  lotnych  (tworzyw  sztucznych  i  folii 
opakowaniowych) metodą pneumatyczną w cyklonie. 

•

 

odsiew  i  wydzielone  zanieczyszczenia  w  procesie  uszlachetniania  kierowane  są  na  linię  odpadów 
nieorganicznych przed prasą i dalej na kwatery składowania odpadów. 

5.

 

Tymczasowe składowanie i dojrzewanie gotowego kompostu.  

sprasowanych  w  bele  odpadów  organicznych  oraz  wysegregowanych  odpadów  mineralnych  drobnych 
w kwaterze  ziemnej:  odpady  są  formowane  w  warstwy  o  wysokości  2 m,  kaŜda  2 m  warstwa  odpadów 
przesypywana  jest  warstwą  izolacyjną  o  grubości  0,2 m.  Warstwę  izolacyjną  stanowią  odpady  mineralne 
o frakcji  do  20 mm  i  inne  odpady  mineralne  oraz  masy  ziemne  pozostałe  z  robót  ziemnych  przy  budowie 
kwatery. 
 

 

34 

ENZYMY Z GRUPY OKSYDO-REDUKTAZ 

 

DYSMUTAZY NADTLENKOWE 
 
Posiadają w swoich centrach jako grupy prostetyczne aktywne jony: Ŝelaza, manganu, niklu lub miedzi + cynku 
(są metaloproteinami). Najszerzej spotykane są dysmutazy zawierające Ŝelazo lub mangan. 
Mn-dysmutazy: Propioniobacterium sp, Thermus thermophilus. 
Fe-dysmutazy: Propioniobacterium sp., Mycobacterium vaccae, E. coli, Pseudomonas ovalis. 
 
Występują powszechnie u mikroorganizmów tlenowych. 
Rozkładają  anionowe  rodniki  ponadtlenkowe  do  tlenu  cząsteczkowego  i  nadtlenku  wodoru  i  w  ten  sposób 
chronią organizmy przed niszczącym działaniem rodników ponadtlenkowych. 
 
Co to jest rodnik? 
 
To  atomy  lub  cząsteczki  posiadające  na  zewnętrznej  orbicie  pojedynczy  elektron.  DąŜąc  do  przyłączenia  lub 
oddania  elektrony  wykazują  duŜą  aktywność  chemiczną  utleniając  kaŜdy  związek,  z  którym  mają  kontakt. 
Preferowanym obiektem „ataku” rodników są związki zawierające podwójne wiązanie. U organizmów Ŝywych 
system ten jest zabójczy – skuteczną obronę stanowi glutation. 
 
Toksyczne rodniki ponadtlenkowe tworzą się w czasie cyklu redukcji chinonu 
 

„…

]†.V.

WY[2!X!

B‡‡‡‡‡‡‡C

„

85

ˆ

†YWUV]†.V.

redukcja 

 

„…

†YWUV]†.V.

 ‰

8

-!!X!

B‡‡‡‡C

„

5

Š‹

Œ]†.V.

 ‰

8

5

Š‹

UVW.

utlenianie 

 

„

85

ˆ

Œ]†.V.

 ‰

8

WY[2!X!

B‡‡‡‡‡‡‡C „…

]†.V.

 ‰Š

8

5

‹

UVW.

utlenianie 

 

Uwolnione rodniki ponadtlenkowe działają, jako czynniki redukujące lub utleniające i w ten sposób biorą udział 
w  rozkładzie  ligniny,  np.  przez  rozcinanie  pierścieni,  demetylację,  itp.  System  ten  rozkłada  wiele  innych 
związków aromatycznych. 
 
Rodnik ponadtlenkowy moŜe działać, jako czynnik utleniający, tworzący wysoko reaktywny jon Mn

3+

: 

 

O

2

•

-

 + Mn

2+

 + 2H

+

 

→

 Mn

3+

 + H

2

O

2 

 

lub, jako czynnik redukujący Ŝelazo z uwolnieniem tlenu cząsteczkowego: 
 

O

2

•

-

 + Fe

3+

 

→

 O

2

 + Fe

2+ 

 

Dalej,  2-wartościowe  jony  Ŝelaza  wchodzą  w  reakcję  z  nadtlenkiem  wodoru  i  tworzą  ekstremalnie  reaktywne 
rodniki hydroksylowe: 
 

Fe

2+

 + H

2

O

2

 

→

 Fe

3+ 

+ HO

•

 + OH

-

 (reakcja Fentona) 

 

Rodniki ponadtlenkowe mogą takŜe tworzyć rodniki hydroksylowe: 
 

O

2

•

-

 + H

2

O

2

 

→

 HO

•

 + OH

-

 + O

2

 (reakcja Hober-Weisa) 

 

Rodniki  ponadtlenkowe  w  połączeniu  z  duŜą  ilością  uwalnianego  tlenu  oraz  wespół  z  rodnikami 
hydroksylowymi tworzą system OKSYDO-REDUKUJĄCY rozkładający wiele związków pierścieniowych. 
System ten jest jednak zabójczy dla organizmów Ŝywych, dlatego produkują one dysmutazy w celu neutralizacji 
tych rodników: 

2‰Š

8

5

 2Š

WY[2!X!

B‡‡‡‡‡‡‡C 

8

‰

8

 ‰

8

 

 

 

35 

Ogólnie  zostało  zaakceptowane,  iŜ  u  wszystkich  dysmutaz  jon  metalu  (M)  katalizuje  reakcję  dysmutacji 
rodników ponadtlenkowych na drodze cyklicznego mechanizmu redukcyjno-utleniającego: 
 



cH

 ‰Š

8

5

Ž 

8H

 ‰

8

 

 



8H

 ‰Š

8

5

2

H

Ž Š

cH

 

8

‰

8

 

 

Usuwanie nadtlenku wodoru przeprowadza katalaza: 
 

2

8

‰

8

!2!-!X!

B‡‡‡‡‡C 3

8

‰   ‰

8

 

 
PEROKSYDAZY  
 
Są to enzymy katalizujące utlenianie nadtlenkiem wodoru róŜnych substratów, w tym  
aromatycznych. W reakcji dochodzi do redukcji nadtlenków. Peroksydazy zawierają w swojej cząsteczce Fe, Mn 
lub  Se.  Najpierw  tworzony  jest  kompleks  Ŝelaza  z  wodą  a  następnie  utlenianie  donatora  wodoru  AH

2

  do 

produktu A. Donatorami wodoru mogą być łańcuchy alifatyczne: 
 

Fe

3+

 (H

2

O) + H

2

O

2

 

→

 Fe

3+

 (H

2

O

2

) + H

2

O 

 

Fe

3+

 (H

2

O

2

) + AH

2 

→

 Fe

3+

 (OH) + AH + H

2

O 

 

AH + Fe

3+

 (OH) 

→

 Fe

3+

 (H

2

O) + A 

 

Do najbardziej znanych enzymów z tej grupy naleŜy peroksydaza glutationowa, odkryta w 1970 r. Jest to enzym 
zaleŜny od selenu,  gdyŜ selen, jako jedyna  grupa prostetyczna,  wchodzi  w skład centrum aktywnego  w  formie 
selenocysteiny. Enzym ten ma 4 identyczne podjednostki. 
 
Peroksydaza  ligninowa  (Fe)  katalizuje  wiele  reakcji  utleniania  w  alkilowym  łańcuchu  bocznym  związków 
ligninowych.  Do  utleniania  potrzebuje  nadtlenku  wodoru.  Rozrywa  wiązania  C

α

-C

β

  w  łańcuchach  bocznych, 

wiązania  eterowe  i  utlenia  benzylowe  grupy  alkoholowe  do  ketonów  lub  aldehydów.  Przy  utlenianiu  ligniny 
peroksydaza współdziała z alkoholem weretrylowym. 
 
OKSYDAZA CYTOCHROMOWA  
 
Enzym  z  grupy oksydaz zawierający Fe i  Cu,  uŜywający tlen, jako akceptor  wodoru.  Stanowi ostatnie ogniwo 
łańcucha oddechowego. Znana jest pod nazwami kompleks cytochrom a i cytochrom a

3

. Występuje u wszystkich 

organizmów tlenowych. 
 
MONOOKSYGENAZY 
Katalizują  wbudowanie  jednego  atomu  cząsteczkowego  tlenu  do  substratu,  podczas  gdy  2 jest  redukowany  do 
wody. 
 
DIOKSYGENAZY 
 
Katalizują  wbudowanie  2 atomów  cząsteczkowego  tlenu  (z  atmosfery)  do  substratu.  Substratami  są  często 
katechol  i  kwas  protokatechinowy.  Przy  wbudowaniu  tlenu  do  cząsteczki  zostaje  rozerwany  pierścień 
aromatyczny. W ten sposób następuje rozerwanie pierścieni benzenowych, katecholowych i innych. 
 
LAKKAZA  
 
Jest  oksydoreduktazą.  Produkują  ją  grzyby,  szczególnie  tzw.  „białej  zgnilizny  drewna”.  Katalizuje  utlenianie 
takich  monofenoli  jak  fenol,  tyrozyna,  naftol  i  krezol  oraz  utlenia  difenole  a  takŜe  kwas  indoliooctowy 
i askorbinowy. Fenole zawierające dłuŜsze łańcuchy boczne są lepszymi substratami. Kompleksy: 
 
Enzym-Cu

2+ 

+AH

2

 

Enzym-Cu

2+

 + (AH

2

)

+

 

Enzym-Cu

2+

 + Cu

+

 + O

2

 + H

+

 

Enzym-Cu

2+

 + H

2

O 

 
AH

2

 – substrat; (AH

2

)

+ 

- substrat utleniony 

 

 

36 

CHARAKTERYSTYKA ODPADÓW KOMUNALNYCH 

 

•

 

odpady domowe 

•

 

odpady z obiektów uŜyteczności publicznej 

•

 

odpady z terenów zieleni 

•

 

ś

nieg i lód 

•

 

urobek ziemny 

•

 

gruz 

•

 

odpady gospodarczo-bytowe 

 

PORÓWNANIE METOD KOMPOSTOWANIA 

 

ZALETY 

WADY 

PRYZMY 

•

 

elastyczna zmiana przepustowości 

•

 

proste urządzenia 

•

 

pracochłonne, produkujące zapachy 

•

 

bardzo duŜa powierzchnia terenu 

kontakt operatora z pryzmami 

STOS NAPOWIETRZANY 

•

 

elastyczna zmiana przepustowości 

•

 

proste urządzenia 

•

 

pracochłonne, produkujące zapachy 

•

 

bardzo duŜa powierzchnia terenu 

kontakt operatora z pryzmami 

REAKTOR MIESZANY 

•

 

pełne natlenienie mieszaniny 

•

 

pełne wymieszanie kompostu 

•

 

przyjmuje róŜne materiały strukturotwórcze 

•

 

stała objętość, brak elastyczności 

•

 

większa powierzchnia terenu 

•

 

kontakt operatora z pryzmami 

REAKTOR BEZTLENOWY 

•

 

nie musi być intensywnie mieszany 

•

 

przyjmuje róŜne materiały strukturotwórcze 

odzysk biogazu 

•

 

konieczność tlenowego dojrzewania 

 

 

KLASY KOMPOSTU DOJRZAŁEGO WEDŁUG NORMY BN-89/9103-09 

 

OZNACZENIA 

JEDNOSTKA 

MASY 

j. m. 

 

KLASA I 

KLASA II 

KLASA III 

1. CECHY CHEMICZNE: 

ZAWARTOŚĆ NIE MNIEJ NIś 

Zawartość substancji 

organicznej 

% s. m. 

40 

30 

20 

Zawartość azotu 

ogólnego 

% s. m. 

0,8 

0,6 

0,3 

Zawartość potasu 

K

2

O  

% s. m. 

0,2 

0,1 

0,1 

Zawartość fosforu 

P

2

O

5

 

% s. m. 

0,6 

0,4 

0,3 

Zawartość wody 

% 

25-40 

25-40 

50 

Odczyn (pH w H

2

O) 

pH 

6,5-8,0 

6,5-8,0 

6,0-9,0 

2. ZAWARTOŚĆ METALI CIĘśKICH  

ZAWARTOŚĆ NIE WIĘCEJ NIś 

MIEDŹ Cu 

mg/kg s. m. 

300 

600 

800 

CYNK Zn 

mg/kg s. m. 

1500 

2500 

2500 

NIKIEL Ni 

mg/kg s. m. 

100 

200 

200 

CHROM Cr 

mg/kg s. m. 

300 

500 

800 

OŁÓW Pb 

mg/kg s. m. 

350 

500 

800 

KADM Cd 

mg/kg s. m. 

5 

15 

25 

 
 
 
 

 

37 

ROZKŁAD MATERII ORGANICZNEJ I SYNTEZY PRÓCHNICY 

 

 

 

38 

Technologia kompostowania metodą „Brikollare” 

 

 

 

 

39 

KOMPOSTOWNIA SYSTEMU ROZDRABNIARKOWEGO [Skaranowski, 1999] 

 

 

 

1.

 

Przenośnik stalowo-członowy 

2.

 

Przesiewacz wstępny 

3.

 

Rozdrabniarka młotkowa 

4.

 

Separator elektromagnetyczny 

5.

 

Mieszalnik homogenizujący z sitem bębnowym 

6.

 

Przerzucarka kompostu 

7.

 

Instalacja napowietrzania pryzm kompostowych 

8.

 

Filtr kompostowy 

9.

 

Przesiewacz wibracyjny 

10.

 

Odsiewacz cząsteczek twardych 

 
 

KOMPOSTOWNIA SYSTEMU DANO [Skaranowski, 1999] 

 

 

 

1.

 

Przenośnik płytowy 

2.

 

Przenośnik taśmowy odpadów 

3.

 

Przenośnik taśmowy odpadów 

4.

 

Biostabilizator 

5.

 

Przenośnik taśmowy balastu 

6.

 

Przenośnik 

taśmowy 

kompostu 

7.

 

Przenośnik taśmowy balastu 

8.

 

Przenośnik taśmowy balastu 

9.

 

Sito wibracyjne 

10.

 

Przenośnik 

taśmowy 

kompostu 

11.

 

Oddzielacz części twardych 

12.

 

Oddzielacz 
elektromagnetyczny 

13.

 

Sito bębnowe 

14.

 

Przenośnik 

taśmowy 

kompostu dojrzałego 

15.

 

Pojemnik na złom Ŝelazny 

16.

 

Pojemnik na złom Ŝelazny 

17.

 

Pojemnik na części twarde 

18.

 

Przenośnik 

taśmowy 

kompostu uszlachetnionego 

19.

 

Pojemnik na odsiewy 

20.

 

Przenośnik 

taśmowy 

kompostu surowego 

21.

 

Wentylator wyciągowy gazów 

 

 

 

40 

KOMPOSTOWNIA SYSTEMU HERHOFF [Skaranowski, 1999] 

 

 

 
 

KOMPOSTOWNIA MOBILNA (ORGANIC 90) [Jurasz, 1998] 

 

 

 

1.

 

Kompostownik – Organic 90; 2. Rozdrabniarka; 3. Ładowarka 

 

 

41 

KONTENEROWE URZĄDZENIE DO KOMPOSTOWANIA – SCHEMAT TECHNOLOGII HORTSMANN 

[Jurasz, 1998] 

 

 

 

 

42 

BADANIE CZYSTOŚCI MIKROBIOLOGICZNEJ WODY PITNEJ I POWIETRZA 

 

Cel ćwiczenia 
Celem ćwiczenia jest oznaczenie stanu sanitarno-biologicznego wody pitnej i powietrza. 
 
Zadania do wykonania 

1.

 

Oznaczyć  czystość  mikrobiologiczną  wody  pitnej  metodą  tradycyjną  oraz  metodą  filtrów 
membranowych 

 

a)

 

Metoda tradycyjna 

Wodę  pobierz  do  jałowej  kolby,  a  następnie  dodaj  do  niej  kroplę  roztworu  tiosiarczanu  sodu  niezbędnego 
do inaktywacji  chloru.  W  celu  określenia  czystości  mikrobiologicznej  z  badanej  wody  wykonaj  posiewy 
w kierunku: 

•

 

ogólnej liczby bakterii mezofilnych – posiew na agar odŜywczy 

Jałową  pipetą  pobierz  1ml  badanej  wody  i  przenieś  na  2 równoległe  płytki  Petriego.  Płytki  zalej  następnie 
upłynnionym  podłoŜem  agarowym  (agarem  odŜywczym,  bulionem  odŜywczym  lub  bulionem  wzbogaconym) 
i inkubuj  w  temperaturze  37 

°

C  przez  24-48  h.  Posiewy  wykonuj  bezpośrednio  z  pobranej  wody  lub  po  jej 

rozcieńczeniu zaleŜnie od przewidywanego stopnia jej zakwaszenia (po konsultacji z prowadzącym ćwiczenia). 

•

 

ogólnej liczby bakterii psychrofilnych – posiew na agar odŜywczy 

Posiew  wykonaj  w  analogiczny  sposób  jak  posiew  mający  na  celu  oznaczenie  ogólnej  liczby  bakterii 
mezofilnych. Posiane płytki inkubuj w temp. 20 

°

C przez 72 h.  

•

 

obecności bakterii z grupy coli ogólnego – posiew na podłoŜe z LBP, tj. podłoŜe laktozowe z purpurą 
bromokreaolową 

W  celu  oznaczenia  obecność  bakterii  z  grupy  coli  posiej  100 ml  wody  na  podwójne  stęŜone  podłoŜe  aLBP  – 
50 ml wody do kolbki zawierającej 50 ml podłoŜa i po 10ml do 5 probówek z 10 ml poŜywki LBP. Zaszczepione 
próby inkubuj w temp. 37 

°

C przez 24-48 h.  

 

b)

 

Metoda filtrów membranowych 

Zmontuj aparat do filtracji. Za pomocą jałowej pęsety przenieś specjalny filterek na porowatą powierzchnię filtra 
zestawu filtracyjnego. Zamocuj lejek, a następnie przeprowadź filtrację wody w celu oznaczenia: 

•

 

ogólnej liczby bakterii mezofilnych 

Do lejka wlej ok. 100ml jałowej wody i 1ml wody badanej. Włącz pompkę układu filtracyjnego. Po zakończeniu 
filtracji wyłącz ja i przenieś filtr na przygotowaną płytkę (Perti-Pad) zalaną uprzednio podłoŜem pozwalającym 
na oznaczenie ogólnej liczby bakterii, płytki inkubuj w pozycji odwróconej w temp. 37 

°

C przez 24-48 h. 

•

 

ogólnej liczby bakterii psychrofilnych – posiew na agar odŜywczy 

Posiew  wykonaj  w  analogiczny  sposób  jak  posiew  mający  na  celu  oznaczenie  ogólnej  liczby  bakterii 
mezofilnych. Posiane płytki inkubuj w temp. 20 

°

C przez 72 h.  

•

 

ogólnej liczby bakterii z grupy coli 

Filtracji poddaj 100 ml badanej wody. Filterki umieść na płytce zawierającej podłoŜe Endo i inkubuj je w temp. 
37 

°

C przez 24-48 h. 

•

 

ogólnej liczby bakterii coli typu fekalnego 

Filtracji  poddaj  100ml  badanej  wody.  Filterki  umieść  na  płytce  zawierającej  podłoŜe  MF  i  inkubuj  je  w  temp. 
44 

°

C przez 24-48 h. 

•

 

ogólnej liczby bakterii z rodzaju Streptococus 

Filtracji poddaj 100 ml badanej wody. Filterki umieść na płytce selektywnej na streptokoki i inkubuj je w temp. 
37 

°

C przez 24-48 h. 

 

2.

 

Oznaczyć  czystość  mikrobiologiczną  powietrza  metodą  tradycyjną  oraz  z  zastosowaniem 
próbnika powietrza. 

a)

 

Metoda tradycyjna czyli sedymentacyjna metoda Kocha (metoda płytkowa) 

W celu określenia stanu sanitarno-higienicznego powietrza w wybranym miejscu pomieszczenia ustaw 2 płytki 
z agarem odŜywczym i 1 płytkę z brzeczką + agar. Zdejmij wieczka z płytek i pozostaw je na 15 min. W trakcie 
ekspozycji ogranicz ruchy wokół miejsca z ustawionymi płytkami. Płytki zamknij i inkubuj w temperaturze: 

•

 

20 

°

C przez 72 h – płytka z agarem odŜywczym (ogólna liczba bakterii psychrofilnych) 

•

 

37 

°

C przez 24-48 h – płytka z agarem odŜywczym (ogólna liczba bakterii mezofilnych) 

•

 

20 

°

C przez 72 h – płytka z brzeczką (ogólna liczba droŜdŜy i pleśni). 

 

43 

b)

 

Metoda z zastosowaniem próbnika powietrza 

Próbniki  powietrza  to  specjalnie  skonstruowane  aparaty  do  kontroli  jakości  mikrobiologicznej  powietrza. 
Aparaty te są wyposaŜone w czujniki przepływu powietrza, które zapewniają pobór określonej ilości powietrza 
gwarantując tym samym powtarzalność wyników. W próbnikach zamontowuje się specjalne płytki z zestalonym 
podłoŜem  –  bulionem  do  oznaczenia  ogólnej  liczby  bakterii  oraz  z  brzeczką  słuŜącą  do  oznaczania  ogólnej 
liczby droŜdŜy i pleśni.  
Ustaw aparat na pobór 100 l powietrza. Metalową pokrywkę próbnika przetrzyj alkoholem. Zdejmij wieczko ze 
specjalnej płytki i umieść ją w próbniku. Przykręć pokrywkę i włącz aparat. Po przepuszczeniu 100 l powietrza 
wyjmij płytkę i zamknij ją.  
W  celu  określenia  stanu  sanitarno-biologicznego  powietrza  dokonaj  analogicznych  posiewów  jak  w  metodzie 
tradycyjnej czyli 2 posiewów  na płytki z agarem odŜywczym (zestalonym bulionem) oraz 1 posiewu  na płytkę 
z brzeczką + agar. Po wykonaniu płytki inkubuj w temperaturze: 

•

 

20 

°

C przez 72 h – płytka z agarem odŜywczym (ogólna liczba bakterii psychrofilnych) 

•

 

37 

°

C przez 24-48 h – płytka z agarem odŜywczym (ogólna liczba bakterii mezofilnych) 

•

 

20 

°

C przez 72 h – płytka z brzeczką (ogólna liczba droŜdŜy i pleśni). 

 
 
 

 

 
 
 

 

 

44 

ZADANIA

 

 

1.

 

Oblicz parametry K

m

 i V

max

 30 min reakcji enzymatycznej hydrolizy skrobi w stęŜeniach 0,2; 0,4; 0,6; 

0,8 i 1,0 % w wyniku której otrzymano produkt końcowy (glukozę) w następujących odpowiednich dla 
stęŜeń substratu ilościach: 0,7; 1,0; 1,3; 1,7 i 1,94 [mg/ml]. 

 
2.

 

Mając dane równania prostych regresji zaleŜności odwrotności szybkości przebiegu reakcji od stęŜenia 
substratu: 

y = 0,05x + 0,025 
y = 0,066x + 0,02 
wyciągnij wnioski o rodzaju inhibicji. 
 
3.

 

Podaj  model  kinetyczny  reakcji  wykorzystania  laktozy  przez  bakterie  Escherischia  coli  rosnących  na 
poŜywkach  zawierających  laktozę  w  ilości  10;  5;  2,5  i  1 g/l.  Szybkość  wykorzystania  tego  cukru 
wynosiła  odpowiednio  2,5;  2;  1,5  i  1 g/l 

⋅

  h.  Oblicz  przewidywaną  szybkość  wykorzystania  laktozy, 

przy początkowym jej stęŜeniu 1,5 g/l. 

 
4.

 

Wyznacz parametry K

m

 i V

max

 oraz określ typ inhibicji aktywności alkalicznej fosfatazy przez fosforany, 

mając do dyspozycji następujące dane: 

 

StęŜenia substratu 

[A] x 10

3

 M 

Szybkość reakcji 

V

0

 

Szybkość reakcji z inhibitorem 

V

i

 

5,85 
4,76 
3,51 
2,34 
1,17 

0,833 
0,800 
0,763 
0,667 
0,500 

0,488 
0,425 
0,345 
0,274 
0,159 

 
5.

 

Oblicz jaka ilość inokulum jest niezbędna do zaszczepienia 3l poŜywek hodowlanych aby po inokulacji  

w ich w kaŜdym ml było 10

6

 komórek. 

 
6.

 

Wiedząc, Ŝe szybkość rozcieńczenia to stosunek V poŜywki doprowadzanej do reakcji do V poŜywki 

wypełniającej  bioreaktor  oblicz,  jaka  powinna  być  szybkość  dodania  poŜywki  maltozy  wprowadzonej  do 
bioreaktora z 3 l poŜywki hodowlanej w ciągu 5 h, aby szybkość rozcieńczenia wynosiła 0,05 l/h. 
 
szybkość = x/3 l 
x = 0,09 

⋅

 5 

x = 0,45 [l] 
x = 450 [ml] 
x 

⋅

 5 h = ilość poŜywki 

 

7.

 

Oblicz, jaką V świeŜej poŜywki naleŜy wprowadzić do bioreaktora w ciągu 1 h, aby po 20 h hodowli 

wymienić całą V roboczą bioreaktora (5 l poŜywki) oraz wyznacz szybkość rozcieńczania. 
 
X – 1 h 
5 l – 20 h 
x = 0,25 l = 250 ml 
V = 250/5000 = 0,05 [h

-1

] 

 
Ile ml inokulum o c = 4,3

⋅

10

9

 naleŜy dodać do 3000 ml aby uzyskać 10

6

 komórek? 

4,3

⋅

10

9

 – 3000 

1

⋅

10

6

 – x 

 

x = 3:4,3 = 0,7 
W 1 ml ma być 10

8

, czyli w 3000 musi być 3

⋅

10

9

 

1 ml (inokulatu – c.obl) 
x – 3

⋅

10

9

 

x = (3

⋅

10

9 

⋅

 1 ml)/zawartość obliczeniowa 

 

45 

8.

 

Mając daną gęstość komórek w kulturze macierzystej wynoszącą 2x10

10

 kom/ml oblicz, jaka ilość 

inokulum jest niezbędna do zaszczepienia 3 l poŜywki hodowlanej w bioreaktorze, aby po inokulacji w kaŜdym 
jej ml było 10

8

 komórek. 

 

3000

⋅

10

8

 = 3x10

11

 kom 

2

⋅

10

10

 kom – 1ml 

30

⋅

10

10

 – x ml 

x = 15 ml – trzeba przenieść do bioreaktora 

 
9.

 

Szybkość rozcieńczania D [1/h] 

 

D = obj. poŜywki wprowadzanej do reaktora [ml/h]/ obj. poŜywki w naczyniu hodowlanym [ml] 

 

Wiedząc, Ŝe szybkość rozcieńczania to stosunek objętości poŜywki doprowadzanej do reaktora do obj. poŜywki 
wypełniającej bioreaktor, oblicz jaką ilość poŜywki naleŜy wprowadzić do bioreaktora z 3 l poŜywki hodowlanej 
w ciągu 5 h, aby szybkość rozcieńczania wynosiła 0,03 h

-1

. 

0,03 

‘

’

“ 

”3

•–

—

7

c3˜‘7

  

 
X = 90 [ml/h] 
CZYLI 
X⋅5h  90 · 5  450 3ml7  

 
10.

 

Oblicz, jaką objętość świeŜej poŜywki naleŜy wprowadzić do bioreaktora w ciągu 1 h, aby po 20 h 

hodowli  wymienić  całą  objętość  roboczą  bioreaktora  –  5 l  płynu  hodowlanego  oraz  wyznacz  szybkość 
rozcieńczania. 

 

5000 ml – 20 h 
x – 1 h 
x = 250 ml/h 

 

D = 250 [ml/h]/5000 [ml] = 0,05 [l/h]