KATEDRA BIOCHEMII
Wydział Biologii i Ochrony
Środowiska
HODOWLE OKRESOWE
DROBNOUSTROJÓW
PODSTAWY
BIOTECHNOLOGII
1
l. Wstęp teoretyczny.
Wzrost drobnoustrojów to przyrost ich objętości, masy, a także podział komórek. Jest on
uwarunkowany syntezą materiału komórkowego (białka, kwasy nukleinowe, nukleotydy), tworzeniem
nowych organelli komórkowych a także dobudowywaniem nowych struktur do już istniejących (ściana
komórkowa, błona cytoplazmatyczna). Tempo wzrostu drobnoustrojów jest uzależnione od składu
podłoża hodowlanego oraz od odczynników fizykochemicznych, takich jak temperatura, pH, potencjał
redox. Maksymalny wzrost można osiągnąć tylko wówczas, gdy składniki podłoża znajdują się w
wystarczających ilościach, gdy nie zachodzi limitowanie wzrostu przez któryś ze składników oraz gdy
zapewnione są optymalne warunki pH, temperatury itp. Mówimy wtedy o warunkach wzrostu
,,nieograniczo
nego”. W hodowli periodycznej (okresowej) warunki takie mają miejsce tylko w
początkowym okresie wzrostu. W następnych okresach następuje zmniejszenie stężenia składników
odżywczych oraz nagromadzenie produktów metabolizmu tj. kwasów organicznych czy alkoholi, co
w
pływa na wzrost drobnoustrojów.
W warunkach hodowli okresowej, gdzie tylko w początkowym okresie ma miejsce wzrost
nieograniczony, wyróżnić możemy charakterystyczne fazy wzrostu: fazę przygotowawczą (lag-faza),
fazę logarytmicznego wzrostu (log-faza), fazę stacjonarną (równowagi) i fazę zamierania hodowli.
W warunkach wzrostu nieograniczonego, a więc w pierwszej fazie hodowli okresowej,
drobnoustroje dzielą się z jednakową szybkością. Liczba ich wzrasta zgodnie z postępem
geometrycznym: 2
0
, 2
1
, 2
2
, 2
3
.. 2
n
. Jeśli w jednostce objętości hodowli na początku znajdowało się N
0
komórek, to po n podziałach będzie ich:
N = N
0
2
n
gdzie:
N
0
= ilość początkowa komórek (j.t.k) w godzinie t = 0 (t
0
)
N = ilość komórek (j.t.k) po czasie t
1
, h
Logarytmując to równanie otrzymamy:
Log N = log N
0
+ n log 2
Wyliczając z tego równania liczbę podziałów n, otrzymujemy:
n =
log N
– log N
0
log 2
Wprowadzając pojęcie częstości podziałów v, czyli liczbę podziałów komórek w ciągu czasu t,
możemy zapisać, że:
v =
n
=
log N
– log N
0
t
log 2 (t
– t
0
)
gdzie:
t
0
- czas w godzinie t = 0, h
t
1
– czas kolejnego pomiaru, h
Czas niezbędny dla podziału komórki nazywamy wiekiem osobniczym g.
g =
t
=
1
n
v
KATEDRA BIOCHEMII
Wydział Biologii i Ochrony
Środowiska
HODOWLE OKRESOWE
DROBNOUSTROJÓW
PODSTAWY
BIOTECHNOLOGII
2
2. Wykonanie.
2A. HODOWLA OKRESOWA
Celem ćwiczenia jest sprawdzenie szybkości rozkładu fenolu (F) oraz 2-metylofenolu (2-MF)
w różnych układach hodowlanych przez szczep Stenotrophomonas maltophilia KB2 w pożywce
mineralnej (g/l: Na
2
HPO
4
12H
2
O, 4; KH
2
PO
4,
0,5; NH
4
Cl, 0,5; MgSO
4
7H
2
O, 0,1; ekstrakt
drożdżowy 0,1) z dodatkiem TMS (ang. Trace Mineral Solution) o składzie: FeSO
4
7H
2
O 3,82 g;
CoSO
4
7H
2
O 295 mg; MnSO
4
H
2
O 82 mg; ZnSO
4
7H
2
O 141 mg; H
3
BO
3
6 mg; Na
2
MoO
4
2H
2
O
40 mg; NiSO
4
7H
2
O 82 mg; CuSO
4
5H
2
O 2,9 mg; Al
2
(SO
4
)
3
18H
2
O 148 mg; Na
2
WO
4
2H
2
O 6
mg.
W tym celu należy założyć hodowlę bakterii w podłożu płynnym o objętości 100 ml, zgodnie z
Tabelą I po jej uprzednim uzupełnieniu:
Tabela I
Stężenie F,
mg/L
Objętość r-ru F
o stężeniu 7,5 g/L,
ml
Objętość
TMS, ml
Objętość
pożywki
mineralnej,
ml
Objętość hodowli
szczepu, ml
Objętość pożywki
mineralnej użyta do
uzupełnienia objętości
hodowli do 100 ml
70
0,1
80
140
0,1
80
Stężenie
2-MF, mg/L
Objętość r-ru 2-MF
o stężeniu 8,7 g/L,
ml
Objętość
TMS, ml
Objętość
pożywki
mineralnej,
ml
Objętość hodowli
szczepu, ml
Objętość pożywki
mineralnej użyta do
uzupełnienia objętości
hodowli do 100 ml
81
0,1
80
162
0,1
80
1.
W każdej kolbie określić:
a.
gęstość hodowli poprzez pomiar absorbancji przy
= 600 nm
b.
wyjściowe stężenie fenolu lub 2-metylofenolu poprzez pomiar metodą kolorymetryczną
z p-
nitroaniliną.
2.
Wyniki umieścić w Tabeli II.
3. Kolby
umieścić na wytrząsarce w temperaturze 30°C.
4.
W odstępach 30-minutowych określać:
a.
gęstość hodowli poprzez pomiar absorbancji przy
= 600 nm
b.
stężenie wprowadzonego źródła węgla poprzez oznaczanie jego stężenia metodą
kolorymetryczną.
5.
Wyniki umieszczać na bieżąco w Tabeli IV oraz w arkuszu programu Excel.
UWAGA! Zachować sterylne warunki w trakcie pracy!!!
KATEDRA BIOCHEMII
Wydział Biologii i Ochrony
Środowiska
HODOWLE OKRESOWE
DROBNOUSTROJÓW
PODSTAWY
BIOTECHNOLOGII
3
METODYKA OZNACZEŃ
Oznaczanie
stężenia fenolu/2-metylofenolu metodą kolorymetryczną z p-nitroaniliną
1.
Pobrać sterylnie 1 ml hodowli i umieścić w probówce typu Eppendorf. Zawartość probówki wirować
przez 5 min przy 12000 rpm w temperaturze 4
C.
2.
Do szklanej probówki miarowej wprowadzić 0,5 ml odwirowanej hodowli (supernatant) albo jej
odpowiednie rozcieńczenie, tj. na przykład rozcieńczenie 10-krotne uzyskuje się poprzez pobranie
50
l supernatantu i 450
l wody destylowanej.
3.
Dodać 2 ml wody destylowanej.
4.
Wprowadzić 0,5 ml zdwuazowanej p-nitroaniliny (otrzymanej poprzez odbarwienie roztworu
p-nitroaniliny
o barwie żółtej z użyciem 2% NaNO
2
)
– przygotowywać zawsze na świeżo!
5.
Dodać 0,25 ml 10% Na
2
CO
3
.
6.
Wprowadzić 0,5 ml 10% NaOH.
7.
Uzupełnić probówkę do objętości 5 ml poprzez wprowadzenie 1,25 ml wody destylowanej.
8.
Jednocześnie przygotować próbę ślepą w identyczny sposób, zastępując supernatant
odwirowanej hodowli,
wodą destylowaną.
9.
Po wymieszaniu zmierzyć absorbancję przy
= 550 nm względem próby ślepej.
10.
Do przeliczeń stężeń F/2-MF stosować równanie krzywej kalibracyjnej A = b * c
fenolu/2-metylofenolu
,
gdzie A to absorbancja przy
= 550 nm, c
to stężenie związków aromatycznych w mg/L, b =
współczynnik kierunkowy krzywej kalibracyjnej.
Wyznaczanie wzrostu bakterii poprzez pomiar absorbancji przy
= 600 nm
Pobrać sterylnie po 1 ml hodowli z każdego układu i zmierzyć absorbancję przy długości fali
=
600 nm z użyciem spektrofotometru HELIOS wobec próby ślepej, którą stanowi woda destylowana.
KATEDRA BIOCHEMII
Wydział Biologii i Ochrony
Środowiska
HODOWLE OKRESOWE
DROBNOUSTROJÓW
PODSTAWY
BIOTECHNOLOGII
4
Wyznaczenie krzywej kalibracyjnej do oznaczania stężenia fenolu
Krzywą kalibracyjną do oznaczania stężenia fenolu wykonać zgodnie z instrukcją do oznaczania
stężenia F metodą kolorymetryczną z p-nitroaniliną oraz tabelą II. Wyniki pomiaru absorbancji przy
=
550 nm umieścić w tabeli II. Na podstawie uzyskanych wyników wyznaczyć współczynnik kierunkowy
krzywej kalibracyjnej.
Tabela II
L.p
Stężenie
F, mg/L
Objętość F
(470,6 mg/L), ml
Woda,
ml
p-nitroanilina
zdwuazowana,
ml
10% Na
2
CO
3
,
ml
10% NaOH,
ml
Woda,
ml
Absorbancja,
= 550 nm
1
0,0
0,00
2,50
0,5
0,25
0,5
1,25
2
9,4
0,01
2,49
0,5
0,25
0,5
1,25
3
18,8
0,02
2,48
0,5
0,25
0,5
1,25
4
28,2
0,03
2,47
0,5
0,25
0,5
1,25
5
37,6
0,04
2,46
0,5
0,25
0,5
1,25
6
47,1
0,05
2,45
0,5
0,25
0,5
1,25
7
56,5
0,06
2,44
0,5
0,25
0,5
1,25
8
65,9
0,07
2,43
0,5
0,25
0,5
1,25
9
75,3
0,08
2,42
0,5
0,25
0,5
1,25
10
84,7
0,09
2,41
0,5
0,25
0,5
1,25
11
94,1
0,10
2,4
0,5
0,25
0,5
1,25
Równanie krzywej: ……………………………………………………………………………………….
KATEDRA BIOCHEMII
Wydział Biologii i Ochrony
Środowiska
HODOWLE OKRESOWE
DROBNOUSTROJÓW
PODSTAWY
BIOTECHNOLOGII
5
Wyznaczenie krzywej kalibracyjnej do oznaczania stężenia 2-metylofenolu
Krzywą kalibracyjną do oznaczania stężenia 2-metylofenolu wykonać zgodnie z instrukcją do
oznaczania stężenia 2-MF metodą kolorymetryczną z p-nitroaniliną oraz tabelą III. Wyniki pomiaru
absorbancji przy
= 550 nm umieścić w tabeli. Na podstawie uzyskanych wyników wyznaczyć
współczynnik kierunkowy krzywej kalibracyjnej.
Tabela III
L.p
Stężenie
2-MF,
mg/L
Objętość 2-MF
(540,7 mg/L), ml
Woda,
ml
p-nitroanilina
zdwuazowana,
ml
10% Na
2
CO
3
,
ml
10% NaOH,
ml
Woda,
ml
Absorbancja,
= 550 nm
1
0,0
0,00
2,50
0,5
0,25
0,5
1,25
2
10,8
0,01
2,49
0,5
0,25
0,5
1,25
3
21,6
0,02
2,48
0,5
0,25
0,5
1,25
4
32,4
0,03
2,47
0,5
0,25
0,5
1,25
5
43,3
0,04
2,46
0,5
0,25
0,5
1,25
6
54,1
0,05
2,45
0,5
0,25
0,5
1,25
7
64,9
0,06
2,44
0,5
0,25
0,5
1,25
8
75,7
0,07
2,43
0,5
0,25
0,5
1,25
9
86,5
0,08
2,42
0,5
0,25
0,5
1,25
10
97,3
0,09
2,41
0,5
0,25
0,5
1,25
11
108,1
0,10
2,4
0,5
0,25
0,5
1,25
Równanie krzywej: ……………………………………………………………………………………….
KATEDRA BIOCHEMII
Wydział Biologii i Ochrony
Środowiska
HODOWLE OKRESOWE
DROBNOUSTROJÓW
PODSTAWY
BIOTECHNOLOGII
6
WYTYCZNE DO PRZYGOTOWANIA SPRAWOZDANIA
Z ĆWICZEŃ „HODOWLE CIĄGŁE I PERIODYCZNE”
Sprawozdanie przygotować należy w postaci prezentacji PowerPoint, nie przekraczającej
20
slajdów.
1.
Slajd tytułowy: tytuł ćwiczenia, nazwiska i imiona, numery indeksów sprawozdających, grupa
ćwiczeniowa.
2.
Cele ćwiczenia.
3.
Metodyka pracy i teoretyczne podstawy oznaczeń (z uwzględnieniem krzywych kalibracyjnych dla
kolorymetrycznego oznaczania stężenia substratów aromatycznych).
4.
Wyniki należy przedstawić w postaci tabel oraz wykresów. Wykresy powinny mieć opisane osie,
legendę oraz odpowiednią skalę. Należy skomentować otrzymane wyniki i zaproponować
wnioski adekwatnie do celów ćwiczenia.
5. Hodowla okresowa
– analiza wyników uzyskanych przez grupy ćwiczeniowe powinna zawierać:
Tabele prezentujące całość wyników, wartości średnie i odchylenia standardowe gęstości
hodowli i stężenia substratów aromatycznych w kolejnych punktach pomiarowych;
Wykresy zmian
gęstości hodowli i stężenia substratów aromatycznych w czasie dla wartości
uśrednionych (osobno dla różnych stężeń związków aromatycznych);
Porównanie czasu trwania poszczególnych faz wzrostu prowadzonych hodowli
Wyznaczenie szybkości rozkładu substratów aromatycznych wprowadzonych w różnych
stężeniach;
8.
Przedstawienie obliczeń i wyników zadania teoretycznego „Wyznaczanie wzrostu bakterii metodą
płytkową”.
9.
Samoocena
grupy
i
samoocena
poszczególnych
studentów
w
postaci
tabeli
z UZASADNIENIEM tej oceny.
KATEDRA BIOCHEMII
Wydział Biologii i Ochrony
Środowiska
HODOWLE OKRESOWE
DROBNOUSTROJÓW
PODSTAWY
BIOTECHNOLOGII
7
Tabela IV
F
2-MF
……………………..mg/L
…………………….. mg/L
…………………….. mg/L
…………………….. mg/L
Pomiar
Czas,
00:00
Rozc.
A
600
A
550
C,
mg/L
A
600
A
550
C,
mg/L
A
600
A
550
C,
mg/L
A
600
A
550
C,
mg/L
0
:
1
:
2
:
3
:
4
:
5
:
6
:
7
:
8
: