Art-9-Hal.pdf

* Praca została wykonana w ramach projektu badawczego Nr 5 PO6G 045 19 finansowanego

przez Komitet Badań Naukowych w latach 2000–2002

Biotechnologia 2(1-2) 2003, 73-81

AKTYWNOŚĆ PROTEOLITYCZNA SZCZEPÓW
DROśDśY POCHODZĄCYCH Z SERÓW ROKPOL*

Agata Czajgucka, Józefa Chrzanowska, Piotr Juszczyk,
Marek Szołtysik, Maria Wojtatowicz

Streszczenie.  Przedmiotem  badań  było  7  szczepów  droŜdŜy  wyizolowanych  z  serów  z
przerostem pleśniowym Rokpol. NaleŜały one do takich gatunków, jak: Candida famata,
C.  sphaerica,  C.  intermedia,  C.  kefyr,  Geotrichum  penicillatum,  Yarrowia  lipolytica  i
Saccharomyces  kluyveri.  U  wszystkich  szczepów  wykazano  duŜe  zróŜnicowanie  w  po-
ziomie  aktywności  zewnątrz- i  wewnątrzkomórkowych endopeptydaz. Enzymy te  wyka-
zywały  teŜ  róŜną  dynamikę  degradacji  kazeiny.  Najbardziej  aktywne  spośród  nich  były
proteazy  szczepu  Y.  lipolytica  PII6a.  NajwyŜszą  aktywność  pozakomórkowe  proteazy
wszystkich szczepów droŜdŜy wykazywały wobec kazeiny w pH 7.0-7.5, a wewnątrzko-
mórkowe w pH 6.0–7.5. Ich aktywność ulegała hamowaniu pod wpływem PMSF i DFP.
Natomiast optimum aktywności zewnątrzkomórkowych  enzymów degradujących hemo-
globinę przypadało w pH 3.5–4.0.

Słowa kluczowe: droŜdŜe, sery, aktywność proteolityczna, właściwości proteaz

WSTĘP

DroŜdŜe są waŜnym składnikiem mikroflory wielu typów serów, szczególnie mięk-

kich i pleśniowych [Fleet 1987, Suzzi i in. 2001]. Stanowią one jednak bardzo zmienną
grupę mikroorganizmów, które mogą wywierać tak pozytywny jak i negatywny wpływ
na przebieg procesu dojrzewania serów [Fleet 1992].

W ostatnich latach podejmowane są szeroko zakrojone badania obejmujące charak-

terystykę metabolizmu i fizjologii droŜdŜy izolowanych z serów [Vivier 1994, Jakobsen
i  Narvhus  1996,  Viljoen  1998].  Ich  celem  jest  wyselekcjonowanie  z  tego  środowiska
szczepów  o  najbardziej  przydatnych  z  technologicznego  punktu  widzenia  cechach  dla
serowarstwa.  Prowadzone  są  juŜ    próby  wykorzystania  niektórych  szczepów  droŜdŜy
jako  ko-starterów  w  produkcji  serowarskiej  [Wyder  i  Puhan  1999a,b].  Pozwoli  to  na
pełniejszą kontrolę tej mikroflory  w serach, a tym samym moŜe zapewnić otrzymywa-
nie  produktów  o  wystandaryzowanych  cechach  jakościowych.  Szczególnie  przydatne,
jako szczepionki, okazały się droŜdŜe charakteryzujące się wysoką aktywnością hydro-
lityczną,  szczególnie  proteolityczną  [van  Tempel  i  Jakobsen  1998].  Celem  podjętych
badań  była  ocena  uzdolnień  proteolitycznych  wybranych  w  oparciu  o  wcześniej  prze-

A. Czajgucka i in.

Acta Sci. Pol.

prowadzone testy 7 spośród 113 szczepów droŜdŜy wyizolowanych z serów pleśnio-
wych Rokpol [Czajgucka 2002, Juszczyk 2002].

METODYKA BADAŃ

Przedmiotem badań było 7 szczepów droŜdŜy pochodzących z kolekcji Katedry Bio-

technologii i Mikrobiologii śywności Akademii Rolniczej we Wrocławiu.

Były to szczepy: Candida famata MI1a, Candida sphaerica FII7a, Geotrichum pe-

nicillatum EII6a, Yarrowia lipolytica PII6a, Candida kefyr PII1b, Saccharomyces kluy-
veri BII3a i Candida intermedia BI2a. Szczepy droŜdŜy przechowywano w temp. +4 ºC
na skosach z podłoŜem YM, zawierającym w 1L: ekstrakt droŜdŜowy (3,0g), ekstrakt
maltozowy (3,0g), baktopepton (5,0g), glukozę (10,0g) i agar (20,0g).

Hodowle droŜdŜy i przygotowanie zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych ekstraktów

enzymów droŜdŜowych prowadzono według Gduli i in. [2002].

Oznaczanie aktywności proteolitycznej

Aktywność proteolityczną określano wobec hemoglobiny i kazeiny jako substratów

w pH odpowiednio 3.0 i 7.5 [Chrzanowska i Kołaczkowska 1998].

Wyznaczanie optimum pH i temperatury proteaz droŜdŜowych

Optimum pH proteaz oznaczono w 0,2 M buforze fosforanowo-cytrynianowym

wobec hemoglobiny i kazeiny jako substratów w zakresie pH od 3.0 do 8.0. Natomiast
optimum temperatury oznaczono w zakresie temperatury: od 5 ºC do 60 ºC, co 5 ºC.

Oznaczanie enzymów proteolitycznych droŜdŜy w elektroforezie natywnej w Ŝelu
poliakrylamidowym [Leluk i in. 1985].

Elektroforetyczny rozdział białek prowadzono w 8% Ŝelu poliakrylamidowym w bu-

forze TRIS-glicyna (pH 8.3). Po zakończonej elektroforezie Ŝel poliakrylamidowy z
aktywnymi enzymami droŜdŜy nałoŜono na Ŝel agarozowy z wbudowaną edestyną i
inkubowano w buforze o pH 7.5 dla proteaz zasadowych i pH 3.0 dla proteaz kwaśnych.
Po transferze enzymów Ŝel agarozowy wybarwiano czernią amidową. W miejscach dzia-
łania enzymu edestyna była trawiona, co powodowało powstawanie przejaśnień w Ŝelu.

Hydroliza enzymatyczna kazeiny

Hydrolizę kazeiny izoelektrycznej (1%) z udziałem proteaz droŜdŜowych prowa-

dzono w temp. 30 ºC przez 48 h w 50 mM buforze boraks-HCl pH 6.5. Podczas inkuba-
cji enzymu z substratem pobierano próby, w których oznaczano przyrost wolnych grup
aminowych według zmodyfikowanej metody Kuchroo i in. [1983] oraz analizowano
zmiany jakościowe metodą elektroforezy w Ŝelu poliakrylamidowym według Andrews
[1983].

OMÓWIENIE I DYSKUSJA WYNIKÓW

W tabeli 1 przedstawiono aktywność proteolityczną 7 szczepów droŜdŜy pochodzą-

cych z sera Rokpol, które wybrano w oparciu o wyniki badań skriningowych z kolekcji
liczącej 113 szczepów, jako potencjalnych ko-starterów serowarskich [Wojtatowicz i in.

Aktywność proteolityczna ...

Biotechnologia 2(1-2) 2003

2000, Czajgucka 2002]. Szczepy te wykazywały istotne róŜnice w poziomie aktywności
pozakomórkowych proteaz. Zdecydowanie najwyŜszą aktywność obserwowano u droŜ-
dŜy Y. lipolytica PII6a. Ich kwaśne proteazy osiągały wartości aktywności średnio 456.0
U x mg

-1

, natomiast kazeinolityczne enzymy działające w środowisku zasadowym prze-

jawiały aktywność na poziomie 47.2 U x mg

-1

. U pozostałych szczepów droŜdŜy ak-

tywność zewnątrzkomórkowych proteaz kwaśnych i zasadowych zawierała się w prze-
dziale odpowiednio 10.1–151.5 U x mg

-1

i 10.2–47.2 U x mg

-1

. Wyniki te są zgodne z

wcześniejszymi obserwacjami innych autorów, którzy wykazywali duŜe zróŜnicowanie
w poziomie pozakomórkowej aktywności proteolitycznej u szczepów droŜdŜy izolowa-
nych z serów, szczególnie w obrębie gatunku C. sphaerica i C. kefyr [Choisy i in. 1987,
Devoyod  1990,  Welthagen  i  Viljoen  1998,  Roostita  i  Fleet  1996].  Wielu  autorów
stwierdzało  teŜ  szczególnie  wysokie,  w  porównaniu  z  innymi  gatunkami,  uzdolnienia
hydrolityczne  droŜdŜy  Y.  lipolytica,  które  zdolne  są  do  biosyntezy  pozakomórkowych
proteinaz,  tak  zasadowych  serynowych,  jak  i  kwaśnych  aspartylowych  [Ogrydziak
1993, Sinigaglia i in. 1994, Glover i in. 1997, van Tempel i Jakobsen 1998, Suzzi i in.
2001].

Tabela 1. Zewnątrz- i wewnątrzkomórkowa aktywność proteolityczna szczepów droŜdŜy
Table 1. Extracellular and intracellular proteolytic activity of selected yeast strains

Aktywność [U x mg

-1

]

Activity [U x mg

-1

]

Zewnątrzkomórkowa

Extracellular

Wewnątrzkomórkowa

Intracellular

Szczepy droŜdŜy

Yeast strain

pH 7,5

pH 3,0

pH 7,5

C. famata MI1a

17,2

1,8

11,6

1,8

34,7

3,2

C. sphaerica FII7a

17,9

2,1

151,5

4,2

27,3

1,0

G. penicillatum EII6a

11,2

0,8

15,8

1,3

45,8

0,5

C. kefyr PII1b

17,8

2,0

11,2

1,3

43,0

3,1

Y. lipolytica PII6a

47,2

3,6

456,5

15,2

93,3

5,2

C. intermedia BI2a

10,2

1,4

10,8

2,6

99,8

6,2

S. kluyveri BII3a

11,1

1,2

10,1

0,7

46,0

3,8

Aktywność wewnątrzkomórkowych proteaz degradujących kazeinę była mniej

zróŜnicowana u badanych droŜdŜy, najwyŜsze jej wartości stwierdzono u szczepów:
C. intermedia (99.8 U x mg

-1

) i Y. lipolytica (93.3 U x mg

-1

), a najmniejsze w granicach

27.3-34.7 U x mg

-1

u C. sphaerica i C. famata.

W celu uwidocznienia aktywnych frakcji ekstrakty enzymów proteolitycznych ba-

danych  szczepów  droŜdŜy  poddano  rozdziałowi  elektroforetycznemu  w  Ŝelu  poliakry-
lamidowym w warunkach natywnych, a następnie dokonano ich transferu na Ŝel agaro-
zowy z wbudowaną edestyną. W oparciu o uzyskane zymogramy (rys. 1) moŜna stwier-
dzić u wszystkich 7 szczepów droŜdŜowych pojedyncze pasma proteaz, tak poza- jak i
wewnątrzkomórkowych, zdolnych do degradacji białka roślinnego  w  środowisku kwa-
śnym i zasadowym. Jakkolwiek, w zaleŜności od szczepu, proteazy te przejawiały róŜ-
nice  w  poziomie  aktywności,  co  przejawiało  się  wielkością  stref  przejaśnień  w  Ŝelu
agarozowym  po  strawieniu  edestyny.  Spośród  pozakomórkowych  enzymów  proteoli-
tycznych  największą  degradację  edestyny  prowadziły  proteazy  kwaśne  Y.  lipolytica

A. Czajgucka i in.

Acta Sci. Pol.

PII6a  oraz  C.  sphaerica  FII7a,  a  takŜe  proteazy  działające  w  środowisku  zasadowym
pierwszego  z  tych  szczepów.  Enzymy  wewnątrzkomórkowe  wszystkich  badanych
szczepów  droŜdŜy  pozostawiały  w  Ŝelu  większe  obszary  zdegradowanego  białka  niŜ
pozakomórkowe proteazy, ale najbardziej aktywne spośród nich były protezy  Y. lipoly-
tica PII6a i C. intermedia BI2a.

A./

B./

1 2 3 4 5 6 7

C./

1 2 3 4 5 6 7

Rys. 1. Zymogramy proteaz zewnątrzkomórkowych aktywnych w środowisku zasadowym A/ i

kwaśnym B/ oraz wewnątrzkomórkowych (zasadowych) C/ szczepów droŜdŜy: 1/ C. fa-
mata MI1a, 2/ Y. lipolytica PII6a, 3/ C. sphaerica FII7a, 4/ C. kefyr PII1b, 5/ C. interme-
dia BI2a, 6/ G. penicillatum EII6a, 7/ S. kluyveri BII3a

Fig. 1. Zymograms of extracellular proteases active at acidic A/ and alkaline pH B/ and intra-

cellular proteases (active at alkaline pH) C/ of yeast strains: 1/ C. famata MI1a, 2/ Y. li-
polytica PII6a, 3/ C. sphaerica FII7a, 4/ C. kefyr PII1b, 5/ C. intermedia BI2a, 6/ G.
penicillatum EII6a, 7/ S. kluyveri BII3a

Wewnątrzkomórkowe proteazy wszystkich szczepów droŜdŜy hamowane były cał-

kowicie  przez  PMSF  (tab.  2).  Podobne  działanie  wywierał  DFP,  który  obniŜał  ich  ak-
tywność do 5–25%. Natomiast EDTA jak i amid kwasu jodooctowego nie miał istotne-
go wpływu na aktywność tych enzymów. Pozakomórkowe kazeinolityczne endopepty-
dazy  droŜdŜy,  podobnie  jak  enzymy  wewnątrzkomórkowe,  okazały  się  najbardziej
wraŜliwe  na  działanie  PMSF  i  DFP,  ulegały  teŜ  znacznemu  hamowaniu  przez  EDTA.
Natomiast  aktywność  proteaz  degradujących  hemoglobinę  w  kwaśnym  pH,  syntetyzo-

Aktywność proteolityczna ...

Biotechnologia 2(1-2) 2003

wanych przez Y. lipolytica PII6a i C. sphaerica FII7a, ulegała całkowitemu hamowaniu
w obecności pepstatyny (wyniki niepodawane).

Tabela 2. Wpływ inhibitorów na aktywność wewnątrzkomórkowych proteaz droŜdŜowych
Table 2. Effect of the inhibitors on the intracellular proteases of yeast

Szczepy droŜdŜy [% aktywności]

Yeast strains [% activity]

Inhibitor
Inhibitor

C. famata

MI1a

C. inter-

media

BI2a

C. kefyr

PII1b

S. kluyveri

BII3a

Y. lipo-

lytica

PII6a

sphaerica

FII7a

G. penicil-

latum

EII6a

Kontrola
Control

100

Jodoacetic amid

100

PMSF

DFP

BPTI

100

EDTA

100

PMSF – fluorek fenylometylosulfonowy, DFP – diizopropylofluorofosforan, BPTI – zasadowy trzustkowy
inhibitor trypsyny, EDTA – kw. etylenodiaminotetraoctowy.

Optymalne dla działania tak zewnątrzkomórkowych jak i wewnątrzkomórkowych

kazeinolitycznych  proteaz  większości  analizowanych  szczepów  droŜdŜy  było  pH  w
zakresie  6.5–7.5  (rys.  2).  Natomiast  kwaśne  pozakomórkowe  proteinazy  z  droŜdŜy
C. sphaerica FII7a i Y. lipolytica PII6a najwyŜszą aktywność wobec hemoglobiny prze-
jawiały w pH 3.5, a enzymy pozostałych szczepów w pH 4.0. Optymalne dla działania
wszystkich  endopeptydaz  droŜdŜowych  były  temperatury  w  przedziale  35–45  °C  (wy-
niki niepodawane).

100

]

C.famata MI1a

C.intermedia BI2a

C.kefyr PII1b

C.sphaerica FII7a

Y.lipolytica PII6a

G.penicillatum BI6a

S.kluyveri BII3a

Rys. 2. Optimum pH wewnątrzkomórkowych proteaz droŜdŜowych
Fig. 2. Optimum pH of intracellular proteases of yeasts

A. Czajgucka i in.

Acta Sci. Pol.

Gripon i in. [1991], badając enzymy, tak zewnątrz-, jak i wewnątrzkomórkowe

droŜdŜy  z  rodzaju  Kluyveromyces,  Debaryomyces,  Saccharomyces  oraz  Geotrichum,
pochodzących  równieŜ  z  sera,  stwierdził,  Ŝe  wykazywały  one  optimum  aktywności
kazeinolitycznej  w  pH  6.0.  Według  Ogrydziaka  [1993]  natomiast  pozakomórkowe  za-
sadowe proteazy droŜdŜy   Y. lipolytica optymalnie działały w pH 9.0–10.0 w tempera-
turze  40  °C.  Natomiast  wewnątrzkomórkowe  endopeptydazy  syntetyzowane  przez
droŜdŜe z gatunku C. kefyr / K. marxianus, C. famata / D. hansenii oraz C. sphaerica /
K.  lactis  najwyŜsze  aktywności  wobec  kazeiny  osiągały  w  zakresie  pH  od  5.0  do  7.0
[Choisy i in. 1987, Lenoir 1984].

A./

K 0’ 30’ 60’ 90’ 120’ 180’ 24h 48h

B./

K 0’ 30’ 60’ 90’ 120’ 180’ 24h 48h

Rys. 3. Rozdział elektroforetyczny kazeiny hydrolizowanej przez wewnątrzkomórkowe proteazy

droŜdŜy A./ C. intermedia, B./ Y. lipolytica

Fig. 3. Poliacrylamide gel electrophoresis of casein degraded by intracellular proteases of yeast

strains A/C. intermediaBI2a, B./ Y. lipolytica PII

Aktywność proteolityczna ...

Biotechnologia 2(1-2) 2003

Wewnątrzkomórkowe proteazy wszystkich badanych szczepów intensywniej hy-

drolizowały kazeinę niŜ enzymy pozakomórkowe, powodując w tym samym czasie
kilku- lub nawet kilkunastokrotnie wyŜsze przyrosty wolnych grup aminowych (wyniki
niepodawane). Najbardziej aktywne były endopeptydazy z droŜdŜy Y. lipolytica Pll6a i
C. intermedia BI2a, co widoczne jest równieŜ w obrazach elektroforetycznych (rys. 3).
Bardziej podatna na działanie tych enzymów okazała się frakcja β niŜ α

-kazeiny. Po

180  min  hydrolizy  prowadzonej  z  udziałem  enzymów  Y.  lipolytica  Pll6a  następował
prawie całkowity zanik pierwszej z tych  frakcji. Obserwacje te są zbieŜne z wynikami
badań  Guerzoni  i  in.  [1993],  które  potwierdziły  głębszą  degradację β-  niŜ α

-kazeiny

pod  wpływem  zewnątrzkomórkowych  proteaz  pochodzenia  droŜdŜowego.  Wyniki  te
wskazują  na  róŜnice  między  proteazami  droŜdŜowymi  a  enzymami  syntetyzowanymi
przez  inne  mikroorganizmy  (np.  grzyby  pleśniowe),  wykorzystywane  w  produkcji  se-
rowarskiej,  a  których  aktywność  proteolityczna  skierowana  jest  głównie  wobec  frakcji
α

-kazeiny [Chrzanowska i in. 1993].

WNIOSKI

1. Szczepy droŜdŜy, pochodzące z serów pleśniowych Rokpol, wykazują szcze-

gólnie duŜe zróŜnicowanie w poziomie aktywności pozakomórkowych enzymów pro-
teolitycznych.

2. NajwyŜszą aktywność przejawiały proteazy tak zewnątrz- jak i wewnątrzko-

mórkowe droŜdŜy Y. lipolytica PII6a.

3. Kazeinolityczne proteazy droŜdŜowe, tak poza- jak i wewnątrzkomórkowe, naj-

bardziej wraŜliwe były na inhibitory proteinaz serynowych: PMSF i DFP, natomiast
kwaśne pozakomórkowe enzymy ulegały inaktywacji pod wływem pepstatyny.

4. Najkorzystniejsze warunki dla działania kazeinolitycznych proteaz droŜdŜo-

wych to pH w zakresie 6.5–7.5, a dla kwaśnych pozakomórkowych – w pH 3.5–4.0 oraz
temp. 35–45 °C.

PIŚMIENNICTWO

Andrews A.T., 1983. Proteases in normal bovine milk and their action on caseins. J. Dairy Res.

50, 45–55.

Choisy C., Gueguen M., Lenoir J., Schmidt J. L., 1987. The ripening of cheese microbiological

aspects, “Cheese making: Science and Technology” ed. A. Eck, Lavoisier, New York.

Chrzanowska, J. and Kołaczkowska, M., 1998. Production of extracellular proteolytic enzymes by

Beauveria bassiana, Acta Mycologica, 33, 277–285.

Chrzanowska, J., Kołaczkowska, M. and Polanowski, A., 1993. Production of exocellular prote-

olytic enzymes by various species of Penicillium, Enzyme Microb. Technol., 15, 140–143.

Czajgucka A., 2002. Charakterystyka uzdolnień hydrolitycznych szczepów droŜdŜy wydzielo-

nych z serów pleśniowych. Praca doktorska, Akademia Rolnicza we Wrocławiu.

Devoyod, J.J., 1990. Yeasts in cheese-making, In: Yeast technology, J.F.T.Spencer &

D.M.Spencer (Eds.), Springer-Verlag.

Fleet, G.H., Mian M.A., 1987. The occurence and growth of yeasts in dairy products, Int. J. Food

Microbiol. 4, 145–155.

Fleet G.H., 1992. Spoilage Yeast’s, Crit. Rev. in Biotechnol., 12, 1–44.

A. Czajgucka i in.

Acta Sci. Pol.

Gdula A., Chrzanowska J., Szołtysik M., KieŜel X., Wojtatowicz M., 2002. Factors affecting

hydrolytic enzymes production by Yarrowia lipolytica strains. Acta Sci. Pol. Biotechnologia.
1–2, 81–88.

Glover D.J., McEwen R.K., Thomas C.R., Young T.W., 1997. pH-regulated expression of the

acid and alkaline extracellular proteases of Yarrowia lipolytica. Microbiology, 143, 3045–
3054.

Gripon J.C., Monnet V., Lambert G., Desmazeaud M.J., 1991. Microbial enzymes in cheese

ripening. Food enzymology in cheese ripening. Vol.1. Ed. Fox P.F.Elsevier Science Publi-
shers.LTD.

Guerzoni M.E., Lanciotti R., Marchetti, R., 1993. Survey of the physiological properties of the

most frequent yeasts associated with commercial chilled foods, Int. J. Food Microbiol. 17,
329–341.

Jakobsen, M., Narvhus, J., 1996. Yeasts and their possible beneficial and negative effects on the

quality of dairy products. Int. Dairy J., 6, 755–768.

Juszczyk P., 2002. Charakterystyka mikroflory droŜdŜowej serów z przerostem pleśni. Praca

doktorska, Akademia Rolnicza we Wrocławiu.

Kuchroo C.N., Rahilly J., Fox, P.F., 1983. Assessment of proteolysis in cheese by reaction with

trinitrobenzene sulphonic acid. Irish J. Food Sci Technol. 7, 129–133.

Leluk J., Pham T.C., Kielczewa J., 1985. Zastosowanie edestyny do oznaczania aktywności pro-

teolitycznej i inhibitorów proteaz. XXI Zjazd PTBioch., Kraków. Streszczenia 139–140.

Lenoir J., 1984. The surface flora and its role in the ripening of cheese. Int. Dairy Federation

Bulletin. Brussels, Belgium, 171, 3–20.

Ogrydziak, D.M., 1993. Yeast extracellular protease. Crit. Rev. Biotechnol. 13, 1–55.
Roostita R., Fleet G.H., 1996. The occurence and growth of yeasts in Camembert and Blue-

veined cheese. Int. J. Food Microbiol. 28, 393-404.

Sinigaglia M., Lanciotti R., Guerzoni, M.E., 1994. Biochemical and physiological characteristics

of Yarrowia lipolytica strains in relation to isolation source. Can. J. Microbiol. 40, 54–59.

Suzzi G., Lanorte M.T., Galgano F., Andrighetto C., Lombardi A., Lanciotti, R., Guerzoni, M.E.,

2001. Proteolytic, lipolytic and molecular characterization of Yarrowia lipolytica isolated
from cheese. Int. J. Food Microbiol. 69, 69–77.

Van den Tempel T., Jakobsen, M., 1998. Yeast associated with Danablu. Int. Dairy J. 8, 25–31.
Viljoen, B.C., 1998. The ecological diversity of yeasts in dairy products, In: FIL-IDF "Yeast in

the dairy industry: positive and negative aspects", Jakobsen M., Narvhus J., Viljoen B.C.,
(Eds.). Copenagen, Denmark, 1996, 70–77.

Vivier D., Rivemale M., Reverbel J.P., Ratomahenina R., Galzy, P., 1994. Study of the growth of

yeasts from feta cheese. Int. J. Food Microbiol. 22, 207–215.

Welthagen J.J., Viljoen B.C., 1998. Yeast profile in Gouda cheese during processing and ripen-

ing. Int. J. Food Microbiol. 41, 185–194.

Wojtatowicz M., Chrzanowska J., Juszczyk P., Skiba A., Gdula A., 2000. Identification and bio-

chemical characteristics of yeast microflora of Rokpol cheese. Int. J. Food Microbiol. 69,135–
140.

Wyder M.T., Puhan, Z., 1999a. Role of selected yeasts in cheese ripening: an evaluation in asep-

tic cheese curd slurries, Int. Dairy J. 9, 117–124.

Wyder M.T., Bachmann H.P., Puhan Z., 1999b. Role of selected yeasts in cheese ripening: an

evaluation in foil wrapped Raclette cheese. Lebensm.-Wiss. Technol. 32, 333–343.