1 

WICZENIE 

7 

SDS-PAGE L

AEMMLI ELEKTROFOREZA

 

 

 

Wyci g z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych 

 •     Akrylamid/bisakrylamid – T 

 •     Temed – C, F 

 •     SDS – Xn 

 •     APS – O, Xn 

 •     EDTA – Xi 

 •     Merkaptoetanol – T, N 

 

Wylewanie  eli 

Odczynniki: 
- AA: 30% akrylamid, 0.8% bisakrylamid  
- bufor do  elu rozdzielaj cego: 1 M Tris-HCl, pH 8,8  
- bufor do  elu zag szczaj cego: 1 M Tris-HCl, pH 6,8  
- 20% siarczan dodecylu sodu (SDS) 
- 1% SDS 
- 10% nadsiarczan amonu (APS) 
- N,N,N’,N’- tetrametyloetylenodiamina (Temed) 
- bufor do próbek (2x st ony):  

625 

µl 1 M Tris-HCl pH 6.8 

1000 

µl glicerol 

500 

µl 2-merkaptoetanol 

1000 

µl 20 % SDS 

3,78 mg EDTA 
1675 

µl H

2

O dejonizowana 

- bufor do naczy  elektrodowych 5 mM Tris, 384 mM glicyna, 0,1 % SDS, pH 8,3 
- 0,02% bł kit bromofenolowy 
- zestaw wysokomasowych białek wzorcowych do elektroforezy (HMW) zawieraj cy: 

miozyna (205 kDa), 

α-galaktozydaza (116 kDa), fosforylaza b (97,4 kDa), albumina 

surowicy wołu (66 kDa), albumina jaja kurzego (45 kDa), anhydraza w glanowa (29 kDa) 

 

W celu przygotowania 12 ml 

8 %  elu rozdzielaj cego odpipetowa : 

•   roztwór AA   

 

3,20 ml 

•  1 M Tris-HCl, pH 8,8  

4,50 ml 

•  20 % SDS 

 

 

60 

µl 

•  H

2

O dejonizowana   

4,25 ml 

 

2 

po odgazowaniu na pompce wodnej doda : 

•  Temed  

 

 

24 

µl 

•  10 % APS 

 

 

60 

µl 

 

 
W celu przygotowania 4 ml 

4,5 %  elu zag szczaj cego odpipetowa : 

•  roztwór AA   

 

0,60 ml 

•  1 M Tris-HCl, pH 6,8  

0,49 ml 

•  20 % SDS    

 

20 

µl 

•  H

2

O dejonizowana   

2,88 ml 

po odgazowaniu na pompce wodnej 

•  Temed  

 

 

4 

µl 

•  10 % APS 

 

 

16 

µl 

 
 

Przygotowanie próbek 

Oznaczy   st enia  białka  w  próbkach  metod   Bradforda.  Z  ka dej  próbki  odpipetowa   po 
15 

µg białka do osobnych eppendorfów. Próbki zag ci  do obj. 5 µl na wirówce pró niowej, 

doda  5 

µl 2x st onego buforu do próbek oraz 0,5 µl roztworu bł kitu bromofenolowego, 

zwirowa  i gotowa  5-10 min w temperaturze 100

°C. Do próbki zawieraj cej białka o znanej 

masie  cz steczkowej  (zestaw  białek  wzorcowych  do  elektroforezy,  3 

µl)  doda   0,5  µl 

roztworu  bł kitu  bromofenolowego,  zwirowa   i  gotowa   1  min  w  temperaturze  100

°C.  Po 

gotowaniu  wszystkie  próbki  zwirowa   i  nakłada   do  kolejnych  studzienek  elu  za  pomoc  
ko cówek kapilarnych. 

Warunki pr dowe:  60 V na wej cie próbki w  el zag szczaj cy (ok. 20 min) 

120 V na rozdział (ok. 100 min) 

Elektroforez  prowadzi  do wyj cia bł kitu bromofenolowego z  elu. 

 

 

Barwienie  elu po elektroforezie 

 

el zanurzy  w wybarwiaczu (10% kwas octowy, 25% metanol, 65% woda 3 x dest. 0,1% 

CBBG-250)  i  pozostawi   na  30  min  na  wytrz sarce  kołyskowej.  Nast pnie  usun  
wybarwiacz  i  el  zala   odbarwiaczem  (10%  kwas  octowy,  25%  metanol,  65%  woda  3  x 
dest.). Cało  pozostawi  na wytrz sarce, a  do uzyskania bezbarwnego tła. 
 

 

 

 

3 

Opracowanie wyników 

 
Oznaczanie wzgl dnych mas cz steczkowych białek: 
- wykre li  krzyw  kalibracyjn  zale no ci log m.cz. białek standardowych od współczynnika 

R

f

  tj.  wzgl dnej  ruchliwo ci  elektroforetycznej  wyznaczonej  ze  stosunku  drogi  przebytej 

przez dane białko do drogi przebytej przez bł kit bromofenolowy. 

-  obliczy   warto ci 

R

f

  dla  białek  badanych  i  z  wykresu  kalibracyjnego  odczyta   wzgl dne 

masy cz steczkowe tych białek.  

 

 

 

  
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
 
 
 
Literatura: 

1. „Techniki bada  fizjologicznych” (red. A. Lity ska, M.H. Lewandowski), str. 102 - 106 

 

Białka standardowe: 

M.cz. (kDa) 

log M.cz. 

R

f

 

miozyna 

205 

 

 

α

-galaktozydaza 

116 

 

 

fosforylaza b 

97,4 

 

 

albumina surowicy wołu 

66 

 

 

albumina jaja kurzego 

45 

 

 

anhydraza w glanowa 

29 

 

 

Białko badane: 

 

 

 

1. 

 

 

 

2. 

 

 

 

3. 

 

 

 

4. 

 

 

 

5. 

 

 

 

6.