1
B
ADANIE WŁAŚCIWOŚCI FIZYKOCHEMICZNYCH AMINOKWASÓW
I
DENTYFIKACJA AMINOKWASÓW
B
IAŁKA
,
JAK I WOLNE AMINOKWASY REAGUJĄ ZA POŚREDNICTWEM GRUP
:
-NH
2
I
–COOH
Z
NINHYDRYNĄ
,
DINITROFLUOROBENZENEM I KWASEM AZOTOWYM
(III).
W
YSTĘPOWANIE W STRUKTURZE AMINOKWASÓW
INNYCH GRUP FUNKCYJNYCH
,
OPRÓCZ AMINOWEJ I KARBOKSYLOWEJ
,
UMOŻLIWIA IDENTYFIKACJĘ TYCH
AMINOKWASÓW NA PODSTAWIE CZUŁYCH REAKCJI BARWNYCH
.
Reakcja biuretowa
Nazwa pochodzi od biuretu, związku powstającego przy ogrzewaniu mocznika do 180
O
C. Reakcję
biuretową dają wszystkie połączenia zawierające w cząsteczce co najmniej 2 grupy -CO-NH- połączone ze sobą
bezpośrednio (np. w diamidzie kwasu szczawiowego NH
2
-CO-CO-NH
2
), poprzez azot (w biurecie) lub poprzez
atom węgla (w diamidzie kwasu malonowego, bursztynowego, w produktach hydrolizy białek). W wyniku
utworzenia połączenia koordynacyjnego Cu
2+
z dwoma przyległymi wiązaniami –CO-NH- powstaje barwny
produkt. Dodatniego odczynu reakcji biuretowej nie dają wolne aminokwasy i dipeptydy.
Wykonanie:
Do 1 ml danej próby dodać 1 ml NaOH i kilka kropli 0,5% CuSO
4
W obecności białka powstaje fioletowe
zabarwienie. Uwaga: ponieważ niebieska barwa odczynnika może maskować właściwy odczyn należy
unikać nadmiaru CuSO
4
.
Reakcja ninhydrynowa
Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu poprzez iminokwasy do amoniaku, dwutlenku
węgla i aldehydu uboższego o 1 atom węgla. W wyniku kondensacji cząsteczki zredukowanej i utlenionej
ninhydryny z amoniakiem powstaje niebiesko-fioletowe zabarwienie, którego natężenie jest proporcjonalne do
zawartości azotu aminowego aminokwasów.
2
R
C
COOH
NH
2
H
+
C
C
C
O
O
OH
OH
zredukowana
ninhydryna
R
CH
NH
+
+
C
C
C
O
O
H
OH
CO
2
ninhydryna
+
R
CH
NH
H
2
O
+
R
C
O
NH
3
+
H
C
C
C
O
O
OH
OH
2
NH
3
+
+
C
C
C
O
O
H
HO
C
C
C
O
O
C
C
C
O
O
N
3H
2
O
H
2
O
+
NH
4
+
barwny kompleks
Wykonanie:
Do 1 ml próby badanej dodać 3-4 krople 0,1% roztworu ninhydryny w 50% etanolu. Po wymieszaniu próbę
ogrzać do wrzenia. Wszystkie aminokwasy (oprócz proliny) reagują z ninhydryną tworząc niebieskie
zabarwienie.
Reakcja ksantoproteinowa
Aminokwasy aromatyczne oraz fenole ulegają reakcji nitrowania w czasie ogrzewania ze stężonym HNO
3
,
dając żółto zabarwione pochodne nitrowe (fenyloalanina wymaga do nitrowania dodatku H
2
SO
4
).
+
2H
2
O
H
2
C
NH
3
COOH
2HNO
3
OH
H
2
C
NH
3
COOH
OH
O
2
N
Wykonanie:
Do 1 ml próby badanej dodać 0,5 ml stężonego HNO
3
i ogrzewać na wrzącej łaźni wodnej przez 2 min.
Wytrąca się żółty osad.
Reakcja Adamkiewicza
Jest to reakcja charakterystyczna dla tryptofanu zawierającego pierścień indolowy. W obecności kwasu
siarkowego i formaldehydu (kwas glioksalowy) dwie grupy indolowe ulegają kondensacji z wydzieleniem
cząsteczki wody i dają barwny fioletowy związek. Schemat przebiegu reakcji:
3
Wykonanie:
Do 1 ml próby badanej dodać kilka kropli formaldehydu. Po wymieszaniu roztwór podwarstwić (po
ściance) stężonym H
2
SO
4
. Na granicy cieczy powstaje fioletowy pierścień.
Reakcja Millona
Reakcja na wykrywanie tyrozyny jest mało specyficzna, ponieważ dodatni wynik dają również związki
zawierające reszty fenolowe.
Wykonanie:
Do 1 ml próby badanej dodać kilka kropli odczynnika Millona. Mieszaninę ogrzewać w łaźni wodnej przez
kilka minut. W przypadku obecności tyrozyny pojawia się biały osad, który zabarwia się na żółto, a później na
czerwono (lub powstaje czerwone zabarwienie roztworu).
Wykrywanie cysteiny i cystyny
Zawarta w cysteinie i cystynie siarka w silnie zasadowym środowisku ulega uwolnieniu w postaci jonów
siarczkowych, które z jonami Pb
2+
dają czarny osad PbS. Metionina nie daje dodatniego wyniku w tej reakcji.
Schemat przebiegu reakcji:
HC
NH
2
COOH
H
2
C
SH
2OH
+
C
O
COOH
CH
3
S
+
2
NH
3
+
H
2
O
+
S
2
PbS
Pb
2
+
Wykonanie:
Do 1 ml próby badanej dodać 1 ml roztworu octanu ołowiu i 3 ml 10% roztworu NaOH (roztwór powinien
być klarowny). Próbkę ogrzewać na łaźni wodnej, po kilku minutach pojawia się czarny osad.
4
Wykrywanie glutaminy
Próba na obecność glutaminy wykorzystuje obecność w jej cząsteczce ugrupowania amidowego, z którego
w warunkach hydrolizy zasadowej uwalnia się gazowy amoniak. Dodatni wynik tej reakcji dają też asparagina
i sole amonowe.
Wykonanie:
Do 3 ml próby badanej dodać 3 ml 10% NaOH (roztwór dodać do probówki pipetą, tak aby nie dotknąć jej
wylotu). Całość umieścić we wrzącej łaźni wodnej a do wylotu probówki zbliżyć zwilżony uniwersalny papierek
lakmusowy. W przypadku obecności glutaminy papierek zmienia zabarwienie na niebieski Uwaga: należy
uważać, aby nie dotknąć papierkiem brzegu probówki. wówczas zmiana zabarwienia papierka następuje
na skutek obecności NaOH a nie amoniaku.