Uczelnia, wydział, kierunek:
Politechnika Wrocławska; Wydział Chemiczny; biotechnologia
Kurs, semestr, prowadzący:
Biotechnologia – wykład; semestr 09l; prof. Barbara Lejczak
Notatka zawiera:
Zagadnienia z wybranych wykładów; wersja robocza nie zawiera wzorów i schematów.
Uwaga:
Notatkę można używad tylko w celach niekomercyjnych. Notatka może zawierad błędy
lub byd niekompletna. Każdy korzysta z niej na własną odpowiedzialnośd.
Więcej notatek na stronie:
http://www.sny.one.pl/
e-notatka -
Biotechnologia -
wyklad.pdf
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
Autorka notatek:
Hanna Siwiec,
Pomoc fotograficzna: Jarosław Zaklika,
Skład tekstu:
Mateusz Jędrzejewski.
sny@sny.one.pl
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
1
Wykład 4. – 24.03.2009 r.
1. INAKTYWACJA (12 enzymów):
a) N-acetylacje,
b) O-acetylacje,
c) O-fosforylacje.
2. UTRUDNIENIE TRANSPORTU (modyfikacja przepuszczalności błony).
3. SPONTANICZNE MUTACJE.
WYKRES
Przemysłowy proces oczyszczania streptomycyny
→podłoże hodowlane(50 m
3
– 5,5 g/l antybiotyku)
↓
→kolumna z Amberlitem (1900 l poj.)
↓
→streptomycyna + Amberlit (270 kg)
↓1) wymywanie 1135 l EDTA (100 g/l)
2) woda + CO
2
→ wymywanie H
2
CO
3
3) wymywanie 2,5 N H
2
SO
4
do pH 5,0
→wodny r-r siarczanu streptomycyny (2700 l → 90 g/l)
↓1) węgiel aktywny
2) zagęszczanie pod próżnią
3) suszenie
→275 kg siarczanu streptomycyny o czystości 98% (→215 kg antybiotyku)
Zastosowania antybiotyków peptydowych
AKTYNOMYCYNA
Najsilniejszy środek p-rakowy
Hamuje syntezę DNA i RNA
BACITRACYNA
p-bakteryjny
Działa na śc.kom., nośnik
lipidowy
BESTATYNA
Immunostymulator p-rakowy
Inhibitor AP
BLEOMYCYNY
Antybiotyk o szerokim
spektrum, p-nowotworowy
Hamuje syntezę DNA, RNA
i białka
CYKLOSPORYNY
Immunosupresory, w
transplantacjach
DRAZOMYCYNY
Rak przewodu pokarmowego i
tkanek miękkich
Antagoniści Gln, synteza puryn
NETROPSYNA
p-fagowa, p-wirusowa, p-
ślimakom
DNA, RNA, białko
NICYNA
p-pierwotniakom,
antymalaryczna
POLIMYKSYNY
Infekcje przewodu moczowego
Działa na błony
VALINOMYCYNA
Nośnik K
+
, rozprzęga
fosforylację oksydacyjną
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
2
1. cykliczne np. Ituryna A,
WZÓR
2. laktony np. aktynomycyna,
WZÓR
3. depsipeptydy np. valinomycyna,
WZÓR
4. krótkie – liniowe np. bialofos,
WZÓR
Trudności przy produkcji związków cytotoksycznych
1. generalna toksycznośd – koocowe stężenie otrzymywanego produktu bardzo niskie,
2. wydzielanie z rozcieoczonego roztworu i oczyszczanie,
3. utrzymanie chemicznej i biologicznej aktywności podczas produkcji i oczyszczania bez narażania
się na skażenie.
4. detoksyfikacja ścieków
a) instalacje pilotowe i fermentory przemysłowe:
bariery biologiczne (systemy filtrów),
sterylizacja odpadów stałych i ścieków (temp, pH, redestylacja rozpuszczalników).
Proces wprowadzania nowego leku przeciwnowotworowego
(od znalezienia do zastosowania w terapii 7-12 lat)
1. izolacja.
2. preskrining – P
388
mysia leukemia, inhibicja enzymów.
3. testy in vivo: modelowe mysie nowotwory (okrężnicy, piersi, płuca, B16 melanoma, nowotwory
ludzkie przeniesione na immunodefektywne „nagie” myszy).
4. przygotowanie do podawania leku per se lub dożylnie – badania toksykologiczne na zwierzętach.
5. I faza badao klinicznych – toksycznośd, aktywnośd, maksymalna dawka tolerowana przez
człowieka.
6. II faza badao klinicznych – potencjalne możliwości zastosowania, dawki.
7. III i IV faza badao klinicznych – aktywnośd w stosunku do różnych nowotworów.
↓
Opracowanie i dopracowanie procesu przemysłowego, badania genetyczne, optymalizacja procesu
produkcji
Antybiotyki przeciwnowotworowe pochodzenia mikrobiologicznego
Ansamycyny – Nocardia sp., N. meditenarei, WZÓR
Antramycyny – Streptomyces, WZÓR
Neotamycyny, WZÓR
Mitosan – mitomycyny, WZÓR
Bleomycyny
Antracykliny – Streptomyces (Daunorubicyna, Adriamycyna, Carminomycyna)
WZÓR
Produkcja daunorubicyny met. Fermentacyjną
Schemat
Adriamycyna
Schemat
Nukleozydy (Streptomyces)
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
3
Pirolopirymidyny, pirazolopirymidyny, σ-azacytydyna,
wzorki
→powinowactwo i specyficznośd do receptora
→aktywnośd katalityczna
Lata 80-te XX wieku – asparaginaza
(białaczka limfoblastyczna u dzieci)
- modyfikacja PEG (PEGylacja)
1987 – pierwszy rekombinowany lek enzymatyczny ACTIVASE
®
(tkankowy aktywator plazminogenu)
dopuszczony przez FDA (Food and Drug Administration) w USA
Orphan Drug Act – 1983 USA, również Europa
- Enzymatyczne terapie uzupełniające
- ALDURAZYM
®
- deficyt α L-iduronidazy
- PHENYLASE
TM
– rekombinowana amoniakoliaza fenyloalaniny z drożdży → fenyloketonuria
- transgeniczne lipazy z kukurydzy – choroby trzustki
- Thera CLEC Total
TM
(lipaza, amylaza, mieszanina proteaz)
- PULMOZYME
®
(dornaza α) – upłynnia śluz gromadzący się w płucach (inhalacje)
Enzymy proteolityczne i glikolityczne do leczenia uszkodzeń tkanek
- DEBRASE – żel – mieszanina wyekstrahowana z ananasa 2002 – druga faza badao klinicznych
- VIBRALASE
TM
(rekombinowana vibrolizyna – Vibrio proteolytius)
Enzymy w leczeniu chorób zakaźnych
Lizozym, RN-aza A, RN-azaU
Enzymy w leczeniu nowotworów
- asparaginaza
- ADEPT – antibody directed enzyme prodrug therapy
- RASBURICASE – hydrolizuje kwas moczowy (5 różnych leków działających w ten sposób)
Siedrofory
schemat
Budowa chemiczna sideroforów
Grzyby i bakterie → kwasy hydroksamowe
Bakterie → fenolany
Kwasy hydroksamowe –
wzory
fenolany –
wzory
Siderofory o aktywności antybiotycznej – sideromycyny
Wzory
Jedyny produkowany na skalę przemysłową – DESFERIOKSAMINA B – DESFERAL
Mutant – Streptomyces pilosus
Zastosowania:
- zatrucia Fe
- hemochromatozy
- diagnoza wczesnych stanów hemochromatozy
- usuwanie innych metali (pierwiastki promieniotwórcze!) → encefalopatia dializacyjna
- pozamedyczne: -Pseudomonas putida – PSEUDOBAKTYNA
-Rhizobium
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
4
Wzory
- dehydrogenacje
- epoksydacje
- estryfikacje
- izomeryzacje
- hydroliza acetali
- hydroliza estrów
- hydroliza epoksydów
- hydroksylacje
- oksydacje alkoholi i ketonów
- redukcja ketonów i podwójnych wiązao
Biokonwersje o znaczeniu praktycznym
→ 11-hydroksylacje (Rhizopus arrhizus, R. nigricans) (pierwsza opisana w 1952 r.)
Progesteron →11 α hydroksyprogesteron 85%
Progesteron → 6 β 11 α dihydroksyprogesteron 6%
→ 1-dehydrogenacje (Arthrobacter simplex, B. sphaericus, Nocardia, pleśnie: Septomyxa affinis,
Fussarium solani)
Hydrokortizon → Prednizolon
→ 16-α-hydroksylacje (Streptomyces roscochromogenes)
3 α fluorokortizon → 16 α hydroksy 8 α fluoro kortizon + 2 β 16 α
Nowe trendy w biotechnologii dla medycyny
1990 – USA HUMANE GENOM PROJECT (HGP)
(15 lat ~3 mld par zasad)
1999 – zmapowano 100 tys. genów
Sekwencje2/3 genomu ~2 mld $
2004 – „genom pod klucz” – 20-25 tys genów (2001-30-35 tys)
Perkin Elmer – wielokanałowy kapilarny sekwenator DNA (100 mln par zasad / doba)
Inst. For Genomie Research – zbadanie genomu ludzkiego w 3 lata i to 10x taniej
Technologia rekombinowanego DNA (recDNA)
Systemy do otrzymywania białek – transgeniczne organizmy
- E.coli – prokariotyczny
- drożdże – eukariotyczny CLONTECH, STRATAGEN
- hodowle komórek ssaków CHO, BHK, małpie
- komórki owadzie – INVITROGEN – system bakulowirusa, k. dmy kalifornijskiej i jedwabnika, muszki
owocowej
- „żywe bioreaktory” – ekspresja heterologicznych białek w gruczołach mlecznych myszy, królika,
owiec, krów i kóz GENZYME, TRANSGENICS Corp. 1-40gbiałka/l mleka
- transgeniczne rośliny – MONSANTO
- leki białkowe, szczepionki
- przeciwciała monoklonalne
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
5
Technologie wytwarzania przeciwciał monoklonalnych
*technika hybrydoma
↓Testy diagnostyczne
↓Nośniki leków
↓podwyższenie „pasywnej obrony organizmu”
(transgeniczne myszy XENOMOUSE – ABGENICS Inc.)
Szczepionki
- rekombinowane antygenowe
- hybrydowe (wirus, bakteria)
- antyidiotopowe
- hybrydowe białkowe
- antygenowe syntetyczne peptydy
- szczepionki DNA (pierwsza szczepionka p-malaryczna)
(1999 r. – w fazie klinicznej szczepionki p-bakteryjne, p-nowotworowe, p-wirusowe, p-AIDS,
pozainiekcyjne – w jadalnych roślinach)
Terapia genowa
- genetyczne szczepionki p-rakowe
- heterogenizacja
- geny samobójcze
- geny supresorowe i antyonkogeny
- geny oporności wielolekowej
- strategia antysensowa i rybozymowa
1998 – 22merowy tiofosforanowy analog nukleotydu zatwierdzony przez amerykaoska agencję FDA –
VITRAVENE – lek przeciw ślepocie (wirus CHV)
- technika SELEX – strategia aptameryczna
Biochipy DNA (DNA BIOCHIP)
→ precyzyjna analiza mutacji w badanych próbkach DNA lub RNA – diagnostyka chorób genetycznych
= nowotwory, mukowiscydoza, anemia sierpowata, Alzheimer, stwardnienie rozsiane
→ „metryki genetyczne”
2000 r. – Brytyjskie Biuro Patentowe przyznaje patent na klonowanie embrionów (w tym ludzkich) –
INSITUTE-ROSSLIN
Zarodek ludzki został uznany za wynalazek (?)
Blastocysta ~140 komórek – Geron Bio Med
↓
Pierwotne komórki zarodkowe
↓
Różne tkanki
Tabele
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
6
Wykład 5. – 31.03.2009 r.
Browarnictwo – najstarszy proces biotechnologiczny
1. słód jęczmienny – ekstrakcja
2. gotowanie z chmielem
3. chłodzenie i fermentacja (drożdże)
Niemcy – Bawaria Purity Law – 1200 browarni – 5000 gatunków
Słód → (zboże) jęczmieo – kiełkowanie (6-9 dni) i przerwanie rozwoju zarodków przez wysuszenie
(synteza enzymów hydrolitycznych – rozkład endospermy nasion – skrobii, białek zapasowych)
Kontrola: wilgotnośd (44-47%), O
2
→ zmiany procedur: moczenie – zmiękczanie, temperatura, kwas giberelinowy (regulacja i
przyspieszenie kiełkowania)
*stopieo słodowania – dotyczy 3 głównych polimerów endospermy:
β glukan, pentozany (śc.kom.)
hordatyny
skrobia
*indeks modyfikacji → stopieo solubilizacji białka
→ stopieo przekształcenia polisacharydów ściany komórkowej →
niskocząsteczkowe cukry
→stopieo degradacji skrobii
*suszenie słodu: 50-60˚C
71˚C
stopniowo strumieniem powietrza
71-82˚C
Chmiel → suszone kwiatostany (substancje smakowe – gorzkie i bakteriostatyczne, humulony,
lupulony) – ekstrakty chmielowe
wzory
Woda → ścisła kontrola jakości (węgiel aktywny, żywice jonowymienne)
Ca
++
- ochrona α amylazy przed termoinaktywacją
- stymulacja proteaz i amylaz
[CaSO
4
, gips, mieszanki soli Ca
++
)
Produkcja brzeczki
*zacieranie = ekstrakcja (mieszanie z ciepłą wodą – inkubacja)
(cukry proste i dekstryny, aminokwasy, peptydy, białka, witaminy, nierozp.zw.P, polifenole i ich
prekursory)
- jest niestabilna mikrobiologicznie, tworzy ciężkie osady
*filtracja
*kocioł i gotowanie z chmielem
(ekstrakcja składników chmielu, dezaktywacja enzymów, precypitacja zw.azotu, sterylizacja,
odparowanie wody)
Zamiast gotowania: ogrzewanie 85˚C, silne mieszanie (nieekonomiczne)
*chłodzenie do 8-10˚C (powietrze, woda, mieszaniny chłodzące)
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
7
Fermentacja
Saccaromyces usarium (carlsbergensis)
Saccaromyces cerevisiae
↓
↓
Lager
ale
(fermentują na dnie, 7-15˚C)
(fermentują na powierzchni, 18-22˚C)
gen MEL → egzokomórkowa
α galaktozydaza – melibiaza
rozkład cukrów: sacharoza, glukoza, fruktoza, maltoza, maltotrioza (2 ostatnie – główne cukry
brzeczki, wewnątrzkom.)
produkty:
alkohole (EtOH i wyższe-fuzlowe),
estry (AcOEt), związki karbonylowe i acetaldehyd,
diacetyl, pentan-2,3-dien (smak maślany, miodowy, toffi),
związki siarki (H
2
S, SO
2
, siarczek dimetylowy (lager))
Oddzielenie drożdży – wirówki, leżakowanie 2-6˚C, na 4 miesiące, pasteryzacja, filtracja (osady
koloidalne)
Enzymologia produkcji piwa
→ produkcja słodu
Słód jęczmienny – własne enzymy: α i β amylazy, solubilaza β glukanu, β glukanaza, endopeptydazy)
Ograniczony przedział temperatur – możliwośd kontroli stopnia rozkładu skrabii, białka, β glukanu
Metoda dekokcyjna i infuzyjna – zaawansowana proteoliza
Przerwa białkowa – 20’-2,5h, 45-53˚C
Przerwy cukrowe – 30’-90’, 65-66˚C
↓
↑
Główna reakcja → hydroliza skrobii
→ zacieranie
63-65˚C – stabilizacja amylaz słodu: jonami Ca, wysokim stężeniem substratu, pH 5-6
-inaktywacja proteinaz
*produkcja piwa nisko- i bezalkoholowego ;)
72-75˚C – inaktywacja β amylazy słodu
+ termostabilna α amylaza bakteryjna
+ β glukanaza
↓
Ekstrakt o odpowiednim niskim stężeniu cukrów fermentacyjnych w brzeczce
- zastosowanie surowców niesłodowych – ryż, kukurydza – mogą stanowid 10-50% zasypu (z
wyjątkiem Niemiec – tu prawo zabrania!)
Teoretycznie – w pełni wartościowa brzeczka bez słodu
→ bakteryjne i pleśniowe preparaty enzymatyczne
a) α amylaza bakteryjna – BAN 120L Novo Nordisk, BREWERS AMYLIQ Gist Brocades, ALFA AMYLAZE
Solway
b) β glukanaza bakteryjna – CEREFLO Novo Nordisk
c) β glukanaza grzybowa – AMB/GLUCANASE XL Biocatalyst Ltd.
d) bakteryjna proteinaza neutralna – NEUTRASE Novo Nordisk
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
8
e) mieszanka enzymatyczna – BREWERS FLOW Gist Brocades, CEREMIX Novo Nordisk
- MUTAREX (Novo Nordisk) – (dekarboksylaza …) (→ diacetyl) – przyspiesza dojrzewanie piwa
- OKSYDAZA GLUKOZOWA (rozp. i immobil.) – obniza stężenienie O
2
rozpuszczinego w piwie lub
usuwa go z powierzchni w butelkach i puszkach
Warunki odżywcze:
s.m.drożdży 46%C, 38%O8,5%N, 6%H, 7,5% popiół
↓
200g sacharozy → 100g drożdży
*Źródła C: cukry „fermentujące”: glukoza, fruktoza, mannoza, galaktoza, sacharoza, maltoza
Systemy transportu:
→ monosacharydy: ułatwiona dyfuzja lub nośniki (3 rodzaje)
→ disacharydy: sacharoza (inwertaza w przestrzeni periplazmatycznej), maltoza (ułatwiona dyfuzja
lub aktywny transport)
Asymilacja tlenowa: CKT, cykl pentozoP, glikoliza
*Źródła N: wodne r-ry NH
3
, sole amonowe, hydrolizaty białka,NO
3
-
i NO
2
-
nie są asymilowane
System transportu: K
+
zależny, (→ Glu, Gln)
*Sole nieorganiczne:
P- H
2
PO
4
-
- aktywny transport, K
+
- PO
4
3-
- Na
+
K – aktywny transport, H
+
Mg, Ca – aktywny transport
S – SO
4
2-
, aktywny transport
*witaminy: grupa B complex (biotyna, kwas pantotenowy, inozytol, tiamina, pirydoksyna, niacyna)
*zapotrzebowanie na tlen: 1g O
2
→ 1g drożdży
Drożdże piekarskie
3 fazy produkcji:
- stadium czystych kultur
- generacja I
- generacja handlowa
- hodowla za skosów do kolb z płynną brzeczką słodową (200ml)
- kolby o 10x większej objętości
- fermentor z brzeczką melasową – propagator (okresowe, kilkuminutowe napowietrzanie)
- separacja komórek, mycie wodą
↓
„mleczko drożdżowe” – drożdże zarodowe
- fermentor z pożywką melasową – kilkaset l, hodowla napowietrzana
- wirowanie, mycie wodą
↓
„mleczko drożdżowe”
- fermentor produkcyjny (2000-3000l) namnażanie drożdży, kontrola warunków, 12-18godz.,
separacja, przemywanie, odwodnienie
Sterylizacja brzeczki melasowej – fermentory ze stali kwasoodpornej, schłodzenie do 30˚C
- forma kremu
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
9
- prasowane 27-30% stałych drożdży
- suche 82-96% stałych drożdży
Szczepionki mikrobiologiczne, startery
Cel:
- utrzymanie w warunkach procesu technologicznego typowych cech danego produktu
- spełnienie przyjętych norm
- zapewnienie trwałościi jakości produktu
Drobnoustroje przemysłowe – cechy użytkowe:
- wydajnośd i szybkośd tworzenia produktu
- szybki wzrost
- stabilnośd genotypowa, fenotypowa, fagoopornośd
- wymagania pokarmowe
- tolerancja zmiennych warunków
- czystośd i łatwośd wydzielania produktu
- SEROWARSTWO: szybkie zakwaszanie → zwarty skrzep, czysty kwaśny smak, zwiększona proteoliza
- MAŚLARSTWO: szybkie i silne zakwaszenie, wytwarzanie substancji aromatycznych (diacetyl,
aldehyd octowy, lotne kwasy)
PRODUKCJA
- namnożenie w optymalnych warunkach
- standaryzacja składu gatunkowego (ustalenie proporcji)
- zabezpieczenie żywotności i właściwości biochemicznych
Forma szczepionki
→ drożdże dla przemysłu winiarskiego, gorzelnianego i browarnianego: skosy agarowe, hodowle
płynne, suszone, granulowane – pokryte specjalną ochronną polewą
→ startery dla piekarstwa: liofilizowane lub mrożone (Lactobacillus + Saccaromyces cerevisiae 100:1)
→ mleczarskie: mieszaniny szczepów, płynne, suszone, mrożone (-40˚C, -70˚C, ciekły azot -196˚C)
RHODIA FOOD BIOLACTA
- koncentraty, liofilizaty, tabletki (kefirowe, serowe, twarogowe, maślane, jogurtowe)
Chr. HANSEN
m.in. szczepionki DVS – Direct Vet Set (mrożony lub liofilizowany granulat) jednostkowe opakowanie
500g, -45˚C – aktywne 1 rok, 1g DVS = 5x10
10
jtk/g (żywe komórki)
Produkty uzyskiwane z mleka na drodze fermentacji: jogurt, kefir, maślanka, kwaśna śmietana,
niedojrzewające sery
Mikroorganizmy starterowe:
- Streptococcus cremoris = maślanka
- S. lactis = maślanka
- S. thermophilus = kwas, smak
- S. diacetylactis = maślanka
- Lactobacillus acidophilus = kwaśne mleko
- L. bulgaricus = kwaśne mleko (acetaldehyd)
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
10
- Leuconostoc cremoris = maślanka
- L. dextranicum = smak (acetoina)
Laktoza → glukoza + galaktoza → pirogronian → kwas mlekowy, ślady CH
3
COOH, CO
2
Główne produkty fermentacyjne
produkt
temp., czas
starter
Kwaśne mleko
37-40˚C, 16-18godz.
L. acidophilus
Maślanka
22˚C, 18godz.
S. cremoris lub lactis
S. diacetylactis lub Leuconostoc
Kefir
18-22˚C, 12godz.
10˚C, 1-3dni
„ziarna kefirowe”
Streptococcus, Lactobacillus
cancasicus,Leuconostoc,
drożdże
Kumys
28˚C, 2godz.
L. bulgaricus, Torulopris kolmii
Jogurt
43-45˚C, 3dni
S. thermophilus, L. bulgaricus
Kwaśna śmietana
22˚C, 18godz
S. cremoris lub lactis, S.
diacetylactis lub Leuconostoc
Lactobacillus – warunki bardzo beztlenowe → AcOH zamiast mleczanu
Leuconostoc dextranicum → kwas cytrynowy → pirogronowy → acetoina (zapach maślany) →
diacetyl → CO
2
L. bulgaricus i S. thermophilus → acetaldehyd (główny składnik smakowy jogurtu)
MLEKO
*kazeina – 80% białka (wrażliwa na precypitację kwaśną, solami,enzymami)
*białka rozpuszczalne (niewrażliwe na precypitację enzymatyczną)
*tłuszcze – zokludowane na micellach kazeiny
*laktoza → glukoza + galaktoza → pirogronian → mleczan (+ CH
3
COOH + CO
2
) (homofermentacja
mlekowa)
PASTERYZACJA HTST – high temperature short time 72˚C/15sek
(niszczy patogenne bakterie: Salmonella, Mycobacterium, unieczynnia enzymy mleka – bakteryjne
lipazy)
PROCEDURA UHT – ultra-heat-treated 141˚C/3sek (wtłaczanie między rozgrzane płyty)
Aseptyczne pakowanie (ok. 6 miesięcy poza chłodnią)
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
11
Wykład 6. – 7.04.2009 r.
→ koagulacja – destabilizacja składników mleka (micelle kazeiny – 80% białka, rozpuszczalne białka,
tłuszcze, laktoza)→ zakwaszenie i/lub ogrzewanie
+ chymozyna – podpuszczka (renina) 1g/100kg mleka (-pepsyna, enzymy z Mucor, B. subtilis) → niska
aktywnośd proteolityczna – wysoka aglutynacja
→ ogrzewanie i oddzielenie serwatki – 38˚C Cheddar, 52˚C Swiss
→ nadawanie kształtu – prasowanie
→ solenie
→ dojrzewanie (działają bakterie, enzymy mleka, podpuszczka, dodane lipazy, pleśnie drożdże) 4-
15˚C kilka tygodni-2 lata
1874 – duoska firma Christian Hansen A/S – preparat podpuszczki cielęcej – chymozyny (dla serów
dojrzewających)
→ proteinazy koagulujące
→ lipazy (wzbogacają aromat)
→ β galaktozydaza (hydroliza laktozy serwatki)
→ lizozym (hamowanie fermentacji masłowej, Edam, Gouda)
→ katalaza (enzymatyczna „pasteryzacja” mleka)
→ koagulanty mikrobiologiczne zastępujące chymozynę – Mucor i transgeniczne bakterie
W Portugalii – podpuszczki roślinne ekstrahowane z kwiatów Cynara cardunculus
- filtrowanie, 30˚C (większe osady)
- klarowanie – sedymentacja, 28-30˚C, pompowanie przez sedymentator 7tys-50tys l/godz
- usuwanie bakterii, wirówki, 54˚C
- subpasteryzacja – 63-65˚C → 4-8˚C
- ultrafiltracja (sery miękkie)
- pasteryzacja 63˚C-30min / 72˚C-16sek
- dodatki – 0,02%CaCl
2
(lepsza koagulacja), NO
3
-
(Edam, Gouda, Swiss), kolor (barwniki pochodzenia
roślinnego), lipazy (Parmezan)
Serwatka – 90% objętości mleka
-zagęszczanie – odwrotna osmoza, ultrafiltracja
-frakcjonowanie
Max odzysk białka – denaturacja > 90˚C , pH 6-7 i precypitacja pH 4,4-5,5, wirowanie
Laktoza – krystalizacja po odbiałczaniu → hydrolizaty → syropy glukozowo/galaktozowe (kwaśna
hydroliza, enzymatyczna i jonit H
+
)
Komercyjnie – wytwórnie we Francji, Anglii, USA i Nowej Zelandii
-immobilizowana laktoza z Aspergillus Niger lub E. coli
→ do produkcji SCP z drożdży
→ etanol 1l EtOH z 42l serwatki
→kwas mlekowy, Lactobacillus bulgaricus
→napoje niealkoholowe – serwatka + soki owocowe + CO
2
Freshi – Szwajcaria (50% serwatki + soki
cytrusowe + cukier, woda 90˚C, pakowane do 0,5l butelek
→fermentacja niealkoholowa: cała lub odbiałczona serwatka – bakterie mlekowe
HACCP – hazard analysis critical control points
- system analizy krytycznych punktów zagrożenia (WHO – Światowa Organizacja Zdrowia I EEC)
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
12
- ma zapewnid prawidłowy stan mikrobiologiczny produktu poprzez zapobieganie zagrożeniom w
całym łaocuchu produkcji od surowców do opakowania i sprzedaży
Punkt krytyczny (CCP) – surowiec, miejsce, postępowanie itd., opakowanie, mycie urządzeo
1. Analiza ciągu produkcyjnego – wyznaczanie wszystkich aspektów procesu (źródło surowca,
sprzedaż…)
2. Identyfikacja CCP – miejsce, etap procesu związany z zagrożeniem mikrobiologicznym
3. Monitorowanie (szybkie, zautomatyzowane metody)
Obrazki
Substancje wzmacniające smaki
E621 – glutaminian sodu
E622 – glutaminian potasu
E623, 624, 625 (wapnia, amonu, magnezu)
E626 – kwas guanylowy (smak umami) (fermentacja lub hydroliza RNA)
↓
627, 628, 629
E630 – kwas inozynowy (z sardynek)
E634 – rybonukleotydy wapnia (smak i zapach mięsa)
E636 – maltol (~”karmel”, „świeżo pieczone pieczywo”)
↓
Gumy do żucia, pieczywo, ciasta, lody, dżemy, wina
E634 – L-Leu (drażetki, pastylki, cukierki)
BARWNIKI
E100 – kurkuma (musztarda, sosy, mrożone ciasta)
E140 – chlorofile (oleje, tłuszcze, przetwory warzywne)
E153 – węgiel drzewny (do cieniowania barwy)
E160 – karotenoidy
SYNTETYCZNE
E143 – zieleo trwała (marmolady cytrusowe, dżemy, galaretki, groszek konserwowy)
E151 – czero brylantowa (ikra rybia, nadzienie z czarnej porzeczki)
Metyloketony
WZÓR
Penicillium roquefortii – spory
REAKCJA
→ produkcja przemysłowa – bardzo kosztowna (są lotne, toksyczne dla grzybów)
→ techniki fermentacyjne – uzupełniane konwersjami enzymatycznymi
Diacetyl (2,3-butadion) CH
3
COCOCH
3
W rozcieoczonym roztworze – zapach maślany (przem. Spożywczy i perfumeryjny)
Obok powstaje też acetoina (
wzór
)
REAKCJA
Streptococcus lactis ssp. diacetilactis
Leuconostoc (na wydajnośd wpływa pH <5,5, niska temp. i napowietrzanie)
→ jest sprzedawany w USA jako produkt importowany z Francji (technologia nie jest znana)
Laktony – cykliczne estry γ i δ hydroksykwasów
Zapachy: brzoskwiniowy, śmietankowy, owocowy, orzechowy, kokosowy, miodowy
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
13
WZORY
Patent: drożdże Pityrosporum
Substrat: kwas olejowy, lecytyna
Kwas izowalerianowy (CH
3
)
2
CHCH
2
COOH
→ estry
- etylowy – zapach jabłkowy (cukierki, gumy do żucia)
- izopentylowy – zapach malinowo – jabłkowy
- izobutylowy – zapach malinowy
→ droga syntezy chemicznej (utlenianie alk. izopentylowego)
→ 2 potencjalne metody fermentacyjne
Zastosowania – mieszaniny smakowo zapachowe
→ mleczarstwo
- „zapachy serowe” – sosy, przekąski
- USA – skrócenie czasu dojrzewania sera z zachowaniem walorów smakowych
- sery niebieskie – preparat enzymatyczny z Aspergillus (przyspiesza tworzenie kwasów tłuszczowych
i δ laktonów)
- sery typu Cheddar – mieszaniny enzymatyczne
- płynne lub sproszkowane zawiesiny bakterii (Streptococcus, Acetobacter – 24 godz hodowli
tlenowej na mleku → pasteryzacja = dodatek)
- EMC – Enzyme Modyfied Cheese – procedury tajne: pełna gama „zapachów” – Cheddar,
szwajcarski, parmezan, mozarella itp.
→ zapachy „chlebowe”
Podczas fermentacji powstaje ponad 100 lotnych związków zapachowych (wyrastanie ciasta)
- uzupełnienie mąki – skrócenie produkcji
„ROCZNY RYNEK” ŚRODKÓW ZAPACHOWYCH I SMAKOWYCH
W 1994 – 9,7 mld $
Znanych jest 10000 syntetycznych środków zapachowych, stosowanych jest kilkaset, 400 jest
produkowanych w skali >1tony rocznie
WNILINA
BENZALDEHYD 4(R)-DEKANOLID – wiele ton rocznie
↓
↓
Koniec XIX w. 1837-Liebig, Wöhlen – pierwszy związek zapachowy
↓
Syntetyczna – 12$/kg, naturalna (ekstrahowana) – 4000$/kg
Metody biotechnologiczne
→ jednostopniowe biotransformacje
→ biokonwersje
→ synteza de novo
Wykorzystanie lignin – ich składników do produkcji waniliny procesie biotransformacji kwasu
ferulowego przez grzyby – podstawczaki
REAKCJE
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
14
Wanilia i wanilina nie znana do czasów Corteza(1520)
Do 1816 izolowana z nasion wanilii
1874 – poznano strukturę
Konsumpcja 12000ton/rok ~50ton z naturalnych źródeł
Met. biotechnologiczne – „identyczna z naturalną” (wykorzystanie szlaku metabolicznego
charakterystycznego dla roślin – funkcjonującego w niższych organizmach)
MIKROLBIOLOGICZNA DEGRADACJA Phe
Grzyby – podstawczaki
REAKCJE
Benzaldehyd (gorzkie migdały) – aromat identyczny z naturalnym
Benzaldehyd jest uwalniany z cyjanogennego glikozydu – amigdaliny (nasiona pestkowców) (uwalnia
się HCN jako produkt uboczny) → aromat naturalny
NOOTKATON I 4-DEKANOLID (owocowo-„tłusty”)
WZORY
JAKAŚ TABELKA
4-dekanolid – główny składnik smakowo-zapachowy truskawek, brzoskwio i moreli (również w
produktach mleczarskich i fermentowanej żywności)
Proces produkcyjny od 1990r
Cena naturalnego produktu – 1200$/kg
Z naturalnych źródeł roślinnych – 20000$/kg
TABELKI
PRODUKCJA SCP (single cell protein)
- dodatek do żywności
- dodatek do paszy
Mikroorganizmy o szerokim spektrum zdolności do wykorzystywania różnych substratów i szybkim
wzroście (czas generacji 20min-2godz. + drożdże, pleśnie, wyższe grzyby – 2-16godz.)
*Alcaligenes faecalis i Cellulomonas sp. – celuloza (Luizjana)
↓glukozydazy
↓celulazy
Cukry rozpuszczalne ← celuloza
*Pseudomonas, Hyphomicrobium, Acinetobacter, Flavobacterium
↓ CH
4
SCP
*Surowce wtórne jako substraty
-wytłoki trzciny cukrowej, ścieki z papierni, ługi posulfitowe (glukoza, celuloza, laktozy) –
Cellulomonas, Thermonospora fusca
-obornik kurzy, bydlęcy, świoski (mocznik, kwas moczowy, białka i niebiałkowe zw. N) – Ps.
fluorescens, Rhodopseudomonas sp.
-melasy i cukry trzciny cukrowej i buraków, ścieki z przeróbki owoców
-serwatka (laktoza) – Acetomonas hydrophilus
-odpady z przeróbki mięsa (kolagen, niebiałkowe zw.N) – Bacillus megaterium
-inne surowce
*węglowodory – Achromobacter deliactate (n-alkany)
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
15
*gaz opałowy – Pseudomonas 5401 (n-alkany)
*n-parafiny (ciekłe) – Cerynebacterium (n-propan)
*n-parafiny (gazowe) – Nocardia paraffinica (n-butan)
*etanol – Acinetobacter calcoaceticus
*metanol – Methylophilus mathylotrophus, Maethylomonas clara (Moedist “Probion”)
*Grzyby nitkowate do produkcji SCP
-odpady skrobiowe, celulozowe, serwatka
Finlandia – Pekilo – Paecilomyces variotti
→ projekt: zżelatynizowana skrobia (jęczmieo) amylolityczny szczep Rhizopus oligosporus –
„mięso”(1981r.)
Tłuszcze i oleje z mikroorganizmów
(soja-16% oleju, 15mln ton rocznie z 60mln rocznego zużycia, USA-65% światowej produkcji, Brazylia-11%
Rośliny oleiste: soja, orzeszki ziemne, bawełna, palmy, kokosy, słoneczniki, rzepak←Europa)
MIKROORGANIZMY OLEAGENICZNE → oleje podobne do roślinnych – C
16
i C
18
kw. tłuszczowe
DROŻDŻE– lipidy>20% biomasy – liaza cytrynianowi
Cytrynian + ATP + CoA → acetylo-CoA + AD + Pi + szczawiooctan
(acetylo-CoA nie musi byd wytwarzany w mitochondriach z Py)
U organizmów nieoleagenicznych brak tego enzymu
Kumulacja lipidów
- u organizmów oleagenicznych na podłożach, gdzie C:N=50:1
*hodowla stacjonarna – wyczerpanie N i kumulacja C w postaci lipidów
*hodowla ciągła – ograniczony dostęp N
(drożdże) → BIOLIPID (byłe ZSRR) – dodatek do olejów napędowych
BAKTERIE: mykobakterie i nocardie
Jedyny „dobry” szczep Arthrobacter AK19? (80% biomasy – triacyloglicerole – ale wzrost bardzo
podobny)
PHB – poli-β-hydroksymaślan
WZÓR
→ Anglia – BIOPOL – biodegradowalne tworzywo, termoplastyczne, własności piezoelektryczne
Alcaligenes entrophus – 70-80% biomasy
WOSKI – Acinetobacter
WZÓR
2-3% biomasy, własności tranu i jojoby
GLONY
Oleje – do 70% Chlorella pirenoidosa, teoretycznie 15-25g/l → 25ton/hektar/rok
Botrycoccus braunii (53% lipidów)
Botrykocen WZÓR
Kraking botrykocenu – 67% benzyna, 15% paliwo do turbin lotniczych, 15% diesel
Przyszłościowa metoda produkcji olejów napędowych???
SCO – Single Cell Oil – ma przewagę nad SCP – może byd zastosowany w technice – niepotrzebne
drogie badania toksykologiczne
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
16
Wykład 7. – 21.04.2009 r.
L-Glu 370 tys ton rocznie
(kwaśna, ciśnieniowa hydroliza białek pszenicy) – dawniej
sole – wartośd smakowa (przyprawa)
Substrat w syntezach chemicznych
N-acyloglu – biodegradowalny surfaktant, nieszkodliwy dla skóry (mydła, szampony)
Amidy N-acyloglu – środki żelujące (dyspergowanie olejów – ochrona wód morskich)
Kwas oksypirolidynokarboksylowy – nawadniający (kosmetyki)
Szczepy: Corynebacterium, Brewibacterium, Microbacterium, Arthrobacter
Źródło C: różne cukry, przemysłowo: melasy, hydrolizaty skrobiowe
Źródło N: NH
4
Cl, (NH
4
)
2
SO
4
, mocznik, NH
3
Proces tlenowy, biotyna – rola regulująca (poprzez zawartośd fosfolipidów w membranach)
L-Asp
-pierwotnie hydroliza Ans z soku asparagusa
-od 1958-met.fermentacyjne lub enzymatyczne z kwasu fumarowego (aspartaza)
-nośnik K
+
i Mg
2+
w mięśniu sercowym (asparagina)
-sól K-
choroby wątroby
Sól Fe-anemia
-związki powierzchniowo-czynne
-B
6
+ Asp-kosmetyki
-sól Na-przyprawa soku pomaraoczowego
-aspartam (L-Asp-PheOMe)
→fermentacja (nie na skalę przemysłową) mutant auksotroficzny Brewibacterium flaum glukoza lub
fumaran (mała wydajnośd, patent przem.)
→enzymatycznie
-fumaran+wysuszone komórki E.coli 37˚C,18 godz.-88% L-Asp
-proces ciągły-przemysłowy (Japonia) (aspartam = amoniakoliaza aspar)
-kolumna-E.coli w poliakrylamidzie (120dni w 37˚C), E.coli w karageninie (2lata)
-1 i 2M fumaran amonu, 1mM Mg
2+
, pH 8,5, 37˚C
Schemat procesu kolumnowego: 60% H
2
SO
4
, chłodzenie 15˚C, wirowanie, przemywanie H
2
O
95% wydajności
Kwas cytrynowy
300tys ton rocznie (met. biol.)
(1784-Schelle-sok z cytryny)
-owoce cytrusowe, produkt pośredni CKT (wszystkie organizmy)
-metody chemiczne od 1889r. z glicerolu(drogie, niska wydajnośd)
-metody fermentacyjne-gatunki Penicilum (citromyces)
Pierwsze technologie-Anglia, Belgia, Czechosłowacja, Niemcy
-rynek światowy 300tys ton/rok
-wytwarzany jako monohydrat lub bezwodny
Zastosowanie:
-środki żywności, słodycze, napoje (75%)
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
17
-farmakologia (10%)
-przemysł (15%)
*kompleksowanie metali ciężkich Fe, Cu (stabilizator olejów i tłuszczy-zmniejsza procesy utleniania
katalizowane przez te metale)
*nie niszczy powierzchni metalowych (czyszczenie bojlerów i innych instalacji)
*stabilizuje kwas askorbinowy-daje efekt musujący z węglanami i dwuwęglanami (rozpuszczalna
aspiryna), jako anion w przypadku leków będących zasadami
*sól trójNa-stabilizacja krwi (kompleksje Ca
2+
zapobiegając krzepnięciu)
-sól żelazoamonowa-anemia
-sól + kwas – mieszaniny buforowe (farmakologia, kosmetyka, przemysł spożywczy), usuwanie SO2 z
gazów odlotowych z ??? i pieców hutniczych (wzór reakcji, ale nie ważny)
-estry z różnymi alkoholami (tributylowe, trietylowe, acetylotributylowe)-plastyfikatory-folie do
pakowanie żywności
Fermentacja:
-Aspergillus niger
-ferm. powierzchniowa-melasa z buraków cukrowych
-ferm. wgłębna-melasa z buraków cukrowych lub trzciny cukrowej ewentualnie syrop
glukozowy
-drożdże Candida
-ferm. wgłębna-melasy lub syrop glukozowy
Proces powierzchniowy: A.niger (30% produkcji) stosowany najpowszechniej-szczegóły-TOP SECRET
→melasa + woda, pH 5-7; 150kg/m
3
; nieorg.składniki, żelazicyjanek, sterylizacja lub gotowanie
→seria „korytek” z czystego aluminium w wentylowanych komorach, dodatek podłoża (0,05-0,2m) +
spory (sterylne powietrze, „usuwanie” ciepła, temp30˚C)
→7-15dni-opróżnienie korytek i usunięcie myceliów, płyn hodowlany→sekcja oczyszczająca
Proces wgłębny: różne typy fermentorów, zbiorniki z mieszaniem i napowietrzaniem, fermentory
wieżowe → wymagają efektywnego chłodzenia temp. 25-37˚C pH 3,5 (NH
3
)
Proces fermentacji na podłożu stałym: Japonia; otręby pszenne, melasy
Kwas glukonowy
50tys ton/rok
-δ lakton-w proszku do pieczenia
-sole Na-czynniki maskujące Fe; NaOH+glukonian Na-alkaliczne odrdzewianie
-sole Ca-leczenie deficytu Ca
-sole Fe-leczenie anemii
-jako aniony w lekach z grupami –NH
2
Produkcja:
-met.chemiczne-utlenienie D-glukozy elektrochem. W obecności ??? lub O
2
+ katalizator
-met.fermentacyjne (wyparły obecnie met.chemiczne)
REAKCJE
*Aspergillus niger
*Acetobacter suboxidous (hodowle wgłębne), Glukonobacter
1)-glukoza lub syrop dekstrozowy
-sole amonowe, mocznik, namok kukurydziany
-PO
4
3-
, K
+
, Mg
2+
, pH 6-7 (NaOH) temp 30-33˚C, 19godz. – 109% (na 100kg glukozy)
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
18
2)-skrobia podhydrolizowana bakteryjnymi α-amylazami do dekstranu + syrop kukurydziany, K
2
HPO
4
,
30˚C, pH 6 (↓ 3-2), 24godz.
Oczyszczanie:
-klaryfikacja, dekoloryzacja, zagęszczanie (odparowanie)
-krystalizacja
-chromatografia jonowymienna – Amberlite
Kwas mlekowy
WZORY
-50% w piekarnictwie-zakwaszacz i środek konserwujący
-stearylomleczan-w przem.farmaceutycznym
-jako r-r 50% lub 88%
-silnie korozyjny (→pudry, proszki)
-synton w przem.farmeceutycznym
-polimleczan-biodegradowalne tworzywa (nici chirurgiczne)
-estry kwasów tłuszczowych-emulsyfikatory w piekarnictwie i kosmetyce
-do produkcji celofanu
-jako plastyfikatory (estry z alkoholami)
-do produkcji pewnych pestycydów
Większośd jest wytwarzana chemicznie. Pozostała fermentacyjnie – karmelizacja – zapach ???
Proces fermentacyjny: (taoszy niż met.chemiczne)
-homofermentacja mlekowa Rhizopus oryzae, Lactobacillus, Pedicoccus, Streptococcus
40˚C, pH 5-7 (fakultatywne anaeroby)
1cz.glukozy→glikoliza→2cz.kwasu mlekowego
Typowa wydajnośd 100g → 90g kwasu mlekowego
-może powstad D(-); L(+); racemat
Wymagane cechy „producenta” przemysłowego:
Szybki i efektywny rozkład taniego źródła C, minimalne zapotrzebowanie na źródło N, wysoka
wydajnośd jednego stereoizomeru w warunkach wysokiej temp., niskiego pH, niska zawartośd
produktów ubocznych.
Fermentacja przemysłowa-proces stacjonarny
→fermentory drewniane lub z nierdzewnej stali
→inokulum w oddzielnym fermentorze lub z poprzedniej szarży
→C-sacharoza, serwatka, dekstroza (większośd wytwórni przy cukrowniach trzciny cukrowej)
N-ekstrakt drożdżowy, namok kukurydziany
→1-2dni – 5% źródło cukru (serwatka)
2-6dni – 15% źródło cukru (glukoza, sacharoza)
→filtracja; dekoloryzacja (węgiel aktywny); odparowanie w 70˚C, 0,5atm; zakwaszenie mlecznu Ca
(69% H
2
SO
4
); kolejna filtracja, zagęszczanie, dekoloryzacja
Polska – Akwawit Leszno (Lactobacillus delbruechii, sacharoza + kiełki/ekstrakt drożdżowy, 50-55˚C,
2-8dni
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
19
BIOTECHNOLOGIA „SPOŻYWCZA” W POLSCE
1)Wołczyn, Maszewo – produkcja osmofilnych drożdży piekarskich (Politechnika Łódzka – fuzja
protoplastów)
2)Rhodia Ford Biolacta – szczepionki (startery) mleczarskie
3)Leszno Akwawit – kwas mlekowy
4)Zgierz „Cytrokwas” – kwas glukonowy
5)Wałcz cukrownia, Biorol, Polfa – kwas cytrynowy
Konwersja skrobi kukurydzianej
W USA do 1972 – jedyny środek słodzący-sacharoza, →poszukiwanie taoszych cukrów
Amyloza 300-1000 reszt glukozy i amylopektyna (dodatkowe wiązania α-1,6←tu przestaje działad
βamylaza->oligo-1,6-glukozydaza) →cięte przez α amylazy
α-amylazy → enzymy dekstrynogenne (endoglikozydazy)
↓
Oligosacharydy (6-7cz. glukozy)
↓
Maltoza
β-amylazy → enzymy sacharogenne
SCHEMAT
Skrobia kukurydziana
↓ kwaśna hydroliza
Dekstroza (mało słodka, gorzka, kolor)
→Metody enzymatyczne
Skrobia → Bakteryjne α-amylazy→ dekstryny (stan ciekły) → dekstroza
↓grzybowe glukoamylazy
Sacharyfikacja → dekstroza
↓ izomeraza glukozowa
Fruktoza
→ od 1972 – proces ciągły z izomerazą immobilizowaną na stałym nośniku
Syropy fruktozowe HFCS (high fructose corn syrup)
-pierwsze -15% fruktozy
-obecnie – 42%, 55%, 90%
Proces technologiczny
1)zawiesina skrobii → żelatynizacja „kleikowanie” (wysoka temp.)
2)α-amylaza → przeprowadzenie w stan ciekły
3)zmiana temp. i pH, glukozamylaza → sacharyfikacja (reaktory o pracy ciągłej – 65-75godz. → 94-
96% dekstrozy)
4)izomeryzacja
Kolumny z immobilizowaną izomerazą glukozową (trwałośd – kilka miesięcy)
5)rafinacja
-szereg filtrów i kolumn z węglem aktywnym
-kolumny jonowymienne (usunięcie metali ciężkich, substancji popiołowych, barwy)
-dodatek Mg
2+
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
20
6)druga rafinacja
-system: węgiel aktywny – wymieniacz jonowy
↓
42% HFCS → odparowanie → 71%
Proces produkcji TAKA-SWEET®FM (Miles Laboratories)
-immobilizacja całych komórek Flavobacterium arborescens
-wirowanie hodowli
-ogrzewanie biomasy („wewnątrzkomórkowa immobilizacja”)
-sieciowanie
PEI – polietylenoimina
-dodatek chitozanu
-dodatek glutaraldehydu
-odwodnienie przez filtracje
-„nadawanie kształtu”
-suszenie
IGI – immobilized glucose isomerase
SWEETZYME® - Bacillus coapulans NOVO INDUSTRI
MEXAZYME® - Actinoplanes
LETOZYME®
OPTISWEET®22
Enzymy w procesach biotechnologicznych
1981 – ok 65000 ton ~400mln $
(Dania (50%), Holandia (20%), USA (12%), Japonia, Niemcy, Francja, Szwajcaria, Anglia)
ENZYMY PROTEOLITYCZNE
Proteazy – hydrolazy peptydowe
→ peptydazy
-aminopeptydazy
-dipeptydazy
-karboksypeptydazy:
-serynowe
-metalozależne
→ proteinazy
-serynowe
-tiolowe
-karboksylowe
-metalozależne
-pochodzenia zwierzęcego → podpuszczka
-pochodzenia roślinnego → papaina – Carica papaya; fizyna – Ficus carica; bromolaina – ananas
-pochodzenia mikrobiologicznego
SCHEMAT
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
21
Proteinazy serynowe – alkaliczne
-trypsynopodobne: -Streptomyces, -pankreatyna (przem.spożywczy, farmaceutyczny,
garbarstwo)
-alkaliczne (serynowe): pochodzenia bakteryjnego: subtylizyna (datergenty enzymatyczne)
Proteinazy tiulowe: papaina, bromelaina, ficyna
Proteinazy kwaśne:
-reninopodobne: podpuszczka cielęca i bakteryjna
-pepsynopodobne: wieprzowa i wołowa pepsyna, proteinazy z Aspergillus (hydroliza białek
soji → sos sojowy)
Metaloproteinazy:
-obojętne: z Bacillus (browarnictwo)
-alkaliczne: z Aspergillus (przem.spożywczy, farmaceutyczny, garbarstwo)
ZASTOSOWANIE:
-kontrola gorzkiego smaku w hydrolizatach białka
-hydrolizaty białek soji
-hydrolizaty żelatyny
-białka serwatki i kazeina
-białka mięsa
-białko rybie
Resztki po przeróbce ryb → rozdrabnianie → (+proteza i H2O) → hydroliza → denaturacja enzymu
(pasteryzacja) → przesiewanie (odrzucane łuski i ości) → teraz mamy 2 drogi:
1- zatężanie → suszenie → produkt częściowo rozpuszczalny
2- wirowanie (oddzielamy olej i ciała stałe) → zatężanie → suszenie → produkt rozpuszczalny
-detergenty enzymatyczne
-mleczarstwo
-browarnictwo
-garbarstwo
-inne: p.roślinne – w paszy, produkcja podłoży mikrobiologicznych, mieszanki poprawiające
trawienie, urokinaza – lecznicze, brinaza (A.aryzae), kolagenaza, lizostafina
Inne enzymy hydrolityczne
→depolimeryzujące polisacharydy: celulazy, β-glukanazy, hemicelulazy, ksylanazy, dekstranazy
→laktaza
→pektynazy – galakturanazy
→lipazy
PEKTYNAZY
Z Aspergillus niger (esteraza + liaza endopoligalakturonowa +poligalakturonaza)
→ekstrakcja soków owocowych
→przetwórstwo soków cytrusowych
Skórka → mielenie → 90˚C → chłodzenie → pektynaza → dostajemy naturalne substancje
zmętniające
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
22
„reszta” → sok ← pektynaza (obniżenie lepkości)
→ pulpa ← pektynaza: odzysk resztek soku; pektyna (naturalne środki zmętniające)
→ produkcja wina (skraca czas fermentacji o 30-50%)
CELULAZY
Aspergillus niger, Trichoberma reesei
Penicillium funiculosum, Rhizopus sp.
→endoglukanazy (G)
n
– (G)
m
→(G)
n
+ (G)
m
→celobiohydrolazy (G)
2
– (G)
n(red.)
→ (G)
2
+ (G)
n(red)
→β glukozydazy (G)
2
→ G + G (+małe dekstryny)
*alkohol et. z celulozy
*”obróbka nasion” , browarnictwo, przetwórstwo owocowe
*wydzielanie wielocukrowców glonów morskich
→β-glukonaza β 1→3/β 1→4
Hydroliza glukanu jęczmienia (jęczmieo, Peniclium emersonii)
Bacillus amyloliquefaciens → komercyjnie
→β-glukanaza β 1→3/β 1→6
Poliglukan wytwarzany przez Botrytis cinerea atakujący winogrona
→dekstranazy
(Leuconostoc mesenteroides → dekstran)
Komercyjne dekstranazy: endo α1→6 glukanaza z Penicilium lilacinum, z Penicilium funiculosum
→Laktaza – β glukozydaza (β1→4)
Aspergillus niger, Bacillus sp., Klugveromyces lactis, Klugveromyces fragilis
SCHEMAT
LIPAZY
→drożdże Candida
→grzyby Aspergillus, Rhizopus, Mucor
→trzustkowe
-leki poprawiające trawienie
-produkcja mydła
-synteza chemiczna
-produkcja serów
-„zapachy” serowe i maślane
-cukiernictwo ( zapachy toffi, karmel)
-sztuczne śmietanki
-proszki enzymatyczne
-w paszy
PREPARATY ENZYMATYCZNE W PRZEMYŚLE SPOŻYWCZYM
1)PRZETWÓRSTWO WARZYW I OWOCÓW
Technologie sokownicze – obróbka miazgi i owoców (zredukowanie lepkości, lepsze klarowanie)
Enzymy pektynolityczne, amylolityczne, celulazy, ksylanazy, glukanazy
Aspergillus niger – pektynazy (liaza pektynianowa (endo), poligalakturanaza (endo i egzo))
Preparaty handlowe pektynaz: (50-70g/t)
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
23
PEELZYME (Novo Nordisk) → ułatwia mechaniczne obieranie skórki → NOVO NORDISK, SOLWAY
ENZYMES GmbH, RÖMM, AMANO, SANKYO, PEKTOWIN – Jasło
WINIARSTWO
Preparaty pektynolityczne: RAPIDASE VINO, RAPIDASE CB, AR, VINEZYM, ULTRAZYM
INNE
Produkcja kiszonek, ekstrakcja barwników i zw.zapach., technologia kawy rozpuszczalnej,
przetwórstwo soji, oleje
Gluten – „substancja białkowa” – 80-90% białka; elastyczna, spoista, lepka, plastyczna
Gluten pszenny – (→odmywanie maki wodą); 40-50% gliadyna – protaminy; 35-40% glutenina –
gluteliny; 3-5% inne białka (duza zawartośd Glu, Gln, Pro, Leu, Ile; mało aminokwasów egzogennych)
SCHEMAT
PIEKARSTWO
Enzymy amylolityczne i proteolityczne
*α amylaza grzybowa: FUNGAMYL (NOVO NORDIKS), AMYLAZE P (GIST BROCADES), DEPOL 243
(BIOCATALYSTS Ltd), FUNGAL AMYLASE (SOLWAY ENZYMES GmbH)
*proteazy grzybowe z A.oryzae (endo- i egzo-) → aminokwasy intensyfikujące wzrost drożdży
(+barwa skórki)
*proteazy bakteryjne z B.subtilis – specyficznośd hydrolizy glutenu na spadek lepkości, mniejsze
wiązanie wody → produkcja krakersów
TECHNOLOGIA CIĄGŁEGO I SZYBKIEGO WYPIEKU
Związki utleniające S-S: bromian potasu, kwas askorb. → oksydaza sulfhydrolowa, oksydaza
glukozowa
Związki redukujące S-S: chlorowodorek Cys, siarczyny
Hemicelulazy, celulazy, amylazy, poteazy
Przedłużenie świeżości: α amylaza, glukoamylaza, lipaza, laktoza, serwatka
Przemysł skrobiowy i gorzelnictwo
Ok. 15% ogólnej wartości sprzedaży preparatów enzymatycznych (przem.syropiarski i gorzelnie rol.)
Technologia:
*- mielenie (suchych i mokrych) ziaren
**- oddzielenie frakcji skrobii
***-enzymatyczne upłynnianie i scukrzanie
*-kukurydza i pszenica – celulazy; fitaza (bezfitynowe namoki skrobiowe)
*** początkowo → kwasem – pH 1,5-2, 140-150˚C, 8-10min
Obecnie →kwasowo-enzymatycznie i enzymatycznie
-ogrzewanie skrobii (30-45% sm) pH 5,8-6 z termostabilną α amylazą i 75-100ppm Ca
strumieniem pary 105-107˚C , 5-8min
-chłodzenie do 95˚C
-dodatek enzymu – dekstrynizacja
Termostabilne α amylazy:
-THERMAMYL (B.licheniformis) NOVO NORDISK
-OPTITHERM
-G-ZYME 6995 (B.stearothermophilus) ENZYME BIOSYSTEM INC
-NERVANASE - MT RHONE –POULENC
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
24
Scukrzanie: syropy wysokiej konwersji (30% glukozy, 43% maltozy) – glkozoamylazy, α amylaza
pleśniowa (A.niger → OPTIDEX, SOLWAY, AMIGASE-Gat)
Pullulanazy – PULLOZYME – RHONE POULENC
MIESZANKI ENZYMATYCZNE: glukoamylaza, pullulanaza
AMNAZYME – RHONE POULENC
DEXTROZYME – NOVO NORDISK
LIZOFOSFATAZY – ułatwiają filtrację skrobii pszennej
FOSFATAZA KWAŚNA – przyspiesza scukrzanie skrobii ziemniaczanej
SYROPY MALTOZOWE (42%) I WYSOKOMALTOZOWE (do 60%)
Maltodekstryny scukrza się α amylazą (A.oryzae) lub β amylazą słodową
POLISACHARYDY POCHODZENIA MIKROBIOLOGICZNEGO
→ przemysł żywnościowy i farmaceutyczny (emulsyfikatory, stabilizatory, czynniki żelujące i
koagulujące, do tworzenia cienkich powłok pokrywających)
Polisacharydy – systemy klasyfikacji:
-wewnątrzkomórkowe – zapasowe
-strukturalne
-egzocelularne – otoczki i śluzy
-homopolisacharydy (pullulan, dekstrany)
-heteropolisacharydy (ksantan)
-rozgałęzione
-prostoliniowe
-anionowe (ksantan, alginian), obojętne (lewan, pullulan), kationowe
→żródła:
Gram (+), Gram (-), glony, grzyby
→substraty:
Glukoza, fruktoza, sacharoza, laktoza, zhydrolizowana skrobia, metanol, węglowodory,
Mycobacterium lactinolum – n-dodekan
Corynebacterium viscosus – n-alkany C
13
-C
16
→>20 różnych otrzymywanych na drodze fermentacji
produkt
substrat
mikroorganizm
%
alginian
Sacharoza
Azotobacter vinelandii
5-45
lewan
2% Sacharoza
Zymomonas mobilis
<2
pullulan
5% Sacharoza
Aureobasidium
pullulans
50-60
ksantan
6% Sacharoza
Xanthomonas
campestris
38
galaktoglukan
6% Sacharoza
Zooglea ramigera
55
Kasntan → guma ksantanowa (żywica) m.cz. do 10
6
1980 → 8000 ton
W USA do otrzymywania ropy naftowej → 0,5kg polimeru/baryłki (1kg – 6-7$)
(D-glu, D-man, D-glukuronian, octan, pirogronian)
WZÓR
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
25
Lepkośd niezależna od temp. w zakresie 10-70˚C i stała w pH 6-9
Dekstran → polimer 6∙10
6
, - α-D-glukopiranoza
Komercyjnie produkowany – Leuconostoc mesenteroides i L.dextranicum, → ekstrakty
bezkomórkowe
WZÓR
→ produkcja sit molekularnych
Pullulan → *maltotrioza+x n, 5x10
4
-4x10
4
→lepiszcze, włókna, do powlekania powierzchni cienkim filmem
→niska rozpuszczalnośd dla tlenu → sieciowanie z innymi związkami → folie do pakowania
żywności zapobiegające utlenieniu
→Japonia – Azotobakter pullulans
WZÓR
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
26
Wykład 9. – 5.05.2009 r.
Biotechnologia otrzymywania niektórych odczynników chemicznych
2000lat pne Asyria – etanol, kwas octowy – ocet
XIX w. – fermentacja acetono-butanolowa
1914 – Clostridium acetobutylicum – komercyjna produkcja acetonu i butanolu → substraty
skrobiowe
-pierwsze instalacje – USA – I Wojna Światowa (aceton – do produkcji kordytu)
-octan butylu – lakiery nitrocelulozowe (Du Pont)
-rozwój przetwórstwa rop naftowej – ropa tania, fermentacja nieatrakcyjna
-wzrost cen ropy – i co dalej?
KWAS ITAKONOWY (matylenobursztynowy)
(p.fermentacyjny – grzyby 15000ton/rok)
WZÓR
→1836 – destylacja kwasu cytrynowego
→1931 – Aspergillus, Rhodotomla
Metody chem. – wysoki koszt surowca, niska wydajnośd
*kopolimer z akrylonitrylu – dobre własności schnące
*styren/butadien/kwas itakonowy – siatki do pokrywania spodów dywanów
*dodatek do farb (lepsza przylepnośd)
*estry – utwardzacze
*sztuczne szkło
….+aminy → pyrrolidony (detergenty)
Proces fermentacyjny – znany od przeszło 80 lat
→Aspergillus terreus – fermentacja wgłębna (USA) lub powierzchniowa
→glukoza, sacharoza + źródło N ((NH
4
)
2
SO
4
, NH
4
O
2
)
→melasa
→wydajnośd 56-65% - 100-180kg/m
3
→proces tlenowy, ograniczony dostęp Pi
REAKCJA
TABELKA
KWAS OCTOWY
→jeden z najważniejszych odczynników chemicznych rocznie produkcja 2,5 mln ton
→34-ty na liście najważniejszych chemikalia
→od 1950r – głównie na drodze syntezy chemicznej
- r-r wodny – ocet (10000 pne)
- najwcześniejsza wzmianka – Stary i Nowy Testament
→Vinegar – ferm.vin(wino); aigre (krainy)
-
łac. acetum – kwaśne wino
→najważniejsze metody otrzymywania :
- z naturalnych węglowodanów i biologiczne utlenienie alkoholu;
- sucha destylacja drewna
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
27
→ocet: jabłka, słód, winogrona, melasa, śliwki, (ocet winny – z tych źródeł – z fermentacji octowej
EtOH ma dodatkowe walory zapachowe i smakowe)
SCHEMAT
Otrzymywanie octu
Produkcja octu winnego
Bakterie fermentacji octowej: Acetobacter, Glukonoacetobacter
Proces wolny – Orleaoski – Metoda Francuska (met.powierzchniowa)
Drewniane baczki z winem, inokulacja octem winnym, 4 tygodnie, co tydzieo porcja wina, po 5
tygodniach odbiera się porcję octu i dodaje taką samą ilośd wina
-bakterie rosną na powierzchni – „mother of vinegar”
-modyfikacja: drewniane kratki, na których rozwija się zooglea (immobilizacja)
Proces szybki – w Niemczech (met.ociekowa)
Generator – drewniany lub okryty metalem, wypełniony bukowymi wiórami – na nich rozwijają- się
bakterie, od góry podawany jest roztwór alkoholu (złoże zraszane), od dołu – tłoczy się powietrze
Dodając 12% alkohol, otrzymuje się 98% konwersję do AcOH w ciągu 5 dni
Ten proces jest stosowany już przez około 1000lat.
BIOCHEMIA FERMENTACJI OCTOWEJ
1)Fermentacja octowa tlenowa
C
2
H
5
OH → *dehydrogenaza alkoholowa E1+→CH
3
CHO + H
2
O ↔ CH
3
CH(OH)
2
→ *dehydrogenaza
acetaldehydu E2+ → CH
3
COOH + H
2
O
2)Fermentacja octowa beztlenowa
Celuloza + mieszana mikroflora: bakterie celulolityczne i niecelulolityczne
+solubilizacja celulozy i hemiceluloz (gram (-), Bacteroides sp., Ruminococcus)
→kwasy alifatyczne (mrówkowy, octowy, propionowy, masłowy, walerianowy), kwas mlekowy,
bursztynowy, EtOH, CO
2
, H
2
)
Kwas mlekowy, bursztynowy, EtOH – substraty bakterii niecelulolitycznych → AcOH, CO
2
, H
2
Substraty: glony morskie, słoma kukurydziana potraktowana wstępnie 1% NaOH, ligniny
Wybór procesu:
Ocet – tlenowy
AcOH – beztlenowy (taoszy, niesterylny, bez napowietrzania)
W procesie biologicznym – 1,5t popiołu/t AcOH
Proces chemiczny – mniejszy nakład energii, ale ….
(fermentacja beztlenowa) CH3COOH – oczyszczanie produktu
*metody fizyczne: destylacja frakcjonowana, ekstrakcja
-w bioreaktorze, aby uniknąd inhibicji przez produkt → ciągły system ekstrakcji → żywice
jonowymienne, separacja membranowa
*rektyfikacja: →95% AcOH
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
28
Kwas propionowy i masłowy
-Głównie na drodze chemicznej i procesach petrochemicznych
-instalacje pilotowe do produkcji fermentacyjnej (oczyszczanie kosztowne, stężenie produktu niskie)
Propionibacterium, Veillonella, Clostridium – wolny wzrost
Rynek zbytu w USA
1981 – 50tys ton/rok – kw.propionowy
20tys ton/rok – kw.masłowy
Zastosowanie:
-sole kw.propionowego – p-grzybowe – konserwanty ziarna
-włókna celulozowe, herbicydy, perfumy, utwardzacze
-kw.masłowy – tworzywa celulozowe (estry), też w gumie do żucia, środki zapachowe
-przyszłośd: alternatywa dla paliw kopalnych – produkcja ketonów z obu kwasów – paliwa (Francja)
Etanol
-przemysłowe zastosowanie – 1800rok
-USA 1941 – 77% z fermentacji ~560mln litrów
-II WŚ – wzrost produkcji 4x (produkcja gumy syntetycznej i kordytu)
-po II WŚ – tanie źródło etylenu – synteza chem.
-1973 – embargo na ropę i wzrost cen – poszukiwanie alternatywnych paliw
-Przemysł fermentacyjny rozwinął się najintensywniej w Brazylii
-dzisiaj metody te dominują w krajach mniej uprzemysłowionych
3 klasy zastosowao przemysłowych:
-odczynnik (EtOH → butadien, etyloaminy, estry, CHCl
3
, chlorek etylu, aceton, acetaldehyd (→AcOH,
aldehyd krotonowy), etylen (→ polietery, surfaktanty, PCV, polistyren, polietylen)
-rozpuszczalnik
-paliwo
Fermentacja:
Substraty:
-sacharozowe – najdroższe
-skrobiowe – wstępna obróbka
-celulozowe – tanie, kosztowna obróbka
Drożdże – wydajne, odporniejsze
Termofilne: Clostridium thermosaccharosyticum, Thermoanaerobacter ethanolicus (pentozy jako
substraty?)
1g glukozy – 0,511g EtOH
Proces okresowy: 40-70godz.
Proces ciągły: dla ługów posulfitowych
Oczyszczanie: >50% kosztów całej produkcji
-dla przemysłu farmaceutycznego, kosmetycznego, chemicznego – 95%
-dla przem.-techn.
-absolutny – 89, 85%
-paliwo – 99,2%
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
29
ETANOL – PROCES FERMENTACYJNY
1)substraty sacharozowe
→sok z trzciny cukrowej – koszty transportu; Brazylia – 43%, ekstrakcja ciepłą wodą – 85-90% cukru;
125kg cukru z tony trzciny
→sok z buraków cukrowych – ciągła ekstrakcja wodą w 85˚C, 19-15% r-r cukru; 140-190kg cukru z
tony, pulpa celulozowa – pasza
→wysokocukrowe melasy – zatężone r-ry cukru, częściowa hydroliza rozcieoczonym kwasem →
sacharoza → glukoza +fruktoza
→”koocowe melasy” – niekrystalizujące pozostałości z produkcji cukru spożywczego (17%
niefermentującego materiału)
→słodkie sorgo
→serwatka
2)substraty skrobiowe (taosze, wstępna obróbka → rozpuszczanie i konwersja do cukrów
fermentujących)
→nasiona zbóż, skrobia bulw, niektóre kaktusy
Skrobia – uwodnienie i żelatynizacja, (mielenie i gotowanie) obróbka enzymatyczna, rozcieoczone
kwasy (20% kosztów produkcji EtOH)
(kukurydza – USA, pszenica, jęczmieo, żyto, sorgo, ryż, bulwy ziemniaka, manioku, karczocha)
3)substraty celulozowe: (ograniczenia kosztami transportu, tanie jako odpady, bardzo kosztowna
obróbka wstępna)
-celuloza, hemicelulozy, ligniny
→ścieki celulozowe z papierni
→ścieki posulfitowe (z produkcji pulpy papierowej) → usunięcie toksyn
Dwa procesy hydrolizy:
a) wolna kwaśna hydroliza
0,2-1% H
2
SO
4
(Scholler) lub 40-45% H
2
SO
4
(Bergins)
↓
500kg cukru z 1 tony materiału drzewnego
-hydroliza w kotłach (14t vol) kwaso- i ciśnienioodpornych – 350kPa – 1135kPa, ogrzewanie parą,
perkolacje kwasu, całkowita hydroliza – 2,5-3,5godz.
-neutralizacja wapnem (Nowa Zelandia, Rosja, Brazylia)
-wymaga 0,65kg H
2
SO
4
i 0,5kg wapna/kg cukru
b) szybka kwaśna hydroliza
3450kPa, 240˚C, 0,5% H2SO4 → 60% konwersji cukru w ciągu 60sek.
(instalacje pilotowe w USA)
c) hydroliza enzymatyczna
niska temperatura i ciśnienie (koszty ↓), nie trzeba neutralizowad, cukry nie ulegają dekompozycji
INSTALACJE PILOTOWE
Mikroorganizmy celulolityczne: grzyby: Fusarium, Phanerochaete, Trichoderma (endo- i
egzoglukanazy – celobioza i β-glukanazy – celobioza → glukoza)
Wstępna obróbka: mielenie i delignifikacja (ekstrakcja)
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
30
Biodegradacja celulozy
Enzymy celulolityczne:
-endoglukanaza
-egzo-β-1,4-glukanaza
-celobiohydrolaza
-β-glukozydaza
RYSUNEK
FERMENTACJA
→głównie drożdże – wydajne, odporne i większe niż bakterie; ślady produktów ubocznych
→termofilne: Clostridium thermosaccharolyticum, Thermoanaerobacter ethanolicus
Wykorzystanie pentoz nieprzyswajalnych dla drożdży? Produkty uboczne, warunki tlenowe
→bakterie Zymonas mobilis – fermentacja glukozy 10% wyższa niż drożdży, mniejsza odpornośd na
EtOH, trudniejsze do odwirowania
Ideał: szybka fermentacja, wykorzystanie pentoz, wysoka tolerancja na EtOH, dobre właściwości
flokulacyjne
Cechy drożdży (wymagane): szybki wzrost, szybka fermentacja, wysoka wydajnośd EtOH, tolerancja
na EtOH i glukozę, osmotolerancja, niskie optimum pH, odpornośd na stres chemiczny i fizyczny
C
6
H
12
O
6
→ 2C
2
H
5
OH + 2CO
2
+ ATP
1g glukozy → 0,511g EtOH
(reakcje uboczne → tworzenie biomasy → zużycie glukozy)
Dodatki: NH
4
Cl, MgSO
4
, CaCl
2
, ekstrakt drożdżowy
→proces okresowy:
*aktywne inokulum
*szereg reaktorów o wzrastającej objętości, warunki tlenowe – 5bilionów komórek/1litr – 5godz.
*fermentacja – 40-70godz. W zależności od surowca
*destylacja
*mycie fermentora
> proces Mellé-Boinot
Krótszy czas, zwiększenie wydajności – zawracanie drożdży do następnego cyklu, stosowany w
Europie dla fermentacji melas
→proces ciągły:
Dla ługów posulfitowych (które są aseptyczne same w sobie)
OCZYSZCZANIE
Energochłonne > 50% kosztów produkcji drogą fermentacji: różne destylacje np. azeotropowa z
benzenem
Problem odpadów pofermentacyjnych: wywary pogorzelniane
-pasza
-fermentacja beztlenowa → 65% CH
4
, CO
2
, NH
3
Produkcja biogazu z wywarów
-z melasy – 290l gazu/ l EtOH
-ścieki posulfitowe – 290l gazu/l EtOH
-skrobia kukurydziana – 80l gazu/l EtOH
-nawóz (zapach!)
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
31
Aceton i butanol
Clostridium acetobutylicum – Weizmann – patenty w USA i Anglii
(skrobia)
BuOH wytwarzany z etylenu → lakiery, sztuczny jedwab (rayon), płyny hamulcowe, rozpuszczalniki
Aceton → uboczny produkt wytwarzanie fenolu oraz w krakingu propanu
Proces fermentacyjny – z trzciny cukrowej w Afryce Płd.
→rozdział rozpuszczalników
→wywar bakteryjny (wit.B) - pasza
Fermentacja: 2-2,5dnia (90tys litrów – fermentory)
2,3-butanodiol
WZÓR
Fermentacje pentoz – ksylozy – cel główny
Klebsiella oxytoca ATC 8724 (mieszaniny stereoizomerów)
Bacillus polymyxa (skrobia – L-2,3-butanodiol)
Instalacje pilotowe w Kanadzie (II WŚ)
→do produkcji MEK
→do produkcji 2-butenu i 1,3-butadionu
→utwardzacze termoplastyczne
Metoda petrochemiczna – taosza
Glicerol
-półprodukt w przemyśle spożywczym, kosmetycznym, farmaceutycznym i chemicznym
-estry – materiały wybuchowe
Podczas I WŚ – Niemcy – met.fermentacyjna
Drożdże + siarczek sodu (zmiana kierunku fermentacji – zamiast EtOH – glicerol)
Mutacje – glicerol bez obecności siarczku sodu
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
32
Wykład 10. – 12.05.2009 r.
Rolnictwo
-koniec XIX w. – mechanizacja
-początek XX w. (lata 40-ste) – chemizacja
-koniec XX w. – biotechnologia (transgeniczne rośliny, zwierzęta, mikroorganizmy)
1983 – pierwsze rośliny transgeniczne
1986 – pierwsze testy polowe
1986-92 – 675 badan polowych na 31 gatunkach w 28 krajach
1993 – 2334 zezwolenia a testy polowe – komercyjne uprawy
1996 – 2,8mln ha
1997 – 12,5mln ha
1998 – 31,4mln ha
*ziemniaki odporne na stonkę i grzyby
*zboża odporne na herbicydy
*pomidory o przedłużonym okresie dojrzewania
*rzepak o zmienionym składzie kw.tłuszczowych
Organizm modelowy – Arabidopsis tmallana (120Mb – 20tys genów)
MONSANTO – 1994 – licencja na wprowadzenie na rynek USA rekombinowanego hormonu wzrostu
wołu
-rośliny transgeniczne (B.thuringensis)
UE – 3 odmiany modyfikowanej genetycznie kukurydzy
-odporna na szkodniki (Monsanto)
-odporna na herbicydy (Agrevo)
-„odporna
2
” (Novartis)
Pierwsza roślina transgeniczna wprowadzona na rynek – pomidor FLAVR-SAVR
Nitragina – wzbogacająca szczepionka bakteryjna produkowana od 1954r. (Rhizobium + podłoże:
jałowa gleba z pożywką)
Wzbogacanie gleby w azot: 10g ziarna – 30kg azotu; dla plonu 10g/ha – 37,5-45kg N
-najbardziej ekonomiczny nawóz azotowy – azot związany biologicznie
(rośliny motylkowe – dają glebie 150-300kg N/ha/rok)
Produkcja nitraginy:
-szczepy Rhizobium – efektywne = wirulentne + aktywne
-grupy fizjologiczne dla określonych roślin motylkowych
-kontrola mikrobiologiczna 1kg – 20mln komórek
Stosowanie:
-zaprawianie nasion (suche, zaciemnione miejsce – UV!, się w pochmurny dzieo)
-bezpośredni rozsiew na polu
-co 4-5 lat
W Polsce najlepsze efekty w uprawie: soji, lucerny, seradeli.
SCHEMAT
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
33
Azobakteryna (Azotobakter o aktywności wiązania N2 o kilkadziesiąt do kilkuset razy większej niż
szczep dziki)
-w naszych warunkach klimatycznych – 15-33% przyrost plonu (kapusta, pomidor, ziemniak, burak,
kukurydza)
-stosowana pod wszystkie rośliny „nie-motylkowe”
-dostarcza N oraz auksyn: giberelin, niektórych witamin i aminokwasów
-antybiotyk grzybobójczy (po zaprawieniu nasion – azobakteryna jest środkiem ochrony roślin)
-stosowanie: jak nitragina, ale co roku
SZCZEPINOKI MOBILIZUJĄCE
Fosfobakteryna – Bacillus megaterium (mineralizuje organiczne połączenie P)
W USA - Pseudomonas putida – siderofory
SZCZEPIONKI OPARTE NA ZJAWISKU MYKORIZY
Mykoriza:
-zewnętrzna – ektotroficzna
-wewnętrzna – endotroficzna
(dwie formy kraocowe – najlepiej poznane i najważniejsze)
Różnice: obszar kolonizacji, , struktura, miejsce systematyczne grzyba
Biotechnologia środowiska
-bt. na skalę środowiska - biokopalnictwo
-bt. dla środowiska – ochrona środowiska
Bioremediacja – wykorzystanie systemów biologicznych w celu redukcji zanieczyszczeo ziemi,
powietrza i wody
*biodegradacja
*biosorpcja
Ściana komórkowa: adsorpcja, wiązanie kowalencyjne, redukcja, precypitacja
Błona komórkowa (p.peryplazmatyczna): adsorpcja, redukcja, precypitacja
Wnętrze komórki: metalotioniny, fitochelatyny, wiązanie niespecyficzne, transformacja → redukcja
Metale ciężkie + mikroorganizmy:
→mobilizacja → bioługowanie
→immobilizacja → biosorpcja, akumulacja, precypitacja, redukcja
Biotechnologia dla środowiska
-bioremediacja:
Biodegradacja → detoksykacja → mineralizacja
→ poprawa warunków – rozsiewanie pożywki (plamy ropy przy brzegach Alaski – 1989 Exxon Valdez)
→ biologiczne oczyszczanie ścieków – osad czynny
→ biologiczne oczyszczanie powietrza i gazów przemysłowych (filtry z kompostem – usuwanie
substancji zapachowych, bioskrubery – zawiesiny komórek + filtry = biodegradacja przez
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
34
immobilizowane mikroorganizmy – równoczesne usuwanie tlenków S, N z gazów pieców kotłowych,
eliminacja styrenu przez grzyby immobilizowane na filtrach (przem.przetw.polistyrenu)
→oczyszczanie ziemi i gleby
In situ – stacje benzynowe (dodatek do gleby czynników odżywczych, wentylacja)
Ex situ – wywiezienie ziemi do kompostowni, bioreaktory
→odpady stałe
-kompostowanie
-„trawienie beztlenowe” (ma największą przyszłośd) → biogaz
-Zapobieganie – procesy przemysłowe „environmentaly friendly”
-stosowanie enzymów – przemysł skórzany, wybielanie tkanin, przem.drzewny, proszki do
prania
Fitaza w karmie (świnie i kurczaki) – zmniejszenie wydalania fosforanów (→do nawozu)
Biologiczna produkcja indygo (bakterie GMO)
AKUMULACJA METALI PRZEZ KOMÓRKI MIKROORGANIZMÓW
-1949 – usuwanie
239
Pu z wody przez osad czynny
-1975 – patent na usuwanie U z wody morskiej za pomocą „matrycy” z glonów
Poziom akumulacji metali przez mikroorganizmy
metal
organizm
g metalu/ g s.m.
Ag
Kultura mieszana
0,32
Pseudomonas maltophilia
0,18
Th. ferrooxidans
0,25
Co
Zooglea sp.
0,25
Cu
Zooglea sp.
0,34
Ni
Zooglea sp.
0,13
Pb
Citrobacter
0,35
U
Rhizopus arrhizus
0,18
Saccharomyces
0,15
Pseudomonas aeruginosa
0,15
METODY POZYSKIWANIA PIERWIASTKÓW NA DRODZE BIOTECHNOLOGICZNEJ
→ wykorzystanie zdolności bakterii (autotroficznych) do produkcji kwasów (→rozpuszczanie
minerałów)
→ wykorzystanie zdolności do kumulacji określonych pierwiastków
METODY WYMYWANIA (ŁUGOWANIA)
*techniki laboratoryjne
→ perkolator
RYSUNEK
→hodowla wytrząsana
→zamknięta „kolba ekologiczna”
→wymywanie podłożem (stosowane o warunkach laboratoryjnych jak i polowych)
RYSUNEK
*wymywanie pierwiastków ze złóż w warunkach in situ
→przy nieopłacalnym tradycyjnym kopalnictwie
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
35
→przy niskim stężeniu pierwiastka w złożu
Stosowane: USA, Australia – U i Cu
→hałdy niskoprocentowych rud gromadzone przy kopalniach i hutach
Western Nuclear Corp. – Gas Hills (Wyoming)→ zagęszczanie U w rudzie z zawartości 0,05-0,1%U
(pozwala wymyd około 90%U)
RYSUNEK
→na duża skalę – dwie metody wymywania:
1)”hole to hole” (rysunek)
2)”hole to mine”(rysunek) Stanrock Uranium Co.→ 700kgU
3
O
8
/miesiąc
Efektywnośd tych metod zależy od:
-dostępności tanich źródeł wody (obieg zamknięty, woda z odwodnienie kopalo)
-składu rudy (obecnośd Fe
+3
, Mn
+2
)
-efektywności… (tajemnica firm)
REAKCJE BIOGEOCHEMICZNE O ZNACZENIU PRAKTYCZNYM
Geochemiczna aktywnośd mikroorganizmów
-wytwarzanie kwasów mineralnych H
2
SO
4
, HNO
3
-wytwarzanie kwasów organicznych
-wytwarzanie H
2
O
2
i związków chelatujących
Biogeochemia Cu:
-Cu w minerałach nie jest bezpośrednio wykorzystywana przez drobnoustroje (Cu
+1
, Cu
+2
– utlenienie
→ mały zysk energetyczny, jest też toksyczna)
-wymywanie Cu jest związane z utlenianiem związków Fe i S (→ H
2
SO
4
, FeSO
4
, Fe
2
(SO
4
)
3
)
minerał
skład
Co się utlenia?
Chalkozyn
Cu
2
S
S
-2
Chalkopiryt
CuFeS
2
S
-2
, Fe
+2
Kowalin
CuS
S
-2
Kupryt
Cu
2
O
-
Boruit
Cu
5
FeSO
4
Fe
+3
, S
-2
Thiobacillus thiooxidans; Th.ferroxidans
(piryt) 2FeS
2
+ 7O
2
+ H
2
O → 2FeSO
4
+ 2H
2
SO
4
2FeS
2
+ 7 ½ O
2
+ H
2
O → Fe
2
(SO
4
)
3
+ H
2
SO
4
Dla Cu w siarczkach:
Cu
2
S + 2Fe
2
(SO
4
)
3
→ 2CuSO
4
+ 4FeSO
4
+ S(→H
2
SO
4
)
BIOGEOCHEMIA U
- w litosferze - 0,004% U (Afryka – Kongo, Kanada)
Uraninit UO
2
, karnotyt K
2
O∙2UO
3
∙U
2
O
5
∙3H
2
O, forbenit CuO∙2UO
3
∙P
2
O
5
∙8H
2
O, autunit, kiuryt
- najczęściej jako kation czterowartościowy w silnie zredukowanym środowisku
- formy zredukowane są łatwo utleniane biologicznie do jonu czterowartościowego – a te są łatwo
wymywane przez kwasy
- ( w warunkach przemysłowych: utleniane: chlorany, KMnO
4
)
- Dyson’s Mine (USA), Australia, Zimbabwe (Uretoli Mine)
- proces „bio” płyn perkolacyjny uzupełniany 5-10% pirytu lub FeSO
4
e-notatka - Biotechnologia - wyklad.pdf
aktualizacja: 2009/06/10 17:46
SNy: Biotechnologia
Studenckie Notatki Cyfrowe
www.sny.one.pl
36
- „oksydaza uranowa”
- biologiczne metody wykorzystywania źródeł U
ZASTOSOWANIA BIOKUMULACJI METALI
- w Missouri – stawy z autotrofami do oczyszczania ścieków poprodukcyjnych z kopalni ołowiu
- propozycja: usuwanie As z wody: dwa reaktory 1300kg glonów w 24,7kg r-ru wody (też dla Cu)
- usuwanie metali ze ścieków przemysłowych
- pewne procesy otrzymywania materiałów jądrowych → ścieki z U i NO
3
-
- mieszana kultura bakterii
(Pseudomonas) – NO
3
-
→ N
2
+ biomasa → II reaktor (kumuluje U)
SCHEMAT
WSPOMAGANE MIKROBIOLOGICZNIE WYDOBYCIE ROPY NAFTOWEJ – MEOR
(microbiologically enhanced oil recovery)
- wykorzystanie odpowiednich mikroorganizmów w podziemnych złożach – „wytwórnia” związków
lub warunków in situ stymulujących wydobycie
Problemy:
- charakter formacji geologicznej: olbrzymia powierzchnia, zdolności buforowe, brak telnu, temp. i
ciśnienie, niemożnośd kontroli
- proces iniekcji kultury w złoże
- źródło C
SCHEMAT:
- metoda ta oparta jest na podawaniu głównych składników odżywczych do złoża
- biorąc pod uwagę czynniki: pH 4-8, temp.<75˚C, zasolenie<10˚h, wyselekcjonowano w USA szereg
złóż potencjalnie nadających się do tego procesu
Szczepy: Pseudomonas putida, Leuconostoc mesenteroides, Bacillus
Problem: kontrakcja złoża na bakterie z MEOR
Bakterie redukujące siarczany → korozja szybów, kwaśnienie złóż
Aspekty metaboliczne:
-biopolimery – (zatykanie, lepkośd)
- biomasa (zatykanie)
- kwasy organiczne (rozpuszczają CO
3
2-
)
- biosurfaktanty (transport węglowodorów)
Badania terenowe:
-1954 – Arkansas – Clostridium acetobutylicum + melasa
-1956 – duoski patent
-Europa wschodnia – CSR-S, Polska, Węgry, Rumunia – kilkaset l inokulum + kilkanaście ton melasy,
2 miesiące fermentacji – krótkotrwały efekt (poprawa też w szybach sąsiednich)
