Katedra Genetyki Molekularnej U
Ł
PCR
Łańcuchowa reakcja
polimerazy
polimerazy
Katedra Genetyki Molekularnej U
Ł
PCR
Łańcuchowa reakcja
polimerazy
polimerazy
PCR
(ang. polymerase chain reaction)
łańcuchowa reakcja polimerazy
Technika badawcza i diagnostyczna
Wykorzystuje zdolność DNA do replikacji
Katalizowana przez polimerazy DNA
Metoda PCR umożliwia amplifikację in vitro wybranych
odcinków DNA (oraz RNA przepisanego na cDNA)
Ważne daty
1987 - grupa naukowców
z Cetus Corporation w USA
opracowała metodę PCR
opracowała metodę PCR
1993 – Kary Mullis otrzymał Nagrodę
Nobla w dziedzinie chemii
O ogromnym znaczeniu tej metody
decydują:
Możliwość analizy DNA w przypadku jego bardzo małej
ilości
Duża czułość metody pozwalająca na zwielokrotnienie
Duża czułość metody pozwalająca na zwielokrotnienie
ściśle określonej sekwencji mimo obecności innych
sekwencji
Można dysponować DNA wyizolowanym z jednej komórki
Reakcja PCR składa się
z powtarzających się cykli a każdy z nich
przebiega w trzech etapach
1.
Denaturacja dwuniciowego
DNA (dsDNA)
92-96
0
C przez 30-60 sek.
2.
Przyłączanie starterów
50-65
0
C przez 30-60 sek
3.
Wydłużanie starterów
(amplifikacja)
68 -72
0
C przez 60-120 sek
(ok. 1000 bp przez 1 min)
Schemat reakcji PCR
W każdym cyklu dochodzi do zwiększenia liczby
amplifikowanych fragmentów w postępie logarytmicznym
np. po 30 cyklach jest juŜ 2
30
czyli 1 073 741 824
Termocykler
Standardowe komponenty reakcji
PCR
1.
matryca - DNA lub RNA
2.
woda wolna od nukleaz
3.
Startery (dolny i górny)
4.
dNTP
5.
termostabilna polimeraza DNA
6.
MgCl
2
7.
bufor reakcyjny
Matryca
Do reakcji PCR można
wykorzystać DNA lub RNA
izolowany z materiału
świeżego lub archiwalnego
Najczęściej w 20 µl reakcji
stosuje się 10-100 ng
matrycy
Trifosforany
deoksyrybonukleozydów (dNTP)
Substraty reakcji PCR
Uczestniczą w wydłużaniu sekwencji starterów
zgodnie z regułą komplementarności względem
amplifikowanej nici DNA
Dostarczają energii do przebiegu reakcji
Stężenie wyjściowe wynosi 5-10 mM, natomiast
stężenie dNTP w reakcji powinno wynosić 20-200 µM
Wskazane jest stosowanie jednakowych stężeń
wszystkich nukleotydów
Rozkład dNTP jest bardzo często przyczyną braku
produktu PCR
Startery
Komplemantarne do amplifikowanej sekwencji
jednoniciowe oligonukleotydy o długości 18-28
nukleotydów
Zawartość GC powinna stanowić 50-60 % całej
Zawartość GC powinna stanowić 50-60 % całej
sekwencji
Optymalne stężenie starterów 0,1-0,5 µM
Denaturacja dsDNA
92-96
0
C przez 30-60 sek.
5’
3’
5’
3’
3’
3’
5’
5’
5’
3’ OH
Starter dolny
Starter górny
OH
3’
Ni
ć
koduj
ą
ca
Ni
ć
komplementarna
Przył
ą
czanie starterów
50-65
0
C przez 30-60 sek
3’
5’
3’
5’
górny
3’
5’
3’
5’
5’
3’
dolny
Amplifikacja
68 -72
0
C przez 60-120 sek
3’
3’
Bardzo ważne w wyborze
starterów są:
Specyficzno
ść
Pełna komplementarno
ść
ko
ń
ców 3‘
starterów z matryc
ą
starterów z matryc
ą
Brak komplementarno
ś
ci mi
ę
dzy sob
ą
Brak powtórze
ń
nukleotydowych
Brak struktur 2 rz
ę
dowych (np. szpilki do
włosów „hairpin”)
Obecno
ść
na ko
ń
cu 3’ nukleotydu G albo C
Polimeraza
Enzym katalizyujący reakcję syntezy DNA
Taq
polimeraza – wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus
Pfu polimeraza – z bakterii Pyrococcus furiosis
Pfu polimeraza – z bakterii Pyrococcus furiosis
Stężenie wyjściowe polimeraz wynosi 0,5-5 U / µl
1 U / reakcję
Optymalny zakres działania wynosi 68-
72
0
C
Bufor reakcyjny
Zapewnia odpowiednie warunki dla działania
polimerazy, stabilizuje ją oraz modyfikuje
oddziaływania pomiędzy matrycą i starterami
Zawiera głównie:
MgCl
2
(1,5- 2mM)
KCl (50 mM)
Tris HCl (10-50 mM) (kwasowa sól
tris (hydroxymetyl)
aminometanu )
(NH
4
)
2
SO
4
(20 mM)
MgCl
2
Jony Mg
2+
wiązane są zarówno przez polimerazę,
startery, matrycę jak i dNTP
Dokładność reakcji PCR jest proporcjonalna do stężenia
Dokładność reakcji PCR jest proporcjonalna do stężenia
wolnych jonów magnezu
Z reguły stosuje się stężenie magnezu przewyższające
stężenie dNTP co zwiększa dokładność polimerazy
Zastosowanie metody PCR
Wykrywanie zmian (mutacji) w genomowym DNA w
chorobach genetycznych
Badanie predyspozycji do chorób nowotworowych
Monitorowanie i wykrywanie nowotworów
Wykrywanie polimorficznych sekwencji DNA na potrzeby
identyfikacji indywidualnej (badanie ojcostwa,
identyfikacji indywidualnej (badanie ojcostwa,
kryminalistyka, transplantacje)
Wykrywanie patogenów infekcyjnych (bakterie, wirusy,
pasożyty)
Produkcja żywności
Choroby zwierząt
Biotechnologia
Zastosowanie metody PCR
Badanie sekwencji mini- i mikrosatelitarnych cechująch
się wysokim polimorfizmem
Diagnostyka pośrednia chorób genetycznych
Medycyna sądowa
Medycyna sądowa
Zwiększenie ilości wybranych odcinków DNA do
późniejszego sekwencjonowania lub tworzenia biblioteki
genów
Modyfikacje metody PCR
PCR-RFLP
RT-PCR
ASO-PCR
PCR-RFLP
(ang. restriction fragment lenght polymorphisms)
Amplifikowany za pomocą łańcuchowej reakcji PCR fragment
badanego genu zawierający miejsce polimorficzne poddany
zostaje działaniu określonego enzymu restrykcyjnego, który
rozpoznaje specyficzną dla niego sekwencję nukleotydową i
rozpoznaje specyficzną dla niego sekwencję nukleotydową i
przecina DNA w określonym miejscu
Następnie pocięty DNA jest rozdzielany elektroforetycznie –
obraz elektroforetycznego rozdziału uzyskanych fragmentów
umożliwia identyfikację poszczególnych alleli danego genu
Zastosowanie: badanie polimorfizmu genów
PCR-RFLP
Enzym restrykcyjny HaeIII z Haemophilus
aegypticus. Enzym ten rozpoznaje i przecina
poniższą sekwencję, w wyniku, czego
powstają "tępe końce".
5' GGCC 3‘
5' GG ... CC 3'
5' GGCC 3‘
5' GG ... CC 3'
3' CCGG 5‘
3' CC ... GG 5'
Uwidocznienie produktów PCR
Produkt PCR powinien być
uwidoczniony na żelu
(agarozowym albo
poliakrylamidowym) jako ostry
prążek o określonej wielkości
prążek o określonej wielkości
i porównany ze znanym
markerem wielkości.
Barwienie
:
Bromek etydyny
Autoradiografia
Srebrzenie
Fluorografia
Produkt reakcji PCR
Trawienie enzymem restrykcyjnym
