Budowa DNA i RNA: 

-DNA 

 

 

 

-RNA 

 

RNA jest najczęściej jednoniciowy i nie spełnia reguł Chargaffa – A ≠ T, C ≠ G. Zawiera jednak 

rejony dwuniciowe- rejony spinki. Sekwencje zasad w mRNA i jego matrycowym DNA są 
komplementarne. 

 

 

 

 

 

Budowa helisy DNA-porównanie 

 

 

BIAŁKA UCZESTNICZĄCE W KLONOWANIU, SYNTEZIE, REPLIKACJI I NAPRAWIE DNA  

Polimeraza DNA I wymaga: 
- 4 dNTP 
- Mg2+ 
-matrycy 
- primera z wolną grupą 3’-OH 
Polimeryzacja następuje w kierunku  5’→ 3’ poprzez atak grupy 3’-OH na grupę alfa 

fosforanową nukleotydu- tworzy się wiązanie fosfodiestrowe.  

Polimeraza I posiada aktywnośd nukleazową w kierunkach: 

  

- 5’→ 3’ dzięki, której usuwany jest odcinek starterowy RNA, usuwanie 12 nukleotydowego 

fragmentu w celu wycięcia dimerów pirymidynowych (naprawa DNA)  

- 3’→5’ umożliwiającą korektę błędów syntezy (polimeraza sprawdza wynik każdego 

przyłączenia nukleotydu przed przystąpieniem do następnego cyklu).   

Polimerazy II i III wymagają: 
- matrycy 
- 4 dNTP 
- primera z wolną grupą 3’-OH 
- Mg 2+ 
Wielopodjednostkowy kompleks zawierający polimerazę III syntezuje większośd nowego DNA 

, natomiast polimeraza I usuwa startery i uzupełnia przerwy, polimeraza II współdziała podczas 
naprawy DNA ale nie jest potrzebna do replikacji.  

Holoenzym polimerazy III katalizuje tworzenie tysięcy wiązao fosfodiestrowych bez 

oddysocjowania od matrycy, jest on asymetrycznym dimerem ponieważ obie nici – prowadząca i 

opóźniona – muszą ulegad replikacji w tym samym czasie. Podjednostka alfa jest polimerazą 
natomiast podjednostka epsilon jest egzonukleazą 3’→5’ sprawdzającą poprawnośd replikacji. Aby 
obie nici były syntezowane w kierunku 5’→3’ nid opóźniona musi się utworzyd pętlę wokół jednej z 
podjednostek holoenzymu.  

Odwrotna transkryptaza  - polimeraza DNA zależna od RNA. RNA jest matrycą dla DNA (-) 

następnie dosyntezowane DNA jest matrycą dla kolejnej nici DNA (+) (3 aktywności polimeraza DNA 
zależna od RNA, polimeraza DNA zależna od DNA i RNAza). Odwrotna transkryptaza wymaga: 

-primera sparowany z RNA z wolną grupą 3’-OH 
-4 DNTP 
Polmeraza RNA zależna od DNA wymaga: 
- 4 NTP 
- Mg 2+ 
- matrycy dwuniciowy DNA ( ssRNA, dsRNA,hybryd RNA-DNA nie jest matrycą‼!) 
Polimeryzacja następuje w kierunku  5’→ 3’ poprzez atak grupy 3’-OH na grupę alfa 

fosforanową nukleotydu- tworzy się wiązanie fosfodiestrowe. Nie jest wymagany primer. Synteza 
RNA jest w pełni konserwatywna. 

 

Endonukleazy restrykcyjne rozpoznają specyficzne sekwencje zasad ( najczęściej 

palindromowe -posiadające podwójną symetrię obrotową) w dwuniciowej helisie i zrywają obie nici 
w dokładnie zdefiniowanych miejscach. Rozcięcie może posiadad kooce tępe lub lepkie-kohezyjne. 
Endonukleazy przeszukując duży rowek DNA szybko i bardzo precyzyjnie odczytują sekwencje 
nukleotydową. 

Ligazy DNA katalizują tworzenie wiązao fosfodiestrowych w miejscach zerwania łaocucha 

DNA.Ligazy wymagają: 

- wolnej grupy 3’-OH 
- ufosforylowanej grupy 5’-OH 
- ATP/ NAD+ 
Ligaza tworzy wiązanie poprzez związanie ATP/NAD+ do Lys ,tworzy się produkt pośredni 

AMP-enzym, następnie ta aktywowana grupa jest przenoszona na koniec  5’ łaocucha DNA,tworzy się 
5’-P-AMP, i dalej ligaza katalizuje tworzenie wiązania fosfodiestrowego poprzez atak grupy 3’-OH na 
aktywowany koniec 5’-P 

 

 

 

Replikacja DNA jest semikonserwatywna tzn. że jedna nid jest rodzicielska, a druga potomna.  

 U procaryota synteza DNA zachodzi w obu kierunkach od rejonu inicjacji -oriC- bogatego w 

pary AT. Replikacja zaczyna się od przyłączenia białka dnaA do rejonów bogatych a AT. Białka dna B i 
C łączą się z białkiem dnaA aby wygiąd i otworzyd dwuniciową helisę.  Białko dnaB jest helikazą, która 
rozplata helisę kosztem ATP. Następnie białko SSB  wiąże się do rozplecionej nici zapobiegając 
skręceniu się ich z powrotem. Rozwijanie kolistego DNA na początku procesu powoduje tworzenie 
dodatnich superskrętów, które są usuwane przez gyrazę (hydroliza ATP).  

Aby rozpocząd syntezę DNA na obu niciach potrzebny jest starter, którym jest krótki odcinek 

RNA tworzony przez prymazę (która po wytworzeniu primera  przesuwana jest po nici opóźnionej w 
kierunku 5’→3’ wytwarzając kolejne startery do syntezy fragmentów Okazaki). Nid 5’→3’ jest 
dobudowyana ciągle i jest nazywana nicią prowadzącą, natomiast nid 3’→5’ określana jest jako nid 
opóźniona ze względu na na fakt, że  jej znaczna częśd występuje w postaci krótkich fragmentów 
(Okazaki) następnie łączonych przez ligazę. Nieciągła synteza nici opóźnionej pozwala na 
polimeryzację w kierunku 5’→3’ na poziomie nukleotydowym, co daje ogólny kierunek wydłużania 
nici 3’→5’. 

 

U Prokaryota transkrypcja rozpoczyna się od promotora TATAAT położonych 10 par zasad 

przed samym genem lub sekwencji TTGACA znajdującej się 35 par zasad przed genem ulegającym 
transkrypcji. U Eucaryota podobna kaseta TATA znajduje się ok. 25 par zasad przed genem oraz 
kaseta CAAT ok. 75 par zasad przed transkrybowanym genem dodatkowo u Eucaryota znajdują się 
sekwencje wzmagające. Zakooczenie transkrypcji w miejscu terminacji, w którym nowo 
zsyntezowana nid RNA przybiera postad spinki i spontanicznie oddysocjowuje od enzymu. 

Kod genetyczny jest: 
- trójkowy -64 trójki, 61 oznacza aminokwasy, 3 oznaczają koniec łaocucha UAA UAG i UGA, 

tylko tryptofan i metionina ( AUG też sygnał start)  kodowane są przez 1 trójkę; 

-bezprzecinkowy; 
-nienakładający się; 
-zdegenerowany; 
Kodony kodujące tan sam aminokwas nazywamy synonimami. Najczęściej synonimy różnią 

się ostatnią zasadą trypletu.  

Sekwencja zasad w genie i sekwencja aminokwasów w jego białku są wspóliniowe. 

BADANIA DNA 

Aby zidentyfikowad określony fragment DNA można go pociąd różnymi endonukleazami, 

rozdzielid wg. wielkości za pomocą elektroforezy, zrobid odbitkę na arkuszu nitrucelulozowym, 
następnie dodad sondę znakowaną P32  komplementarną do interesującego nas fragmentu DNA i 

wykonad autoradiografię (Southen blotting, Northern Blotting – oznaczanie RNA; Western blotting- 
oznaczanie białek) 

Metoda Sangera- metoda sekwencjonowania DNA- wymaga: 
- matrycy DNA (sekwencjonowany DNA) 
- polimerazy I DNA 
- 4 dNTP 
- primera  
- 4 ddNTP 

 

Wbudowanie ddNTP do rosnącego łaocucha uniemożliwa jego dalsze wydłużanie, ponieważ 

analog ten nie zawiera grupy 3’-OH. Poprzez odpowiednie dobranie stężeo reagentów powstają 
fragmenty DNA o różnej długości, w których ddNTP znajduje się na koocu 3’. Mieszaninę następnie 
poddaje się elektroforezie i odczytuje sekwencję badanego DNA (zsenkwenjonowany fragment jest 
komplementarny do badanej nici) na autoradiogramie.   

Rekombinacja DNA za pomocą wektorów. Do klonowania DNA wybiera się głównie plazmidy 

lub faga λ. Odpowiedni fragment wektora zostaje przecięty przez enzym restrykcyjny, do takiego 
zmodyfikowanego plazmidu można wprowadzid dowolny fragment DNA pod warunkiem, że ma takie 
same „kooce” jak rozcięty wektor.  

Inaktywacja insercyjna – inaktywowanie genów np. oporności w plazmidzie poprzez 

przecięcie go endonukleazą. (Selekcja bakterii) 

Po rozdzieleniu genomowego DNA na łaocuchy o wielkości mniej więcej  15 kz można je 

włączyd w genom wirusa i utworzyd populację zrekombinowanych fagów zawierających prawie 
kompletny genom – biblioteka genomowa. Wyszukiwanie interesujących nas genów poprzez  
odwzorowanie układu łysinek na nitrocelulozie poddanej lizie i zastosowaniu znakowanych sond 
DNA. 

Biblioteka cDNA- biblioteka genów zawierająca tylko DNA ekspresjonowane w danej 

komórce. Tworzy się ją poprzez izolowanie całego mRNA z komórki,  przekształceniu do DNA przez 
odwrotną transkryptazę, a następnie klonowanie w wektorze np. wirusie. Aby uzyskad maksymalną 
transkrypcję, cDNA wprowadza się do wektora blisko silnego promotora bakteryjnego. Obecnośd 
klonów DNA można ujawnid na podstawie ich zdolności do kierowania syntezą białka obcego dla 
bakterii będącej gospodarzem (wykrywanie przez zastosowanie autoradiogramu z repliki kolonii ze 
znakowanymi przeciwciałami swoistymi dla białek) 

PCR – reakcja łaocuchowej polimeryzacji, służy do wielokrotnego powielenia (ampiflikacji) 

sekwencji DNA . PCR wymaga: 

- DNA 
- 4 dNTP 

- 2 primerów, których sekwencja otacza fragment DNA nas interesujący 
- termostabilnej polimerazy DNA 
 
Metoda PCR polega na wielokrotnym powtarzaniu poniższych kroków co prowadzi do 

ogromnego zwielokrotnienia interesującej nas (znajdującej się miedzy primerami) sekwencji DNA: 

- ogrzanie do temperatury rozdzielenia nici DNA 

- szybkie ochłodzenie mieszaniny, dodanie do niej sekwencji primerowych co skutkuje 

dołączeniem ich do komplementarnych rejonów DNA 

- synteza komplementarnego DNA przez polimerazę DNA 

Wszystkie nowe cząsteczki DNA służą jako matryce w kolejnych cyklach. Jedynym DNA, który 

ulega amplifikacji jest odcinek zawarty pomiędzy parą primerów zhybrydyzowanych z wyjściowym 
DNA. 

Ukierunkowana mutageneza. Po izolacji genu możliwe jest zmodyfikowanie sekwencji w celu 

zmiany zakodowanej sekwencji aminokwasów. Aby skorzystad z tej techniki potrzebujemy 
oligonukleotydu, którego sekwencja jest komplementarna do interesującego nas fragmentu genomu 
jednak posiada zmienioną zasadę azotową. Zhybrydyzowany  do rozdzielonego plazmidu 
oligonukleotyd służy jako primer dla polimerazy DNA, a produkt syntezy zostaje zamknięty jako 
cząsteczka kolista (przez ligazę) i służy jako zmutowany plazmid. 

 

 

Mutacje: 
- Substytucja – podstawienie jednej pary zasad zamiast innej, rodzaje: 

-tranzycja – podstawianie jednej puryny w miejsce drugiej lub pirymidyny w miejsce 

drugiej pirymidyny A→G, G→A, C→T, T→C 

- transwersja – zamiana pirymidyny na purynę lub puryny na pirymidynę 

- Delecja – usunięcie jednej lub większej ilości par zasad 
- Insercja – wstawienie jednej lub większej ilości par zasad. 
 
Mutageny : 
- 5-bromouracyl – powstawanie tranzycji AT→GC lub GC→ AT 
- 2-aminopuryna – powstawanie tranzycji AT→GC lub GC→ AT 
- kwas azotowy (III) – powstawanie tranzycji AT→GC lub GC→ AT 
- hydroksyloamina – jednokierunkowa tranzycja  GC→ AT 
- akrydyny – delecje lub insercje jednej lub więcej par nukleotydów 
- UV – powstawanie dimerów pirymidynowych CC, TT