POMIAR AKTYWNOŚCI DROBNOUSTROJÓW
Każda żywa komórka musi nieustannie - zarówno podczas wzrostu, jak i w czasie
spoczynku - pobierać energię, którą zużywa nie tylko na procesy związane z budową swego
organizmu, ale również na utrzymanie swego uporządkowanego stanu materii. Aby żywy
organizm mógł funkcjonować, zużywana przez ten organizm energia musi być więc w sposób
ciągły uzupełniania. Ilość tej energii zależy od aktualnego stanu fizjologicznego tego
organizmu, czyli jego aktywności. Uniwersalnym źródłem tej energii są procesy biologiczne
utleniania związków organicznych, których ostatnim etapem są przemiany zachodzące w
łańcuchu oddechowym. Inaczej -
s
zlaki metaboliczne podstawowych procesów
prowadzonych przez drobnoustroje zbiegają się w łańcuchu oddechowym. Procesy te przy
udziale dehydrogenaz dostarczają substratów - atomów wodoru- wykorzystywanych podczas
utleniania biologicznego zachodzącego w łańcuchu oddechowym. Dlatego pomiar szybkości
transportu atomów wodoru w łańcuchu oddechowym może być miarą ogólnej aktywności
mikroorganizmów. Albowiem zahamowanie któregokolwiek procesu życiowego, na przykład
pod działaniem substancji toksycznej, spowoduje zmniejszenie tej szybkości.
1. Określenia aktywności drobnoustrojów przy pomocy pomiarów poboru tlenu
Dostarczycielami substratów (atomy wodoru) wykorzystywanymi w procesie
utleniania przy pomocy łańcucha oddechowego są produkty pośrednie głównych procesów
metabolicznych prowadzonych przez drobnoustroje. Natomiast ostatecznym akceptorem
elektronów organizmów tlenowych są atomy tlenu, tworzące cząsteczki wody. Szybkość
zużycia tlenu jest więc miarą intensywności procesów oddychania zachodzących w komórce.
Szybkość ta jest jednocześnie miarą ogólnej aktywności drobnoustrojów, gdyż zahamowania
któregokolwiek z głównych procesów życiowych spowoduje zmniejszenie zużycia tlenu.
Do pomiarów oddychania materiału biologicznego używany był w przeszłości
powszechnie aparat Warburga. Istota metody Warburga jest wyznaczanie ubytku O
2
poprzez
bezpośredni pomiar zmian ciśnienia wywołanego w układzie zamkniętym przez jego
wykorzystanie w procesach życiowych. Obecnie metoda Warburga została powszechnie
zastąpiona wygodniejszymi metodami bezpośredniego pomiaru zmian stężenia
rozpuszczonego tlenu w układzie zamkniętym.
2. Określanie aktywności drobnoustrojów przy pomocy sztucznych akceptorów elektronów
W warunkach fizjologicznych ostatecznym akceptorem atomów wodoru
przenoszonych w łańcuchu oddechowym - jest tlen. Elektrony i protony przenoszone przez
biologiczne układy oksydoredukcyjne, mogą być także przyłączane przez wprowadzone
sztucznie do środowiska związki chemiczne. Etapy, w których sztuczne akceptory elektronów
ulegają redukcji, zależą od potencjału oksydoredukcyjnego naturalnych przenośników i
wprowadzonych związków.
Najwcześniej i powszechnie stosowanym związkiem chemicznym do oceny
aktywności dehydrogenaz był błękit metylenowy, który w środowisku beztlenowym
odbarwiał się po przyłączeniu atomów wodoru.
N
S
(H
3
C)
2
N
(H
3
C)
2
N
N
S
N(CH
3
)
2
H
N(CH
3
)
2
H
+
+
+2
+2e -
utleniona forma błękitu forma zredukowana
metylenowego (niebieska) (bezbarwna)
Jednakże ze względu na to, że błękit metylenowy nie reaguje wybiórczo z
dehydrogenazami, wykazuje właściwości bakteriobójcze i wymaga odtleniania środowiska,
zaczęto stosować inne, wygodniejsze w użyciu związki chemiczne, głównie sole tetrazolowe.
Najszersze zastosowanie znalazła metoda testu TTC. Pomiar polega na wprowadzaniu
do układu oddechowego chlorku 2,3,5-trójfenylotetrazolowego (TTC), który przyłącza atomy
wodoru tworząc trójfenyloformazan (TF).
C
N
N
N
N
C
N
N
N
Cl
NH
H
Cl
H
+
-
+2
-
Zasadniczą zaletą stosowania TTC do oznaczania aktywności dehydrogenaz polega na
tym, że jest on w postaci utlenionej bezbarwny i rozpuszczalny w wodzie, natomiast forma
zredukowana posiada czerwone zabarwienie i jest słabo rozpuszczalna w wodzie. Ta ostatnia
cecha powoduje, że TTC znalazł zastosowanie także przy lokalizacji wewnętrzkomórkowej
dehydrogenaz.
Jakkolwiek test TTC stosowany jest od dość dawna, metodyka oznaczenia nie jest
jednolita. Metoda określania aktywności dehydrogenaz przy pomocy tego związku
przechodziła kolejne ewolucje i ciągle jeszcze wprowadzane są modyfikacje. Stosowana
przez różnych autorów metodyka badań różni się odczynem, temperaturą, warunkami
tlenowymi, stężeniem roztworu TTC, wprowadzeniem egzogennego substratu, czasem
inkubacji, rodzajem substancji przerywającej reakcję, ekstrahentem używanym do wymycia
formazonu itd.
2.1. Wyznaczanie optymalnego stężenia chlorku 2,3,5
trójfenylo- tetrazolowego podczas
oznaczania aktywności dehydrogenaz za pomocą testu TTC.
Podstawowym czynnikiem wpływającym na wiarygodność uzyskiwanych rezultatów
oznaczania aktywności dehydrogenaz, jest stężenie TTC w inkubowanej próbce. Wielkość
optymalnego stężenia TTC jest bowiem zmienna i zależna od aktualnego składu, morfologii
oraz stanu fizjologicznego badanej biocenozy. Stężenie to wynika z kompromisu pomiędzy
sprzecznymi wymogami: zapewnienia z jednej strony takiej koncentracji TTC, aby związek
ten mógł wniknąć w odpowiedniej ilości do wewnątrzkomórkowych miejsc aktywności
oksydoredukcyjnej, a z drugiej strony - nie działał jeszcze toksycznie. Niekiedy nie można
spełnić obydwu tych wymogów i stężenie TTC nie gwarantujące odpowiedniego nadmiaru
tego związku w miejscach aktywności oksydoredukcyjnej komórek, działa już toksycznie.
Taki przypadek wyklucza możliwość oznaczania za pomocą testu TTC rzeczywistej
aktywności mikroorganizmów. Dlatego przed przystąpieniem do oznaczania aktywności
mikroorganizmów należy każdorazowo wyznaczyć optymalne stężenie TTC w inkubowanych
próbkach.
2.2. Wyznaczanie zakresu wprost proporcjonalnego przyrostu trójfenyloformazanu podczas
oznaczania aktywności dehydrogenaz za pomocą testu TTC
Ważnym czynnikiem decydującym o prawidłowości wykonywanego oznaczenia, jest
stosowanie takiego czasu inkubacji próbek, w którym przyrost TF jest liniowy. Jedynie
wówczas można podawać uzyskany wynik oznaczenia aktywności w przeliczeniu na
jednostkę czasu.
W przypadku gdy wykres zależności aktywności dehydrogenaz od czasu inkubacji nie
przecina początku układu współrzędnych, należy zmodyfikować oznaczenie zwiększając
dwukrotnie ilość inkubowanych próbek. Inkubację połowy próbek kończyć po krótkim czasie
(najczęściej 5
÷
10 minut), a inkubację pozostałych prowadzić dalej przez 15
÷
30 minut. W
takim przypadku aktywność dehydrogenaz wyznacza się na podstawie stosunku ilości
powstałego TF do czasu, w którym ten przyrost nastąpił:
⋅
−
−
=
h
dm
TF
mg
T
T
TF
TF
AD
3
1
2
1
2
2.3. Wpływ warunków tlenowych na wynik testu TTC
Pomimo wyższego potencjału oksydoredukcyjnego, rozpuszczony tlen jest
konkurencyjnym w stosunku do TTC akceptorem atomów wodoru przenoszonych w łańcuchu
oddechowym. Powoduje to zaniżanie wyników oznaczania aktywności dehydrogenaz za
pomocą testu TTC. Ze względu na różną ilość rozpuszczonego tlenu w analizowanych
próbkach, zmieniającą się także w czasie inkubacji próbek, jego wpływ na wynik analizy jest
zmienny w każdym doświadczeniu i trudny do jednoznacznego ustalenia. Bardziej
wiarygodny obraz stanu fizjologicznego mikroorganizmów uzyskuje się więc przy pomiarach
aktywności w warunkach anaerobowych, gdy TTC jest jedynym akceptorem atomów wodoru.
W warunkach tych zmniejsza się także rozrzut uzyskiwanych wyników. Ten korzystny wpływ
odtleniania próbek na dokładność testu TTC, jest stosunkowo łatwy do wytłumaczenia.
Wynika on ze stworzenia jednolitych warunków doświadczenia (w całej próbce warunki
beztlenowe), podczas gdy w próbkach nieodtlenionych warunki te są zmienne, nieustalone,
gdyż w niektórych miejscach np. wewnątrz kłaczków osadu czynnego, panować mogą
warunki beztlenowe, podczas gdy w innych rejonach, rozpuszczony tlen będzie konkurował z
TTC jako akceptor atomów wodoru.
Potwierdzeniem wzrostu powtarzalności wyników oznaczania aktywności w próbkach
inkubowanych w warunkach anaerobowych są także wyniki uzyskane przez Lenharda, który
jednakże nie zwrócił uwagi na ten fakt. Tymczasem wyliczony współczynnik zmienności dla
tych doświadczeń wykazuje ponad dwukrotnie zmniejszenie rozrzutu wyników wokół
średniej arytmetycznej w próbkach odtlenionych.