322

 www.postepybiochemii.pl

Agnieszka Olejnik-Schmidt

*

Agnieszka Gronowalska
Marcin Schmidt

Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii 

Żywności,  Wydział  Nauk  o  Żywności  i 

Żywieniu,  Uniwersytet  Przyrodniczy  w  Poz-

naniu

*

Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii 

Żywności,  Wydział  Nauk  o  Żywności  i 

Żywieniu,  Uniwersytet  Przyrodniczy  w 

Poznaniu,  ul.  Wojska  Polskiego  48,  60-627 

Poznań;  tel.:  (61)  84  66  024,  e-mail:  agao@

up.poznan.pl,

Artykuł otrzymano 26 czerwca 2013 r.

Artykuł zaakceptowano 2 lipca 2013 r.

Słowa kluczowe: heterologiczna ekspresja ge-

nów, GRAS, L. lactis, nizyna, system NICE

Wykaz skrótów: GRAS (ang. Generally Regar-

ded As Safe) — uznawany za bezpieczny; MIC 

(ang. Minimal Inhibitory Concentration) — mini-

malne  stężenie  hamujące  wzrost;  NICE  (ang. 

NIsin Controlled gene Expression system) — nizy-

nowy system ekspresyjny; RBS (ang. ribosome 

binding site) — miejsce wiązania rybosomu

Podziękowania:  Praca  powstała  w  trak-

cie  realizacji  projektu  badawczego  MNiSW 

NN312 323935.

Charakterystyka systemu nizynowego jako narzędzia do produkcji 

białek i peptydów w komórkach 

Lactococcus lactis

StreSzczenie

r

ozwój  technologii  badawczych  umożliwia  zastosowanie  coraz  to  większej  liczby 

szczepów bakterii do ekspresji rekombinowanych białek. W tym celu wykorzysty-

wane są także bakterie fermentacji mlekowej (LAB). Nizynowy system ekspresyjny jest 

narzędziem molekularnym umożliwiającym ekspresję białek w komórkach paciorkow-

ców mlekowych 

Lactococcus lactis. Szczepy tego gatunku wykorzystywane są szeroko 

w  przemyśle  mleczarskim  i  od  lat  spożywane  były  przez  człowieka  wraz  z  żywnością 

fermentowaną. Bakterie te posiadają cechy, które predysponują je jako gospodarza do 

produkcji rekombinowanych białek; są to m.in.: niewielkie wymagania względem wa-

runków hodowli i poznane warunki skalowania hodowli, brak syntezy endotoksyn oraz 

formowania  agregatów  wewnątrzkomórkowych  z  naprodukowanego  białka,  ściśle  re-

gulowana ekspresja pozwalająca na produkcję białek toksycznych względem komórek 

bakteryjnych. System nizynowy składa się z gospodarza (komórek bakteryjnych), wek-

tora plazmidowego oraz induktora - nizyny potrzebnej do kontrolowanej syntezy białka. 

System ten z powodzeniem został zastosowany do syntezy heterologicznych peptydów 

antymikrobiologicznych,  produkcji  eukariotycznych  i  prokariotycznych  białek  błono-

wych, syntezy białek stosowanych przy farmakologicznej produkcji szczepionek oraz w 

inżynierii metabolicznej.

WprOWAdzenie

Poznanie  budowy  operonu  nizynowego  i  autoregulacyjnego  mechani-

zmu  syntezy  nizyny  umożliwiło  opracowanie  systemu  do  podukcji  białek 

nazwanego  systemem  nizynowym,  w  komórkach  paciorkowca  mlekowego 

(Lactococcus lactis). System ten wykazuje wiele cech, które czynią go atrakcyj-

ną alternatywą wobec powszechnie stosowanych systemów ekspresyjnych w 

bakteriach pałeczki okrężnicy (E. coli), szczególnie z uwagi na brak produkcji 

endotoksyn — lipopolisacharydów. Gatunek Lactococcus lactis należy do typu 

Firmicutes, bakterie te to Gram-dodatnie nieruchliwe ziarniaki, nie wytwarza-

jące przetrwalników, względnie beztlenowe i prowadzące homofermentację 

mlekową. Za naturalne środowisko przedstawicieli tego gatunku uważa się 

rośliny zielone, choć znane są one głównie z zastosowania w przemyśle mle-

czarskim jako składnika szczepionek do produkcji serów, maślanki, kwaśnej 

śmietany i kefiru [1]. Bakterie te posiadają status GRAS [2], a ich genetyka i 

fizjologia zostały bardzo dobrze poznane [3].

chArAkteryStykA nizyny

Nizyna jest peptydem produkowanym przez wybrane szczepy Lactococcus 

lactis. Należy ona do I klasy bakteriocyn, peptydów o charakterze bakterio-

bójczym. Peptyd ten dopuszczony jest do obrotu jako biokonserwant żyw-

ności [4] i stosowany w postaci komercyjne dostępnego preparatu Nisaplin

®

. 

Obecnie stosowany jest w 50 krajach. Długa historia zastosowania oraz bez-

pieczeństwo dla konsumenta spowodowały, że nizyna należy do najczęściej 

komercyjnie używanych bakteriocyn [5].

BUDOWA NIZyNy

Nizyna syntetyzowana jest w postaci peptydu prekursorowego. Prenizy-

na, będąca strukturalnym prekursorem nizyny, zbudowana jest z dwudzies-

tu trzech aminokwasów tworzących peptyd liderowy oraz trzydziestu czter-

ech aminokwasów stanowiących po licznych modyfikacjach dojrzałą nizynę. 

Peptyd ten ulega obróbce potranslacyjnej. Wśród modyfikowanych aminok-

wasów  pojawiają  się  rzadko  spotykane  dehydrobutyryna,  dehydroalanina, 

lantionina  i  β-metylolantionina.  Poza  nietypowymi  aminokwasami  nizyna 

charakteryzuje  się  występowaniem  w  jej  budowie  pięciu  pierścieni  struk-

turalnych. Istnieją trzy naturalne warianty nizyny u Lactococcus lactis: nizyna 

A, nizyna Q oraz nizyna Z. Wersje A i Z różnią się od siebie pojedynczym 

Postępy Biochemii 59 (3) 2013 

323

aminokwasem w pozycji dwudziestej siódmej. W nizynie 

A występuje w tym miejscu reszta histydyny, natomiast 

w nizynie Z — reszta glutaminy. Nizyna Q różni się resz-

tami  aminokwasowymi  w  pozycjach  8  i  2  w  peptydzie 

liderowym oraz pozycjach 15, 21, 27 i 30 propeptydu [6,7].

REGUlACjA BIOSyNtEZy NIZyNy

Biosynteza  nizyny  podlega  autoregulacji.  Operon  ni-

zynowy składa się z 11 genów nisABTCIPRKFEG (Ryc. 1). 

Sekwencja nisA jest genem strukturalnym i koduje nizy-

nę. Klaster nizynowy zawiera trzy promotory: silny pro-

motor P

nisA

, oraz słabe P

nisF

 i P

nisR

. Promotor P

nisR

 jest kon-

stytutywny, natomiast promotory P

nisA

 i P

nisF 

aktywowane 

są  obecnością  nizyny  w  podłożu  hodowlanym.  Nizyna 

syntetyzowana jest na rybosomach jako peptyd prekurso-

rowy zawierający peptyd liderowy. W dojrzewaniu nizy-

ny bierze udział dehydrataza NisB, która po oddziaływa-

niu z peptydem liderowym dehydratuje reszty treoniny 

i seryny w prenizynie, do odpowiednio, dehydroalaniny 

oraz dehydrobutyryny.

Następnie, na skutek działania NisC, pięć zdehydraty-

zowanych  jednostek  bierze  udział  w  cyklizacji  poprzez 

sparowanie  z  resztą  cysteiny.  Rezultatem  jest  utworze-

nie  charakterystycznej  struktury  zwanej  pierścieniami 

β-metylolantioninowymi. transport przekształcanej mo-

lekuły poprzez błonę komórkową odbywa się w wyniku 

działania białka transportującego NisT, który jest pompą 

typu ABC wykorzystującą energię hydrolizy AtP. Dele-

cja bądź zakłócenia w działaniu nisT redukują zewnątrz-

komórkowe  wydzielanie  nizyny.  transportery  ABC  od-

powiedzialne za wydzielanie określonych antybiotyków 

są  najczęściej  dedykowane  do  transportu  specyficznego 

dla siebie polipeptydu. transporter NisT w odróżnieniu 

od innych posiada bardzo szeroki zakres specyficzności. 

Może transportować nie tylko całkowicie zmodyfikowa-

ną i dojrzałą nizynę, ale również częściowo i w pełni nie-

zmodyfikowaną  jej  formę.  Gen  nisP  koduje  subtylizynę 

odpowiedzialną  za  zewnątrzkomórkową  proteolityczną 

aktywację  nizyny  i  jest  odpowiedzialna  za  odłączanie 

peptydu  liderowego  od  końca  aminowego  prenizyny. 

Peptyd liderowy powoduje, że prenizyna jest nieaktyw-

na.  Krótko  po  przetransportowaniu  lub  jeszcze  w  trak-

cie  transportu  prekursora  nizyny,  peptyd  liderowy  jest 

usuwany przez subtylizynę, a prenizyna przekształca się 

w dojrzałą postać nizyny. Aktywna nizyna jest zdolna do 

indukowania  systemu,  który  reguluje  jej  biosyntezę  [7-

9].  Przy  autoregulacji  procesu  syntezy  nizyna  indukuje 

transkrypcję genów operonu nizynowego poprzez dwu-

składnikowy  system  regulujący  —  NisRK.  Białko  NisK 

jest kinazą histydynową umiejscowioną w błonie cytopla-

zmatycznej i działa jako receptor dla całkowicie dojrzałej 

nizyny.  Natomiast  NisR  jest  regulatorem  odpowiedzi  o 

charakterze  czynnika  transkrypcyjnego.  Kiedy  nizyna 

przyłącza się do N-terminalnej domeny zewnątrzkomór-

kowej  NisK  następuje  autofosforylacja  histydyny  w  do-

menie cytoplazmatycznej tego receptora. Grupa fosfora-

nowa  przenoszona  jest  na  asparaginian  białka  NisR,  co 

uruchamia  wiązanie  się  regulatora  odpowiedzi  do  pro-

motorów P

nisA

 i P

nisF

. Nizyna funkcjonuje jako peptydowy 

feromon. Mutanty nizyny oraz modyfikowana prenizyna 

mogą  działać  również  jako  induktory  transkrypcji  ge-

nów. Bakterie Lactococcus lactis syntetyzujące nizynę mają 

rozwiniętą oporność przeciwko bakteriobójczej aktywno-

ści tego peptydu. Oporność ta jest osiągana dzięki dwóm 

różnym systemom: NisFEG, który jest transporterem ABC 

oraz lipoproteinie NisI [6,8-11].

kOnStrukcjA SySteMu nice

Badania  nad  nizyną  pod  względem  struktury  i 

funkcji  oraz  nad  klastrem  genów  nisABTCIPRKFEG 

zaangażowanych  w  autoregulację  biosyntezy  nizyny 

umożliwiły  budowę  nizynowego  systemu  ekspresyjne-

go  (NICE).  System  ten  opracował  w  1996  roku  Pascalle 

de Ryter (NIZO Food Research, Holandia). Przeniósł on 

promotor P

nisA

 do wektora plazmidowego oraz skonstru-

ował szczep gospodarza Lactococcus lactis poprzez wpro-

wadzenie  do  chromosomu  szczepu  nie  posiadającego 

operonu nizinowego genów nisR i nisK. W laboratoriach 

badawczych NIZO opracowano szereg szczepów i kom-

patybilnych z nimi wektorów, z których produkcja białka 

indukowana  jest  nizyną.  System  nizynowy  jest  obecnie 

komercyjnie  dostępny  pod  anglojęzyczną  nazwą  NICE 

Expression  System  for  Lactococcus lactis.  W  jego  skład 

wchodzi  szczep  gospodarza,  kompatybilny  wektor  pla-

zmidowy oraz induktor — nizyna potrzebny dla kontro-

lowanej syntezy białka [12].

Rycina 1. Schemat przedstawiający biosyntezę nizyny oraz regulację tego proce-

su u szczepów Lactococcus lactis. Operon nizynowy (nisAZBTCIPRKFEG) koduje 

m.in.  nizynę  powstającą  w  formie  peptydu  prekursorowego  (l-NisAZ),  która 

podlega sekrecji (1) przez produkty NisBCTP, w trakcie której dochodzi do od-

cięcia peptydu liderowego (l). Dojrzała nizyna (NisAZ) może wykazywać funk-

cję przeciwbakteryjną (2) lub sygnalną (3). Sygnał odbierany jest przez receptor 

o aktywności kinazy histydynowej (NisK), która przekazuje go (4) na regulator 

transkrypcji (NisR) aktywujący ekspresję z promotorów (p) operonu nizynowego 

(5). Część produktów operonu nizynowego (NisIFEG) odpowiedzialna jest za od-

porność komórki na przeciwbakteryjne działanie nizyny.

324

 www.postepybiochemii.pl

GOSpOdArze

Gospodarzami  dla  systemu  nizynowego  są  bakterie 

Gram-dodatnie.  Wśród  nich  wymienić  można  bakterie 

z rodzajów: Lactobacillus, Enterococcus, Bacillus, Leuconos-

toc.  Najważniejszymi  i  najchętniej  używanymi  są  szcz-

epy  bakterii  fermentacji  mlekowej  (lAB),  a  zwłaszcza 

Lactococcus lactis. Mikroorganizmy z gatunku Lactococcus 

lactis  są  łatwe  w  hodowli.  Dobrze  poznane  są  genetyka 

tych  bakterii,  sposoby  wprowadzania  DNA  do  komó-

rek  oraz  warunki  powiększania  skali  hodowli.  Szczepy 

bakteryjne wykorzystywane do heterologicznej ekspresji 

mogą być zdolne do samodzielnej produkcji nizyny lub 

też pozbawione zdolności do syntezy tego peptydu. De-

lecja 4 par zasad w genie nisA może spowodować zaham-

owanie wytwarzania nizyny. W przypadku szczepów nie 

produkujących  nizyny  indukcja  ekspresji  genów  może 

być osiągnięta przez dodatek nizyny do pożywki w loga-

rytmicznej fazie wzrostu bakterii.

Skuteczność indukcji syntezy heterologicznego białka 

przez szczepy nie wytwarzające nizyny, ale zawierające 

zintegrowane  geny  nisRK  (indukcja  kontrolowana)  jest 

większa  od  szczepów  syntetyzujących  nizynę.  Dzieje 

się  tak  z  powodu  obecności  białka  NisI  u  szczepów 

produkujących nizynę. Białko to wiąże część cząsteczek 

nizyny  zawartych  w  pożywce  hodowlanej.  Podob-

ny  efekt  występuje  w  przypadku  drugiego  systemu 

opornościowego — NisFEG. Szczepy produkujące nizynę 

zachowują jednak zdolność do autoindukcji syntezy nizy-

ny stąd są gospodarzami produkującymi tę bakteriocynę 

i  samoindukującymi  ekspresję  genów  heterologicznych 

(ciągła indukcja) [7,13].

WektoRy PLAzmidoWe

Plazmidy wykorzystywane w systemie nizynowym są 

transkrypcyjnymi  lub  translacyjnymi  wektorami  fuzyj-

nymi.  Zasadniczymi  elementami  wektora  plazmidowe-

go są promotor P

nisA

 oraz polilinker. Przy fuzjach geno-

wych  transkrypcyjnych  gen  przeznaczony  do  ekspresji 

musi  zostać  tak  zaprojektowany,  aby  posiadał  własną 

sekwencję  kodującą  miejsce  wiązania  rybosomu  (RBS). 

Gen  bądź  geny  przeznaczone  do  ekspresji  muszą  także 

posiadać  własny  kodon  starto-

wy  [11].  Przy  fuzjach  genowych 

translacyjnych gen przeznaczony 

do ekspresji jest zaprojektowany 

tak, aby zawierał miejsce restryk-

cyjne rozpoznawane przez enzy-

my restrykcyjne NdeI (CAtAtG) 

lub  NcoI  (CCAtGG)  zawierające 

kodon  startowy.  Umożliwia  to 

wprowadzenie insertu genowego 

tabela 1. Szczepy L. lactis będące gospodarzami w nizynowym systemie ekspresyjnym [11].

Szczep L. lactis

Charakterystyka

NZ9700

szczep powstały w wyniku koniugacji pomiędzy dwoma producentami nizyny: szczepem NIZO B8 oraz MG1614

NZ9800

szczep niezdolny do syntezy nizyny, oporny na jej działanie

NZ 9000

szczep obecnie najczęściej używany jako gospodarz; geny nisK i nisR są zintegrowane w genie pepN szczepu MG1363

NZ3900

gospodarz używany w przemyśle spożywczym; selekcja transformantów oparta na zdolności do wzrostu na laktozie

NZ3000

w szczepie wprowadzono delecję genu lacF; szczep nie jest zdolny do wzrostu na laktozie; wzrost 

na laktozie może zostać osiągnięty po wprowadzeniu genu lacF na plazmidzie

NZ9000 htrA

szczep NZ9000 pozbawiony genu htrA w wyniku delecji; gospodarz dedykowany do syntezy białek wydzielanych do podłoża

FI7847

szczep z delecją w genie nisA

tabela 2. Najczęściej stosowane wektory plazmidowe w nizynowym systemie ekspresyjnym [11].

Nazwa wektora

Charakterystyka

pNZ123

wektor wysokopopijnyz genami replikacyjnymi z L. lactis, genem CAT oraz polilinkerem do fuzji transkrypcyjnych

pNZ8020

wektor do stosowania z różnymi gatunkami komórek gospodarza. Zawiera gen oporności na 

chloramfenikol (cat), promotor P

nisA

 oraz polilinkerem do fuzji transkrypcyjnych

pNZ8037

wektor do stosowania z różnymi gatunkami komórek gospodarza. Wektor z genem oporności na 

chloramfenikom (cat), promotorem P

nisA

 i polilinker z miejscem NcoI do fuzji translacyjnych

pNZ8048

stworzony na bazie wektora pNZ8037 dodatkowo z sekwencją terminacyjną za polilinkerem

pNZ8113

stworzony na bazie wektora pNZ8048 dodatkowo z sekwencją kodującą  

His-tag (znacznik fuzyjny na C-końcu rekombinowanego białka)

pNZ9530

wektor niskokopijny z genami nisR i nisK oraz genem oporności na erytromycynę, używany do 

kotransformacji wraz z wektorami serii pNZ8* do stosowania u gatunków innych niż Lactococcus lactis

pNZ9520

wektor wysokokopijny z genami nisR i nisK oraz genem oporności na erytromycynę, używany do 

kotransformacji wraz z wektorami serii pNZ8* do stosowania u gatunków innych niż Lactococcus lactis

*oznacza liczby od 0–9

tabela 3. Wykorzystanie nizynowego systemu ekspresyjnego do produkcji szczepionek.

Rodzaj białka

Pochodzenie rekombinowanego białka

Piśmiennictwo

Antygeny bakteryjne

antygen l7/12 Brucella abortus

[23]

podjednostka c toksyny ttFC Clostridium tetani

[24]

Antygeny wirusowe

białko niestrukturalne 4 NSP4 rotawirusa bydlęcego

[25]

epitop BCV bydlęcego koronawirusa

[26]

białko E7 ludzkiego wirusa brodawczaka typu 16

[27]

białko VP60 wirusa Norwalk

[28]

Postępy Biochemii 59 (3) 2013 

325

w ramkę odczytu zawierającą sekwencję kodującą miej-

sce wiązania rybosomu [11,12].

induktOry ekSpreSji

Indukcja  ekspresji  zachodzi  przy  użyciu  nizyny,  jej 

analogów  bądź  też  przy  użyciu  supernatantu  ze  szcze-

pów produkujących nizynę, np. L. lactis NZ9700. Ilość ni-

zyny potrzebnej do indukcji jest niższa niż wartość MIC 

(minimalne stężenie hamujące) i oscyluje w przedziale od 

0,01 do 10 ng/ml. takie wartości stężenia nizyny nie są w 

stanie zahamować wzrostu mikroorganizmu gospodarza 

nawet  jeśli  gospodarz  pozbawiony  jest  systemów  opor-

ności NisI lub NisFEG. W celu prawidłowego indukowa-

nia  ekspresji  genów  induktory  muszą  zostać  podane  w 

trakcie  logarytmicznej  fazy  wzrostu.  Poziom  ekspresji 

jest regulowany ilością nizyny użytej do indukcji [11].

zAStOSOWAniA

System  nizynowy  z  wykorzystaniem  L. lactis  znalazł 

zastosowanie między innymi przy syntezie białek homo-

logicznych  i  heterologicznych  peptydów  antymikrobio-

logicznych, syntezy białek błonowych [14,15], produkcji 

białek  wykorzystywanych  w  wytwarzaniu  szczepionek 

(tab. 3) czy w inżynierii metabolicznej. System ten wyko-

rzystywany jest do produkcji wielkoskalowej białek oraz 

produkcji białek ulegających sekrecji do podłoża hodow-

lanego [16-18]. Na skalę przemysłową z wykorzystaniem 

systemu  nizynowego  produkowane  są  między  innymi 

lizostafyna pochodząca ze Staphylococcus simulans biovar 

Staphylolyticus [19], CoA ligaza z Arabidopsis thaliana [20] 

oraz enzymy szlaku syntezy folianów [21,22].

pOdSuMOWAnie

System nizynowy jest wygodnym i łatwym w użyciu 

narzędziem  molekularnym  pozwalającym  na  heterolo-

giczną  syntezę  biomolekuł  zarówno  do  celów  badaw-

czych jak i w produkcji wielkoskalowej.

PiśmieNNiCtWo

1.  Ziarno M, Godlewska A (2008) Znaczenie i wykorzystanie bakterii ro-

dzaju Lactococcus w mleczarstwie. Med Wet 64: 35-39

2.  EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ), Scientific opinion on 

the maintenance of the list of QPS biological agents intentionally ad-

ded to food and feed (2012 update). EFSA j 10: 3020

3.  Bayjanov jR, Starrenburg Mj, van der Sijde MR, Siezen Rj, van Hijum 

SA  (2013)  Genotype-phenotype  matching  analysis  of  38  Lactococcus 

lactis strains using random forest methods. BMC Microbiol 13: 68

4.  EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ) (2006) Opinion of the 

scientific panel on food additives, flavorings, processing aids and ma-

terials in contact with food on request from the commission related to 

the use of nisin (E234) as food additive. EFSA j 314: 1-16

5.  Hagiwara A, Imai N, Nakashima H, toda y, Kawabe M, Furukawa 

F, Delves-Broughton j, yasuhara K, Hayashi SM (2010) A 90-day oral 

toxicity study of nisin A, an anti-microbial peptide derived from Lacto-

coccus lactis subsp. lactis, in F344 rats. Food Chem toxicol 48: 2421-2428

6.  lubelski j, Rink R, Khusainov R, Moll GN, Kuipers OP (2008) Biosyn-

thesis, immunity, regulation, mode of action and engineering of the 

model lantibiotic nisin. Cell Mol life Sci 65: 455-476

7.  Mierau I, Kleerebezem M (2005) 10 years of the nisin-controlled gene 

expression system (NICE) in Lactococcus lactis. Appl Microbiol Biotech-

nol 9: 1-13

8.  Cheigh CI, Pyun yR (2005) Nisin biosynthesis and its properties. Bio-

technol lett 27: 1641-1648

9.  Kuipers OP, Beerthuyzen MM, Siezen Rj, De Vos WM (1993) Charac-

terization of the nisin gene cluster nisABtCIPR of Lactococcus lactis. 

Requirement of expression of the nisA and nisI genes for development 

of immunity. Eur j Biochem 216: 281-291

10. de Ruyter PG, Kuipers OP, Beerthuyzen MM, van Alen-Boerrigter I, 

de Vos WM (1996) Functional analysis of promoters in the nisin gene 

cluster of Lactococcus lactis. j Bacteriol 178: 3434-3439

11. Zhou XX, li WF, Ma GX, Pan yj (2006) the nisin-controlled gene ex-

pression  system:  construction,  application  and  improvements.  Bio-

technol Adv 24: 285-295

12. de Ruyter PG, Kuipers OP, de Vos WM (1996) Controlled gene expres-

sion systems for Lactococcus lactis with the food-grade inducer nisin. 

Appl Environ Microbiol 62: 3662-3667

13. Zhou XX, Wang yB, Pan yj, li WF (2008) Nisin-controlled extracel-

lular production of apidaecin in Lactococcus lactis. Appl Microbiol Bio-

technol 78: 947-953

14. Kunji ER, Slotboom Dj, Poolman B (2003) Lactococcus lactis as host for 

overproduction  of  functional  membrane  proteins.  Biochim  Biophys 

Acta 1610: 97-108

15. Monné M, Chan KW, Slotboom Dj, Kunji ER (2005) Functional expres-

sion of eukaryotic membrane proteins in Lactococcus lactis. Protein Sci 

14: 3048-3056

16. Ravn P, Arnau j, Madsen SM, Vrang A, Israelsen H (2003) Optimiza-

tion of signal peptide SP310 for heterologous protein production in 

Lactococcus lactis. Microbiology 149: 2193-2201

17. lv j, Huang C, Zhang X, tan S (2012) Extracellular secretion of anti-

coagulant peptide hirudin in Lactococcus lactis using SP310mut2 signal 

peptide. Biotechnol lett 34: 61-65

18. Ng Dt, Sarkar CA (2011) Nisin-inducible secretion of a biologically ac-

tive single-chain insulin analog by Lactococcus lactis NZ9000. Biotech-

nol Bioeng 108: 1987-1996

19. Mierau I, leij P, van Swam I, Blommestein B, Floris E, Mond j, Smid Ej 

(2005) Industrial-scale production and purification of a heterologous 

protein in Lactococcus lactis using the nisin-controlled gene expression 

system NICE: the case of lysostaphin. Microb Cell Fact 4: 15

20. Martínez-Cuesta MC, Gasson Mj, Narbad A (2005) Heterologous ex-

pression of the plant coumarate: CoA ligase in Lactococcus lactis. lett 

Appl Microbiol 40: 44-49

21. Sybesma W, Van Den Born E, Starrenburg M, Mierau I, Kleerebezem 

M, De Vos WM, Hugenholtz j (2003) Controlled modulation of folate 

polyglutamyl tail length by metabolic engineering of Lactococcus lactis. 

Appl Environ Microbiol 69: 7101-7107

22. Sybesma W, Starrenburg M, Kleerebezem M, Mierau I, de Vos WM, 

Hugenholtz j (2003) Increased production of folate by metabolic en-

gineering of Lactococcus lactis. Appl Environ Microbiol 69: 3069-3076

23.  Ribeiro lA, Azevedo V, le loir y, Oliveira SC, Dieye y, Piard jC, 

Gruss A, langella P (2002) Production and targeting of the Brucella 

abortus antigen l7/l12 in Lactococcus lactis: a first step towards food-

grade  live  vaccines  against  brucellosis.  Appl  Environ  Microbiol  68: 

910-916

24. Grangette C, Müller-Alouf H, Geoffroy M, Goudercourt D, turneer M, 

Mercenier A 2(2002) Protection against tetanus toxin after intragastric 

administration of two recombinant lactic acid bacteria: impact of strain 

viability and in vivo persistence. Vaccine 20: 3304-3309

25. Enouf V, langella P, Commissaire j, Cohen j, Corthier G (2001) Bovine 

rotavirus nonstructural protein 4 produced by Lactococcus lactis is anti-

genic and immunogenic. Appl Environ Microbiol 67: 1423-1428

26. langella P, le loir y (1999) Heterologous protein secretion in Lacto-

coccus lactis: a novel antigen delivery system. Braz j Med Biol Res 32: 

191-198

27. Bermúdez-Humarán lG, Cortes-Perez NG, le loir y, Gruss A, Ro-

driguez-Padilla C, Saucedo-Cardenas O, langella P, Montes de Oca-

326

 www.postepybiochemii.pl

the NiCe system as a tool for protein expression in 

Lactococcus lactis

Agnieszka Olejnik-Schmidt

*

, Agnieszka Gronowalska, marcin Schmidt

Department of Biotechnology and Food Microbiology, Poznan University of life Sciences, 48 Wojska Polskiego St., 60-627 Poznań, Poland

*

e-mail: agao@up.poznan.pl

key words: heterologous protein expression, GRAS microorganisms, L. lactis, nisin, NICE gene expression system

ABStRACt

the progress in genetic engineering allows to employ still growing number of bacterial strains for recombinant gene expression. Among them are 

many lactic acid bacteria including 

Lactococcus lactis which belongs to the most developed ones. those microorganisms are ideal for heterologous 

protein expression because they can synthesize nisin which is a bacteriocin that can be used as an inductor factor. the recently developed NiCe 

system is molecular tool that allows to produce heterolguos proteins in 

Lactococcus lactis. the NiCe system needs three components for correct ope-

ration: host strain, plasmid and inductor factor — nisin. the NiCe system proved to be valuable tool for recombinant protein expression including 

synthesis of heterologous antimicrobial peptides, membrane proteins, and vaccines development.

luna R (2003) Fusion to a carrier protein and a synthetic propeptide 

enhances  E7  HPV-16  production  and  secretion  in  Lactococcus lactis. 

Biotechnol Prog 19: 1101-1104

28. Martín MC, Fernández M, Martin-Alonso jM, Parra F, Boga jA, Al-

varez MA (2004) Nisin-controlled expression of Norwalk virus VP60 

protein in Lactobacillus casei. FEMS Microbiol lett 237: 385-391

PoLSkie toWARzyStWo BioCHemiCzNe

SkłAdki CzłoNkoWSkie W 2014 Roku

SZANOWNI PAŃStWO!

Przypominamy, że składki członkowskie za 2014 r. powinny być opłacone do 31 marca. Wysokość składki wynosi 100 zł (50 zł w przypadku 

składek ulgowych). Bardzo prosimy o terminowe opłacanie składek. Członkowie, którzy są na emeryturze zwolnieni są z płacenia składek, nie 

otrzymują kwartalnika „Postępy Biochemii”, ale mogą go zaprenumerować po ulgowej cenie 50 zł rocznie. 

Członkowie, którzy opłacą składkę członkowską do 31 marca 2014 r. mają zapewnioną bezpłatną prenumeratę kwartalnika „Postępy Bioche-

mii”. Członkowie, którzy opłacą składkę po 31 marca powinni liczyć się z faktem, że mogą nie otrzymać wszystkich zeszytów rocznika 2014 r. 

(będą otrzymywać kwartalnik do czasu wyczerpania nakładu). 

Przypominamy także osobom, które zalegają ze składkami, że opłata zaległych składek, uchroni przed wszczęciem procedury skreślenia tych 

osób z listy członków towarzystwa. Apelujemy o uregulowanie zaległych składek. jeszcze raz serdecznie zachęcamy do skorzystania z przywi-

lejów, jakie daje opłata składki członkowskiej w terminie.

Prenumerata „Postępów Biochemii” w 2014 roku

Prenumeratorzy instytucjonalni płacą za prenumeratę „Postępów Biochemii” 180 zł rocznie. Osoby fizyczne nie będące członkami towarzy-

stwa mogą zaprenumerować „Postępy Biochemii” w cenie 120 zł rocznie. Studenci i doktoranci nie będący członkami towarzystwa prenumerują 

„Postępy Biochemii” po ulgowej cenie 50 zł rocznie. Konieczne jest przy tym udokumentowanie statusu studenta lub doktoranta odpowiednim 

zaświadczeniem.

Opłaty należy wnosić do banku PekAo S.A. Oddział Warszawa, ul. Krucza 6/14; na konto 81 1240 6003 1111 0000 4947 2703; 

Opłaty z zagranicy: IBAN: Pl81 1240 6003 1111 0000 4947 2703; SWIFt Code: PKOPPlPW

Koszt przelewu ponosi wpłacający.

joanna Bandorowicz-Pikuła
Skarbnik Polskiego towarzystwa Biochemicznego