314

 www.postepybiochemii.pl

Katarzyna Łepeta
Anna Maria Łasica
Elżbieta Katarzyna Jagusztyn-

-Krynicka

*

Zakład  Genetyki  Bakterii,  Instytut  Mikrobio-

logii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszaw-

ski, Warszawa

*

Zakład 

Genetyki 

Bakterii, 

Instytut 

Mikrobiologii,  Wydział  Biologii,  Uniwersytet 

Warszawski,  ul.  Miecznikowa  1,  02-096 

Warszawa; e-mail: kjkryn@biol.uw.edu.pl

Artykuł otrzymano 28 marca 2012 r.

Artykuł zaakceptowano 20 czerwca 2012 r.

Słowa  kluczowe:  nowotwór,  szczepionka 

DNA, terapia genowa, wektor, LBV

Wykaz skrótów: APC (ang. antigen presenting 

cell)  —  komórka  prezentująca  antygen;  IL-2 

(ang. interleukin 2) — interleukina 2; LBV (ang. 

attenuated live bacterial vaccine) — atenuowane 

żywe  bakteryjne  szczepionki;  MHC  (ang. 

major histocompatibility complex)  —  główny 

układ zgodności tkankowej; SPI1/2 (ang. Sal-

monella  pathogenicity island 1 or 2) — wyspa 

patogenności 1 lub 2 w komórkach Salmonella

Zastosowanie mikroorganizmów jako wektorów  

w antynowotworowych terapiach genowych

STRESZCZENIE

T

erapia  genowa  stanowi  potencjalną  nową  strategię  leczenia  chorób  nowotworowych. 

Aby  dostarczyć  transgen  specyficznie  do  komórek  nowotworowych,  wymagane  jest 

zastosowanie odpowiedniego wektora. Do tej pory większość genowych terapii nowotwo-

rowych opierało się na wykorzystaniu różnych wektorów wirusowych. Bakterie takie jak 

Salmonella, Clostridium lub niepatogenne Bifidobacterium selektywnie gromadzą się w gu-

zach 

in vivo, co czyni je użytecznymi wektorami w terapii genowej nowotworów. Chociaż 

mechanizm transferu DNA z bakterii do komórek ssaków nie jest całkowicie poznany ich 

potencjał do dostarczania genów terapeutycznych do komórek nowotworowych wykazano 

in vitro i in vivo. Praca przeglądowa prezentuje najnowsze osiągnięcia terapii genowej no-

wotworów z wykorzystaniem bakterii.

WPROWADZENIE

Jednym z głównych problemów konwencjonalnych terapii antynowotworo-

wych  jest  brak  specyficzności  leków  wobec  komórek  nowotworowych,  czego 

skutkiem jest ich toksyczność wobec wszystkich komórek, zarówno rakowych, 

jak  i  tych  zdrowych.  Dlatego  badania  dotyczące  terapii  antynowotworowych 

koncentrują się na poszukiwaniu metody, która umożliwiłaby selektywne dzia-

łanie leków na komórki guza. Od około 20 lat prowadzone są intensywne ba-

dania dotyczące zastosowania antynowotworowych terapii genowych. Terapie 

te można zaklasyfikować do sześciu kategorii: terapie samobójcze (ang. suicide-

-gene therapy), terapie mające na celu przywrócenie właściwego cyklu komór-

kowego poprzez dostarczenie prawidłowych kopii uszkodzonych genów (ang. 

corrective gene addition), terapie immunomodulujące, terapie blokujące procesy 

angiogenezy, terapie powodujące wyciszanie genów oraz terapie onkolityczne. 

Jako  wektory  dostarczające  do  komórek  nowotworowych  odpowiednie  geny 

stosowane były w początkowych badaniach głównie wektory wirusowe takie 

jak adenowirusy, retrowirusy, HSV (ang. herpex simplex virus) oraz plazmidowy 

DNA [1-3]. Także bakterie od wielu lat próbowano wykorzystywać w walce z 

chorobami nowotworowymi. Od ponad 200 lat opisywane były przypadki re-

gresji chorób nowotworowych u pacjentów przechodzących infekcje bakteryjne, 

np. już w 1813 roku odnotowano regresję nowotworu u pacjenta z objawami 

zgorzeli gazowej spowodowanej infekcją Clostridium perfringens. Stosowano ce-

lowe infekcje, które w wielu przypadkach prowadziły do regresji lub całkowite-

go zaniku guza. Przykładem mogą być tzw. toksyny Coley’a (mieszanina zabi-

tych temperaturą komórek Streptococcus pyogenes i Serratia marcescens) stosowane 

jako stymulatory układu odpornościowego w terapiach mięsaków [4,5]. W roku 

1976 po raz pierwszy udokumentowano terapeutyczne działanie prątków BCG 

(ang. Bacillus Calmette-Guerin) w leczeniu powierzchniowego raka pęcherza mo-

czowego (ang. superficial bladder cancer). Terapia ta stosowana jest do dzisiaj, choć 

dopiero niedawno częściowo wyjaśniono mechanizm tego zjawiska [6]. Ponad-

to, prątki BCG są stosowane jako stymulujący adiuwant w kilku typach antyno-

wotworowych szczepionek np. OncoVAX czy CancerVax [7,8]. Wiele gatunków 

bakterii preferencyjnie kolonizuje obszary guzów nowotworowych charaktery-

zujące się silnym niedotlenieniem. Rozwój inżynierii genetycznej pozwolił na 

manipulowanie materiałem genetycznym mikroorganizmów i oszacowanie ich 

skuteczności jako wektorów w antynowotworowych terapiach genowych. Bak-

terie stosowane jako nośniki genów w omawianych terapiach należą do trzech 

grup:  bakterie  mlekowe  z  rodzaju  Bifidobacterium,  fakultatywne  wewnątrzko-

mórkowe  patogeny  np.  rodzaj  Salmonella  oraz  ściśle  beztlenowe  bakterie  ro-

dzaju Clostridium [9,10]. Jak dotąd nie udało się skonstruować bezpiecznego i 

absolutnie skutecznego wektora do zastosowania w antynowotworowej terapii 

genowej,  powodującego  zniszczenie  wszystkich  typów  komórek  nowotworo-

wych bez poważnych efektów ubocznych. Praca przeglądowa przedstawia osią-

gnięcia ostatnich lat dotyczące użycia żywych komórek bakteryjnych oraz spor 

bakterii rodzaju Clostridium.

Postępy Biochemii 58 (3) 2012 

315

MECHANIZM „

TUMOR-TARGETING” — SELEKTYWNA 

KOLONIZACJA KOMÓREK NOWOTWOROWYCH

W  toku  wieloletnich  badań  udokumentowano,  że  różne 

gatunki  obligatoryjnych  i  fakultatywnych  anaerobowych 

mikroorganizmów preferencyjnie kolonizują i są zdolne se-

lektywnie replikować się w guzach litych, jeśli bakterie do-

starczane  są  ogólnoustrojowo.  Powodem  tej  selektywności 

są  panujące  wewnątrz  guzów  unikalne  warunki.  Rozwój 

guza  i  przerzutów  stymuluje  angiogenezę  czyli  formowa-

nie  nowych  naczyń  krwionośnych.  Są  one  jednak  mocno 

nieuorganizowane,  ich  wyściółka  endotelialna  jest  niekom-

pletna, często mają też „ślepe” końce. Prowadzi to do spo-

wolnionego przepływu krwi i nieefektywnego dostarczania 

składników odżywczych oraz tlenu do komórek guzów no-

wotworowych. W efekcie w obrębie guza powstają regiony 

hipoksji i anoksji, co promuje wzrost bakterii fakultatywnie 

i obligatoryjnie beztlenowych. Jednocześnie występująca w 

obrębie guzów nekroza dostarcza składników odżywczych 

niezbędnych  do  wzrostu  mikroorganizmów.  Panujące  w 

guzach unikalne warunki określa się często mianem „sank-

tuarium immunologicznego”, jako że obserwuje się w nich 

zjawisko  restrykcji  składników  układu  odpornościowego; 

bezpośrednim skutkiem tego zjawiska jest zahamowanie me-

chanizmów usuwania bakterii. Opisane cechy tego mikrośro-

dowiska  faworyzują  więc  selektywne  namnażanie  bakterii 

anaerobowych.  Obserwacje  te  spowodowały  rozwój  badań 

nad zastosowaniem niektórych gatunków bakterii jako wek-

torów do dostarczania odpowiednich genów specyficznie do 

tkanek nowotworowych (tzw. „tumor targeting”) [9, 10].

SALMONELLA SPP.

Jednymi  z  najdokładniej  opisanych  bakterii  potencjalnie 

użytecznych  w  terapii  antynowotworowej  są  mikroorgani-

zmy  rodzaju  Salmonella,  gramujemne  względnie  beztleno-

we, wewnątrzkomórkowe patogeny, które kolonizują guzy 

człowieka i to zarówno te większe, jak i mniejsze, lepiej na-

tlenione. Szczep dziki S. enterica sv. Typhimurium powoduje 

głównie zakażenia jelitowe, które nie leczone mogą wywoły-

wać ogólnoustrojowe infekcje. W celu odpowiedzi na pyta-

nie, jaki mechanizm jest odpowiedzialny za infekcje i wzrost 

Salmonella w guzach po iniekcji dożylnej lub iniekcji do jamy 

otrzewnej konieczne były badania nad rolą dwóch głównych 

wysp patogenności zlokalizowanych na chromosomie S. ente-

rica sv. Typhimurium, SPI1 oraz SPI2. We wnętrzu guza znaj-

dują się leukocyty infiltrujące — makrofagi, komórki dendry-

tyczne, limfocyty i neutrofile o właściwościach antybakteryj-

nych. Zdolność bakterii Salmonella do pokonania tych barier 

i przeżycia jest nieodzowna w jej zastosowaniu jako wektora 

antyrakowego. W obrębie SPI1 Salmonella enterica sv. Typhi-

murium znajdują się geny kodujące białka budujące system 

sekrecyjny typu III, który odgrywa kluczową rolę w proce-

sach inwazyjności (np. wnikanie do enterocytów). Geny SPI2 

warunkują przeżycie bakterii we wnętrzu makrofagów i ko-

mórek epitelialnych. Aktywność genów SPI2 jest niezbędna 

dla wywołania antynowotworowego efektu przez S. enterica 

sv. Typhimurium poprzez warunkowanie namnażania bak-

terii w komórkach guza. Mutanty w genach SPI1 charakte-

ryzują się znacząco zredukowaną zdolnością do inwazji, nie 

wpływa to jednak na indukowany efekt antynowotworowy 

[9]. Pomimo poznania roli SPI2 w procesie tropizmu w sto-

sunku do komórek nowotworowych, mechanizm działania 

antynowotworowego produktów genów kodowanych w ob-

rębie tej wyspy patogenności pozostaje nadal niewyjaśniony 

i wymaga dalszych badań.

Zdolność bakterii z rodzaju Salmonella do wewnątrzko-

mórkowej inwazji i proliferacji w obrębie guzów potwier-

dzona została w badaniach z wykorzystaniem bakterii pro-

dukujących białko GFP (ang. Green Fluorescent Protein, zie-

lone białko fluoryzujące). Zarówno w badaniach in vitro, jak 

i in vivo na modelu mysim, bakterie z rodzaju S. enterica sv. 

Typhimurium, w których ekspresji ulegało GFP, były zdol-

ne do wzrostu i replikacji wewnątrz komórek nowotworo-

wych. Ponadto, po 6 dniach od dożylnej aplikacji szczepu 

S. enterica sv. Typhimurium A1, liczba bakterii w zdrowych 

tkankach zaczęła spadać, a po 15 dniach od iniekcji bakterie 

lokalizowały się jedynie w obrębie guzów [12].

Ze względu na wysoką toksyczność związaną z zastoso-

waniem patogennego dla człowieka mikroorganizmu, stoso-

wanie bakterii rodzaju Salmonella w terapii antynowotworo-

wej wymagało konstrukcji atenuowanego szczepu. Za wyso-

ki  poziom  immunostymulacji  odpowiedzialny  jest  głównie 

LPS,  składnik  błony  zewnętrznej  bakterii,  indukujący  mię-

dzy innymi produkcję TNF-α. W celu obniżenia toksyczności 

skonstruowano auksotroficzny szczep VNP20009 ze zmody-

fikowanym lipidem A. Szczep ten posiada delecje w genach 

msbB oraz purI. Produkt genu msbB jest niezbędny do termi-

nalnej mirystylacji lipidu A, natomiast delecja purI wywołuje 

konieczność dostarczenia zewnętrznego źródła adeniny. Mu-

tanty te, badane na modelu mysim, w znacznie mniejszym 

stopniu indukowały produkcję TNF-α gospodarza, co skut-

kowało obniżeniem toksyczności przy jednoczesnym zacho-

waniu specyficzności wobec komórek nowotworowych oraz 

opóźniało  wzrost  guza.  Kolejne  badania  z  zastosowaniem 

atenuowanego  szczepu  S. enterica  waaN  (uprzednio:  msbB) 

oraz purI potwierdziły obniżoną patogenność oraz podwyż-

szoną zdolność do kolonizacji obszarów nowotworowych ze 

względu na podwyższony w tych regionach poziom adeniny 

[13,14]. Tak więc szczep VNP20009 powinien być odpowied-

nim kandydatem do konstrukcji bezpiecznych wektorów o 

potencjalnym  zastosowaniu  w  terapii  antynowotworowej. 

Niemniej jednak, w trakcie pierwszej fazy testów klinicznych 

u  pacjentów  z  przerzutowym  czerniakiem  oraz  z  przerzu-

towym  rakiem  nerkowokomórkowym  nie  potwierdzono 

jego  właściwości  terapeutycznych.  U  żadnego  z  pacjentów 

nie zaobserwowano regresji choroby nowotworowej po do-

żylnym podaniu szczepu VNP20009, a jedynie u trzech pa-

cjentów guzy były kolonizowane przez komórki Salmonella 

[15]. Przyczyny tego zjawiska nie są znane. Dane z ostatnio 

przeprowadzonych doświadczeń z wykorzystaniem szczepu 

VNP20009 na modelu mysim wykazały zależność jego sku-

teczności od drogi podania preparatu. Po doustnej aplikacji 

znacząca liczba podanych bakterii lokalizowała się w rejonie 

guzów, skutkując spowolnieniem wzrostu guza oraz zwięk-

szoną przeżywalnością zwierząt. Jednoczesne podanie bak-

terii  i  cyklofosfamidu  zwiększyło  terapeutyczny  efekt  che-

mioterapii silnie indukując apoptozę komórek nowotworo-

wych bez istotnej toksyczności dla całego organizmu [16]. W 

fazie doświadczeń są inne auksotroficzne szczepy S. enterica, 

które także charakteryzują się preferencyjną kolonizacją no-

wotworów np. szczep A1, auksotrof wymagający do wzrostu 

316

 www.postepybiochemii.pl

leucyny i argininy [12,17]. Bakterie rodzaju Salmonella stoso-

wano również w połączeniu z konwencjonalnymi metodami 

terapii antynowotworowej, takimi jak chemio- czy radiotera-

pia, w wyniku czego nastąpiło podwyższenie skuteczności 

tych metod w badaniach na myszach [9,17,18].

CLOSTRIDIUM SPP.

Innymi  mikroorganizmami  o  potencjalnym  zastosowaniu 

w  terapii  antynowotworowej  są  gramdodatnie,  beztlenowe 

wytwarzające  spory,  bakterie  rodzaju  Clostridium.  Wiele,  z 

około 80 gatunków tego rodzaju, było testowanych pod ką-

tem potencjalnego zastosowania w terapiach antynowotworo-

wych. Pierwsze odnotowane przez Vautier’a przypadki wyle-

czenia raka powiązane z infekcją bakteryjną miały miejsce już 

w 1813 roku na skutek przebycia zgorzeli gazowej. Ponad 130 

lat później, w 1947 roku, po raz pierwszy zaobserwowano on-

kolizę i regresję mięsaka u myszy po iniekcji spor Clostridium 

histolyticum do guza. Zmniejszeniu masy nowotworowej towa-

rzyszyła jednak silna toksyczność dla organizmu, powodująca 

śmierć większości zwierząt. Również zastosowanie w podob-

nych doświadczeniach spor patogennego mikroorganizmu C. 

tetani wywoływało śmierć zwierząt związaną z wysoką tok-

sycznością.  Badania  nad  niepatogennymi  fakultatywnymi 

tlenowcami Bacillus subtilis i Bacillus mesentericus wykazały, że 

nie wszystkie sporujące bakterie zdolne do wzrostu w warun-

kach beztlenowych wykazują podobny efekt antynowotworo-

wy, jako że spory Bacillus przygotowane w ten sam sposób, 

nie indukowały procesu onkolizy. Na podstawie tych badań 

sformułowano hipotezę, że chociaż u podstawy zastosowania 

bakterii rodzaju Clostridium w terapii antynowotworowej leży 

zdolność  mikroorganizmów  do  namnażania  w  warunkach 

beztlenowych, istotne są również inne, nie do końca scharakte-

ryzowane czynniki. W terapiach antynowotworowych mogły-

by potencjalnie znaleźć zastosowanie również zmodyfikowa-

ne genetycznie niepatogenne gatunki rodzaju Clostridium takie 

jak np. C. sporogenes, C. acetobutylicum, C. oncolyticum czy C. 

novyi [4]. Wykazano istotne różnice w skuteczności działania 

spor zależnie od użytego w doświadczeniach gatunku. Z prze-

badanych przez Vogelstein i wsp. 26 gatunków anaerobowych 

bakterii najwyższym poziomem kolonizacji guzów nowotwo-

rowych charakteryzował się gatunek C. novyi [19]. Ze wzglę-

du na wysoką toksyczność dzikiego szczepu, skonstruowano 

atenuowany szczep C. novyi-NT pozbawiony genu kodujące-

go toksynę. Jednak efekty terapeutyczne odnotowano tylko w 

połączeniu z chemioterapią [19,20]. Ostatecznie kombinowana 

terapia w postaci aplikacji szczepu C. novyi-NT z chemiotera-

peutykami oddziałującymi na mikrotubule okazała się obiecu-

jąca i znajduje się obecnie w trakcie I fazy badań klinicznych 

[21].  Podobne  doświadczenia  wykonane  z  użyciem  innych 

gatunków  rodzaju  Clostridium  także  udokumentowały  celo-

wość stosowania terapii łączonych. Niestety niektóre z prze-

badanych  strategii  pomimo  powodowania  regresji  guzów 

prowadziły do śmierci zwierząt doświadczalnych [19, 20]. Po-

nadto, nie zawsze wyniki uzyskane podczas doświadczeń na 

modelach mysich pokrywały się z tymi otrzymanymi podczas 

badań klinicznych [4,5]. Ponieważ bakterie rodzaju Clostridium 

są obligatoryjnymi beztlenowcami spory posiadają zdolność 

do kiełkowania wyłącznie w guzach o odpowiednio dużych 

rozmiarach, gwarantujących dogodne dla tej bakterii warunki 

anoksji; mniejsze guzy są stosunkowo dobrze napowietrzone 

i odżywiane. Również zewnętrzne warstwy litych guzów po 

onkolitycznych terapiach pozostawały często nienaruszone, co 

w konsekwencji prowadziło do rozwoju nowotworu. Ta ob-

serwacja także uzasadnia konieczność łączenia różnych strate-

gii terapeutycznych.

BIFIDOBACTERIUM SPP.

Opisane  dotychczas  dwa  rodzaje  mikroorganizmów:  Sal-

monella i Clostridium  są  patogenami  człowieka,  ich  zastoso-

wanie  wiąże  się  więc  z  koniecznością  konstrukcji  szczepów 

atenuowanych, ale nadal zachowujących tropizm wobec ko-

mórek nowotworowych. Problem ten nie dotyczy bakterii ro-

dzaju Bifidobacterium, gramdodatniego, niesporującego beztle-

nowego  mikroorganizmu  naturalnie  występującego  w  prze-

wodzie pokarmowym człowieka i innych ssaków. Zaliczany 

jest  on  do  probiotyków  oraz  do  grupy  bakterii  GRAS  (ang. 

Generalny Regarded As Safe), jednocześnie wykazując zdolność 

do  kolonizacji  guzów  nowotworowych,  co  czyni  ten  mikro-

organizm potencjalnie bezpieczniejszym wektorem w terapii 

antyrakowej.  Aby  zbadać  faktyczne  powinowactwo  bakterii 

do guzów nowotworowych, liofilizat Bifidobacterium wstrzyk-

nięto myszom z rakiem Ehrlicha (rak jelita grubego i odbytu) i 

badano przeżywalność oraz proliferację bakterii, wstrzykując 

dootrzewnowo laktulozę, cukrowy substrat metabolizowany 

przez ten mikroorganizm, ale nie przez komórki ssaków. Do-

żylne podanie laktulozy zwiększyło tempo wzrostu i poziom 

przeżywalności bakterii, których znacząca liczba lokalizowa-

na była w obrębie guza, potwierdzając w ten sposób zdolność 

Bifidobacterium do preferencyjnego kolonizowania guzów. Po-

nieważ  zastosowanie  Bifidobacterium  nie  przyniosło  spodzie-

wanych efektów antynowotworowych, w przeciwieństwie do 

opisanych uprzednio onkolitycznych właściwości związanych 

z podaniem bakterii z rodzaju Salmonella oraz Clostridium, ko-

lejne badania skupiły się na ocenie potencjalnego zastosowa-

nia Bifidobacterium do dostarczania odpowiednich genów efek-

torowych do guzów. W tym celu Yazawa i wsp. sklonowali na 

plazmidzie gen warunkujący oporność na spektynomycynę. 

Transformowane  nim  bakterie  B. longum  wprowadzono  do 

mysich komórek czerniaka (B16-F10) oraz raka płuc Lewis´a. 

Kolonie bakteryjne oporne na spektynomycynę wyizolowano 

jedynie z komórek rakowych, co udokumentowało że bakte-

rie są zdolne do dostarczenia kodowanych na plazmidzie ge-

nów efektorowych i potencjalnie mogą znaleźć zastosowanie 

w terapii antynowotworowej [22]. Trzeba jednak podkreślić, 

że poziom kolonizacji guzów przez mikroorganizmy rodzaju 

Bifidobacterium  jest  niższy  niż  ten  udokumentowany  dla  mi-

kroorganizmów rodzaju Salmonella i Clostridium. Dodatkowo 

zauważono,  że  mikroorganizmy  rodzaju  Bifidobacterium  nie 

rozprzestrzeniają  się  intensywnie  w  obrębie  guza,  co  może 

ograniczać zakres działania genu efektorowego. Ponadto, bak-

terie z rodzaju Bifidobacterium nie wytwarzają spor, co czyni je 

bardziej wrażliwymi na zmienne warunki, a w związku z tym 

nieco trudniejsze w hodowli i przechowywaniu [4].

ZASTOSOWANIE BAKTERII JAKO WEKTORÓW 

DOSTARCZAJĄCYCH GENY CYTOTOKSYCZNE

Zastosowanie  bakterii  z  rodzaju  Bifidobacterium,  Clostri-

dium  i  Salmonella  jako  żywego  wektora  do  dostarczania 

genów bezpośrednio indukujących śmierć komórek nowo-

tworowych polega na wprowadzeniu genów należących do 

dwóch głównych kategorii, genów pro-apoptotycznych lub 

Postępy Biochemii 58 (3) 2012 

317

tzw.  genów samobójczych (ang.  suicide genes).  Badanych i 

opisanych przykładów wykorzystania bakterii w terapiach 

samobójczych jest wiele, opierają się one jednak na podob-

nym schemacie tzw. systemie prolek — enzym. Zdecydo-

waną większość badań wykonano z użyciem atenuowanego 

szczepu S. enterica VNP20009 lub jego pochodnych stosowa-

nych jako nośniki odpowiednich genów. Szczep VNP20009 

wykazuje wysoką zdolność do kolonizacji guzów przy jed-

noczesnej stosunkowo niskiej toksyczności. Po raz pierwszy 

antynowotworowe właściwości tego szczepu udokumento-

wali w 1997 roku Pawelek i wsp., rozpoczynając serię badań 

z wykorzystaniem rożnych genów efektorowych i różnych 

pochodnych tego szczepu [13,23].

Chociaż  bakterie  nie  mogą  przeprowadzać  niektórych 

ssaczych potranslacyjnych modyfikacji białek, jest wiele pro-

tein efektorowych, które nie wymagają takich modyfikacji i 

potencjalnie mogą być skuteczne w genowych terapiach an-

tynowotworowych. Należy do nich np. kinaza tymidynowa 

wirusa opryszczki (HSV-TK). Dostarczenie przez S. enterica 

sv.  Typhimurium  plazmidu  z  genem  kodującym  HSV-TK 

wraz z aplikacją proleku gancyklowiru, analogu nukleozy-

dów, aktywowanego przez ten enzym, prowadziło do znacz-

nego zmniejszenia rozmiaru guzów. Spowodowane było to 

aktywacją proleku do jego chemioterapeutycznej formy po-

przez enzym kodowany przez gen dostarczony na wektorze 

bakteryjnym [24]. Innym przykładem o podobnym mechani-

zmie była konstrukcja plazmidu zawierającego gen kodują-

cy ePNP (fosforylaza nukleozydów purynowych Escherichia 

coli) wyrażany z silnego promotora CMV (ang. cytomegalovi-

rus). Plazmidem tym stransformowano atenuowany szczep 

S. enterica sv. Typhimurium i przebadano efekt jego aplikacji 

wraz z MePdR (2-deoksyryboza 6-metylopurynowa). Enzym 

ePNP powodował konwersję nietoksycznego proleku w wy-

soce toksyczną 6-metylopurynę (6-MeP) [25]. MeP ma wła-

ściwości cytotoksyczne i antyproliferacyjne, co prowadzi do 

śmierci komórek w wyniku ich spontanicznej apoptozy. W 

doświadczeniach in vivo, przeprowadzonych na myszach z 

rakiem trzustki, obserwowano znaczącą regresję guza, nawet 

w przypadku guzów dużych rozmiarów, w wielu przypad-

kach prowadzącą nawet do całkowitego zaniku guza. Dzia-

łaniu temu towarzyszyły jednak silne efekty uboczne. Dalsze 

badania i ewentualne ulepszanie tego systemu daje jednak 

duże szanse opracowania skutecznej terapii dla pacjentów z 

rakiem trzustki, którego leczenie jak do tej pory jest bardzo 

mało skuteczne [26]. System ePNP/MePdR w wielu ekspery-

mentach stanowił efektywną strategię typu gen samobójczy/

prolek. Udokumentowano znaczącą jego antyrakową aktyw-

ność w przypadku raka jajnika, glejaka, czerniaka, raka pro-

staty,  trzustki,  wątroby  i  pęcherza.  W  kolejnych  badaniach 

stosowano również system ePNP/MoPdR (2′-deoksyryboza 

6-metoksypurynowa), w wyniku działania którego zamiast 

metylopuryny  powstaje  metoksypuryna,  indukująca  rów-

nież spontaniczną apoptozę komórek [25]. Jest możliwe, że 

jednoczesna obecność komórek ulegających apoptozie, bak-

teryjnych produktów jak np. lipopolisacharydy oraz bakte-

ryjnego DNA, mogłaby działać jako sygnał o niebezpieczeń-

stwie dla infiltrujących komórek układu odpornościowego. 

Lokalna  obfitość  tych  sygnałów,  związana  z  fagocytozą 

martwych komórek rakowych przez makrofagi, ze sporym 

prawdopodobieństwem jest zdolna zainicjować odpowiedź 

immunologiczną wobec specyficznych rakowych antygenów 

i zwiększyć spontaniczną apoptozę komórek guza.

W  celu  zwiększenia  efektu  terapeutycznego  szczepu 

VNP20009, skonstruowano jego pochodną, szczep TAPET-CD 

niosący  gen  E. coli  kodujący  deaminazę  cytozyny  (CD),  en-

zym warunkujący konwersję nietoksycznej 5-fluorocytozyny 

(5-FC) w 5-fluorouracyl (5-FU), fluorową pochodną uracylu, 

mającą  działanie  cytostatyczne.  Działanie  antynowotworo-

we 5-FU polega na inhibicji syntazy tymidylanowej, enzymu 

odpowiedzialnego  za  biosyntezę  monofosforanu  tymidyny 

(TMP).  Niski  poziom  TMP  powoduje  zakłócenia  replikacji 

DNA oraz zahamowanie proliferacji komórek rakowych [27]. 

Po pozytywnych wynikach otrzymanych na modelu mysim, 

we wstępnych badaniach klinicznych z wykorzystaniem TA-

PET-CD, trzem pacjentom zaaplikowano badany preparat bez-

pośrednio do guza po czym podano im 5-FC. Pomimo zaob-

serwowania u dwu pacjentów kolonizacji guza przez mikroor-

ganizmy przez okres 15 dni oraz przekształcenia 5-FC w 5-FU 

ta strategia nie wykazała znaczących efektów terapeutycznych 

[28].  Natomiast  obiecujące  wyniki  otrzymano  w  badaniach 

z zastosowaniem pochodnej szczepu VNP20009 niosącej gen 

kodujący karboksypeptydazę G2 (CG2), gdy rekombinowane 

bakterie  dostarczane  były  wraz  z  prolekiem.  CG2  katalizuje 

przekształcenie  zastosowanego  proleku  w  silnie  reaktywne 

związki alkilujące, które penetrują do wnętrza komórki uszka-

dzając DNA i powodując śmierć komórek nowotworowych, 

nie wpływając ujemnie na wzrost bakterii i ich dalsze powie-

lanie. Zarówno w badaniach in vitro z użyciem ludzkich linii 

nowotworowych, jak i in vivo na modelu mysim odnotowano 

znaczny efekt onkolityczny i redukcję wzrostu guza [29].

Aby zapewnić lepszą kontrolę oraz dodatkowo zwiększyć 

antyrakowe właściwości wprowadzanych genów, rozpoczęto 

badania nad systemem regulacji ich ekspresji. W doświadcze-

niach dotyczących „wewnątrzguzowej” indukcji genów użyto 

dwóch systemów promotor/gen reporterowy. W pierwszym 

z nich zastosowano komórki rodzaju Salmonella niosące gen 

lucyferazy wyrażany z promotora wrażliwego na tetracykli-

nę [30]. Po dożylnym podaniu myszom anhydrotetracykliny 

obserwowano  produkcję  lucyferazy  w  komórkach  nowo-

tworu, gdzie preferencyjnie lokalizowały się bakterie niosące 

plazmid z genem reporterowym [9]. W drugim z badanych 

systemów sklonowany w komórkach Salmonella gen kodujący 

kolicynę E3 znajdował się pod kontrolą promotora zależnego 

od sygnałów naprawy DNA, SOS. Kolicyna E3 hamuje pro-

liferację  komórek  nowotworowych;  natomiast  zastosowany 

promotor  warunkuje  ekspresję  kontrolowanych  przez  niego 

genów w odpowiedzi na uszkodzenia DNA. W tych doświad-

czeniach obserwowano produkcję kolicyny wewnątrz guza po 

dootrzewnowej iniekcji mitomycyny C lub po potraktowaniu 

promieniowaniem  X  powodującym  uszkodzenia  DNA  i  in-

dukcję ekspresji z promotora wrażliwego na SOS. Dodatkowe 

badania dotyczące mutantów recN wykazały ich zwiększoną 

wrażliwość  na  indukcję  produkcji  wewnątrz  guza  kolicyny 

eksprymowanej pod kontrolą analizowanego promotora [9]. 

Zastosowanie  indukowalnych  promotorów  umożliwiłoby 

precyzyjną kontrolę ekspresji genów o właściwościach anty-

nowotworowych pozwalając np. na „włączenie“ ekspresji w 

momencie, gdy znacząca liczba bakterii dotarłaby już do guza, 

wywołując silniejszy efekt przy minimalizacji działania genu 

efektorowego poza obszarem nowotworu.

318

 www.postepybiochemii.pl

Przykładem  zastosowania  bakterii  do  indukcji  specyficz-

nej  dla  nowotworu  apoptozy  pod  kontrolą  indukowalnego 

promotora jest wykorzystanie szczepu Salmonella VNP20009 

eksprymującego TRAIL pod kontrolą prokariotycznego pro-

motora genu recA. Zewnątrzkomórkowa domena związanego 

z  TNF  ligandu  indukującego  apoptozę  (TRAIL)  jest  silnym 

induktorem apoptozy w komórkach nowotworowych, o mi-

nimalnej  toksyczności  wobec  komórek  zdrowych.  Promotor 

genu recA prokariotów uczestniczy w odpowiedzi SOS „włą-

czanej” w wyniku uszkodzeń DNA. Zaindukowana promie-

niowaniem gamma ekspresja genu kodującego TRAIL z pro-

motora recA z wprowadzonego przez szczep VNP20009 wek-

tora wywołała redukcję guzów u myszy [31]. Podobne wyniki 

otrzymano z zastosowaniem B. longum [32].

Od niedawna rozwój inżynierii genetycznej umożliwił kon-

struowanie rekombinowanych szczepów bakterii rodzaju Clo-

stridium. Jeden z głównych systemów prolek/enzym opiera-

jący się na zastosowaniu Clostridium spp. jako wektora wyko-

rzystuje deaminazę cytozynową (CD) E. coli. Gen kodujący CD 

sklonowano na wektorze Clostridium beijerincki pod kontrolą 

silnego promotora, uzyskując wysoki poziom ekspresji genu 

kodującego ten enzym w komórkach rakowych, co prowadzi-

ło do uszkodzeń DNA i RNA w wyniku aktywacji 5-FU. Inną 

strategią  wykorzystującą  jako  wektor  Clostridium beijerinckii 

jest system nitroreduktaza/CB1954 — nitroreduktaza (NTR) 

E. coli. NTR metabolizuje CB1954 (5-azyrydynylo-2,4-dinitro-

benzamid) w silnie alkilujący czynnik prowadzący do powsta-

nia „cross-links” w DNA, co doprowadza do śmierci komór-

ki. Chociaż badane układy ekspresyjne wykazały aktywność 

obu systemów in vitro, to efekt terapeutyczny w badaniach na 

zwierzętach nie był wystarczający. Było to prawdopodobnie 

spowodowane niskim poziomem kolonizacji guzów in vivo. W 

początkowych  badaniach  stosowano  szczepy  sacharolitycz-

ne, które kolonizują guzy z częstością 1000 krotnie niższą niż 

szczepy proteolityczne [4]. W 2006 roku opracowano metody-

kę  manipulacji  materiałem  genetycznym  szczepów  proteoli-

tycznych takich jak np. C. novyi-NT, którego możliwość zasto-

sowania w terapiach antynowotworowych jest w trakcie ba-

dań klinicznych [21,33]. Analogicznie do opisanych powyżej 

doświadczeń z zastosowaniem 5-FC lub NTR, znacznie lepszy 

efekt  antynowotworowy  uzyskano  w  przypadku  szczepów 

proteolitycznych  w  porównaniu  do  uprzednio  stosowanych 

szczepów sacharolitycznych [4].

Podobne  badania,  choć  nie  tak  intensywne  jak  w  od-

niesieniu  do Salmonella i Clostridium  były  prowadzone  z 

użyciem  mikroorganizmów  rodzaju  Bifidobacterium.  Skon-

struowano  szczepy  B.  longum i B. breve  eksprymujące  de-

aminazę cytozyny CD. Dożylne wstrzyknięcie tych bakterii 

wraz z jednoczesnym podaniem proleku 5-FC skutkowało 

aktywacją proleku do jego aktywnej formy w rejonach guza 

[34,35]. Opisana już powyżej na przykładzie Salmonella te-

rapia  z  użyciem  kinazy  tymidynowej  wirusa  opryszczki 

(HSV-TK)  w  połączeniu  z  aplikacją  gancyklowiru  (HSV-

-TK/GCV)  okazała  się  również  efektywna  w  przypadku 

użycia Bifidobacterium infantis jako żywego wektora. Bakte-

rie niosące gen kodujący kinazę tymidynową wstrzyknięto 

szczurom  z  nowotworem  pęcherza  moczowego,  podając 

jednocześnie gancyklowir. Skutkiem tego było zahamowa-

nie wzrostu guza oraz apoptoza komórek nowotworowych, 

prawdopodobnie w wyniku zwiększonej ekspresji genu ko-

dującego kaspazę 3 [34].

ZASTOSOWANIE MIKROORGANIZMÓW  

W CELU MODULACJI ANTYNOWOTWOROWEJ 

AKTYWNOŚCI UKŁADU ODPORNOŚCIOWEGO

Układ odpornościowy ma za zadanie ochronę organizmu 

przed  chorobami,  identyfikację  i  likwidację  czynników  in-

fekcyjnych  oraz  komórek  nowotworowych.  W  celu  jego 

prawidłowego działania niezbędne jest rozróżnienie między 

patogenami  bądź  tkankami  nowotworowymi  a  zdrowymi 

komórkami  i  tkankami.  Cechą  charakterystyczną  systemu 

odpornościowego  jest  tolerancja  dla  protein  niskoimmu-

nogennych,  do  których  należą  m.in.  białka  nowotworowe. 

Dlatego też jednym z głównych celów w terapii antyrakowej 

jest złamanie tej tolerancji i podwyższenie poziomu odpow-

iedzi  odpornościowej  wobec  komórek  nowotworowych. 

Obiecujące  wyniki  uzyskano  wykorzystując  do  tego  celu 

bakterie jako nośniki szczepionek DNA.

Szczepionki DNA to bakteryjne plazmidy, które zostały tak 

skonstruowane, aby specyficzny antygen ulegał ekspresj pod 

kontrolą eukariotycznego promotora, co pozwala na ekspre-

sję heterologicznych genów w komórkach ssaczych. Plazmid 

stosowany  jako  szczepionka  DNA  zawiera  ponadto  termi-

nator  warunkujący  zakończenie  transkrypcji  genu,  obszary 

DNA warunkujące replikację plazmidu oraz marker selekcyj-

ny  ułatwiający  produkcję  plazmidów  w  transformowanych 

bakteriach. Poza kodowaniem jednego lub kilku antygenów, 

szczepionki  te  mogą  również  zawierać  geny,  których  pro-

dukty charakteryzują się działaniem immunostymulacyjnym 

bądź immunomodulacyjnym. Szczepionki DNA podawane są 

m.in. domięśniowo lub podskórnie, bądź też obcy plazmido-

wy DNA może być dostarczany do organizmu uodparniane-

go przez odpowiednie szczepy bakteryjne. Kodowany na pla-

zmidzie antygen jest produkowany w komórkach gospodarza 

głównie w profesjonalnych komórkach prezentujących anty-

gen (APCs), co prowadzi do stymulacji odpowiedzi odporno-

ściowej, przede wszystkim do pobudzenia naiwnych limfocy-

tów T CD8+ poprzez prezentację antygenu eksprymowanego 

wewnątrz komórki przy udziale MHC klasy I. Rozpoznanie 

to prowadzi do pobudzenia funkcji efektorowych limfocytów 

T CD8+, a w konsekwencji do produkcji cytotoksycznych czą-

steczek w celu lizy eksprymujących dany antygen komórek, 

jak również do stymulacji sekrecji cytokin, które wpływają na 

poziom transkrypcji wielu genów w docelowych komórkach 

oraz rekrutują inne komórki układu odpornościowego. Biorą 

one także udział w procesie apoptozy poprzez oddziaływanie 

Fas-Fas ligand [36-38]. Dodatkowo, jako że wykorzystywane 

bakteryjne plazmidy DNA zawierają niemetylowane motywy 

CpG  podanie  tego  typu  preparatu  prowadzi  do  stymulacji 

wrodzonego  układu  odpornościowego  poprzez  interakcję  z 

receptorami TLR 9 (ang. Toll-like receptor 9) [36,39].

W ostatnich latach badania dotyczące zastosowania szcze-

pionek  DNA  w  walce  z  rakiem  nabrały  nowego  wymiaru 

ponieważ  dowiedziono,  że  wiele  komórek  nowotworowych 

koduje  tzw.

 

antygeny  związane  z  nowotworem  (TAA,  ang. 

tumor associated antigens), zdolne do indukcji długotrwałej od-

porności. Do tej pory zidentyfikowanych zostało już wiele spe-

cyficznych dla ludzkich nowotworów antygenów, będących 

Postępy Biochemii 58 (3) 2012 

319

celem działania dla limfocytów T  CD8+. Pierwszym z nich był 

antygen MAGE-1 (ang. Melanoma Antigen 1). Pośród zidentyfi-

kowanych antygenów jest wiele obiecujących kandydatów do 

zastosowania  jako  cele  w  immunoterapii  raka.  Dostarczenie 

szczepionek  DNA  kodujących  nowotworowy  antygen  bądź 

jego  epitopy  działało  skutecznie  w  doświadczeniach  wyko-

nywanych  na  modelach  zwierzęcych  i  dotyczących  terapii 

różnych rodzajów nowotworów, takich jak czerniak, nerwiak 

płodowy i wielu gruczolakorakach. Efektywną ochronę zaob-

serwowano m.in. w przypadku fuzji epitopu gp100 (antygen 

związany z czerniakiem) i TRP2 (ang. tyrosine-related protein-2) 

z ubikwityną; połączeniu epitopu hydroksylazy tyrozynowej 

z ubikwityną czy też immunizacji przy użyciu antygenu PSA 

(ang. prostate-specific antygen) [3,38].

Badania przeprowadzone na modelu mysim z implantowa-

nymi  guzami  dostarczyły  przekonywujących  dowodów  do-

kumentujących zdolność limfocytów T CD8+ do odrzucenia 

nowotworu.  Ponadto,  udowodniono,  że  otrzymanie  in vitro 

autologicznych, specyficznych wobec antygenu/ów komórek 

nowotworowych limfocytów T CD8+, a następnie podanie ich 

pacjentom, w wielu przypadkach prowadziło do regresji guza. 

Jednak  wiele  badań,  przeprowadzonych  m.in.  przez  Conry-

’ego i wsp. pokazało, że domięśniowe bądź podskórne poda-

nie  „nagich”  plazmidowych  szczepionek  wywoływało  jedy-

nie  słabą  odpowiedź  u  pacjentów  z  chorobą  nowotworową 

[40,41]. Konieczne stało się wiec poszukiwanie sposobów po-

wodujących zwiększenie immunogenności tych szczepionek. 

Dwie główne strategie stosowane w tym celu obejmują mo-

dyfikację sposobu podania preparatu (zastosowanie szczepów 

bakteryjnych jako nośników) oraz zastosowanie adiuwantów, 

substancji  modulujących  odpowiedź  immunologiczną  lub 

wręcz pozwalających na jej wywołanie. Dzięki zastosowaniu 

tych preparatów odpowiedź odpornościowa może zostać za-

indukowana  nawet  wobec  antygenów,  które  normalnie  nie 

są  „zauważane”  przez  układ  odpornościowy.  Niewątpliwą 

zaletą szczepionek zawierających plazmidowy DNA jest ich 

stosunkowa łatwość wytwarzania oraz potwierdzone w wielu 

badaniach bezpieczeństwo. Obecnie wiele z tych produktów 

znajduje się w później fazie testów klinicznych [1,42-44].

LBV — ATENUOWANE BAKTERIE JAKO 

WEKTORY SZCZEPIONEK DNA W GENOWEJ 

TERAPII ANTYNOWOTWOROWEJ

Najbardziej  obiecującym  sposobem  wprowadzenia  pla-

zmidów eksprymujących eukariotyczny antygen (szczepionki 

DNA) w celu indukcji skutecznej odpowiedzi immunologicz-

nej wobec komórek nowotworowych jest użycie szczepionek 

wykorzystujących  atenuowane  wewnątrzkomórkowe  bakte-

rie jako żywe wektory do ich dostarczenia. Mikroorganizmy 

stosowane są zarówno do dostarczania specyficznych dla no-

wotworu antygenów, antygenów blokujących procesy angio-

genezy, jak również jako nośniki dostarczające substancje mo-

dulujące  układ  odpornościowy,  głównie  interleukinę  2.  Od-

powiedź generowana przez LBV (ang. attenuated live bacterial 

vaccine) skierowana jest nie tylko przeciwko heterologicznemu 

antygenowi, ale także przeciwko antygenom użytego jako no-

śnik patogenu. Wykorzystanie niektórych mikroorganizmów 

umożliwia dostarczenie antygenu poprzez powierzchnię ślu-

zówki jelit do komórek APCs. Stosowane są w tym celu szcze-

py atenuowanych zarówno gramdodatnich, jak i gramujem-

nych mikroorganizmów. W badaniach in vitro potwierdzono 

zdolność tych bakterii do dostarczania szczepionek DNA do 

komórek ludzkich, a in vivo skuteczność tego procesu zwery-

fikowano w doświadczeniach wykonanych na modelach my-

sich z różnymi rodzajami nowotworów. Od lat prowadzone 

są testy kliniczne mające na celu ocenę bezpieczeństwa, sku-

teczności oraz immunogenności wybranych szczepów bakte-

ryjnych. Strategia LBV

 

wykorzystuje drogę administracji imi-

tującą naturalną infekcję patogenem, co może prowadzić do 

długotrwałej humoralnej i komórkowej odpowiedzi zarówno 

lokalnej w obrębie śluzówki, jak i ogólnoustrojowej. Ponadto, 

podanie preparatu tą drogą powoduje mniej efektów ubocz-

nych, a w wielu przypadkach jest też tańsze [38].

Najczęściej  stosowane  w  badaniach  szczepy  wykorzysty-

wane jako żywe wektory to atenuowane mutanty Salmonella 

enterica sv. Typhimurium i sv. Typhi. S. enterica sv. Typhi jest 

zdolna do przeżycia i replikacji we wnętrzu wakuoli komórek 

APCs, takich jak komórki dendrytyczne i makrofagi. Szczep 

Ty21a  (atenuowany  mutant  S. enterica  sv.  Typhi  Ty2)  stoso-

wany  jest  jako  szczepionka  przeciwko  durowi  brzusznemu. 

Szczep  ten  otrzymano  w  wyniku  mutagenezy  chemicznej, 

prowadzącej  do  powstania  wielu  nieodwracalnych  mutacji, 

skutkujących m.in. wrażliwością na galaktozę (mutacja w ge-

nie galE), auksotrofią pod względem izoleucyny i waliny (gen 

ilvD), brakiem otoczki polisacharydowej (gen via) i redukcją 

oporności  na  stres  (gen  rpoS).  Nie  odnotowano  rewersji  ko-

mórek do typu dzikiego ani w warunkach in vitro ani in vivo, 

otrzymany szczep jest genetycznie stabilny [45, 46]. Problemem 

związanym z zastosowaniem S. enterica Ty21a jest konieczność 

aplikacji wielu dawek w celu wywołania odpowiedzi o cha-

rakterze ochronnym. Dlatego też prowadzone doświadczenia 

mają  na  celu  konstrukcję  szczepu  zdolnego  do  wywołania 

skutecznej odporności po zastosowaniu pojedynczej doustnej 

immunizacji. Wśród intensywnie badanych wymienić należy 

szczep CVD908, posiadający delecje w genach aroC i aroD (wy-

wołuje to auksotrofię w stosunku do aminokwasów aroma-

tycznych) oraz szczep CVD908-htrA

-

 z usuniętym dodatkowo 

genem htrA, kodującym peryplazmatyczną proteazę seryno-

wą odpowiedzialną za degradację nieprawidłowo zwiniętych 

białek  powstających  w  warunkach  stresowych.  Mutacja  ta 

upośledza więc odpowiedź bakterii m.in na stres oksydacyj-

ny, a w związku z tym, także zdolność do przeżycia wewnątrz 

makrofagów.  Mutacje  w  genach  aroC i aroD  limitują  wzrost 

bakterii, jako że w ssaczych tkankach wymagane aromatyczne 

substraty znajdują się w niewystarczających do normalnego 

wzrostu ilościach. Oba atenuowane szczepy S. enterica Ty21a 

okazały  się  silnie  immunogenne  już  po  doustnym  podaniu 

jednej dawki. Szczep CVD908, pomimo że był dobrze tolero-

wany, przedostawał się do krwiobiegu pacjentów po podaniu 

stosunkowo dużej dawki, dlatego też jego dalsze wykorzysta-

nie w terapii okazało się niemożliwe. W przeciwieństwie do 

CVD908, nie odnotowano obecności szczepu CVD908-htrA w 

krwiobiegu, dlatego uważany jest on za bezpieczny [44,47].

Innym szczepem S. enterica sv. Typhi badanym pod wzglę-

dem  użyteczności  w  zastosowaniu  jako  LBV  jest  m.in.  ZH9 

posiadający mutacje w genach aroC i ssvA (gen kodujący pro-

teinę biorącą udział w sekrecji białek w systemie sekrecyjnym 

typu III SPI2). Szczep ten jest silnie immunogenny, a zarazem 

bezpieczny w fazie II testów klinicznych; jego aplikacja skut-

kowała  wywołaniem  wysokiego  poziomu  odpowiedzi  od-

320

 www.postepybiochemii.pl

pornościowej humoralnej, komórkowej i związanej z błonami 

śluzowymi [48]. Innym przykładem jest pochodzący od Ty2 

szczep Ty800, posiadający dodatkowo delecje w genach ukła-

du dwuskładnikowego phoP-phoQ, odpowiedzialnym za kon-

trolę przeżycia bakterii w fagosomie. W badaniach klinicznych 

w fazie I był dobrze tolerowany i silnie immunogenny [38].

W badaniach nad zastosowaniem mikroorganizmów jako 

LBV wykorzystuje się również mutanty Shigella spp. oraz Li-

steria monocytogenes. Bakterie te po wydostaniu się z fagosomu 

do cytoplazmy komórki gospodarza replikują się w niej, a na-

stępnie mogą się rozprzestrzeniać do sąsiadujących komórek. 

Unikalna zdolność tych bakterii do przedostania się do cyto-

zolu czyni je potencjalnie idealnym wektorem do dostarczania 

specyficznych antygenów do komórek APC. Eksprymowane 

w  cytoplazmie  antygeny  prezentowane  są  głównie  z  udzia-

łem MHC klasy I, jednocześnie znaczna część bakterii pozo-

staje uwięziona w fagosomie, a produkowane przez nie białka 

prezentowane są na powierzchni komórki za pomocą MHC 

klasy II, co skutkuje silniejszą odpowiedzią przeciwko anty-

genowi  [49,50].  W  badaniach  przedklinicznych  na  małpach 

zastosowanie pierwszych badanych mutantów Shigella, zawie-

rających jedynie mutacje w genach aro przyniosło obiecujące 

wyniki,  w  badaniach  na  ochotnikach  wyniki  te  były  jednak 

mniej przekonujące. Mutanty aro były zbyt słabo atenuowane 

i niezbędne okazało się wprowadzenie dodatkowych mutacji 

w celu zwiększenia bezpieczeństwa preparatu. Szczep Shigella 

flexneri SC602, pozbawiony genu virG oraz iucA-iut, chromoso-

mowego locus zaangażowanego w proces syntezy sideroforu 

(aerobaktyny)  utracił  zdolność  do  poruszania  się  wewnątrz 

komórki, a także przedostawania się do sąsiednich komórek 

nabłonka jelitowego. Pomimo zachęcających wyników otrzy-

manych w badaniach przedklinicznych, szczep ten okazał się 

nieprzydatny w testach klinicznych. Inny otrzymany szczep 

Shigella, szczep CVD1208, w pierwszej fazie badań klinicznych 

był  dobrze  tolerowany  przy  jednoczesnej  stosunkowo  silnej 

immunogenności. Posiada on mutację w operonie guaBA, cze-

go skutkiem jest defekt syntezy nukleotydów guaninowych. 

Dodatkowo  mutant  ten  pozbawiony  jest  genów  kodujących 

enterotoksyny 1 i 2, co podwyższa poziom jego bezpieczeń-

stwa w zastosowaniu jako LBV [38].

Jednym z ostatnio badanych szczepów L. monocytogenes był 

podwójny mutant Lm z usuniętymi genami actA i plcB. Białko 

ActA odpowiada za zdolność bakterii do ruchu wewnątrz ko-

mórki eukariotycznej i wraz z fosfolipazą C, kodowaną przez 

plcB, uczestniczy w przemieszczaniu się bakterii do innych ko-

mórek. Fosfolipaza C bierze dodatkowo udział w lizie waku-

oli w komórce gospodarza. W badaniach na myszach szczep 

Lm actA

-

 plcB

-

 okazał się bezpieczny, a jednocześnie jego po-

danie prowadziło do wywołania odpowiedzi immunologicz-

nej zależnej od cytotoksycznych limfocyów T (CD8+) [51]. U 

ochotników, których w trakcie fazy I testów klinicznych im-

munizowano przy użyciu tego zmutowanego szczepu odno-

towano  specyficzną  wobec  Listeria  odpowiedź  odpornościo-

wą. Jednocześnie u kilku pacjentów zaobserwowano jednak 

zaburzenia w funkcjonowaniu wątroby, które związane mo-

gły być ze szczepieniem [52]. Niezbędne jest przeprowadzenie 

dalszych badań w celu oszacowania przydatności tego szcze-

pu w terapiach. Innym potencjalnie interesującym szczepem 

jest L. monocytogenes actA

- 

inlB

-

 z usuniętym genem kodującym 

internalinę, białko ułatwiające wniknięcie bakterii do wnętrza 

komórek niefagocytujących. Delecja w genie internaliny miała 

więc na celu obniżenie toksyczności wobec komórek niefago-

cytujących, takich jak hepatocyty. Szczep ten w badaniach na 

myszach okazał się bezpieczny, a zarazem immunogenny [53].

MIKROORGANIZMY JAKO NOŚNIKI SPECYFICZNYCH 

DLA NOWOTWORU ANTYGENÓW ORAZ BIAŁEK 

BLOKUJĄCYCH PROCESY ANGIOGENEZY

Szczepionki DNA mają na celu złamanie tolerancji na ni-

skoimmunogenne białka eksprymowane na powierzchni ko-

mórek nowotworowych. Odkrycie istnienia antygenów specy-

ficznych dla różnych rodzajów nowotworów wraz z postępem 

w użyciu żywych bakterii jako nośników genów eukariotycz-

nych zapoczątkowało nową erę w badaniach nad leczeniem 

nowotworów. Prowadzone w ostatnich latach doświadczenia 

nad  zastosowaniem  bakterii  jako  wektorów  do  dostarcza-

nia  antygenów  specyficznych  dla  nowotworów  przyniosły 

obiecujące wyniki. Białko NY-ESO-1 często występuje na po-

wierzchni komórek nowotworowych, nie jest natomiast odnaj-

dywane na powierzchni normalnych komórek somatycznych. 

Białko to jest silnie immunogennym antygenem, jednak w wie-

lu nowotworach jego obecność jest różna i w przypadku czer-

niaka, raka prostaty, płuc czy jajnika NY-ESO-1 eksprymowa-

ne jest w około 20–40% nowotworów. Rekombinowany szczep 

S. enterica sv.  Typhimurium  produkujący  NY-ESO-1  został 

skonstruowany tak, aby umożliwić dostarczenie tego antyge-

nu do cytoplazmy APCs poprzez system sekrecji typu III. Po-

danie tak skonstruowanego szczepu myszom z nowotworem, 

w którym NY-ESO-1 był syntetyzowany, wywoływało odpo-

wiedź odpornościową i regresję guza. W trakcie nowatorskich 

badań skonstruowano rekombinowany szczep S. enterica sv. 

Typhimurium  SL3261,  w  którym  nukleotydowe  sekwencje 

kodujące epitopy antygenu NY-ESO-1 wklonowane zostały w 

nukleotydową sekwencję genu kodującego jedno z białek two-

rzących fimbrie. Fimbrie występują na powierzchni wielu pa-

togennych bakterii i posiadają zdolność do prezentowania ob-

cych antygenów. Doustne podanie rekombinowanego szcze-

pu SL3261 transgenicznym myszom wywoływało pobudzenie 

specyficznej wobec eksprymowanego epitopu cytotoksycznej 

odpowiedzi T-komórkowej [54]. Obiecujące wyniki otrzyma-

no też w przypadku zastosowania rekombinowanej S. enteri-

ca sv. Typhimurium eksprymującej różne antygeny: antygen 

gp100 (antygen związany z czerniakiem) połączony z częścią 

stałą łańcucha przeciwciała [38] antygen HPV16L1 związany 

z nowotworem szyjki macicy [55] czy śródbłonkowy marker 

nowotworowy TEM8 (ang. tumor endothelial marker 8) [49].

Pierwsze obiecujące badania nad użyciem żywych bakte-

rii Listeria monocytogenes do dostarczenia antygenów zwią-

zanych  z  nowotworami  opublikowane  zostały  w  latach 

dziewięćdziesiątych, od tego czasu L. monocytogenes jest jed-

nym z najintensywniej badanych gatunków bakterii dostar-

czających antygeny związane z nowotworem. W ostatnich 

latach  skonstruowano  wiele  atenuowanych  szczepów  L. 

monocytogenes eksprymujących takie antygeny jak HPV-16 

E7, antygen związany z nowotworem szyjki macicy, głowy 

oraz  szyi,  PSA  (prostate  specific  antigen),  antygen  specy-

ficzny dla raka prostaty, związany z czerniakiem antygen 

MAGE czy Her-2/neu, antygen nadeksprymowany w oko-

ło 30% przypadków raka piersi. W badaniach przedklinicz-

nych na modelu mysim szczepy te okazały się wysoce im-

Postępy Biochemii 58 (3) 2012 

321

munogenne, a ich aplikacja powodowała regresję guza, w 

którym dochodziło do ekspresji dostarczonego przez bak-

terie antygenu. W ostatnich latach rekombinowany szczep 

Lm-HPV16  E7  (ADXS11-001)  poddany  został  badaniom 

klinicznym z udziałem pacjentek z zaawansowanym nowo-

tworem szyjki macicy. U 30% badanych pacjentek zaobser-

wowano redukcję rozmiaru guza, u dwóch z nich guzy zo-

stały całkowicie wyleczone [49]. Pomimo dość obiecujących 

wyników, niezbędne jest przeprowadzenie dalszych badań 

w  celu  oszacowania  przydatności  opisanych  szczepów  w 

terapiach. Przewagą L. monocytogenes nad innymi gatunka-

mi bakterii stosowanymi jako wektor do dostarczania an-

tygenów  specyficznych  dla  nowotworu  jest  unikalny  cykl 

życiowy tej bakterii oraz wynikający z tego fakt prezentacji 

eksprymowanego  przez  Listeria  antygenu  zarówno  przy 

udziale MHC klasy I, jak i MHC klasy II, a także zdolność 

do przemieszczania się bakterii do sąsiadujących komórek. 

Cechy te związane są jednak z wysoką wirulencją tego pa-

togenu, stworzenie idealnego wektora wiąże się więc z uzy-

skaniem optymalnego balansu pomiędzy atenuacją a zacho-

waniem tych unikalnych cech jako wektora [56].

Proces  wzrostu  guza  i  powstawania  przerzutów  jest 

silnie  związany  z  procesami  angiogenezy.  Hamowanie 

rozwoju naczyń zaopatrujących guz w tlen i składniki od-

żywcze  może  być  doskonałą  strategią  walki  z  chorobami 

nowotworowymi.  W  pionierskich  badaniach  nad  zastoso-

waniem  bakterii  w  tym  celu,  skonstruowano  szczepionkę 

z użyciem Salmonella niosącą na plazmidzie gen kodujący 

FLK-1 (VEGFR2, ang. vascular endothelial growth factor recep-

tor 2, receptor czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego) 

bądź jedynie epitop/y tego receptora. Doustna aplikacja tej 

szczepionki myszom prowadziła do stymulacji odpowiedzi 

odpornościowej z udziałem limfocytów T CD8+ i prowadzi-

ła do supresji angiogenezy, uniemożliwiając w ten sposób 

dopływ  krwi  do  tkanki  nowotworowej  [57].  Doustne  po-

danie Salmonella eksprymującej FLK-1 myszom z glejakiem 

wywoływało zahamowanie wzrostu guza, redukcję naczyń 

krwionośnych związanych z guzem oraz wydłużenie okre-

su życia zwierząt [58]. FLK-1 odgrywa istotną rolę w roz-

woju i progresji nowotworów płuc. Białko FLK-1 kodowane 

jest przez gen o wielkości 4kb. Im dłuższy gen, tym większe 

ryzyko  pojawienia  się  mutacji.  W  celu  zmniejszenia  ryzy-

ka spontanicznych mutacji oraz uniknięcia pracy z dużym 

białkiem w przeprowadzonych niedawno badaniach z za-

stosowaniem atenuowanego szczepu Salmonella SL3261 na 

wektorze  sklonowano  jedynie  fragment  kodujący  zewną-

trzkomórkową domenę FLK-1. Doustne podanie tego kon-

struktu myszom z nowotworem płuc Lewisa spowodowało 

złamanie tolerancji odpornościowej wobec antygenu FLK-1, 

skutkując zahamowaniem wzrostu guzów oraz zwiększo-

ną przeżywalnością zwierząt doświadczalnych [57]. Innym 

przykładem terapii blokującej proces angiogenezy było do-

starczenie endogliny (CD105), transbłonowej glikoproteiny, 

będącej  receptorem  transformującego  czynnika  wzrostu 

(TGF)-β i ulegającej nadprodukcji w proliferujących komór-

kach  endotelialnych  nowo  utworzonych  naczyń  krwiono-

śnych  nowotworu  piersi.  Jako  wektor  użyty  został  atenu-

owany szczep S. enterica sv. Typhimurium niosący mutację 

w genach aroA i dam. Na modelu mysim zaobserwowano 

silną odpowiedź zależną od limfocytów T CD8+, która efek-

tywnie powstrzymała powstanie przerzutów do płuc [38]. 

Innym endogennym inhibitorem angiogenezy jest trombo-

spondyna 1 (TSP-1), której zdolność do zahamowania wzro-

stu czerniaka oraz przerzutów została już udokumentowa-

na in vitro i in vivo [59]. W badaniach na myszach przepro-

wadzonych przez Lee i wsp. dootrzewnowe wstrzyknięcie 

bakterii gatunku Salmonella choleraesuis niosących plazmid 

kodujący  trombospondynę  1  powodowało  zahamowanie 

wzrostu  i  zmniejszenie  rozmiarów  guzów  (czerniaka),  co 

związane było z redukcją unaczynienia guzów [60]. Dodat-

kowo badano szczepy Bifidobacterium adolescentis i longum z 

plazmidami  zawierającymi  gen  kodujący  endostatynę  (in-

hibitor  procesu  angiogenezy).  Szczepy  (podane  dożylnie) 

docierały wyłącznie do guzów wątroby hamując proces an-

giogenezy i wzrost tych guzów [61,62].

Innym  stosunkowo  nowatorskim  podejściem  w  walce 

z  nowotworami  jest  immunizacja  przeciwko  molekułom 

nadeksprymowanym przez makrofagi związane z guzem, 

które  to  molekuły  stymulują  proliferację  komórek  nowo-

tworowych oraz proces metastazy poprzez sekrecję czynni-

ków wzrostu oraz czynników pro-angiogennych. Leguma-

ina (ang. legumain) jest silnie nadeksprymowana przez ma-

krofagi w tkankach wielu rodzajów nowotworów. Zaszcze-

pienie  myszy  szczepem  S. enterica  sv.  Typhimurium  aroA 

dam kodującym gen legumainy prowadziło do odpowiedzi 

limfocytów T CD8+ przeciwko makrofagom związanym z 

guzem, prowadząc do supresji angiogenezy, zahamowania 

wzrostu guza i zapobiegnięcia powstawania przerzutów w 

wyniku zaburzeń mikrośrodowiska guza [38].

W leczeniu istniejących już guzów oraz zapobieganiu na-

wrotów najefektywniejszą terapią wydaje się połączenie tra-

dycyjnej chemioterapii z immunoterapią. Przykładem takiej 

kombinowanej terapii było doustne zaaplikowanie myszom 

komórek Salmonella będących nośnikiem genu kodującego 

płytkopochodny czynnik wzrostu B, nadeksprymowanego 

w proliferujących endotelialnych komórkach naczyń krwio-

nośnych  guza,  wraz  z  leczeniem  przy  użyciu  cyklofosfa-

midu, szeroko stosowanego leku cytostatycznego. Terapia 

ta  nie  tylko  spowodowała  zahamowanie  wzrostu  wielu 

rodzajów  nowotworów,  ale  także  odrzucenie  guza  (ang. 

tumor rejection) [63]. Jest to jedno z wielu badań potwierdza-

jących zasadność stosowania terapii łączonych w celu uzy-

skania  maksymalnego  efektu  antynowotworowego.  Jed-

nym z głównych problemów tradycyjnej chemioterapii jest 

nabywanie  wielolekowej  oporności  (MDR,  ang.  multidrug 

resistance)  przez  komórki  nowotworowe,  co  uniemożliwia 

kontynuację  konwencjonalnego  leczenia.  Jako  alternatywę 

dla leczenia takich przypadków podjęto próbę wykorzysta-

nia immunoterapii z użyciem bakterii. W celu złamania ob-

wodowej tolerancji limfocytów T, na wektorze obecnym w 

komórkach S. enterica sv. Typhimurium wprowadzono gen 

kodujący  białko  MRP1  (ang.  multidrug resistance-associated 

protein 1). Doustne podanie tej szczepionki myszom, dopro-

wadziło  do  wywołania  specyficznej  wobec  antygenu  od-

powiedzi zależnej od limfocytów T CD8+ i wydłużyło czas 

życia zaszczepionych zwierząt [64]. Tak więc zastosowanie 

bakterii  jako  wektorów  produkujących  odpowiedni  anty-

gen stanowi obiecującą strategię do przełamania tolerancji 

układu odpornościowego wobec antygenów nadeksprymo-

wanych przez komórki nowotworowe, szczególnie jeśli te-

rapia ta łączona jest z tradycyjną chemio- czy radioterapią.

322

 www.postepybiochemii.pl

ZASTOSOWANIE MIKROORGANIZMÓW 

JAKO NOŚNIKÓW GENÓW MODULUJĄCYCH 

AKTYWNOŚĆ UKŁADU ODPORNOŚCIOWEGO

Siła odpowiedzi immunologicznej wobec LBV może ulec 

znacznemu zwiększeniu w wyniku modyfikacji wektorów 

ekspresyjnych,  bądź  przez  koekspresję  immunostymula-

torów. Pośród organizmów, nośników, atenuowane szcze-

py Salmonella okazały się jak do tej pory najatrakcyjniejsze 

i  najskuteczniejsze  zarówno  w  aspekcie  profilaktycznym, 

jak i terapeutycznym. Poza zastosowaniem bakterii rodza-

ju  Salmonella  do  konstrukcji  szczepionek  eksprymujących 

specyficzny dla nowotworu antygen, bakteria ta wykorzy-

stywana  jest  również  w  immunoterapii  raka  jako  nośnik 

dostarczający stymulujące układ odpornościowy cytokiny, 

między innymi ludzki gen kodujący interleukinę 2 (IL-2).

IL-2  to  cytokina  o  wielkości  15  kDa,  produkowana 

przez  zaktywowane  komórki  T  CD4+  oraz  inne  komór-

ki układu odpornościowego. Odgrywa kluczową rolę w 

generacji i regulacji odpowiedzi odpornościowej, dlatego 

też  jest  potencjalnym  czynnikiem  antynowotworowym. 

IL-2  aktywuje  proliferację  limfocytów  i  przyczynia  się 

do  wzmocnienia  cytolitycznych  właściwości  komórek  T 

i NK. Zastosowanie IL-2 w przypadku terapii niektórych 

nowotworów, jak na przykład raka nerki czy czerniaka, 

okazało  się  stosunkowo  skuteczne,  aczkolwiek  zastoso-

wanie wysokich (silnie toksycznych) dawek IL-2 u wie-

lu  pacjentów  objawiało  się  m.in.  gorączką,  obrzękiem, 

gwałtownym spadkiem ciśnienia, żółtaczką i dysfunkcją 

nerek,  w  skrajnych  przypadkach  prowadzącą  do  śmier-

ci  [65].  Dlatego  też  badania  naukowców  skupiły  się  na 

zmniejszeniu  efektów  ubocznych  poprzez  manipulację 

dawką, drogą czy częstością aplikowania; zabiegi te nie 

przyniosły  jednak  początkowo  oczekiwanych  efektów. 

W  nadziei  na  znalezienie  skutecznego  sposobu  lokalne-

go dostarczenia IL-2, w wyniku którego zachowany był-

by  efekt  terapeutyczny  przy  zmniejszeniu  do  minimum 

ogólnej toksyfikacji organizmu, rozpoczęto badania nad 

skonstruowaniem  atenuowanego  szczepu  S.  enterica  sv. 

Typhimurium, w których dochodziło by do lokalnej syn-

tezy IL-2 w rejonach kolonizowanych przez bakterie. Jed-

ne z pierwszych badań z zastosowaniem Salmonella eks-

prymującej IL-2, przeprowadzone przez Sorensona i wsp. 

dotyczyły  nieoperowalnego  raka  wątroby,  dla  którego 

nieznana  jest  obecnie  skuteczna  terapia;  nowotwór  ten 

wiąże  się  z  bardzo  złymi  rokowaniami.  Skonstruowano 

atenuowany  szczep  Salmonella  χ4550,  do  którego  wpro-

wadzono plazmid pYA292 zawierający ludzki gen kodu-

jący IL-2. Konstrukt ten zaaplikowano doustnie myszom 

C57BL/6,  którym  uprzednio  wstrzyknięto  do  śledziony 

komórki MCA-38 mysiego gruczolakoraka. Jest to dobrze 

opisany i powtarzalny model dla analizy selektywnej ge-

neracji  przerzutów  wątrobowych.  Podanie  rekombino-

wanej Salmonella eksprymującej IL-2 skutkowało zmniej-

szeniem liczby guzów przerzutowych w porównaniu ze 

zwierzętami kontrolnymi bądź zwierzętami, którym za-

aplikowano  bakterie  Salmonella  z  pustym  wektorem.  W 

dalszej kolejności badania tego samego zespołu wykaza-

ły,  że  komórki  NK  oraz  limfocyty  T  CD8+  są  jednym  z 

głównych  mediatorów  efektu  antynowotworowego  wy-

woływanego przez IL-2 [66].

Kolejne  badania  pozwoliły  na  efektywne  zastosowanie 

konstruktu Salmonella-pIL2 jako formy bioterapii do lokal-

nego dostarczenia IL-2 do nerwiaka płodowego, złośliwe-

go nowotworu wywodzącego się z neuroblastów, komórek 

cewy  nerwowej,  będącego  najczęstszym  z  nowotworów 

spotykanych  u  niemowląt.  W  badaniach  na  modelu  my-

sim, u zwierząt z wstrzykniętymi zaotrzewnowo komórka-

mi Neuro-2a (N2a) nerwiaka płodowego, zaobserwowano 

znaczną redukcję rozmiaru i ciężaru guzów u myszy trak-

towanych S. enterica sv. Typhimurium lub Salmonella-pIL2 

w  stosunku  do  tych,  którym  nie  zaaplikowano  bakterii. 

Antynowotworowy  efekt  zaobserwowany  w  przypadku 

Salmonella-pIL2 był większy niż w przypadku podania sa-

mej bakterii. Pojedyncze doustne zastosowanie Salmonella i 

Salmonella-pIL2 prowadziło do redukcji guza odpowiednio 

o 63% i 84% w stosunku do kontroli. Obserwowany efekt 

może znacznie zwiększyć procent przeżywalności dzieci z 

wyższym stopniem zaawansowania tego nowotworu [67].

Jednym z nowszych badanych przykładów zastosowania 

Salmonella-pIL2 jako adiuwanta w terapii antynowotworo-

wej jest użycie tego konstruktu w zapobieganiu przerzutów 

do płuc u pacjentów z mięsakiem kościopochodnym (ina-

czej:  kostniakomięsak,  OS  i  osteosarcoma).  Wcześniej  już 

wykazano  zdolność  SalpIL-2  do  redukcji  wielkości  i  masy 

guzów przerzutowych OS do płuc, następnie badano sku-

teczność  zapobiegania  tym  przerzutom  poprzez  zastoso-

wanie  jednej  doustnej  dawki  SalpIL-2  [66,68].  Pozytywne 

długoterminowe  prognozy  dotyczą  pacjentów,  u  których 

w  wyniku  zastosowania  chemioterapii  nastąpiła  nekroza 

przynajmniej  90%  guza  pierwotnego  oraz  mających  niską 

zawartość we krwi białka ezryny biorącej udział w procesie 

metastazy.  Doustne  podanie  SalpIL-2  pozwala  bakteriom 

podążać naturalną drogą infekcji i kolonizować różne tkan-

ki z uwzględnieniem kępek Peyera, wątroby, płuc i śledzio-

ny. Na podstawie otrzymanych w doświadczeniu wyników 

potwierdzona  została  hipoteza  zakładająca  zwiększenie 

odpowiedzi  odpornościowej  komórek  NK  po  doustnym 

podaniu  SalpIL-2  [66].  Jednakże  ostateczne  zastosowanie 

tego  szczepu  w  terapiach  wymaga  doprecyzowania  losu 

rekombinowanej Salmonella w organizmie gospodarza oraz 

oszacowania czy infekcje SalpIL-2 nie powodują toksyczno-

ści związanej z nadmiarem IL-2.

W  badaniach  przeprowadzonych  przez  Al-Ramadi  i 

współpracowników  testowano  skuteczność  szczepu  GI-

DIL2  Salmonella.  GIDIL2  jest  pochodną  szczepu  BRD509 

(mutanta w genach aroA i aroD) eksprymującą gen ludzkiej 

IL-2 pod kontrolą promotora indukowanego w warunkach 

beztlenowych.  Tak  skonstruowany  szczep  wstrzyknięto 

myszom  C57BL/6  z  czerniakiem  (linia  komórkowa  B16.

F1). Antynowotworowy efekt, nekrozę guza oraz redukcję 

gęstości sieci naczyń krwionośnych wokół guza, obserwo-

wano zarówno w przypadku szczepu GIDIL2 jak i szczepu 

BRD509, efekt ten był jednak znacznie silniejszy w przypad-

ku administracji szczepu eksprymującego IL-2. Wielokrot-

ne podanie niższych dawek GIDIL2 pozwoliło na znaczne 

zmniejszenie efektu toksycznego obserwowanego w przy-

padku jednokrotnej wysokiej dawki powodującej silne za-

burzenia metaboliczne jako wynik masowej śmierci wielu 

komórek nowotworowych [69].

Postępy Biochemii 58 (3) 2012 

323

Rekombinowane  szczepy  Salmonella  są  obecnie  głów-

nym narzędziem w terapii antynowotworowej specyficz-

nie  dostarczającej  IL-2  jako  adiuwant.  Podjęto  również 

próby wykorzystania w tym celu innych rodzajów bak-

terii. Barbé i wsp. skonstruowali szczep Clostridium ace-

tobutylicum DSM792 eksprymujący szczurzą IL-2 (rIL-2), 

której biologiczna aktywność została oceniona przez ba-

danie zdolności do indukcji proliferacji limfocytów T (ba-

dania in vitro) [70]. Uprzednie badania z wykorzystaniem 

Clostridium wykazywały, że bakteria ta nie jest zdolna do 

kolonizacji  niewielkich  guzów  przerzutowych,  co  ogra-

niczałoby jej zastosowanie jedynie do leczenia guzów o 

odpowiednio  dużych  rozmiarach.  Pionierskie  badania 

nad  zastosowaniem  Clostridium  do  produkcji  cytokin 

pobudzających  układ  odpornościowy  zwróciły  uwagę 

naukowców na nowe możliwości wykorzystania bakterii 

w  terapiach  antynowotworowych,  zarówno  do  dostar-

czenia TNFα, jak i IL-2. Kolejnym krokiem będzie ocena 

efektywności Clostridium produkującej IL-2 w testach na 

zwierzętach.

Prowadzone  są  również  badania  z  wykorzystaniem 

prątków  Bacillus  Calmette-Guérin  (BCG)  jako  nośników 

genu kodującego IL-2. Prątki BCG stosowane są w lecze-

niu powierzchniowych nowotworów pęcherza moczowe-

go od ponad 30 lat. Pomimo tak długiej historii w lecze-

niu tych nowotworów i postulowania udziału wielu cy-

tokin, nadal wiele szczegółów dotyczących mechanizmu 

antynowotworowego  działania  prątków  BCG  pozostaje 

niewyjaśnionych.  Prątki  BCG  w  leczeniu  powierzchnio-

wych  nowotworów  pęcherza  moczowego  okazały  się 

bardzo  skuteczną  terapią  adiuwantową,  zapobiegając 

w  wielu  przypadkach  nawrotom  choroby  oraz  hamując 

wzrost guza [6,71]. Terapia ta obarczona jest jednak dość 

poważnymi efektami ubocznymi. Ponadto, około 30–40% 

pacjentów z powierzchniowym nowotworem układu mo-

czowego nie odpowiada na leczenie prątkami BCG, a u 

znacznej  części  pacjentów,  u  których  wyleczono  tę  cho-

robę dzięki BCG, następuje nawrót choroby w przeciągu 

kilku lat od początkowego wyleczenia. W celu optyma-

lizacji  terapii  z  użyciem  BCG  podjęto  próby  dostarcze-

nia prątków BCG wraz z INF-a bądź IL-2. W obu przy-

padkach  terapia  kombinowana  wykazała  większy  efekt 

antynowotworowy niż podanie samych prątków BCG w 

takiej samej, niskiej dawce i efekt ten był porównywalny 

z  efektem  wysokiej  dawki  BCG,  która  jednak  wiąże  się 

z wysoką toksycznością [72].

Przeprowadzono  też  kilka  eksperymentów  mających 

na  celu  stymulację  układu  odpornościowego  przez  inne 

niż IL-2 preparaty. Ligand Flt3 (Flt3L, ang. FMS-like tyrosi-

ne kinase 3 ligand) stymuluje namnażanie komórek układu 

odpornościowego, działa jak czynnik wzrostu. Poprzednie 

badania  udokumentowały  umiarkowane  antynowotworo-

we właściwości tej cząsteczki, Yoon i wsp. postanowili więc 

zwiększyć cytotoksyczny efekt Flt3L poprzez dostarczenie 

jej na wektorze niesionym przez S. Typhimurium. Podskór-

ne zaaplikowanie myszom z czerniakiem bakterii z rodzaju 

Salmonella eksprymujących Flt3L powodowało zahamowa-

nie wzrostu guzów oraz zwiększenie przeżywalności zwie-

rząt w porównaniu z myszami kontrolnymi [73].

Wyniki  niektórych  doświadczeń  wskazują,  że  immu-

nizacja  terapeutyczna  przy  użyciu  nośnika  dostarczają-

cego  zarówno  antygen  jak  i  cytokinę  skutkuje  wzmożoną 

odpowiedzią  odpornościową.  Wykazano,  że  jednoczesne 

dostarczenie  przez  S. enterica  sv.  Typhimurium  mysiego 

genu FLK-1 oraz IL-12 było efektywniejsze w redukcji una-

czynienia  guza,  sugerując  synergistyczny  efekt  działania 

produktów obu dostarczonych genów. Inną cytokiną o po-

tencjalnym zastosowaniu w terapii antynowotworowej jest 

IL-18,  wzmagająca  produkcję  cytokin  przez  limfocyty  T  i 

komórki NK oraz indukująca ich aktywność proliferacyjną 

i  cytolityczną.  Dostarczenie  samej  IL-18  przy  użyciu  jako 

nośnika S. enterica sv. Typhimurium prowadziło do znacz-

nej  regresji  przerzutów  pierwotnego  raka  piersi  u  myszy. 

Dostarczenie tej cytokiny w kombinacji z plazmidem kodu-

jącym antygen specyficzny dla raka piersi myszy (antygen 

1  związany  z  czynnikiem  transkrypcyjnym  Fos)  w  fuzji  z 

ubikwityną,  prowadziło  do  jeszcze  silniejszej  odpowiedzi 

odpornościowej.  Koadministracja  IL-18  działała  jako  silny 

i naturalny adiuwant i zapewniła odpowiednie warunki do 

aktywacji  limfocytów  T  CD8+  i  CD4+  oraz  komórek  NK, 

indukując silną specyficzną wobec nowotworu odpowiedź 

cytotoksyczną odznaczającą się długotrwałą pamięcią lim-

focytów  T  przeciw  nawrotom  guza  [38].  Innym  przykła-

dem było dostarczenie przez atenuowany szczep S. enteri-

ca  sv.  Typhimurium  aroA

-

 dam

-

  chemokiny  CCL21  wraz  z 

surwiwiną, inhibitorem apoptozy, nadeksprymowanym w 

znacznej większości guzów litych. Chemokina CCL21 jest 

chemoatraktantem aktywującym prezentujące antygen ko-

mórki  dendrytyczne  i  naiwne  limfocyty  T,  powodującym 

ich gromadzenie się w grudkach limfoidalnych i wtórnych 

narządach limfatycznych w celu wywołania efektywnej od-

powiedzi zależnej od limfocytów T. Jednoczesne dostarcze-

nie  CCL21  i  surwiwiny  powodowało  aktywację  komórek 

dendrytycznych  prezentujących  antygen  oraz  wywołanie 

silnej odpowiedzi z udziałem limfocytów T CD8+ zarówno 

w  modelu  profilaktycznym,  jak  i  terapeutycznym  guzów 

przerzutowych do płuc [74].

PODSUMOWANIE — PROBLEMY ORAZ 

PERSPEKTYWY DOTYCZĄCE WYKORZYSTANIA 

BAKTERII JAKO WEKTORÓW W TERAPIACH 

ANTYNOWOTWOROWYCH

Efektywne  dostarczenie  odpowiedniego  genu  specy-

ficznie  do  wybranej  tkanki  lub  grupy  komórek  jest  głów-

ną  trudnością  w  terapii  genowej.  Wstrzyknięcie  „nagich“ 

szczepionek  DNA  do  guza  w  wielu  przypadkach  powo-

dowało  zbyt  niską  immunogenność,  ponadto  nie  rozwią-

zywało problemu dostarczenia pożądanych genów do nie-

zdiagnozowanych przerzutów, konieczne więc stało się po-

szukiwanie  optymalnego  nośnika.  Systemy  stosowane  do 

dostarczania  do  komórek  nowotworowych  odpowiednich 

genów podzielić można na sposoby biologiczne (bakterie i 

wirusy) oraz nie biologiczne (chemiczne i fizyczne). Pomi-

mo  wysokiej  skuteczności,  zastosowanie  wektorów  wiru-

sowych budzi kontrowersje ze względów bezpieczeństwa; 

ponadto,  produkcja  i  stosowanie  wektorów  wirusowych 

jest znaczniej bardziej skomplikowana niż użycie wektorów 

bakteryjnych.  Systemy  chemiczne,  takie  jak  dostarczenie 

DNA  w  liposomach,  kationowych  peptydach  czy  polime-

324

 www.postepybiochemii.pl

rach, jak i sposoby fizyczne: elektro- i sonoporacja są obec-

nie znacznie mniej efektywne od sposobów biologicznych, 

niektóre z nich wiążą się z wysokimi kosztami produkcji, 

a jednocześnie okres ekspresji tak dostarczonego transgenu 

jest zazwyczaj dość krótki [3].

Podobnie jak w przypadku wirusów, biologiczne właści-

wości bakterii pozwalają na efektywne dostarczenie DNA 

do komórek lub tkanek. Ze względów bezpieczeństwa za-

stosowanie jako wektorów patogennych gatunków bakterii 

wymaga konstrukcji atenuowanych szczepów, które zacho-

wałyby pożądane cechy idealnego wektora, takie jak wyso-

ka immunogenność oraz zdolność do kierowania się do re-

jonu guza bądź do inwazji enterocytów, przy jednoczesnej 

znikomej toksyczności dla całego organizmu. Problemami, 

z jakimi boryka się nowoczesna terapia antynowotworowa 

wykorzystująca  bakterie  jako  żywe  wektory,  to  poza  ko-

niecznością  konstrukcji  szczepów  atenuowanych  również 

fakt  stosunkowo  szybkiej  utraty  plazmidu  zawierającego 

gen efektorowy przez bakterie, a także ryzyko lateralnego 

transferu  genów  oporności  do  innych  bakterii  i  rozprze-

strzenianie wektora w środowisku. W przypadku zastoso-

wania bakterii do dostarczania genów kodujących enzymy 

przekształcające  nieaktywny  prolek  w  jego  aktywną  tok-

syczną formę niezbędne jest zabezpieczenie przed ekspresją 

genu efektorowego poza pożądanym miejscem docelowym. 

W tym celu prowadzone są badania nad wprowadzeniem 

promotorów pozwalających na regulację procesu ekspresji 

genu,  jak  na  przykład  promotora  indukowanego  warun-

kami hipoksji lub promieniowaniem jonizującym. Badania 

koncentrują się na opracowaniu metod przedłużenia czasu 

ekspresji pożądanego genu, ustaleniu optymalnych dawek i 

sposobu podania bakterii oraz podwyższeniu poziomu od-

powiedzi odpornościowej, na przykład poprzez zastosowa-

nie niektórych cytokin [4,9].

Postęp badań znacząco przyśpiesza rozwój metod inży-

nierii genetycznej oraz opracowanie w ostatnich latach co-

raz to doskonalszych metod sekwencjonowania genomów 

bakteryjnych. Nadal jednak wiele zagadnień wymaga wy-

jaśnienia:  jak  efektywne  jest  w  wypadku  ludzkich  terapii 

kierowanie się bakterii do guza w zależności od wielkości 

guza  i  jego  położenia  oraz  ukrwienia;  czy  wprowadzane 

wektory podlegają atakowi immunologicznemu w guzach 

oraz czy replikują się w nowotworach, a w związku z tym 

czy efekt terapeutyczny ulega amplifikacji. Pomimo wymie-

nionych problemów, terapia z zastosowaniem mikroorgani-

zmów jako wektorów nośników genów kodujących enzymy 

aktywujące proleki może okazać się skuteczna, szczególnie 

w połączeniu z terapią tradycyjną, np. radioterapią czy che-

mioterapią. Problemem terapii konwencjonalnych jest fakt, 

że działają efektywniej w rejonach mocno unaczynionych, 

co często uniemożliwia dotarcie do hipoksyjnych stref guza. 

Terapia z zastosowaniem bakterii koncentruje się natomiast 

na rejonach hipoksji i anoksji, uzupełniając się w ten spo-

sób skutek działania terapii tradycyjnej. Badania wykazały, 

że terapie te działają na inne subpopulacje komórek, efekt 

równoczesnego ich zastosowania okazuje się, więc być ad-

dytywny.  Połączenie  obu  metod  umożliwiłoby  znaczne 

zmniejszenie  dawki  stosowanych  chemioterapeutyków, 

obniżając w ten sposób toksyczność terapii dla całego orga-

nizmu [3,9,38].

Zastosowanie szczepionek DNA z użyciem żywych bak-

terii  jest  obiecującą  strategią  walki  z  rakiem,  jednak  poza 

koniecznością wywoływania odpowiednio silnej odpowie-

dzi  odpornościowej  skierowanej  przeciwko  dostarczanym 

antygenom,  muszą  też  okazać  się  całkowicie  bezpieczne 

dla pacjentów. Trudne jest uzyskanie pożądanej równowa-

gi  pomiędzy  immunogennością  i  bezpieczeństwem,  pro-

wadzące  do  wywołania  odpowiednio  silnej  odpowiedzi 

odpornościowej  przy  jednoczesnej  minimalizacji  efektów 

ubocznych.  Pomimo  istniejących  wciąż  pewnych  proble-

mów  i  niejasności  związanych  z  zastosowaniem  LBV,  co-

raz bardziej szczegółowa wiedza na temat funkcjonowania 

systemu odpornościowego wraz z obiecującymi wynikami 

badań przedklinicznych i klinicznych sprawia, że produk-

cja  szczepionek  specyficznych  wobec  nowotworu  wydaje 

się  realna.  Pośród  możliwych  strategii  szczepienia,  doślu-

zówkowa administracja z użyciem żywych atenuowanych 

bakterii  okazała  się  najbardziej  obiecująca.  Jako  jedne  z 

głównych zalet tej strategii wymienić należy niewątpliwie 

zdolność  do  stymulacji  wrodzonego  układu  odpornościo-

wego, a więc naturalne właściwości adiuwantowe, bezpie-

czeństwo oraz łatwość manipulacji genetycznych [38].

PIŚMIENNICTWO

1.  Anderson RJ, Schneider J (2007) Plasmid DNA and viral vector-based 

vaccines for the treatment of cancer. Vaccine 25: B24-B34

2.  Stevenson  FK,  Rice  J,  Ottensmeier  CH,  Thirdborough  SM,  Zhu  D 

(2004) DNA fusion gene vaccines against cancer: from the laboratory 

to the clinic. Immunol Rev 199: 156-180

3.  Baban CK, Cronin M, O’Hanlon D, O’Sullivan GC, Tangney M (2010) 

Bacteria as vectors for gene therapy of cancer. Bioengineered Bugs 1: 

385-394

4.  Wei MQ, Mengesha A, Good D, Anné J (2008) Bacterial targeted tumo-

ur therapy-dawn of a new era. Cancer Lett 259: 16-27

5.  Cao S, Cripps A, Wei MQ (2010) New strategies for cancer gene the-

rapy: progress and opportunities. Clin Exp Pharmacol Physiol 37: 108-

114

6.  Shintani Y, Sawada Y, Inagaki T, Kohjimoto Y, Uekado Y, Shinka T 

(2007) Intravesical instillation therapy with bacillus Calmette–Guerin 

for superficial bladder cancer: study of the mechanism of bacillus Cal-

mette–Guerin immunotherapy. Int J Urol 14: 140-146

7.  Uyl-de Groot CA, Vermorken JB, Hanna MG Jr, Verboom P, Groot 

MT, Bonsel GJ, Meijer CJ, Pinedo HM (2005) Immunotherapy with au-

tologous tumor cell-BCG vaccine in patients with colon cancer: a pro-

spective study of medical and economic benefits. Vaccine 23: 2379-87

8.  Goldman B, DeFrancesco L (2009) The cancer vaccine roller-coster. Nat 

Biotechnol 27 :129-39

9.  Pawelek JM, Low KB, Bermudes D (2003) Bacteria as tumor-targeting 

vector. Lancet Oncol 4: 548-556

10. Ryan RM, Green J, Lewis CE (2006) Use of bacteria in anti-cancer the-

rapies. Bioessays 28: 84-94

11. Theys J, Barbé S, Landuyt W, Nuyts S, Van Mellaert L, Wouters B, 

Anné J, Lambin P (2003) Tumor-Specific Gene Delivery Using Geneti-

cally Engineered Bacteria. Curr Gene Ther 3: 207-221

12. Zhao M, Yang M, Li XM, Jiang P, Baranov E, Li S, Xu M, Penman S, 

Hoffman  RM  (2005)  Tumor-targeting  bacterial  therapy  with  amino 

acid auxotrophs of GFP-expressing Salmonella typhimurium. Proc Natl 

Acad Sci USA 102: 755-760

13. Clairmont C, Lee KC, Pike J, Ittensohn M, Low KB, Pawelek J, Bermu-

des D, Brecher SM, Margitich D, Turnier J, Li Z, Luo X, King I, Zheng 

LM (2000) Biodistribution and genetic stability of the novel antitumo-

ur agent VNP20009, a genetically modified strain of Salmonella typhi-

murium. J Infect Dis 18: 1996-2002

Postępy Biochemii 58 (3) 2012 

325

14. Low KB, Ittensohn M, Luo X, Zheng LM, King I, Pawelek JM, Ber-

mudes D (2004) Construction of VNP20009: a novel, genetically stable 

antibiotic-sensitive strain of tumor-targeting Salmonella for parenteral 

administration in humans. Methods Mol Med 90: 47-60

15. Toso JF, Gill VJ, Hwu P, Marincola FM, Restifo NP, Schwartzentruber 

DJ, Sherry RM, Topalian SL, Yang JC, Stock F, Freezer LJ, Morton KE, 

Seipp C, Haworth L, Mavroukakis S, White D, MacDonald S, Mao J, 

Sznol M, Rosenberg SA (2002) Phase I Study of the Intravenous Ad-

ministration  of  Attenuated  Salmonella typhimurium  to  Patients  With 

Metastatic Melanoma. J Clin Oncol 20: 142-152

16. Jia LJ, Wei DP, Sun QM, Huang Y, Wu Q, Hua ZC (2007) Oral delivery 

of tumor-targeting Salmonella for cancer therapy in murine tumor mo-

dels. Cancer Sci 98: 1107-1112

17. Lee CH, Wu CL, Tai YS, Shiau AL (2005) Systemic administration of 

attenuated  Salmonella choleraesuis  in  combination  with  cisplatin  for 

cancer therapy. Mol Ther 11: 707-716

18. Platt J, Sodi S, Kelley M, Rockwell S, Bermudes D, Low KB, Pawelek J 

(2000) Antitumour effects of genetically engineered Salmonella in com-

bination with radiation. Eur J Cancer 36: 2397-2402

19. Dang LH, Bettegowda C, Huso DL, Kinzler KW, Vogelstein B (2001) 

Combination bacteriolytic therapy for the treatment of experimental 

tumours. Proc Natl Acad Sci USA 98: 15155-15160

20. Agrawal N, Bettegowda C, Cheong I, Geschwind JF, Drake CG, Hip-

kiss EL, Tatsumi M, Dang LH, Diaz LA Jr, Pomper M, Abusedera M, 

Wahl RL, Kinzler KW, Zhou S, Huso DL, Vogelstein B (2004) Bacterio-

lytic therapy can generate a potent immune response against experi-

mental tumors. Proc Natl Acad Sci USA 101: 15172-15177

21. www.clinicaltrials.gov/ct
22. Yazawa K, Fujimori M, Amano J, Kano Y, Taniguchi S (2000) Bifodobac-

terium longum as a delivery system for cancer gene therapy: selective 

localization and growth in hypoxic tumors. Cancer Gene Ther 7: 269-

274

23. Pawelek JM, Low KB, Bermudes D (1997) Tumor-targeted Salmonella 

as a novel anticancer vector. Cancer Res 57: 4537-4544

24. Bermudes D, Low B, Pawelek JM (2000) Tumour-targeted Salmonella: 

strain development and expression of the HSV TK effector gene. W: 

Walther W, Stein U (Eds). Gene therapy: methods and protocols. Toto-

wa: Humana Press 419-436

25. Fu W, Lan H, Liang S, Gao T, Ren D (2008) Suicide gene/prodrug the-

rapy using Salmonella-mediated delivery of Escherichia coli purine nuc-

leoside phosphorylase gene and 6-methoxypurine 2′-deoxyriboside in 

murine mammary carcinoma 4T1 model. Cancer Sci 99: 1172-1179

26. Deharvengt S, Wack S, Uhring M, Aprahamian M, Hajri A (2004) Su-

icide gene/prodrug therapy for pancreatic adenocarcinoma by E. coli 

purine nucleoside phosphorylase and 6-methylpurine 2′-deoxyribosi-

de. Pancreas 28: 54-56

27. King I, Bermudes D, Lin S, Belcourt M, Pike J, Troy K, Le T, Ittensohn 

M, Mao J, Lang W, Runyan JD, Luo X, Li Z, Zheng LM (2002) Tumor-

-targeted Salmonella expressing cytosine deaminase as an anticancer 

agent. Hum Gene Ther 13: 1225-1233

28. Nemunaitis J, Cunningham C, Senzer N, Kuhn J, Cramm J, Litz C, Ca-

vagnolo R, Cahill A, Clairmont C, Sznol M (2003) Pilot trial of gene-

tically modified, attenuated Salmonella expressing the E. coli cytosine 

deaminase gene in refractory cancer patients. Cancer Gene Ther 10: 

737- 744

29. Friedlos F, Lehouritis P, Ogilvie L, Hedley D, Davies L, Bermudes D, 

King I, Martin J, Marais R, Springer CJ (2008) Attenuated Salmonella 

targets prodrug activating enzyme carboxypeptidase G2 to mouse me-

lanoma and human breast and colon carcinomas for effective suicide 

gene therapy. Clin Cancer Res 14: 4259-4266

30. Clairmont C, Lee KC, Pike J, Ittensohn M, Low KB, Pawelek J, Ber-

mudes D, Brecher SM, Margitich D, Turnier J, Li Z, Luo X, King I, 

Zheng LM (2000) Biodistribution and genetic stability of the novel an-

titumor agent VNP20009, a genetically modified strain of Salmonella 

typhimurium. J Infect Dis 181: 1996-2002

31. Ganai S, Arenas RB, Forbes NS (2009) Tumour-targeted delivery of 

TRAIL using Salmonella typhimurium enhances breast cancer survival 

in mice. Br J Cancer 101: 1683-1691

32. Hu B, Kou L, Li C, Zhu LP, Fan YR, Wu ZW, Wang JJ, Xu GX (2009) 

Bifidobacterium longum as a delivery system of TRAIL and endostatin 

cooperates  with  chemotherapeutic  drugs  to  inhibit  hypoxic  tumor 

growth. Cancer Gene Ther 16: 655-663

33. Groot AJ, Mengesha A, van der Wall E, van Diest PJ, Theys J, Vooijs 

M (2007) Functional antibodies produced by oncolytic clostridia. Bio-

chem Biophys Res Commun. 364: 985-989

34. Tang W, He Y, Zhou S, Ma Y, Liu G (2009) A novel Bifidobacterium 

infantis-mediated TK/GCV suicide gene therapy system exhibits an-

titumor activity in a rat model of bladder cancer. J Exp Clin Canc Res 

28: 155

35. Yazawa K, Fujimori M, Amano J, Kano Y, Taniguchi S (2007) Bifidobac-

terium longum as a delivery system for cancer gene therapy: Selective 

localization and growth in hypoxic tumors. Biosci Biotechol Biochem 

71: 2921-2926

36. Coban C, Koyama S, Takeshita F, Akira S, Ishii KJ (2008) Molecular 

and cellular mechanisms of DNA vaccines. Hum Vaccin 4: 453-456

37. Fioretti D, Iurescia S, Fazio VM, Rinaldi M (2010) DNA vaccines: deve-

loping new strategies against cancer. J Biomed Biotechnol 2010: 174378

38. Daudel D, Weidinger G, Spreng S (2007) Use of attenuated bacteria 

as delivery vectors for DNA vaccines. Expert Rev Vaccines 6: 97-110

39. Krieg  AM  (2007)  Antiinfective  Applications  of  Toll-like  Receptor  9 

Agonists. Proc Am Thorac Soc 4: 289-294

40. Conry RM, Curiel DT, Strong TV, Moore SE, Allen KO, Barlow DL, 

Shaw DR, LoBuglio AF (2002) Safety and immunogenicity of a DNA 

vaccine encoding carcinoebryonic antigen and hepatitis B surface an-

tigen in colorectal carcinoma patients. Clin Cancer Res 8: 2782-2787

41. Triozzi  PL,  Aldrich  W,  Allen  KO,  Carlisle  RR,  LoBuglio  AF,  Conry 

RM (2005) Phase I study of plasmid DNA vaccine encoding MART-1 

in patiens with resected elanoma at risk of relapse. J Immunother 28: 

382-388

42. Lowe DB, Shearer MH, Kennedy RC (2006) DNA vaccines: successes 

and limitations in cancer and infectious disease. J Cel Biochem 98: 235-

242

43. Wahid R, Pasetti MF, Maciel M Jr, Simon JK, Tacket CO, Levine MM, 

Sztein  MB  (2011)  Oral  priming  with  Salmonella Typhi  vaccine  strain 

CVD 909 followed by parenteral boost with the S. typhi Vi capsular 

polysaccharide vaccine induces CD27+IgD− S. typhi-specific IgA and 

IgG B memory cells in humans. Clin Immunol 138: 187-200

44. Tacket CO, Sztein MB, Wasserman SS, Losonsky G, Kotloff KL, Wyant 

TL, Nataro JP, Edelman R, Perry J, Bedford P, Brown D, Chatfield S, 

Dougan G, Levine MM (2000) Phase 2 Clinical Trial of Attenuated Sal-

monella enterica Serovar Typhi Oral Live Vector Vaccine CVD 908-htrA 

in U.S. Volunteers. Infect Immun 68: 1196-1201

45. Zhang XL, Jeza VT, Pan Q (2008) Salmonella typhi: from a human patho-

gen to a vaccine vector. Cell Mol Immunol 5: 91-7

46. Kopecko DJ, Sieber H, Ures JA, Fürer A, Schlup J, Knof U, Collioud A, 

Xu D, Colburn K, Dietrich G (2009) Genetic stability of vaccine strain 

Salmonella typhi Ty21a over 25 years. Int J Med Microbiol 299: 233-246

47. Tacket CO, Sztein MB, Losonsky GA, Wasserman SS, Nataro JP, Edel-

man R, Pickard D, Dougan G, Chatfield SN, Levine MM (1997) Safety 

of live oral Salmonella typhi vaccine strains with deletions in htrA and 

aroC aroD and immune response in humans. Infect Immun 65: 452-456

48. Tran TH, Nguyen TD, Nguyen TT, Ninh TT, Tran NB, Nguyen VM, 

Tran TT, Cao TT, Pham VM, Nguyen TC, Tran TD, Pham VT, To SD, 

Campbell JI, Stockwell E, Schultsz C, Simmons CP, Glover C, Lam W, 

Marques F, May JP, Upton A, Budhram R, Dougan G, Farrar J, Nguyen 

VV, Dolecek C (2010) A randomised trial evaluating the safety and im-

munogenicity of the novel single oral dose typhoid vaccine M01ZH09 

in healthy Vietnamese children. PLoS One 5: e11778

49. Shahabi V, Maciag PC, Rivera S, Wallecha A (2010) Live, attenuated 

strains of Listeria and Salmonella as vaccine vectors in cancer treatment. 

Bioengineered Bugs 1: 235-243

50. Schroeder GN, Hilbi H (2008) Molecular pathogenesis of Shigella spp.: 

controlling host cell signaling, invasion, and death by type III secre-

tion. Clin Microbiol Rev 21: 134-156

326

 www.postepybiochemii.pl

Application of microorganisms as delivery vehicles in cancer gene therapies

Katarzyna Łepeta, Anna Maria Łasica, Elżbieta Katarzyna Jagusztyn-Krynicka

*

Department of Bacterial Genetics, Institute of Microbiology, Faculty of Biology, University of Warsaw, 1 Miecznikowa Str., 02-096 Warsaw, Poland

*

e-mail: kjkryn@biol.uw.edu.pl

Key words: cancer, DNA vaccine, gene therapy, gene delivery vectors, LBV

ABSTRACT

Gene therapy represents a potential new strategy for cancer treatment. In order to deliver a transgene into target tumor cells, a vector system 

is required. To date, most of the cancer therapies are based on the use of different viral vectors. However, bacteria such as 

Salmonella, Clos-

tridium or non-pathogenic Bifidobacterium can selectively accumulate in tumors in vivo what renders them useful for cancer gene therapy 

vectors. Although the mechanism of DNA transfer from bacteria to mammalian cells is not completely understood their potential to deliver 

therapeutic genes into tumor cells have been demonstrated 

in vitro and in vivo. The review presents recent achievements in bacteria-mediated 

cancer gene therapy.

51. Darji A, Mohamed W, Domann E, Chakraborty T (2003) Induction of 

immune  responses  by  attenuated  isogenic  mutant  strains  of  Listeria 

monocytogenes. Vaccine 21 Suppl 2: S102-109

52. Johnson PV, Blair BM, Zeller S, Kotton CN, Hohmann EL (2011) Atte-

nuated Listeria monocytogenes vaccine vectors expressing influenza A 

nucleoprotein: preclinical evaluation and oral inoculation of volunte-

ers. Microbiol Immunol 55: 304-317

53. Brockstedt DG, Giedlin MA, Leong ML, Bahjat KS, Gao Y, Luckett W, 

Liu W, Cook DN, Portnoy DA, Dubensky TW Jr (2004) Listeria-based 

cancer  vaccines  that  segregate  immunogenicity  from  toxicity.  Proc 

Natl Acad Sci USA 101: 13832-13837

54. Meng JZ, Dong YJ, Huang H, Li S, Zhong Y, Liu SL, Wang YD (2010) 

Oral Vaccination with Attenuated Salmonella enterica Strains Encoding 

T-Cell Epitopes from Tumor Antigen NY-ESO-1 Induces Specific Cy-

totoxic T-Lymphocyte Responses. Clin Vaccine Immunol 17: 889-894

55. Echchannaoui H, Bianchi M, Baud D, Bobst M, Stehle JC, Nardelli-Ha-

efliger D (2008) Intravaginal Immunization of Mice with Recombinant 

Salmonella enterica Serovar Typhimurium Expressing Human Papillo-

mavirus Type 16 Antigens as a Potential Route of Vaccination against 

Cervical Cancer. Infect Immun 76: 1940-1951

56. Tangney M, van Pijkeren JP, Gahan CG (2010) The use of Listeria mo-

nocytogenes as a DNA delivery vector for cancer gene therapy. Bioen-

gineered Bugs 1: 284-287

57. Zuo SG, Chen Y, Wu ZP, Liu X, Liu C, Zhou YC, Wu CL, Jin CG, Gu 

YL, Li J, Chen XQ, Li Y, Wei HP, Li LH, Wang XC (2010) Orally Admi-

nistered DNA Vaccine Delivery by Attenuated Salmonella typhimurium 

Targeting Fetal Liver Kinase 1 Inhibits Murine Lewis Lung Carcinoma 

Growth and Metastasis. Biol Pharm Bull 33: 174-182

58. Feng K, Zhao H, Chen J, Yao D, Jiang X, Zhou W (2004) Anti-angio-

genesis effect on glioma of attenuated Salmonella typhimurium vaccine 

strain with flk-1 gene. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci 24: 

389-391

59. Miao WM, Seng WL, Duquette M, Lawler P, Laus C, Lawler J (2001) 

Thrombospondin-1 type 1 repeat recombinant proteins inhibit tumor 

growth through transforming growth factor-b-dependent and -inde-

pendent mechanisms. Cancer Res 61: 7830-7839

60. Lee CH, Wu CL, Shiau AL (2005) Systemic administration of attenu-

ated Salmonella choleraesuis carrying thrombospondin-1 gene leads to 

tumor-specific transgene expression, delayed tumor growth and pro-

longed survival in the murine melanoma model. Cancer Gene Ther 

12: 175-184

61. Li X, Fu GF, Fan YR, Liu WH, Liu XJ, Wang JJ, Xu GX (2003) Bifidobacte-

rium adolescentis as a delivery system of endostatin for cancer gene the-

rapy: selective inhibitor of angiogenesis and hypoxic tumor growth. 

Cancer Gene Ther 10: 105-111

62. Xu YF, Zhu LP, Hu B, Fu GF, Zhang HY, Wang JJ, Xu GX (2007) A 

new expression plasmid in Bifidobacterium longum as a delivery system 

of endostatin for cancer gene therapy. Cancer Gene Ther 14: 151-157

63. Loeffler M, Krüger JA, Reisfeld RA (2005) Immunostimulatory effects 

of low-dose cyclophosphamide are controlled by inducible nitric oxide 

synthase. Cancer Res 65: 5027-5030

64. Niethammer AG, Wodrich H, Loeffler M, Lode HN, Emmerich K, Ab-

dollahi A, Krempien R, Debus J, Huber PE, Reisfeld RA (2005) Multi-

drug resistance-1 (MDR-1): a new target for T cell-based immunothe-

rapy. FASEB J 19: 158-159

65. Chavez AR, Buchser W, Basse PH, Liang X, Appleman LJ, Maranchie 

JK, Zeh H, de Vera ME, Lotze MT (2009) Pharmacologic administra-

tion of interleukin-2. Ann N Y Acad Sci 1182: 14-27

66. Sorenson  BS,  Banton  KL,  Frykman  NL,  Leonard  AS,  Saltzman  DA 

(2008) Attenuated Salmonella typhimurium with interleukin 2 gene pre-

vents the establishment of pulmonary metastases in a model of oste-

osarcoma. J Pediatr Surg 43: 1153-1158

67. Barnett SJ, Soto LJ 3rd, Sorenson BS, Nelson BW, Leonard AS, Salt-

zman DA (2005) Attenuated Salmonella typhimurium invades and de-

creases tumor burden in neuroblastoma. J Pediatr Surg 40: 993-997

68. Sorenson  BS,  Banton  KL,  Frykman  NL,  Leonard  AS,  Saltzman  DA 

(2008) Attenuated Salmonella typhimurium with IL-2 gene reduces pul-

monary metastases in murine osteosarcoma: development of a repro-

ducible model. Clin Orthop Relat Res 466: 1285-1291

69. al-Ramadi BK, Fernandez-Cabezudo MJ, El-Hasasna H, Al-Salam S, 

Bashir G, Chouaib S (2009) Potent anti-tumor activity of systemical-

ly-administered  IL2-expressing  Salmonella  correlates  with  decreased 

angiogenesis and enhanced tumor apoptosis. Clin Immunol 130: 89-97

70. Barbé S, Van Mellaert L, Theys J, Geukens N, Lammertyn E, Lambin 

P, Anné J (2005) Secretory production of biologically active rat inter-

leukin-2 by Clostridium acetobutylicum DSM792 as a tool for anti-tumor 

treatment. FEMS Microbiol Lett 246: 67-73

71. Alexandroff  AB,  Jackson  AM,  O’Donnell  MA,  James  K  (1999)  BCG 

immunotherapy of bladder cancer: 20 years on. Lancet 353: 1689-1694

72. Xiao Z, Hanel E, Mak A, Moore RB (2011) Antitumor efficacy of intra-

vesical BCG, Gemcitabine, Interferon-α and Interleukin-2 as Mono- or 

Combination-  Therapy  for  Bladder  Cancer  in  an  Orthotopic  Tumor 

Model. Clinical Medicine Insights: Oncology 5: 315-323

73. Yoon WS, Choi WC, Sin JI, Park YK (2007) Antitumor therapeutic ef-

fects of Salmonella typhimurium containing Flt3 Ligand expression pla-

smids in melanoma-bearing mouse. Biotechnol Lett 29: 511-516

74. Xiang R, Mizutani N, Luo Y, Chiodoni C, Zhou H, Mizutani M, Ba 

Y, Becker JC, Reisfeld RA (2005) A DNA vaccine targeting survivin 

combines apoptosis with suppression of angiogenesis in lung tumor 

eradication. Cancer Res 65: 553-561