W
YSOKOSPRAWNA
C
HROMATOGRAFIA
C
IECZOWA
materiały do ćwiczeń seminaryjno-
laboratoryjnych
Materiały zebrała i przygotowała do druku:
dr inŜ. Agata Kot-Wasik, Katedra Chemii Analitycznej, Politechnika Gdańska
W
YSOKOSPRAWNA
C
HROMATOGRAFIA
C
IECZOWA
materiały do ćwiczeń seminaryjno-
laboratoryjnych
Materiały zebrała i przygotowała do druku:
dr inŜ. Agata Kot-Wasik, Katedra Chemii Analitycznej, Politechnika Gdańska
SPIS TRE
Ś
CI
Ć
wiczenie 1
Przygotowanie chromatografu cieczowego do pracy – przygotowanie fazy
ruchomej, instalacja kolumny; zasady post
ę
powania dla efektywnego
stosowania aparatu.
Dr in
Ŝ
. A. Kot-Wasik
Ć
wiczenie 2
Dobór warunków rozdzielania w układzie faz odwróconych.
Dr in
Ŝ
. B. Makuch, mgr in
Ŝ
. J. Wilga
Ć
wiczenie 3
Rozwi
ą
zywanie problemów chromatograficznych – problemy zwi
ą
zane z
dozowaniem próbki, kolumn
ą
, detektorem, pomp
ą
.
Prof. dr hab. in
Ŝ
. M. Kami
ń
ski, mgr in
Ŝ
. E. Gilgenast,
mgr in
Ŝ
. G. Romanik
Ć
wiczenie 4
Analiza ilo
ś
ciowa zwi
ą
zków w próbkach.
Dr in
Ŝ
. A. Kot-Wasik
Ć
WICZENIE 1
P
RZYGOTOWANIE CHROMATOGRAFU CIECZOWEGO DO PRACY
–
PRZYGOTOWANIE FAZY RUCHOMEJ
,
INSTALACJA KOLUMNY
;
ZASADY
POSTĘPOWANIA DLA EFEKTYWNEGO STOSOWANIA APARATU
.
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest przygotowanie chromatografu cieczowego do pracy. Przygotowanie aparatu
obejmuje przygotowanie fazy ruchomej, instalację kolumny chromatograficznej, przygotowanie detektora
i stabilizaja warunków chromatograficznych.
Schemat blokowy chromatografu cieczowego, którego elementy poddawane będą omówieniu i
przygotowaniu do pracy analitycznej przedstawiono na Rysunku.
Faza
ruchoma
Pompa
Nastrzyk
Kolumna
Detektor
Rejestrator
Termostat
Schemat blokowy chromatografu cieczowego
W celu przygotowania aparatu do pracy naleŜy:
1.
przygotować fazę ruchomą,
2.
zainstalować kolumnę chromatograficzną,
3.
przygotować detektor ,
4.
przygotować wzorzec i próbkę do analizy,
5.
ustabilizować warunki chromatograficzne,
6.
zdiagnozować ewentualne problemy chromatograficzne.
ad.1
Fazą ruchomą w chromatografii cieczowej są pojedyncze rozpuszczalniki lub ich dwu- lub więcej
składnikowe mieszaniny. Faza ruchoma, która zostaje wprowadzona do kolumny to eluent, który
bezwzględnie musi być pozbawiony rozpuszczonego w cieczy powietrza (zaprezentowane zostaną róŜne
sposoby usuwania powietrza z fazy ruchomej: odgazowanie próŜniowe, helem lub za pomocą
ultradzwięków). Rodzaj i stosunek ilościowy mieszaniny rozpuszczalników w fazie ruchomej ma bardzo
duŜy wpływ na proces chromatografowania. Omówione zostaną sposoby przygotowania faz ruchomych
składających się z dwóch (lub więcej) składników, zawierające dodatki (kwasy nieorganiczne, organiczne
i bufory). Przedstawiony zostanie sposób wymiany eluentu. Przez cały czas trwania wymiany eluentu
kolumna powinna być odłączona i zastąpiona łącznikiem (dwójnikiem). Kolejna kolumna potrzebna do
wykonania oznaczeń, powinna zostać przyłączona w miejsce dwójnika dopiero po upewnieniu się, Ŝe cały
aparat został poprawnie przepłukany i zawiera eluent, który aktualnie będzie wykorzystywany do analizy.
Zawór dozujący w pozycji powinien być w pozycji „inject”.
JeŜeli, eluent poprzedni i następny wzajemnie się nie mieszają, a szczególnie gdy stosowane są roztwory
buforowe, lub eluenty zawierające substancje będące w stanie czystym fazą stałą, naleŜy upewnić się, Ŝe
kolejna ciecz pompowana przez aparat nie spowoduje wytrącenia się stałego osadu wewnątrz
chromatografu, ani powstania emulsji. W takich przypadkach naleŜy zastosować ciecz pośrednią, o której
wiadomo, Ŝe jest dobrym rozpuszczalnikiem składników poprzedniego i następnego eluentu, np. wodę
destylowaną, gdy ma być stosowany bufor zawierający sole nieorganiczne, albo tetrahydrofuran, aceton
lub dioksan, gdy poprzedni i następny eluent są cieczami bez dodatku substancji stałych, ale wzajemnie
się nie mieszają. Pomocne moŜe być wprowadzenie strzykawką poprzedniego eluentu do następnego
zawartego w probówce w celu sprawdzenia czy nie powstaje osad lub emulsja;
Zawsze naleŜy kaŜdą ze stosowanych cieczy pośrednich przepłukać takŜe kanał odniesienia detektora,
gdy detektor taki kanał posiada (np. w przypadku detektora refraktometrycznego);
Podstawowy problem związany z fazą ruchomą w HPLC: ciśnienie wskazywane przez wyświetlacz na
płycie czołowej pompy waha się więcej niŜ +/- 2 bary, a jednocześnie widać okresowe zasysanie małych
banieczek z przewodu ssawnego do pompy. Przyczyna: zapowietrzony eluent, albo eluent o zbyt
wysokiej pręŜności par, albo/i zatkany zanieczyszczeniami filtr ssawny pompy. (Uwaga! Eluent przed
uŜyciem musi być przefiltrowany przez filtr 0,45 um, jeŜeli nie ma pewności, Ŝe wykonał to producent, a
takŜe nie wolno dopuścić do powstania Ŝycia biologicznego w eluencie nietoksycznym dla bakterii i
grzybów - stosować 0.5 mM azydek sodu). NaleŜy przedmuchać filtr ssawny pompy spręŜonym
powietrzem w kierunku odwrotnym do kierunku przepływu cieczy, dodatkowo odpowietrzyć eluent i
postawić go powyŜej poziomu głowicy pompy.
ad.2
Sposób połączenia kolumny z dozownikiem i detektorem powinien być taki, Ŝeby
zminimalizować powstające ewentualne objętości martwe. W ten sposób zmniejsza się udział objętości
martwych stosunek rozmyciu pików chromatograficznych. Przez cały czas trwania wymiany eluentu
kolumna powinna być odłączona i zastąpiona łącznikiem (dwójnikiem). Kolejna kolumna potrzebna do
wykonania oznaczeń, powinna zostać przyłączona w miejsce dwójnika dopiero po upewnieniu się, Ŝe cały
aparat został poprawnie przepłukany i zawiera eluent, który aktualnie będzie wykorzystywany do analizy.
Zawór dozujący w pozycji powinien być w pozycji „inject”.
JeŜeli klumna chromatograficzna podłączana jest do układu po raz pierwszy lub teŜ nie była uŜywana
przez dłuŜszy okres czasu naleŜy - po podłączniu jej do układu chromatograficznego – zastosować
wzrastający przepływ fazy ruchomej (od najmniejszego do właściwego). Gwałtowne włączenie pompy
pompującej fazę ruchomą z duŜym przepływem moŜe zruszyć złoŜe upakowane w kolumnie
chromatgraficznej.
Przy rozpoczynaniu analizy chromatograficznej jedną z bardzo waŜnych rzeczy jest ustalenie równowagi
kolumny chromatograficznej. Jak długo naleŜy kolumnę stabilizować zaleŜy od jej stanu, stęŜenia
składników fazy ruchomej oraz ich wskaźnika retencji. Ustalenie stanu równowagi jest uwarunkowane
przez prędkość, z którą składniki fazy ruchomej są transportowane do kolumny lub mogą z niej być
usunięte. JeŜeli stęŜenie dodatków organicznych w fazie ruchomej jest niskie, ustalenie równowagi
zajmie sporo czasu, np.: jeŜeli kolumna wcześniej nie miała kontaktu z metanolem, a jego stęŜenie w
fazie ruchomej wynosi 1%, to potrzeba przepuścić przez kolumnę co najmniej 10-krotną jej objętość w
celu dostarczenia odpowiedniej ilości metanolu. Na Rysunku poniŜej przedstawiono nieustabilizowaną
linię bazową świadczącą o zbyt krótkim czasie stabilizacji kolumny.
Czas [min]
In
te
n
s
y
w
n
o
ś
ć
[
j.
u
.]
Nieustabilizowana linia podstawowa ze wzgl
ę
du na zbyt krótki czas stabilizowania kolumny.
ad.3
Detektor naleŜy włączyć na 15-20 minut przed rozpoczęciem analiz (wyjątek stanowi detektor
refraktometryczny, którego stabilizacja moŜe zająć 24 godziny). Przed rozpoczęciem analiz
chromatograficznych detektor naleŜy wyzerować. JeŜeli detektor UV, UV-VIS-DAD lub fluorescencyjny
nie daje się wyzerować w całym, albo w części zakresu pomiarowego, zaś balans detektora RI nie daje się
sprowadzić do jednej diody świecącej to naleŜy podejrzewać, Ŝe uzyty został eluent o niedostatecznej
czystości, albo - co gorzej - na powierzchni wewnętrznej naczyńka przepływowego w detektorze
wydzieliła się emulsja, albo depozyt substancji stałej. Jeśli tak to naleŜy wymieć eluent na inny - o
wyŜszej czystości, a jeŜeli to nie pomaga, przepłukać naczyńko przepływowe odpowiedniego detektora
kolejno: dichlorometanem, acetonem, wodą, acetonem, toluenem i powrócić do stosowanego eluentu. W
razie potrzeby zastosować ciecz pośrednią. JeŜeli to nie pomaga zastosować dodatkowo płukanie 5% -
owym kwasem azotowym.
ad. 4
W chromatografie cieczowym próbka wprowadzana zostaje (pod ciśnieniem atmosferycznym) do
kolumny poprzez dozownik. W kolumnie panuje ciśnienie do kilkudziesięciu MPa. Dozowniki są
skonstruowane tak, aby nie było w nich przestrzeni „martwych”, nie przemywanych fazą ruchomą. Zły
dozownik lub złe dozowanie mogą być przyczyną pojawienia się źle rozdzielonych, szerokich i
niesymetrycznych pików.
Najczęściej w HPLC stosuje się objętości nastrzykiwanych próbek w zakresie od 1(5) do 150 µl. Jako
optymalną objętość próbki do nastrzyku ustalić moŜna na 5-25µl (najmniej efektów uboocznych
związanych z niewłaściwym przygotowanie próbki). Bardzo waŜną kwestią dotyczącą nastrzyku jest
skład jakościowy roztworu, w którym nastrzykiwane są anality. Dlaczego? OtóŜ, przy przepływie 0,5
ml/min – przeliczając przepływ na µl/s otrzymujemy 8,3µl/s – nastrzyk o wielkości 5µl – przy załoŜeniu,
Ŝ
e moment nastrzyku trwa sekundę – powoduje, Ŝe do układu chromatograficznego wprowadzamy
niemalŜe jeszcze raz taką objętość cieczy, jaka w danej chwili przepływa przez kapilary. Spowodować to
moŜe znaczne zaburzenie składu ilościowego fazy, a to jak wiadomo ma bardzo duŜy wpływ na
parametry retencji analitów. Stąd teŜ roztwór do nastrzyku powinien przygotowywany w fazie ruchomej
aby jak największym stopniu zapobiec niepoŜądanym zmianom wcześniej ustalonych parametrów.
Istnieje moŜliwość tzw. przeładowania kolumny. W zaleŜności o tego, czy za duŜe okazało się stęŜenie
wprowadzanej próbki czy jej objętość, mówi się o przeładowaniu objętościowym lub stęŜeniowym. W
trakcie zajęć omówione zostaną takie problemy, jak obecność pików frontujących i ogonujących (patrz
rysunki poniŜej).
Cz a s re te n c ji [m in ]
Czas retencji [min]
Notatki własne
Ć
WICZENIE 2
D
OBÓR WARUNKÓW ROZDZIELANIA W UKŁADZIE FAZ ODWRÓCONYCH
Dr in
Ŝ
. B. Makuch, mgr in
Ŝ
. J. Wilga
Pani Bogumiła Makuch jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej
Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej;
Pani Joanna Wilga jest doktorantką na Studium Doktoranckim przy Wydziale Chemicznym
Politechniki Gdańskiej;
jawil@wp.pl
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie dobór optymalnych warunków rozdzielenia substancji w układzie
faz odwróconych, na przykładzie ekstraktu z liści z Ginkgo bilobae.
Rysunek 1. Li
ś
cie Ginkgo bilobae
JuŜ przed wiekami odkryto, Ŝe liście Ginkgo bilobae, tej najstarszej na świecie rośliny zawierają związki
flawonoidowe i terpenoidowe, które potrafią stymulować procesy pamięciowe mózgu, wpływają
pomocniczo w zwalczaniu zaburzeń obwodu krąŜenia krwi, a takŜe w zaburzeniach pracy mózgu
spowodowanych zaburzeniami krąŜenia mózgowego, a rozmaite produkty zawierające Ginkgo robią
obecnie zawrotną karierę i są stosowane w postaci tabletek lub w roztworze.
Ekstrakty roślinne są złoŜonymi, wieloskładnikowymi mieszaninami związków znacznie róŜniących się
właściwościami chemicznymi. Dobór warunków rozdzielania moŜe być procesem trudnym i
pracochłonnym. Na ogół bywa, Ŝe nie jest moŜliwe rozdzielenie w układzie izokratycznym (stały skład
fazy ruchomej) i naleŜy stosować gradient (zmiana skokowa bądź ciągła składu fazy ruchomej).
Obecnie najczęściej stosowanymi układami rozdzielania metodą Wysokosprawnej Chromatografii
Cieczowej (HPLC) jest tzw. układ faz odwróconych (RP) i moŜna zaryzykować stwierdzenie, Ŝ e90%
wszystkich rozdzielań wykonuje się w tych układach z zastosowaniem fazy stacjonarnej typu RP – 18
tzn. Ŝel krzemionkowy modyfikowany grupą oktadecylową.
W praktyce laboratoryjnej doboru faz rozdzielania dokonuje się przez:
a – zmianę składu fazy ruchomej - zmiana ilościowego udziału rozpuszczalników,
b – zmianą pH fazy ruchomej,
c- zastosowanie pary jonowej,
e – zmiana typu fazy ruchomej.
W trakcie wykonywania ćwiczenia będą uwzględniane punkty a, b, c, e. Rozpuszczalniki stosowane jako
fazy ruchomew układach RP wg ich iły elucyjnej to woda (najsłabszy) < MeOH< ACN < EtOH < THF <
iPrOH < chlorek metylenu (najsilniejszy). W praktyce najczęściej stosuje się 4 – ry rozpuszczalniki w
róŜnych układach tj. wodę, metanol, acetonitryl i tetrahydrofuran, a parametry retencji mogą być
regulowane składem fazy ruchomej.
Podstawowa zaleŜność to wzrost zawartości rozpuszczalnika bardziej polarnego w fazie ruchomej obniŜa
wartość współczynnika retencji (k).
Bywają takie problemy rozdzielcze, które moŜna rozwiązać poprzez zamianę rozpuszczalnika w fazie
ruchomej; moŜna np. zamienić metanol na tetrehydrofuran. Przy załoŜeniu stałej siły elucyjnej fazy
ruchomej korzysta się z prostej zaleŜności:
S
T
=
ΣΣΣΣ
S
i
θθθθ
i
gdzie:
S
T
– całkowita siła elucyjna fazy ruchomej,
S
i
– siła elucyjna rozpuszczalnika
θ
i – udział molowy rozpuszczalnika w fazie ruchomej.
Przykład: mamy skład fazy ruchomej MeOH : H
2
O w stosunku objętościowym 7:3. Wówczas całkowitą
siłę elucyjną fazy ruchomej liczymy wg powyŜszej zaleŜności otrzymując:
S
T
= S
MeOH
θθθθ
+ S
H2O
θθθθ
= 2,6 x 0,7 + 0 x 0.3 = 1,82
Gdy zastąpimy metanol tetrahydrofuranem przy załoŜeniu takiej samej siły elucyjnej fazy ruchomej to
obliczenie jest następujące:
1,82 = 4,5 x X + 0 x X
→
ok. 40
czyli nowy skład fazy ruchomej będzie następujący THF : H2O 4: 6 (v/v).
Innym sposobem doboru warunków rozdzielania jest zmiana pH fazy ruchomej. W przypadku
rozdzielania związków o charakterze słabych kwasów, fazę ruchomą zakwaszamy, zaś w przypadku
rozdzielania słabych zasad fazę ruchomą alkalizujemy. Efektem takich zabiegów jest wzrost
współczynnika retencji co w konsekwencji prowadzi do rozdzielenia związków, które zbyt szybko
opuszczają kolumnę chromatograficzna. Zmiana pH powoduje cofnięcie dysocjacji.
W układach RP mogą być stosowane równieŜ inne typy faz stacjonarnych np. RP – 8, rzadziej RP
– 2, jak równieŜ Ŝel modyfikowany grupa cyjanową lub fenylową. W kaŜdym przypadku kolejność elucji
jest następująca: pierwsze eluują substancje polarne (hydrofilowe)a w dalszej kolejności substancje
niepolarne (hydrofobowe). W przypadku rozdzielania węglowodorów czas elucji jest zaleŜny od długości
łańcucha fazy związanej z Ŝelem krzemionkowym.
WYKONANIE ĆWICZENIA
W trakcie ćwiczenia dobierane będą optymalne warunki rozdzielenia substancji czynnych w ekstrakcie
Ginkgo bilobae, w układzie faz odwróconych.
Pomiar wykonany zostanie w warunkach izokratycznych,; przy mierzonej długości fali
λ
= 330 nm.
Wykorzystywane kolumny chromatograficzne:
-
LiChrospher RP-18
-
Kolumna cyjanowa
Wykorzystywane fazy ruchome:
-
MeOH : H
2
O (7:3 v/v)
-
MeOH : H
2
O (9:3 v/v)
-
MeOH: H
2
O (7:3 v/v) z dodatkiem H
3
PO
4
(1%)
-
THF:H
2
O (4:6 v/v)
-
THF:H
2
O (4:6 v/v) z dodatkiem H
3
PO
4
(1%)
-
MeOH: H
2
O (7:3 v/v) z dodatkiem H
3
PO
4
(0,1%)
-
THF:H
2
O (4:6 v/v) z dodatkiem H
3
PO
4
(0,1%)
Parametry aparatury
•
Detektor UV/DAD L – 7450 firmy Merck HITACHI
•
Pętla dozująca 20
µ
l
•
Dozownik Rheodyne 7125
•
Pompa L – 6200 firmy Merck HITACHI
Notatki własne
Ć
WICZENIE 3
R
OZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW CHROMATOGRAFICZNYCH
–
PROBLEMY
ZWIĄZANE Z DOZOWANIEM PRÓBKI
,
KOLUMNĄ
,
POMPĄ I DETEKTOREM
.
Prof. dr hab. in
Ŝ
. M. Kami
ń
ski, mgr in
Ŝ
. E. Gilgenast, mgr in
Ŝ
. G. Romanik
Pan Marian Kamiński jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej
Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej;
mknkj@wp.pl
Panie Ewelina Gilgenast i GraŜyna Romanik są doktorantkami na Studium Doktoranckim przy Wydziale
Chemicznym Politechniki Gdańskiej;
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z najstępującymi zagadnieniami: geneza oraz sposoby
rozwiązywania problemów, spotykanych w praktyce i dotyczących kolumny, dozowania, detekcji, elucji
gradientowej; zasady postępowania w celu doboru warunków rozdzielania w układach NP-HPLC;
metodyka zastosowania chromatografii Ŝelowej (GPC, SEC) do oznaczania rozkładu masy molekularnej
polimerów; obserwacja przebiegu rozdzielania barwnych substancji w kolumnie HPLC.
Streszczenie przebiegu ćwiczenia
1. Zapoznanie Uczestników z alternatywnymi sposobami postępowania, zapewniającymi zapobieganie /
eliminację problemów spotykanych w praktyce i dotyczących:
-
doboru/oceny selektywności, sprawności, rozdzielczości i przepuszczalności kolumny,
-
dozowania bardzo małych i bardzo duŜych objętości próbki oraz doboru odpowiedniego
rozpuszczalnika roztworu dozowanego do kolumny,
-
doboru właściwej metody detekcji oraz najkorzystniejszych warunków pracy najwaŜniejszych
detektorów stosowanych w HPLC (UV-VIS, RI, FLD),
-
problemów spotykanych w warunkach elucji gradientowej i sposobów ich eliminacji /
minimalizacji : zanieczyszczenie składników eluentu, obecność rozpuszczonego powietrza w
cieczach stanowiących składniki eluentu, niedoskonałość systemu synchronizacji pracy zaworów
proporcjujących i cyklicznej pracy pompy, nieodpowiednie parametry mieszalnika, „demiksja”
składników eluentu w warunkach programowania składu cieczy eluującej, wytrącanie się
składników próbki w eluencie o niskiej sile elucyjnej i innych.
2. Przykład wpływu składu eluentu na retencję i selektywność rozdzielania: chlorofili i karotenoidów
zawartych w ekstrakcie roślinnym, albo produktów naftowych, albo mieszanin innych substancji nisko i
ś
rednio polarnych (do wyboru przez uczestników grupy) oraz przedstawienie i przedyskutowanie zakresu
zastosowania detektora UV-VIS/DAD do zastosowań jakościowych oraz do określania tzw. „czystości
pików”;
3. Przedstawienie metodyki zastosowania chromatografii Ŝelowej do oznaczenia rozkładu masy
molekularnej polimeru - kalibracja „nisko-dyspersyjnymi” standardami polimeru, a następnie oznaczenie
rozkładu masy cząsteczkowej próbki polimeru (styropian, sztućce, albo fragment obudowy
styropianowej).
4. Wizualna obserwacja przebiegu rozdzielania chlorofili i karotenoidów w kolumnie szklanej w
warunkach NP-HPLC z detekcją UV-254, rejestracją w trybie Y-t. oraz kolekcją frakcji – przykład
preparatywnego zastosowania HPLC w skali „modelowej”.
Materiały, aparatura, oprogramowanie
Składniki eluentu: n-heksan, n-heptan, eter metylowo – tertbutylowy (MTBE), czterowodorofuran (THF),
acetonitryl (ew.), wszystkie o czystości „do HPLC” („HPLC grade”), albo „do elucji gradientowej”
(„gradient grade”);
Próbki i rozpuszczalniki próbek: odwodniony ekstrakt z trawy lub z liści do acetonu, „przeprowadzony”
do rozpuszczalnika o składzie eluentu, albo roztwór oleju napędowego lub nafty w n-heptanie, lub w n-
heksane o stęŜeniu 0,05g/ml; roztwór polimerów polistyrenowych w THF o stęŜeniach ok. 0.1 g/ml.
Aparatura i wyposaŜenie: A) Modułowy chromatograf cieczowy MERCK – HITACHI serii LaChrom
(pompa HPLC, dozownik Rheodyne, kolumna 250x4mm typu CN – 100 7 um, termostat kolumny,
detektor UV-VIS/DAD, detektor RI , interface, komputer, oprogramowanie „HSM”; B) Chromatograf
cieczowy z pompą strzykawkową, dozownik Rheodyne, detektor RI, rejestrator Y-t ; C) Bezpompowy
zbiornikowy moduł zasilania kolumny pod wpływem spręŜonego azotu poprzez reduktor ciśnienia, z
dozownikiem membranowym, kolumną szklaną HPLC, detektorem UV-254 i rejestratorem Y-t ; D)
Chromatograf cieczowy serii „Elite” MERCK HITACHI, sterowany komputerem oraz oprogramowanie
rejestracji i przetwarzania danych najnowszej generacji.
Przydatne w praktyce zaleŜności obliczeniowe
1.
Rozdzielczość (R
S
) - uzaleŜnia stopień rozdzielenia substancji od sprawności i selektywności
układu chromatograficznego i jest wyraŜona następującym równaniem:
2
2
1
1
4
k
k
N
R
S
+
−
=
α
α
2.
Obliczanie sprawności i innych parametrów na podstawie chromatogramu testowego:
2
2
/
1
)
(
54
,
5
l
S
L
H
C
=
2
2
/
1
)
(
54
,
5
S
l
H
L
N
C
=
=
a
b
As
=
1
,
0
0
t
L
u
C
=
•
Obliczanie sprawności osiągalnej teoretycznie w chromatografii cieczowej niezaleŜnie od
skali rozdzielania – równanie Knoxa
ν
ν
ν
C
A
B
h
teor
+
+
=
33
,
0
, gdzie
p
d
H
h
=
;
M
p
D
ud
=
ν
(dla dobrze wypełnionych i bardzo sprawnych kolumn: A=1, B=2, C=0,1)
Rys. Schemat, przedstawiający chromatogram testowy i sposób wyznaczania parametrów do
obliczenia parametrów sprawności kolumny
Znaczenie symboli:
a, b – część szerokości piku w 0,1 wysokości (patrz rys.)
α
- współczynnik selektywności
As
0,1
– współczynnik asymetrii piku w 0,1 wysokości
A, B, C – stałe dla konkretnej kolumny
D
M
– współczynnik dyfuzji molekularnej substancji rozdzielanej w eluencie
d
p
– średnica ziaren wypełnienia kolumny; wielkość ziaren wypełnienia kolumny
h- tzw. zredukowana wysokość półki teoretycznej
H – wysokość wypełnienia równowaŜna półce teoretycznej
h
teor
– wartość h otrzymana z równania Knoxa
k
2
– współczynnik retencji substancji później eluowanej
l –
odległość mierzona na chromatogramie ( w warunkach elucji izokratycznej i stałego natęŜenia
przepływu eluentu)
L
C
– długość wypełnienia kolumny
N- liczba półek teoretycznych
R
S
– stopień rozdzielenia
S
1/2
– szerokość piku w ½ wysokości
t
0
– czas martwy kolumny
u - liniowa prędkość przepływu eluentu w kolumnie
ν
- tzw. zredukowana prędkość przepływu eluentu
Uwagi i zalecenia
Sugeruję, aby Uczestnicy ćwiczenia wykorzystali czas trwania ćwiczenia takŜe dla przedyskutowania z
prowadzącymi i z innymi uczestnikami, problemów, z jakimi spotkali się w swojej praktyce stosowania
HPLC.
Literatura
1.
Chromatografia cieczowa – praca zbiorowa pod redakcją M. Kamińskiego, CEEAM, Gdańsk
2004
2.
Z. Witkiewicz – Podstawy chromatografii, WNT, Warszawa 1995
Notatki własne
Ć
WICZENIE 4.
A
NALIZA ILOŚCIOWA ZWIĄZKÓW W PROBKACH
dr in
Ŝ
. A. Kot-Wasik
Pani Agata Kot-Wasik jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej
Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej;
agata@chem.pg.gda.pl
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest przygotowanie krzywej kalibracyjnej metodą wzorca zewnętrznego do oznaczenia
zawartości fluoksetyny w próbce.
Charakterystyka fluoksetyny
Produkcja, leków, choć tak poŜyteczna dla ludzi i zwierząt, moŜe stać się teŜ dla nich zagroŜeniem.
Stosowanie ogromnej ilości antybiotyków, hormonów, środków przeciwbólowych czy uspokajających,
stanowi powaŜny problem w dzisiejszym świecie. Stąd środki farmaceutyczne podawane ludziom są w
dalszej kolejności obecne w mierzalnych stęŜeniach w wodach powierzchniowych, podziemnych jak
równieŜ wodzie pitnej. Korzystanie z wody zanieczyszczonej przez pozostałości farmaceutyków,
spoŜywanie produktów pochodzenia zwierzęcego zawierających pozostałości śladowe ilości leków, a
takŜe ich metabolitów, zaburza równowagę w organizmie, oraz potęguje problem tak juŜ niebezpiecznego
zjawiska lekooporności.
Do leków antydepresyjnych najnowszej generacji zaliczane są selektywne inhibitory
wychwytu zwrotnego serotoniny. Do leków tych naleŜy m.in. fluoksetyna, którą w
1988 roku wprowadziła na rynek firma Eli Lilly pod nazwą handlową Prozac®. Jedna
kapsułka np.: Prozac®, poza wieloma innymi składnikami, zawiera 20 mg
fluoksetyny.
Oznaczenie chromatograficzne.
Techniki chromatograficzne są typowym przykładem technik opartych na pomiarze względnym czyli
inaczej mówiąc na porównaniu sygnału detektora uzyskanego dla:
•
próbki wzorcowej, w której znane jest stęŜenie analitu;
•
próbki badanej.
W związku z tym konieczne jest przygotowanie krzywych kalibracyjnych dla wszystkich analizowanych
związków. Krzywe takie wyznacza się w oparciu o analizę próbek wzorcowych.
Analiza jakościowa:
Na podstawie zgodności czasów retencji analitów obecnych w próbce badanej i we
wzorcu
Na podstawie widma UV lub/i MS
Na podstawie zgodności stosunku sygnału dla dwóch róŜnych długości fal
A
1
A
2
A
1
/A
2
= constans dla danego analitu
Analiza ilościowa
metoda wzorca zewnętrznego
W tym celu naleŜy przygotować szereg rozcieńczeń
analitu, nastrzyknąć do układu chromatograficznego i
wyznaczyć zaleŜność powierzchni piku od stęŜenia.
A następnie dokonać analizy chromatograficznej i
znaleźć wartość powierzchni piku dla badanego
analitu, po czym obliczyć stęŜenie (z krzywej
kalibracyjnej y = ax + b lub z proporcji
A/C = A
x
/C
x
gdzie, C
x
= C*A
x
/ A )
Chromatogramy wzorcowych roztworów substancji
o st
ę
Ŝ
eniach róznych st
ę
Ŝ
eniach.
metoda dodatku wzorca
metoda wzorca wewnętrznego
metoda normalizacji
y = 129,47x - 3,6134
R
2
= 0,9998
0
100
200
300
400
500
600
700
0
1
2
3
4
5
6
St
ę
Ŝ
enie [C]
P
o
le
p
o
w
ie
rz
c
h
n
i
p
ik
u
[
A
]
Warunki analizy chromatograficznej umozliwiaj
ą
cej oznaczenie zawarto
ś
ci fluksetyny
Elementy układu pomiarowego
Rodzaj elementu i parametry pracy
Chromatograf cieczowy
HPLC-UV-DAD, Agilent seria 1100
Składniki fazy ruchomej
A: MeOH (0,1% TFAA) oraz B: H
2
O (0,1% TFAA)
Skład
40% MeOH : 60% H
2
O
Faza ruchoma
Prędkość przepływu
0.5 ml/min
Kolumna
Discovery RP Amide 15cm x 3mm, 5µm
Detektor
UV – 226nm
Wielkość nastrzyku
20µl
Czas trwania analizy
20 min
Przebieg ćwiczenia:
Przygotować wzorzec fluoksetyny o stęŜeniu 100mg/mL i nastrzyknąć.
W kolbce miarowej o objętości 50 ml umieścić 5 mg wzorca fluoksetyny [FLU].
PoniewaŜ związek ten dobrze rozpuszcza się w metanolu, dopełnić kolbkę do kreski
tymŜe rozpuszczalnikiem, a tym samym otrzyma się wzorzec o stęŜeniu 100µg/ml.
Chromatogram HPLC-DAD-MS uzyskany w trakcie analizy roztworu wzorcowego fluoksetyny
(maprotylina
jest tutaj wzorcem wewn
ę
trznym) wraz z widmami UV i MS.
220 240 260 280
300 320
340 360 380
mAU
0
50
100
150
200
250
DAD1, 9.541 (0. 6 mAU, Bln) of CHECKV15.D
DAD1, 12. 074 (1.0 mAU, - ) of CHECKV15.D
DAD1, 10. 474 (291 mAU, - ) of CHECKV15.D
Długo
ś
ć
fali [nm]
A
220
240 260 280 300 320
340 360 380
mAU
0
100
200
300
400
500
600
DAD1, 6.034 (1.5 mAU, - ) of CHECKV15.D
DAD1, 7.981 (4.1 mAU, - ) of CHECKV15.D
DAD1, 6.714 (686 mAU, - ) of CHECKV15.D
Długo
ś
ć
fali [nm]
B
Sporządzenie rozcieńczeń roztworu wzorcowego fluoksetyny;
Metodą serii rozcieńczeń w kolbkach o pojemności 10 ml wyposaŜonych w nakrętki z
tworzywa sztucznego przygotować roztwory wzorcowe o stęŜeniach: 30, 20, 10, 5, 2, 0.7,
0.3, 0.2, 0.02, 0.001 µg/ml. Z tak przygotowanych próbek do chromatografu cieczowego
wprowadzić po 20µl kaŜdego roztworu.
Nastrzyknąć ( 3 razy) roztwór wzorcowy o najwyŜszym stęŜeniu;
Nastrzyknąć (3 razy) roztwór o niŜszym stęŜeniu;
Potraktować tą analizę jako analizę próbki i policzyć stęŜenie na podstawie jednego punktu (z
analizy pierwszej); zastanowić się nad źródłami błędu;
Na podstawie analizy nr 1 oraz analizy nr 2 narysować krzywą kalibracyjną; określic jej
parametry;
Nastrzyknąć mieszaninę o trzecim stęŜeniu (3 razy) traktując ją jako analizę próbki i policzyć
stęŜenie na podstawie dotąd otrzymanych wyników; zastanowić się nad źródłami błędów;
Uzupełnić krzywą kalibracyjną o kolejny punkt;
Powtórzyć schemat postępowania aŜ do uzyskania 5-7 punktowej krzywej kalibracyjnej;
Krzywa wzorcowa dla fluoksetyny otrzymana na podstawie analiz z wykorzystaniem detektora DAD
Wyznaczyć stęŜenie fluoksetyny w roztworze o nieznanym stęŜeniu.
Notatki własne
Wszelkie prawa zastrze
Ŝ
one. Nieautoryzowane rozpowszechnianie cało
ś
ci lub fragmentów
niniejszych materiałów jest zabronione. Utwór nie mo
Ŝ
e by
ć
powielany ani rozpowszechniany
za pomoc
ą
urz
ą
dze
ń
elektronicznych, mechanicznych, kopiuj
ą
cych, nagrywaj
ą
cych i innych bez
pisemnej zgody posiadacza praw autorskich. Wykonywanie kopii jak
ą
kolwiek metod
ą
powoduje
naruszenie praw autorskich do niniejszej publikacji.