Biochemia dla Biologii nr ETCS
Ś
ledzenie przebiegu enzymatycznej hydrolizy białka
Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii
Przedmiot prowadzony przez Katedrę Biochemii
1
ZADANIE 5
TYTUŁ: ŚLEDZENIE PRZEBIEGU ENZYMATYCZNEJ HYDROLIZY BIAŁKA
Forma zaliczenia: Kolokwium z części teoretycznej do ćwiczeń oraz praktyczne zaliczenie
ć
wiczeń
Materiały i urządzenia:
• Materiały
1. pepsyna
2. żelatyna
3. ziemniak
4. ugotowane białko jaja kurzego
5. fenoloftaleina
6. czerwień metylowa
7. benzydyna
8. węglan sodu
9. NaOH 0,02N
10. HCl 0,2N
11. CH
3
COOH 0,2N
12. bufor pH=6 i pH=7
13. zobojętniony roztwór formaldehydu
14. 3% H
2
O
2
15. KCN
16. woda destylowana
• Urządzenia
1. probówki
2. palniki
3. zlewki
4. pipety
5. łaźnie wodne
INFORMACJE TEORETYCZNE:.
Pepsyna jest to najważniejszy enzym trawienny soku żołądkowego działający w silnie
kwaśnym środowisku. Wykazuje ona specyficzność względem aminokwasów tworzących
rozkładane przez nią wiązania peptydowe, w które jest wprzęgnięta grupa aminowa
aminokwasów aromatycznych.
Trypsyna jest to hydrolaza peptydylopeptydowa o dużej specyficzności hydrolizująca
tylko wiązania peptydowe utworzone przez grupę karboksylowa lizyny lub argininy.
Wszystkie peptydy powstające pod działaniem trypsyny maja lizynę lub argininę jako
końcowe aminokwasy z wolna grupa karboksylowa. W miarę postępowania hydrolizy białka
przez trypsynę pojawia się w roztworze coraz więcej grup karboksylowych, które po
uprzednim zablokowaniu grup aminowych przez formaldehyd można oznaczyć ilościowo,
miareczkując wodorotlenkiem sodowym wobec fenoloftaleiny. Ilość zasady zużytej do
miareczkowania jest, wiec miara stopnia zhydrolizowania białka.
Katalaza jest jednym z najbardziej aktywnych enzymów zabezpieczających organizm
przed nagromadzeniem szkodliwego nadtlenku wodoru. Powoduje rozkład nadtlenku wodoru
niezależnie od obecności akceptora tlenu. Proces oksydoredukcyjny zachodzi pomiędzy
dwoma cząsteczkami nadtlenku wodoru:
Biochemia dla Biologii nr ETCS
Ś
ledzenie przebiegu enzymatycznej hydrolizy białka
Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii
Przedmiot prowadzony przez Katedrę Biochemii
2
H
2
0
2
+ H
2
0
2
=> 0
2
+ H
2
0
Peroksydaza jest enzymem roślinnym; w większych ilościach znajduje się w korzeniu
chrzanu. Rozkłada nadtlenek wodoru do wody przy wykorzystaniu elektronów i protonów
pobranych ze związku organicznego.
donor + H
2
O
2
==> utleniony donor + H
2
O
Donorami wodoru dla peroksydaz mogą być fenole, aminy i niektóre związki heterocykliczne.
Peroksydazy utleniają benzydynę do błękitu benzydynoweg
Przebieg doświadczenia:
Podzadanie 1:
hydroliza białka przez pepsynę – wpływ pH na aktywność pepsyny
Do sześciu probówek wlać roztwory odczynników według poniższego wykazu.
2 ml pepsyny przed dodaniem do probówki 5 zagotować przez 2 minuty i oziębić.
Do 2 ml pepsyny przed dodaniem do probówki 6 wprowadzić 2 krople
fenoloftaleiny i roztwór węglanu sodowego (odczynnik stołowy) do barwy różowej.
Pozostawić w łaźni wodnej o temperaturze 40°C przez 5 minut, następnie dodać
krople czerwieni metylowej i rozcieńczonego kwasu solnego do barwy różowej.
Objętość roztworów (ml) w poszczególnych
probówkach
Odczynniki
nr 1
nr 2
nr 3
nr 4
nr 5
nr 6
0,2 N HCl
2
2
2
0,2 N CH
3
COOH
2
Bufor pH=6
2
Bufor pH=7
2
Pepsyna natywna
2
2
2
2
Pepsyna zinaktywowana ciepłem
2
Pepsyna zinaktywowana zasadą
2
Do każdej probówki wrzucić krążek białka jaja ugotowanego na twardo. Wszystkie
próby umieścić w łaźni wodnej w temperaturze 40°C na dwie godziny. Zapisać
obserwacje i wyciągnąć odpowiednie wnioski.
Podzadanie 2: oznaczanie szybkości reakcji trawienia żelatyny przez trypsynę
Do 5 erlenmajerek na 100 ml wprowadzić po 10 ml zobojętnionego roztworu
formaldehydu. Do kolby na 100 ml wlać 6 ml roztworu enzymu ogrzanego
uprzednio do temperatury 37°C i 24 ml roztworu żelatyny. Po wymieszaniu pobrać
natychmiast 5 ml mieszaniny i wprowadzić do jednej z erlenmajerek zawierającej
formaldehyd i zmiareczkować 0,02 N NaOH wobec fenoloftaleiny do różowego
zabarwienia (próba kontrolna).
Resztę trawionej mieszaniny inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37°C
i pobierać po 5, 15, 30 i 60 minutach - 5 ml mieszaniny do analogicznego
miareczkowania jak przy próbie kontrolnej. Po odjęciu ilości mililitrów 0,02 N
NaOH przypadających na próbę kontrolna wykreślić zależność ilości mililitrów
roztworu NaOH zużytego na miareczkowanie prób badanych od czasu.
Biochemia dla Biologii nr ETCS
Ś
ledzenie przebiegu enzymatycznej hydrolizy białka
Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii
Przedmiot prowadzony przez Katedrę Biochemii
3
Podzadanie 3: wykrywanie katalazy
Umyty i obrany ziemniak utrzeć na tarce. Miazgę włożyć do woreczka płóciennego
i zanurzyć w zlewce zawierającej 200 ml wody destylowanej. Otrzymuje się wodny
wyciąg z ziemniaka zawierający enzymy oraz wypłukana skrobie. Gdy skrobia
opadnie na dno zlewki płyn znad osadu pobrać do doświadczeń. Do dwóch
probówek wlać po 2 ml wyciągu ziemniaczanego. Do pierwszej dodać kilka kropli
3% roztworu nadtlenku wodoru. Do drugiej kilka kropli KCN - zamieszać
i następnie dodać kilka kropli 3% roztworu nadtlenku wodoru. Zapisać obserwacje
i wyciągnąć odpowiednie wnioski.
Podzadanie 4: wykrywanie peroksydazy
Do dwóch probówek wlać po 2 ml wyciągu ziemniaczanego. Do pierwszej dodać
kilka kropli benzydyny oraz kilka kropli 3% roztworu nadtlenku wodoru. Do
drugiej kilka kropli KCN -zamieszać i następnie dodać kilka kropli benzydyny oraz
kilka kropli 3% roztworu nadtlenku wodoru. Zapisać obserwacje i wyciągnąć
odpowiednie wnioski.
LITERATURA
1. Biochemia”, L. Stryer, PWN, Warszawa 1997 i nowsze
2. „Biochemia Harpera”, R. K. Murray i wsp., PZWL, Warszawa 1995 i nowsze
3. Cytobiochemia”, L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa 1995, 2002
4. Biochemia- Krótkie Wykłady”, B. D. Hames i wsp., PWN, Warszawa 2002
5. Zarys Biochemii Cz.1, Karlson P., Pwn W-Wa 1987
6. Fizjologia komórki, Giese A., PWN W-wa 1985
7. Chemia bionieorganiczna, Kafarski P., Lejczak B. PWN Warszawa 1994
8. Podstawy biofizyki, Pilawski, PWN Warszawa
9. Podstawy Cytofizjologii, Kawiak J. i inni PWN, Warszawa 1996
10. Ćwiczenia z biochemii”, L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa 1999, 2003
11. Ćwiczenia z biochemii, Strzeżek J wyd. ART. 1997
12. Ćwiczenia z biochemii, Logoń A. wyd. ART. 1997