1
Badania serologiczne w
diagnozowaniu ostrych
zaka
ż
e
ń
wirusowych
Maciej Przybylski
Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej WUM
Przydatno
ść
metod serologicznych (1)
Gdy wykrycie przeciwciał daje miarodajn
ą
informacj
ę
na temat
przyczyny objawów
zaka
ż
enie rzadkie w populacji (niski „poziom tła”)
czas potrzebny do wytworzenia przeciwciał – zaka
ż
enia o
długim czasie inkubacji, zaka
ż
enia przewlekłe
du
ż
a szansa,
ż
e jest to zaka
ż
enie pierwotne (zaka
ż
enia u
małych dzieci – ocena serokonwersji)
zaka
ż
enie
≡
zachorowanie
Gdy nie ma mo
ż
liwo
ś
ci wykonania bada
ń
bezpo
ś
rednich
wirus trudny w hodowli
wirus niebezpieczny
trudno
ś
ci w dotarciu do ogniska zaka
ż
enia
miano wirusa w materiale klinicznym poni
ż
ej progu
wykrywalno
ś
ci rutynowych metod diagnostyki bezpo
ś
redniej
Badania epidemiologiczne
ocena stanu zaka
ż
enia populacji – badania serologiczne na
reprezentatywnej grupie
ocena skuteczno
ś
ci szczepie
ń
•
badania serologiczne populacji
•
wyznaczenie miana ochronnego
•
ocena odpowiedzi poszczepiennej
Specyficzne sytuacje kliniczne
potwierdzenie zaka
ż
enia wrodzonego – IgM u noworodka
badania serologiczne biorców i dawców przeszczepów
Przydatno
ść
metod serologicznych (2)
Badania serologiczne w
rozpoznawaniu zaka
ż
e
ń
Rutynowo wykonywane dla:
HIV
HAV
HBV
HCV
wirusa kleszczowego zapalenia mózgu
wirusów gor
ą
czek krwotocznych
Diagnostyka serologiczna ostrych
zaka
ż
e
ń
wirusowych
wirusowe choroby wieku dzieci
ę
cego
zaka
ż
enia herpeswirusamiwirusami limfotropowymi:
mononukleoza zaka
ź
na (i inne formy zaka
ż
e
ń
EBV)
CMV
HHV-6
serodiagnostyka zaka
ż
e
ń
OUN
wirusowe zapalenie wsierdzia i mi
ęś
nia sercowego
opryszczka narz
ą
dów płciowych
Wirusowe zapalenie mi
ęś
nia
sercowego
Diagnostyka:
badania serologiczne
wykrywanie wirusowych kwasów nukleinowych we krwi obwodowej
biopsja (ocena histopatologiczna, hybrydyzacja in situ, NAAT)
Czynniki brane pod uwag
ę
:
enterowirusy (wirusy Coxsackie)
wirusy parainfluenzy
wirusy grypy
CMV
EBV
HHV-6
parwowirus B19
wirus ró
ż
yczki
2
European Heart Journal
doi:10.1093/eurheartj/ehq493
Grupa badana: 124 pacjentów z objawami zapalenia mi
ęś
nia
sercowego
Badania histopatologiczne:
nasilone zmiany zapalne: 4 (3%)
lekki naciek: 40 (32%)
bez znamion stanu zapalnego: 70 (56%)
Badania serologiczne:
Badanie surowic parzystych (odst
ę
p mi
ę
dzy próbkami surowic 7-28
dni)
wykrywanie IgM, IgA oraz IgG
ocena dynamiki miana (4-krotny wzrost)
Badania bezpo
ś
rednie: wykrywanie wirusowych kwasów
nukleinowych w bioptatach mi
ęś
nia sercowego
Kryteria dla dodatniego wyniku bada
ń
serologicznych: wykrycie
swoistych IgM przynajmniej w jednej próbce surowicy lub wykrycie
znacz
ą
cego wzrostu miana IgA lub IgG
Wyniki bada
ń
serologicznych:
Dodatnie wyniki bada
ń
: 20 pacjentów (16%)
Wykryto przeciwciała przeciw:
enterowirusom (10)
adenowirusom (1)
parwowirusowi B19 (2)
CMV (3)
HHV-6 (3)
EBV (1)
Wyniki bada
ń
bezpo
ś
rednich (wykrycie
wirusowego DNA lub RNA w bioptacie)
Dodatnie wyniki: 58 pacjentów (47%)
Wykryte wirusy
Enterowirus 5 (4%)
Adenowirus 3 (2%)
Parwowirus B19 33 (27%)
CMV 0
HHV-6 10 (8%)
EBV 7 (6%)
zaka
ż
enie 2 lub wi
ę
cej wirusami 13 (10%)
Porównanie wyników bada
ń
serologicznych i wykrywania wirusowych
kwasów nukleinowych
Diagnostyka serologiczna zaka
ż
e
ń
EBV u osób dorosłych
Standardowy panel bada
ń
w diagnostyce
serologicznej EBV obejmuje wykrywanie
przeciwciał w klasach IgM, IgA oraz IgG
przeciwko
białkom kapsydu (VCA)
białku wczesnemu (EA)
antygenowi j
ą
drowemu EBV (EBNA)
Znaczenie diagnostyczne przeciwciał
przeciw EBV
VCA IgM: wska
ź
nik ostrej fazy zaka
ż
enia, pojawiaj
ą
sie jako pierwsze w
zaka
ż
eniu pierwotnym a tak
ż
e w przebiegu reaktywacji wirusa latentnego
VCA IgG: wska
ź
nik przebytego zaka
ż
enia, utrzymuja si
ę
latami
EA IgM: podobnie jak VCA IgM s
ą
markerem aktywnego zaka
ż
enia, pojawiaj
ą
sie w przebiegu infekcji pierwotnej i rzadko przy reaktywacjach. Reaktywno
ść
znacznie rzadsza w porównaniu z VCA IgM
EA IgG: charakterystyczne dla fazy zdrowienia. Wyst
ę
puj
ą
u niewielkiego
odsetka zaka
ż
onych
EBNA IgM: znaczenie nie w pełni okre
ś
lone. Prawdopodobnie zwi
ą
zane z
ustalaniem stanu latencji EBV
EBNA IgG: pojawiaj
ą
si
ę
stosunkowo pó
ź
no po wyzdrowieniu (~3 miesi
ą
ce),
utrzymuj
ą
si
ę
latami
3
Typowy wzór przeciwciał w
mononukleozie zaka
ź
nej
Najcz
ęś
ciej obserwowane wzory
przeciwciał swoistych wobec EBV
+
+/(-)
+/(-)
+/(-)
+
+
reaktywacja wirusa latentnego
+
(-)
(-)
(-)
+
(-)
zakażenie przebyte
+
+/(-)
+/(-)
(-)
+
+/(-)
zakażenie pierwotne
(rekonwalescencja)
(-)
+
+/(-)
+/(-)
(-)
+
ostre zakażenie pierwotne
(faza późna)
(-)
(-)
(-)
+/(-)
(-)
+
ostre zakażenie pierwotne
(faza wczesna)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
brak zakażenia
EBNA
IgG
EBNA
IgM
EA
IgG
EA
IgM
VCA
IgG
VCA
IgM
Przypadek I
Immunokompetentna osoba dorosła, ostra objawowa
reaktywacja wirusa latentnego
Limfohistiocytoza hemofagocytarna. Prawdopodobnie niedobory odporno
ś
ci
komórkowej. Przebieg ci
ęż
ki z naciekiem histiocytarnym w skórze i narz
ą
dach
wewn
ę
trznych, powa
ż
nymi zaburzeniami krzepni
ę
cia i uszkodzeniem w
ą
troby
Przypadek II
Diagnostyka serologiczna chorób
wieku dzieci
ę
cego (1)
Odra – badanie surowic parzystych, IgM ELISA, N=108
Pacjenci rozpoznani przez pediatr
ę
na podstawie obrazu
klinicznego
Pierwsza próbka surowicy pobrana w momencie pojawienia si
ę
wysypki, druga 14 dni pó
ź
niej
Wyniki:
dodatnie
ujemne „szara strefa”
Faza ostra choroby:
69
30
1
Faza zdrowienia:
95
4
1
JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Jan. 2000, p. 99–104
Diagnostyka serologiczna chorób
wieku dzieci
ę
cego (2)
Nagminne zapalenie przyusznic, N=155
Badanie serologiczne – pojedyncza próbka surowicy pobrana w
fazie ostrej choroby, wykrywanie swoistych IgM
Badania genetyczne (RT-PCR): wykrywanie wirusowego RNA w
próbkach sliny i moczu pobranych w fazie ostrej choroby
(równocze
ś
nie z surowic
ą
)
Wyniki:
wyniki
wyniki
dodatnie
ujemne
wirusowe RNA w
ś
linie
122
33
wirusowe RNA w moczu
66
89
swosite IgM w surowicy
38
117
Can J Infect Dis Med Microbiol 2009 Vol 20 (4)
4
Diagnostyka serologiczna w
reaktywacji VZV
Metody:
wykrywanie VZV DNA w surowicy – PCR w czasie
rzeczywistym (PCR)
metody serologiczne: wykrywanie swoistych przeciwciał,
badanie surowic parzystych, I próbka pobrana w 0-26 dniu od
wystapienia objawów, II próbka w 14-40 dniu od wyst
ą
pienia
objawów, minimalny odst
ę
p mi
ę
dzy próbkami: 14 dni
•
odczyn wi
ą
zania dopełniacza dla VZV IgG (CF)
•
odczyn immunofluorescencji po
ś
redniej dla VZV IgG (IFA)
•
ELISA dla VZV IgM w pierwszej próbce surowicy (IgM1)
•
ELISA dla VZV IgM w drugiej próbce surowicy (IgM2)
Wyniki
SWISS MED WKLY 20 08;138:47–51
Opryszczka narz
ą
dów płciowych
(ONP)
Rozpoznanie opiera si
ę
na:
objawach klinicznych
metodach bezpo
ś
rednich
metodach serologicznych
Objawy kliniczne
owrzodzenia
ś
luzówki lub skóry narz
ą
dów płciowych (mo
ż
liwa inna lokalizacja
zmian)
miejscowe powi
ę
kszenie w
ę
złów chłonnych
gor
ą
czka
dyzuria
Podobne objawy obserwuje si
ę
przy:
zaka
ż
eniu Chlamydia trachomatis
kandydiazach
kile
wrzodzie mi
ę
kkim
zaka
ż
eniach Klebsiella granulomatis
ś
wierzbie
urazach
alergiach
liszajcu
u wi
ę
kszo
ś
ci pacjentów zaka
ż
enie narz
ą
dów płciowych HSV-1/HSV-2 jest
bezobjawowe
Rozpoznanie na podstawie objawów klinicznych w
odniesieniu do wyników bada
ń
diagnostycznych
wykazało:
u 37% pacjentów ze zmianami „wysoce wskazuj
ą
cymi
na opryszczk
ę
” nie wykryto HSV metodami
bezpo
ś
rednimi (hodowla, PCR), byli te
ż
seronegatywni
u 50% pacjentów ze zmianami „nie wskazuj
ą
cymi na
opryszczk
ę
” wykryto HSV-1 lub HSV-2
CLIN MICROBIOL REV 1999, p. 1–8 Vol. 12, No. 1
Metody diagnostyczne
cytologia
(Tzank/Papanicolau)
izolacja wirusa w hodowli
wykrywanie antygenów
HSV
PCR, PCR w czasie
rzeczywistym
serologia
Typy opryszczkowego
zapalenia błon
ś
luzowych
i skóry narz
ą
dów
płciowych
bezobjawowe
zmiany pierwotne
nawroty/reaktywacje
5
Poziom serokonwersji HSV-1/HSV-2
w grupach wiekowych
Diagnostyka na podstawie wyników
bada
ń
serologicznych
Zaka
ż
enie pierwotne: „okienko serologiczne” mo
ż
e trwa
ć
kilka
tygodni
okres wyl
ę
gania objawowego zaka
ż
enia HSV-1/HSV-2 ~ 7-20 dni.
Zaka
ż
enie wynikaj
ą
ce z reaktywacji:
A% zaka
ż
onych (dodatni wynik serologii)
z tego B% ulega latencji,
z tego C% ulega reaktywacjom
z tego D% przebiega z objawami
Około 20% pacjentów z przeciwciałami przeciw
HSV-2 nie wykazuje objawów zaka
ż
enia lub
zmiany s
ą
trudne do zaobserwowania. U 60%
pacjentów serododatnich objawy zaka
ż
enia
nie s
ą
rozpoznawane przez lekarzy ani
pacjentów jako zmiany wywołane przez
wirusa opryszczki.
Wykrycie przeciwciał umo
ż
liwia postawienie
diagnozy w przypadkach, w których metody
wirusologiczne (izolacja wirusa, wykrywanie
antygenów lub PCR) s
ą
niepraktyczne lub
daj
ą
wyniki ujemne.
CLIN MICROBIOL REV 1999, p. 1–8 Vol. 12, No. 1
Czuło
ść
metod bezpo
ś
rednich (1)
Przykład I
36,471 próbek,
z 1087 próbek wyizolowano w hodowli HSV (3,0%)
ale: 12% je
ż
eli były zmiany i 1,7% je
ż
eli nie było zmian
w 4415 próbkach wykryto DNA HSV (12%)
ale: 37% je
ż
eli były zmiany i 8,4% je
ż
eli nie było zmian
(JID 2003:188)
Przykład II
HSV-1 wykryto w 26 (24%) ze 110 próbek (qPCR) i w 24 (22%) metod
ą
izolacji w hodowli
HSV-2 wykryto w 40 (36%) ze 110 próbek (qPCR) i w 30 (27%) metod
ą
izolacji w hodowli
(HSV-1 + HSV-2 = 66%)
(Journal of Clinical Virology 29, 2004, 120–126)
Czuło
ść
metod bezpo
ś
rednich (2)
71%
34%
Wykrycie wirusa w
przypadku
reaktywacji
78
63
Reaktywacje
(% pacjentów)
61%
65%
Wykrycie wirusa przy
braku objawów
87%
72%
Wykrycie wirusa w
typowym materiale
Pacjenci z objawami
Pacjenci “bez
uprzedniej historii
ONP”
NEJM March 23, 2000 884-850
Stosowane metody
serologiczne:
HSV Ig EIA (jako
ś
ciowe, nie
ró
ż
nicuje typów wirusa)
HSV-1, HSV-2 IgG EIA
(jako
ś
ciowe)
point-of-care
(immunobloting, ró
ż
nicuje
HSV-1 i HSV-2, jako
ś
ciowe)
HSV-1 IgM, HSV-2 IgM
(jako
ś
ciowe)
Przydatno
ść
metod
serologicznych:
pacjent ma objawy
mo
ż
na u
ż
y
ć
metod
bezpo
ś
rednich do
wykrycia wirusa
pacjent bezobjawowy
nie ma mo
ż
liwo
ś
ci
diagnostyki
bezpo
ś
redniej
TAK albo nie wiadomo
TAK
NIE
nie wiadomo (okienko, zak.
bezobjawowe)
NIE
NIE
TAK (okienko)
NIE
TAK
TAK
TAK
TAK
pacjent ma opryszczkę
narządów płciowych
przeciwciała w surowicy
Wirus wykryty w zmianach
6
Konkluzja
1.
Ocena wyników serologii w kontek
ś
cie innych danych na temat pacjenta:
objawy (lub brak)
wywiad z pacjentem i partnerem (partnerami)
czy wyst
ę
puje promiskuityzm
ocena populacji, z której pochodzi pacjent jako wysokiego lub niskiego ryzyka
ko
ń
cowa ocena „wysokiego lub niskiego prawdopodobie
ń
stwa
przedtestowgo”
po czym nast
ę
puje wykrycie przeciwciał (lub niewykrycie)
(Australian Family Physician Vol. 34, No. 12, December 2005 )
2.
Metody serologiczne s
ą
niezalecane w diagnozowaniu opryszczki narz
ą
dów
płciowych, nale
ż
y u
ż
ywa
ć
najczulszej i najbardziej swoistej z dost
ę
pnych metod
bezpo
ś
rednich. Edukacja pacjenta na temat rozpoznawania objawów (lokalizacja,
wygl
ą
d, rozwój i zej
ś
cie) ogranicza znacz
ą
co liczb
ę
pacjentów „zaka
ż
onych
bezobjawowo”
(Guidelines for the laboratory diagnosis of genital herpes in eastern European countries,
Eurosurveillance, 45, 2010)