Budowa chromatyny i transkrypcja
Dr Radek Tomaszewski
radek@ibb.waw.pl
Pracownia Biologii Molekularnej Roślin
1. CHROMATYNA
W komórkach eukariotycznych DNA jądrowy występuje w postaci skondensowanej, tworząc kompleks
nukleoproteinowy zwany chromatyną. Kondensacja DNA możliwa jest dzięki oddziaływaniom z białkami o
charakterze zasadowym, głównie histonami. Chromatyna ma budowę regularną, a jej podstawową jednostkę
strukturalną stanowi nukleosom, który obejmuje fragment DNA o długości około 200 par zasad, nawinięty na
białkowy rdzeń zbudowany z histonów (Kornberg, 1974). Nukleosomowy typ budowy chromatyny oraz sama
struktura nukleosomu są uniwersalne u wszystkich Eukaryota.
1.1 NUKLEOSOM - PODSTAWOWA JEDNOSTKA STRUKTURALNA CHROMATYNY
W skład nukleosomu wchodzi odcinek DNA o długości około 200 par zasad, tzw. cząstka rdzeniowa (ang. core
particle) oraz cząsteczka histonu łącznikowego (ang. linker histone). Cząstkę rdzeniową tworzy regularny
kompleks 8 histonów rdzeniowych (ang. core histones) (po 2 cząsteczki histonów H2A, H2B, H3 i H4)
owiniętych fragmentem DNA o długości 146 par zasad, który tworzy niecałe 2 zwoje (Wolffe, 1994b). Sposób
oddziaływania histonów rdzeniowych w oktamerze przypomina �uścisk dłoni� (ang. hand shake), a kluczową
rolę w interakcjach między różnymi histonami rdzeniowymi przypisuje się charakterystycznym motywom
strukturalnym w cząsteczkach histonów zwanym �zwinięciem� (ang. histone fold) (Arents i Moudrianakis,
1995).
Istnieją dwa modele opisujące położenie histonu łącznikowego w obrębie nukleosomu. Pierwszy zakłada, że
jego domena globularna (zob. Wstęp, rozdział 1.2) wiąże się od zewnątrz i spina obie nici nukleosomowego
DNA w miejscu ich wejścia i zejścia z powierzchni oktameru, dodatkowo oddziałując z mniejszą bruzdą DNA w
rejonie osi symetrii nukleosomu (ang. dyad axis) (Wolffe, 1994b). Drugi model zakłada, że H1 wiąże się z dużą
bruzdą DNA asymetrycznie w stosunku do osi nukleosomu i od wewnątrz DNA owiniętego wokół oktameru
(Pruss i wsp., 1996). Histon łącznikowy jest spośród wszystkich histonów nasłabiej związany z DNA i
oddysocjowuje w roztworach o sile jonowej przekraczającej 0.35 M NaCl (Stein, 1979).
Odkładanie nukleosomów w komórce jest sprzężone z replikacją DNA (Almouzni i Wolffe, 1993). Wiadomo, że
u człowieka w wiązaniu acetylowanych histonów H3 i H4 do DNA bierze udział kompleks CAF-1 (ang.
chromatin assembly factor), natomiast w dołączaniu H2A i H2B uczestniczy białko NAP-1 (ang. nucleosome
assembly protein) (Krude i Elgin, 1996). Z kolei w oocytach Xenopus proces odkładania nukleosomów
kontroluje nukleoplazmina (Laskey i wsp., 1978) oraz czynniki N1/N2 (Kleinschmidt i Franke, 1982) (zob.
również: Wstęp, rozdział 3.1.1).
Chromatyna eukariotyczna daje się łatwo trawić nukleazą z Micrococcus (ang. Micrococcal nuclease, MNase),
która przecina DNA między nukleosomami, tzw. DNA łącznikowe (ang. linker DNA). Proces trawienia jest
wieloetapowy, a kolejne etapy prowadzą do uzyskania produktów odpowiadających poszczególnym poziomom
organizacji nukleosomu. W pierwszej fazie trawienia powstaje produkt równy średniej odległości między
nukleosomami (ang. nucleosomal spacing), który w zależności od organizmu i typu tkanki może wahać się od
160 do 220 par zasad (van Holde, 1989). W dalszym etapie trawienia degradacji ulega łącznikowy DNA, a
produkt zostaje skrócony do odcinka o długości około 160 par zasad odpowiadającego tzw. chromatosomowi,
który stanowi cząstkę rdzeniową wraz ze zasocjowanym z nią histonem H1 (Simpson, 1978). Dalsze trawienie
nukleazą prowadzi do usunięcia H1 i otrzymania ściśle oddziałującego z oktamerem fragmentu DNA o długości
146 par zasad.
1.2 HISTONY
Wszystkie histony mają charakter zasadowy. Właściwość ta wynika z wysokiej zawartości lizyny i argininy.
Histony rdzeniowe zbudowane są z domeny globularnej oraz z niezestrukturalizowanych fragmentów N- i C-
końcowych, tzw. �ogonów�. Część globularna charakteryzuje się regularnym rozmieszczeniem ładunków
elektrycznych i odpowiada za interakcje histonów między sobą oraz za wiązanie się z DNA. Funkcja
�
ogonów� nie jest do końca wyjaśniona, wiadomo jedynie, że w tym obszarze histony podlegają
modyfikacjom kowalencyjnym (zob. dalej). Ładunki elektryczne w części globularnej histonów rdzeniowych
rozmieszczone są równomiernie. Histony rdzeniowe są białkami o silnie konserwowanej sekwencji
aminokwasowej, w szczególności dotyczy to części globularnej (Wolffe, 1994b).
W cząsteczce histonu łącznikowego (np. H1 lub H5) wyróżnia się 3 domeny: jedną globularną, odpowiedzialną
za interakcje z DNA, oraz dwie zasadowe, niezestrukturalizowane domeny N- i C-końcową (Ramakrishnan i
wsp., 1993). Histon H1 jest białkiem o największej zmienności wśród histonów, jednak i tu domena globularna
wykazuje znaczną konserwatywność struktury (Wolffe, 1994b) Na różnorodność histonów łącznikowych
największy wpływ ma obecność licznych wariantów sekwencyjnych tych białek oraz wymiana wariantów w
trakcie rozwoju. Na przykład u Xenopus wyróżnia się wczesny wariant B4 akumulowany podczas oogenezy,
następnie warianty somatyczne H1A, H1B i H1C syntetyzowane w fazie blastuli oraz wariant H10 występujący
w tkankach terminalnie zróżnicowanych (Dimitrov i wsp., 1993). Dane literaturowe wskazują, że różnorodność
podtypów histonów łącznikowych może pełnić istotną rolę regulacyjną w stosunku do transkrypcji genów
(Hoyer-Fender i Grossbach, 1988; Storm i wsp., 1995).
Wszystkie histony mogą podlegać potranslacyjnym modyfikacjom w rejonie �ogonów�: acetylacji,
fosforylacji, ubikwitynylacji, metylacji i ADP-rybozylacji (van Holde, 1989). Z punktu widzenia regulacji
ekspresji genów najistotniejsze znaczenie odgrywa proces acetylacji histonów. Uważa się, że wysoki poziom
acetylacji histonów H3 i H4 związany jest z rozluźnieniem struktury chromatyny i towarzyszy aktywacji
transkrypcyjnej wielu genów (Turner, 1991; Lee i wsp., 1993) (por. Wstęp, rozdział 2.2.2). W ostatnim okresie
udało się zidentyfikować kilka jądrowych acetylotransferaz, które okazały się znanymi od dawna czynnikami
transkrypcyjnymi (Bannister i Kouzarides, 1996; Brownell i wsp., 1996; Mizzen i wsp., 1996; Spencer i wsp.,
1997; Chen i wsp., 1997; Wang i wsp., 1997; Currie, 1998).
1.3 POZYCJONOWANIE NUKLEOSOMÓW
Położenie nukleosomu względem DNA określone jest przez dwa parametry: tzw. położenie translacyjne (ang.
translational position), które opisuje granice oddziaływań DNA-histony i określa, która sekwencja znajduje się w
DNA łącznikowym, oraz tzw. położenie rotacyjne (ang. rotational position) określające, która strona DNA
oddziałuje z histonami, a która z otoczeniem (por. Wstęp, rozdział 2.2.2).
Z badań in vitro wynika, że łączenie się histonów z DNA zachodzi niezależnie od sekwencji. Prawdopodobnie
większość nukleosomów w komórce nie jest przypisana do ściśle określonej sekwencji w DNA i wykazuje
mobilność, której rezultatem może być ślizganie się nukleosomów wzdłuż nici DNA (ang. sliding). Część
nukleosomów związana jest jednak ze specyficznymi fragmentami DNA (pozycjonowanie). Mobilność i
pozycjonowanie nukleosomów są istotnymi elementami systemu regulacji ekspresji genów na poziomie
transkrypcji, gdyż decydują o dostępności konkretnych sekwencji DNA dla czynników trans (por. Wstęp,
rozdział 2.2.2) (Wolffe, 1994b).
Nie jest do końca jasne, jak zachodzi pozycjonowanie nukleosomów w chromatynie. Wśród mechanizmów,
które mogą współdecydować o sposobie rozmieszczania nukleosomów, wymienia się replikację DNA, udział
sekwencji specyficznie wiążących nukleosomy (zob. Wstęp, rozdział 3.1.2.3), oddziaływanie ze specyficznymi
białkami pozycjonującymi oraz formowanie chromatynowych struktur wyższego rzędu (Thoma, 1992). Na
pozycjonowanie nukleosomu mogą mieć także wpływ odcinki DNA wykazujące preferencje do wyginania się
lub odcinki o strukturze usztywnionej (Simpson, 1991). Mobilność nukleosomów zmieniają również kompleksy
białkowe stabilizujące lub rozluźniając strukturę chromatyny (zob. Wstęp, rozdział 2.2.3). Prawdopodobnie
ż
aden z wymienionych czynników nie odgrywa roli decydującej, a końcowa pozycja zajmowana przez
nukleosom w chromatynie jest efektem współdziałania wszystkich powyższych elementów.
2. TRANSKRYPCJA
2.1 APARAT TRANSKRYPCYJNY EUKARYOTA
2.1.1 Czynniki transkrypcyjne
W komórkach eukariotycznych istotą procesu aktywacji transkrypcji są interakcje promotora i sekwencji
regulatorowych w DNA z czynnikami białkowymi, które oddziałują z polimerazami RNA (czynniki
transkrypcyjne, ang. transcription factors) (por. rozdział 2.1.3). Wyróżnia się 3 kategorie tych czynników: 1)
ogólne czynniki transkrypcyjne (ang. general factors) niezbędne do inicjacji syntezy RNA na wszystkich typach
promotorów, 2) czynniki transkrypcyjne upstream (ang. upstream factors) rozpoznające krótkie specyficzne
sekwencje cis położone przed miejscem startu (ang. upstream) syntezy RNA i zwiększające tempo inicjacji
transkrypcji oraz 3) czynniki indukowalne (ang. inducible factors) analogiczne do czynników upstream, lecz
syntetyzowane tylko w określonych tkankach i w określonym czasie, wiążące się specyficznie do sekwencji RE
(ang. response elements). W rezultacie oddziaływań czynników trans z sekwencjami regulatorowymi możliwe
staje się przyłączenie polimerazy RNA i utworzenie kompleksu transkrypcyjnego (zob. rozdział 2.1.3). Czynniki
transkrypcyjne odgrywają kluczową rolę w procesie inicjacji transkrypcji, nie są natomiast niezbędne do
elongacji łańcucha RNA (Lewin, 1997).
2.1.2 Polimerazy RNA
U Eukaryota istnieją trzy typy polimeraz RNA. Podstawą ich klasyfikacji jest przede wszystkim wrażliwość na
cykliczny oktapeptyd, a -amanitynę. Hamuje on już przy niskich stężeniach aktywność polimerazy RNA II,
natomiast nie wywiera wpływu na polimerazę RNA I. Efekt a -amanityny na polimerazę RNA III zależy od
organizmu; wiadomo, że enzym jest hamowany przy wysokich stężeniach inhibitora w komórkach zwierzęcych
(Lewin, 1997). Polimerazy RNA typu I zlokalizowane są w jąderku i odpowiadają za syntezę rybosomalnego
RNA. Obszary chromatyny transkrybowane przez tę klasę polimeraz to przede wszystkim sekwencje kodujące
18S i 28S rRNA. Polimerazy RNA II i III znajdują się w nukleoplaźmie (poza jąderkiem). Polimerazy klasy II
prowadzą syntezę heterogennego jądrowego RNA (hnRNA), będącego prekursorem mRNA, natomiast
polimerazy RNA III syntetyzują tRNA i inne małe RNA (m. in. 5S RNA, niektóre snRNA). Względne
aktywności polimeraz klasy I, II i III stanowią odpowiednio 60, 30 i 10 % całkowitej aktywności polimeraz
RNA w komórce (Lewin, 1997).
2.1.3 Inicjacja transkrypcji
Ż
adna z eukariotycznych polimeraz nie jest w stanie rozpoznawać promotora samodzielnie. Rolę tę pełnią
czynniki transkrypcyjne, które oprócz tego wiążą polimerazę i umiejscawiają ją precyzyjnie na promotorze.
Samo powstanie kompleksu inicjacyjnego jest procesem wieloetapowym, w którym uczestniczy szereg białek
(Lewin, 1997).
Transkrypcja genów dla polimerazy RNA I znajduje się pod kontrolą dwuczęściowych sekwencji położonych
przed miejscem startu transkrypcji. Sam rdzeń promotora obejmuje pozycje od -45 do +20, a dodatkowa
sekwencja UCE (ang. upstream control element) zlokalizowana w pozycji od -180 do -107 jest bogata w pary
GC. Inicjacja transkrypcji przez polimerazę RNA I wymaga związania 2 czynników: UBF1 (ang. upstream
binding factor), specyficznie rozpoznającego sekwencję rdzenia promotora i UCE, oraz czynnika SL1 wiążącego
się kooperatywnie po przyłączeniu UBF1 (Lewin, 1997).
Polimeraza RNA III wykorzystuje 3 typy promotorów. Promotory typu 1 i 2 znajdują się za miejscem startu
transkrypcji (ang. downstream). Obejmują one wewnątrzgenowe sekwencje DNA (ang. internal control regions,
ICR) złożone albo z domen A i C przedzielonych sekwencją IE (ang. intermediate element) (np. promotory
genów 5S rRNA), albo z domen A i B (np. promotory genów tRNA) (Geiduschek i Tocchini-Valentini, 1988).
W typie 3 znaleziono tzw. bliski i daleki promotor (ang. proximal i distal sequence element, PSE i DSE)
położone przed miejscem startu transkrypcji (np. geny U6 snRNA). W transkrypcji genów klasy III biorą udział
tylko trzy ogólne czynniki transkrypcyjne: TFIIIA, TFIIIB i TFIIIC, które wiążą się w obszarze promotora przed
przyłączeniem polimerazy, tworząc kompleks pre-inicjacyjny (ang. pre-initiation complex).
Promotory genów dla polimerazy RNA II składają się z rdzenia oraz dodatkowych sekwencji regulatorowych
(ang. cis-acting elements). Rdzeń promotora obejmuje blok TATA w pozycji od -30 do -25 i zwykle krótką
sekwencję bogatą w pirymidyny w pobliżu miejsca startu transkrypcji. Elementy cis znajdują się powyżej
miejsca startu syntezy RNA i przed blokiem TATA. Należą do nich m. in. sekwencja CAAT (ang. CAAT box)
w pozycji -75 oraz sekwencje GC (ang. GC box) w pozycjach od -40 do -70 (Roeder, 1996). Sekwencje
regulatorowe cis w obrębie promotorów genów klasy II rozpoznawane są przez specyficzne czynniki białkowe
trans (ang. trans-acting factors). Do sekwencji regulatorowych genów klasy II zalicza się również tzw.
wzmacniacze (ang. enhancers), które same nie są w stanie kontrolować aktywności polimerazy RNA, lecz mogą
oddziaływać przez aktywatory, których przyłączenie prowadzi do zgięcia DNA i zbliżenia sekwencji
wzmacniacza do promotora. Z tego względu enhancery mogą wywierać efekt nawet na duże odległości i
niezależnie od orientacji samej sekwencji. Odrębna klasa sekwencji regulatorowych nazywana jest elementami
RE (ang. response elements) (por. rozdział 2.1.1), wiążą się do nich indukowalne czynniki trans. Na obecności
elementów RE i czynników indukowalnych opiera się istota regulacji ekspresji genów na poziomie transkrypcji
u Eukaryota (Lewin, 1997).
Sekwencja TATA stanowi miejsce specyficznego wiązania czynnika transkrypcyjnego TFIID, który jako
pierwszy lokuje się na promotorze (Burley, 1996). TFIID składa się z 2 elementów: białka rozpoznającego i
wiążącego sekwencję TATA (ang. TATA-binding protein, TBP) oraz podjednostek związanych z TBP (ang.
TBP-associated factors, TAFs) (Buratowski i wsp., 1989). Przyłączenie czynnika TFIID wywołuje odkształcenie
nici DNA i w rezultacie zbliżenie sekwencji położonych przed i za blokiem TATA. Umożliwia ono związanie
czynnika TFIIA, który może stabilizować oddziaływania TBP z DNA w tzw. słabych promotorach (Tan i wsp.,
1996). Następnie dochodzi do związania TFIIB i przyłączenia kompleksu polimeraza RNA II-TFIIF (Leuther i
Bushnell, 1996), w wyniku czego powstaje kompleks pre-inicjacyjny. Przekształcenie w aktywny kompleks
transkrypcyjny zachodzi wskutek fosforylacji domeny CTD polimerazy (ang. carboxy-terminal domain) przy
udziale czynników TFIIE i TFIIH (Buratowski, 1994; Roeder, 1996). TFIIH obok aktywności kinazy białkowej
ma aktywność helikazy rozluźniającej DNA na odcinku 10 par zasad przed miejscem startu transkrypcji
(Svejstrup, 1996). Rozluźnienie nici DNA jest następnie przemieszczane zgodnie z kierunkiem syntezy RNA
(Holstege i wsp., 1996). Rozpoczęciu transkrypcji przez polimerazę towarzyszy odłączenie czynników
transkrypcyjnych od kompleksu.
2.1.4 Interakcje czynników trans z DNA
W strukturze czynników transkrypcyjnych zidentyfikowano kilka typowych domen odpowiedzialnych za
wiązanie do DNA oraz interakcje z innymi białkami. Do najpowszechniejszych motywów należą: palce
cynkowe (ang. zinc finger), heliks-skręt-heliks (ang. helix-turn-helix), heliks-pętla-heliks (ang. helix-loop-helix,
HLH) i suwak leucynowy (ang. leucine zipper) (Lewin, 1997).
Aktywność indukowanych czynników transkrypcyjnych podlega złożonemu systemowi regulacji i może być
kontrolowana na wiele sposobów: przez syntezę (np. czynniki tkankowo-specyficzne), przez fosforylację (np.
czynnik HSTF, ang. heat shock transcription factor) (Pahlvani i wsp., 1995) lub defosforylację (np. podjednostka
Jun w heterodimerze AP1, ang. activator protein) (Edwards i wsp., 1992), przez wiązanie ligandu (np. receptory
steroidowe), przez odłączenie od inhibitora (np. czynnik NFk B) (Chytil i Verdine, 1996) i przez zmianę
struktury drugiej podjednostki w obrębie dimeru (np. białka HLH).
2.2 TRANSKRYPCJA A STRUKTURA CHROMATYNY
W komórkach Eukaryota ze względu na upakowanie DNA w struktury nukleoproteinowe transkrypcja zachodzi
na matrycy chromatynowej. Jest faktem bezspornym, że struktura chromatyny odgrywa kluczową rolę w
regulacji ekspresji genów. Wiadomo, że chromatyna podlega transkrypcji w niejednakowym stopniu, a niektóre
geny (tzw. geny milczące, ang. silent genes) pozostają nieaktywne mimo obecności w komórce białek
potrzebnych do ich transkrypcji. Obszary jądra zawierające geny o wysokiej aktywności transkypcyjnej (tzw.
euchromatyna) różnią się pod względem strukturalnym od tzw. heterochromatyny, w której transkrypcja jest
wyłączona. W obu typach chromatyny istnieją nukleosomy, jednak obszary aktywne transkrypcyjnie są bardziej
podatne na nukleazy, co by sugerowało, że ich struktura jest bardziej rozluźniona. Wiadomo również, że
aktywacji genu towarzyszy reorganizacja struktury chromatyny (Wolffe, 1994; Lewin, 1997).
Proces transkrypcji sprowadzony jedynie do poziomu oddziaływań między DNA, czynnikami transkrypcyjnymi
i polimerazami RNA jest uproszczeniem, które można zastosować wyłącznie na użytek układu in vitro. Przy
opisie zdarzeń zachodzących w komórce musi zostać uwzględniona obecność struktur nukleosomowych oraz
indukowanych przez H1 struktur wyższego rzędu w postaci tzw. włókien 30 nm, które stanowią poważną
przeszkodę w rozpoznawaniu sekwencji regulatorowych przez czynniki transkrypcyjne. Z tego powodu u
Eukaryota istnieją mechanizmy umożliwiające zmianę struktury chromatyny w chwili aktywacji genu, a tym
samym ułatwiające czynnikom trans dostęp i oddziaływanie z sekwencjami w DNA. Przez wiele lat jedynymi
kandydatami do roli regulatorów transkrypcji były histony tworzące rdzeń nukleosomu oraz histon H1. Choć
nikt dziś nie kwestionuje udziału histonów w regulacji ekspresji genów u Eukaryota (Grunstein, 1990;
Felsenfeld, 1992; Kamakaka i wsp., 1993; Adams i Workman, 1993) (por. Wstęp, rozdziały 2.2.2 i 2.2.3), to
jednak coraz większą wagę przywiązuje się do takiego modelu regulacji ekspresji genów, w którym kluczową
rolę odgrywają oprócz interakcji DNA z histonami również interakcje z białkami wchodzącymi w skład
kompleksów oddziałujących bezpośrednio na elementy strukturalne chromosomu. Takie kompleksy
regulatorowe zmieniają strukturę chromatyny w dwojaki sposób: albo zwiększają dostępność DNA dla
czynników transkrypcyjnych i ułatwiają zorganizowanie aktywnego kompleksu transkrypcyjnego (aktywatory
transkrypcji) (Winston i Carlson, 1992), albo stabilizują histony na powierzchni DNA i utrudniają kontakt
czynników transkrypcyjnych z sekwencjami regulatorowymi genu (repesory transkrypcji) (por. Wstęp, rozdział
2.2.4). Efektem rozluźnienia struktury chromatyny jest zawsze aktywacja transkrypcji, natomiast stabilizacja
struktur chromatynowych przez kompleksy białkowe prowadzi do represji transkrypcji (Kingston i wsp., 1996).
W badaniach eksperymantalnych efekt rozluźnienia chromatyny można obserwować w postaci jej zwiększonej
wrażliwości na DNazę I (ang. DNase I hypersensitivity) (Felsenfeld, 1978). Właściwość ta jest silnie
skorelowana z aktywnością transkrypcyjną genów i nie występuje w wyciszonych obszarach chromatyny
(Lewin, 1997).
2.2.1 Modele aktywacji genów u Eukaryota
Kluczowym pytaniem, jakie towarzyszy badaniom nad mechanizmami regulacji transkrypcji u Eukaryota, jest
pytanie o to, w jaki sposób czynniki transkrypcyjne uzyskują dostęp do promotora w chromatynie. W oparciu o
dotychczasowe dane eksperymentalne zaproponowano dwa modele wyjaśniające mechanizm zmian struktury
chromatyny w aktywowanych genach: model konkurencji (ang. pre-emptive model) i model dynamiczny (ang.
dynamic model).
2.2.1.1 Model konkurencji
Model ten zakłada istnienie współzawodnictwa między dwoma procesami: tworzenia kompleksu
transkrypcyjnego i rekonstytucją nukleosomów w obrębie promotora. Mechanizm miałby polegać na
konkurowaniu histonów i czynników trans w wiązaniu się do DNA. W rezultacie, jeżeli na promotorze najpierw
uformują się nukleosomy, to nie będą mogły związać się już czynniki transkrypcyjne. I odwrotnie, związanie
czynników transkrypcyjnych oraz utworzenie kompleksu inicjacyjnego wyklucza możliwość powstania
nukleosomu (Lewin, 1997) (Ryc. 1A).
Potwierdzeniem modelu konkurencji są wyniki wczesnych badań in vitro, w których wykazano, że czynnik
TFIIIA nie jest w stanie aktywować genów 5S rRNA, gdy są one skompleksowane z histonami, natomiast
histony dodane do mieszaniny z uformowanym już kompleksem transkrypcyjnym nie przeciwdziałają istniejącej
aktywacji genu (Almouzni i wsp., 1990a). Z kolei aktywacja lub represja transkrypcji genów dla polimerazy
RNA II zależy od tego, czy najpierw do mieszaniny dodano czynnik TFIID, czy histony (Workman i Roeder,
1987).
Zgodnie z założeniami modelu współzawodnictwa atywacja genów polega więc na przyłączaniu się czynników
transkrypcyjnych do nagiego DNA, który występuje w komórce zaraz po zakończeniu replikacji a jeszcze przed
odtworzeniem chromatyny (Svaren i Chalkey, 1990; Felsenfeld, 1992; Adams i Workman, 1993) (zob. także:
Wstęp, rozdział 2.2.2).
2.2.1.2 Model dynamiczny
Model ten opiera się na założeniu, że aktywacji genu towarzyszy dysrupcja struktury chromatyny. Proces ten jest
energetycznie kosztowny i musi być sprzężony z hydrolizą ATP (Lewin, 1997) (Ryc. 1B). Efektem dysrupcji
chromatyny jest rozluźnienie jej struktury i umożliwienie inicjacji transkrypcji. In vitro system taki udało się
skonstruować dla promotora hsp70 genów szoku cieplnego u Drosophila. Wiązanie specyficznego czynnika
transkrypcyjnego GAGA do promotora przeorganizowuje strukturę chromatyny w taki sposób, że nukleosomy
zajmujące dotychczas
przypadkowe pozycje są pozycjonowane, a w rejonie promotora pojawia się nadwrażliwość na DNazę I. Cały
proces wymaga hydrolizy ATP, a czynnik GAGA może wywierać efekt nawet wtedy, gdy został dodany do
mieszaniny po rekonstrukcji nukleosomów (Taylor i wsp., 1991; Tsukiyama i wsp., 1994) (zob. również:
rozdział 2.2.3.1). Inne systemy dysrupcji nukleosomów na promotorach genów eukariotycznych opisano w
rozdziale 2.2.2.
2.2.2 Nukleosomy i transkrypcja
Obecność nukleosomów stanowi fizyczną przeszkodę w procesie inicjacji transkrypcji (Morse, 1986; Lorch i
wsp., 1987; Svaren i Chalkey, 1990; Grunstein, 1990). Wynika to z kilku przesłanek: po pierwsze, jedna strona
podwójnej helisy DNA jest zawsze skierowana do powierzchni nukleosomu i nie może oddziaływać z
czynnikami transkrypcyjnymi. Po drugie, wygięcie DNA spowodowane kontaktem z histonami rdzeniowymi
wymaga dopasowania przestrzennego czynników transkrypcyjnych do krzywizny nukleosomowego DNA. Po
trzecie, naładowane dodatnio N-końcowe �ogony� histonów rdzeniowych położone w obrębie dużej bruzdy
DNA ograniczają kontakt czynników transkrypcyjnych z DNA (Wolffe, 1994b).
Z analizy szczepów drożdży, w których nie zachodzi synteza histonów, wynika, że utracie nukleosomów
towarzyszy uruchomienie transkrypcji wielu nieczynnych wcześniej genów (Han i Grunstein, 1988). Z kolei z
badań in vitro wiadomo, że rdzenie nukleosomów silnie hamują zarówno inicjację (Lorch i wsp., 1987) jak i
elongację (O�Neill i wsp., 1992) transkrypcji przez polimerazę RNA z faga T7, a hamujący wpływ
nukleosomów na transkrypcję przez eukariotyczną polimerazę RNA II wykazali Laybourn i Kadonaga
(Laybourn i Kadonaga, 1991). Powyższe dane wskazują, że stabilna struktura nukleosomowa zmniejsza
intensywność transkrypcji. Aby proces mógł zachodzić wydajnie, musi nastąpić rozluźnienie struktury
chromatyny udostępniające czynnikom trans sekwencje regulatorowe w DNA mimo obecności nukleosomów.
Do najistotniejszych mechanizmów reorganizacji struktury chromatyny zaliczyć można pozycjonowanie
nukleosomu, usunięcie nukleosomu z obszaru promotora oraz modyfikacje histonów przez acetylację (Wolffe,
1994a; Wolffe, 1994b).
Pozycjonowanie nukleosomu
W nukleosomie granice oddziaływań DNA-histony określone są przez tzw. położenie translacyjne, natomiast
orientację danej sekwencji DNA względem histonów opisuje tzw. położenie rotacyjne (por. Wstęp, rozdział 1.3).
Sekwencje, które mają zostać rozpoznane przez czynniki transkrypcyjne, muszą być zorientowane na zewnątrz
nukleosomu albo zlokalizowane w obrębie DNA łącznikowego. Spozycjonowany nukleosom ułatwia więc
transkrypcję wtedy, gdy eksponuje sekwencje regulatorowe w sposób ułatwiający ich kontakt z czynnikami
transkrypcyjnymi oraz gdy dzięki upakowaniu DNA umożliwia zbliżenie sekwencji regulatorowych oddalonych
od siebie o wielokrotność długości pojedynczego skrętu DNA w nukleosomie (Wolffe, 1994b). Z kolei represja
transkrypcji wskutek pozycjonowania ma miejsce wtedy, gdy sekwencje regulatorowe zamknięte są w obrębie
nukleosomu i stają się niedostępne dla elementów trans (Lu i wsp., 1994).
Przykładem aktywacji transkrypcji przez spozycjonowany nukleosom jest promotor vitellogeniny B1 Xenopus.
Związanie nukleosomu pomiędzy enhancerem a miejscem wiązania czynnika HNF3 (ang. hepatocyte nuclear
factor) i czynnika NF1 (ang. nuclear factor) prowadzi do powstania pętli DNA, w której elementy promotora i
enhancera zbliżają się do siebie, stymulując transkrypcję (Schild i wsp., 1993).
Usunięcie nukleosomu z obszaru promotora
Nukleosom może zostać usunięty w sposób indukowany (ang. induced displacement) lub na stałe (ang.
permanent displacement) (Adams i Workman, 1993; Workman i Buchman, 1993).
Dobrze opisanym przykładem regulacji transkrypcji przez indukowane usunięcie nukleosomu jest gen mysiego
wirusa raka sutka (ang. mouse mammary tumor virus, MMTV). Promotor genu MMTV obejmuje 5
spozycjonowanych nukleosomów (Richard-Foy i Hager, 1987). Aktywacja transkrypcji tego genu wymaga
związania się receptora glukokortykoidowego z DNA, w wyniku czego dochodzi do dysrupcji 2 nukleosomów
przylegających do bloku TATA i do uformowania kompleksu pre-inicjacyjnego (Cordingley i wsp., 1987; Zaret
i Yamamoto, 1984). Mechanizm dysrupcji nukleosomów polega tu na usunięciu histonu H1 z obszaru DNA
łącznikowego (Bresnick i wsp., 1992) i interakcji z czynnikiem jądrowym NF-1, który konkuruje z H1 o miejsce
wiązania do linkera (Lee i Archer, 1994; Archer i wsp., 1992). W rezultacie powstaje aktywny kompleks
transkrypcyjny, który jest jednak nietrwały. Po odłączeniu się kompleksu promotor MMTV zostaje ponownie
zablokowany przez nukleosom (Lee i Archer, 1994).
Podobnie przebiega aktywacja genu PHO5 kodującego kwaśną fosfatazę u drożdży. Spadek stężenia
nieorganicznego fosforanu wywołuje reorganizację struktury promotora, podczas której cztery z sześciu
nukleosomów zlokalizowanych na promotorze zostają usunięte (Almer i Hö rz, 1986; Almer i wsp., 1986). Do
odblokowanego obszaru promotorowego przyłącza się kompleks transkrypcyjny (Fascher i wsp., 1990).
Analiza pozycjonowania nukleosomów na drożdżowym genie URA3 transkrybowanym pod kontrolą
indukowanego promotora pokazała, że aktywacji genu towarzyszy zniesienie pozycjonowania nukleosomów
przy jednoczesnym zachowaniu ich dotychczasowej gęstości na promotorze i genie. Stan represji prowadzi
natomiast w krótkim czasie do unieruchomienia nukleosomów (Cavalli i Thoma, 1993).
Stałe usunięcie nukleosomów z rejonu promotora zachodzi w przypadku genów transkrybowanych
konstytutywnie i ma miejsce bezpośrednio po replikacji DNA (Almouzni i wsp., 1990a). Przykładem systemu, w
którym nukleosomy usuwane są na stałe, jest promotor hsp26 genów szoku cieplnego u Drosophila. Dochodzi na
nim do zależnej od ATP dysrupcji nukleosomów w wyniku wiązania specyficznego czynnika GAGA (Taylor i
wsp., 1991; Tsukiyama i wsp., 1994) (por. Wstęp, rozdział 2.2.1.2).
Acetylacja histonów
Alternatywą do usuwania nukleosomu z obszaru promotora jest acetylacja histonów tworzących nukleosom.
Acetylacja od dawna uznawana jest za proces związany z transkrypcją. Jej efektem jest obniżenie dodatnich
ładunków na N-końcach białek i osłabienie oddziaływań między �ogonami� histonów a nukleosomowym
DNA (Cary i wsp., 1982). W rezultacie zachodzą zmiany konformacyjne nukleosomu umożliwiające łatwiejsze
dojście czynników transkrypcyjnych do sekwencji regulatorowych w DNA (Turner, 1991). Z badań in vitro
wynika, że acetylacji �ogonów� histonowych w obrębie nukleosomu spozycjonowanego na genie 5S rRNA
towarzyszy przyłączenie czynnika TFIIIA (Lee i wsp., 1993) oraz że sztuczne usunięcie �ogonów�
histonowych z obszaru dużej bruzdy DNA ułatwia dostęp czynników trans do DNA w nukleosomie (Vettesse-
Dadey i wsp., 1994).
Nukleosomy stanowią istotną przeszkodę również w procesie elongacji RNA (Morse, 1986). Do niedawna
istniało kilka hipotez próbujących pogodzić elongację transkrypcji z obecnością oktamerów histonowych.
Najbardziej prawdopodobny model zakładał destabilizację rdzenia nukleosomu pod wpływem przesuwającej się
polimerazy i przemieszczenie tetrameru H3-H4 na wolną nić DNA za polimerazą poprzedzone
oddysocjowaniem dimeru H2A-H2B, następnie ponowne przyłączenie dimeru H2A-H2B i odtworzenie struktury
nukleosomu (ang. progressive displacement) (van Holde i wsp., 1992; Adams i Workman, 1993). Aktualnie
dominuje jednak pogląd, że oktamer histonowy przemieszcza się, nie oddysocjowując od DNA (Clark i
Felsenfeld, 1992; Studitsky i wsp., 1994). Cały proces miałby polegać na odwinięciu DNA z oktameru przed
polimerazą i ponownym jego nawinięciu na oktamer po przejściu enzymu (tzw. obejście transkrybującej
polimerazy przez nukleosom). Wyniki badań z polimerazą RNA z faga SP6 wskazują na możliwość tworzenia
przez polimerazę pozytywnych superskrętów na nici DNA z przodu kompleksu enzymatycznego. Dodatnie
superskręty sprzyjają usuwaniu oktamerów sprzed polimerazy i przenoszeniu ich do tyłu na fragment nici
negatywnie superskręcony, jednak bez utraty kontaku z DNA i/lub polimerazą (Studitsky i wsp., 1995;
Felsenfeld i wsp., 1996).
W doświadczeniach in vitro pokazano, że polimeraza RNA II wydłuża transkrypty z wysoką wydajnością tylko
na nagich matrycach DNA, natomiast zorganizowanie DNA w strukturę nukleosomową znacznie spowalnia
proces elongacji (Izban i Luse, 1992). Rdzenie nukleosomów hamują również elongację transkrypcji przez
polimerazę RNA z faga T7, a obserwowany 3-4-krotny spadek liczby transkryptów zachodzi prawdopodobnie na
skutek zablokowania promotora T7 przez rdzenie nukleosomów (O�Neill i wsp., 1992).
2.2.3 Kompleksy białkowe zmieniające strukturę chromatyny
Charakterystyka kompleksów białkowych zmieniających strukturę chromatyny jest niezbędna do zrozumienia
ogólnych mechanizmów transkrypcji, a szczególnie procesów rozwoju. Wiele bowiem z omawianych tu białek
odkrytych zostało przy okazji badania mutacji rozwojowych związanych m. in. z segmentacją u Drosophila,
przełączaniem typów koniugacyjnych u drożdży i neoplazją u ssaków (Stern i wsp., 1984; Kennison i Tamkun,
1988; Haupt i wsp., 1991; van Lohuizen i wsp., 1991). Na początku lat 90-tych przypuszczano, że białka
aktywujące lub hamujące transkrypcję są bezpośrednio zaangażowane w modyfikację struktury chromatyny.
Dowodów na to dostarczyło m.in. odkrycie mutacji w rejonie N-końca histonu H4 hamującej aktywację
promotorów PHO5 i GAL1 u drożdży. W rezultacie zaproponowano mechanizm, w którym czynniki te miałyby
oddziaływać wprost z N-końcem histonu (Durrin i wsp., 1991). Od tej pory udało się zidentyfikować wiele
czynników, których funkcja polega na destabilizacji struktury chromatyny (aktywatory) lub stabilizacji
nukleosomów (represory), prowadzących odpowiednio do aktywacji lub represji transkrypcji. Z czasem okazało
się, że wiele z tych białek wymaga obecności dodatkowych czynników pełniących rolę koaktywatorów w
reorganizacji struktury chromatyny (Lorch i wsp., 1992). Do najlepiej poznanych kompleksów należą SWI/SNF
z drożdży oraz NURF i Polycomb z Drosophila.
2.2.3.1 Aktywatory transkrypcji
Kompleks SWI/SNF z S. cerevisiae
Geny grupy SWI są konieczne do regulacji zmian typu koniugacyjnego u drożdży (Stern i wsp., 1984; Breeden i
Nasmyth, 1987), część z nich jest niezbędna do prawidłowej transkrypcji niektórych genów drożdżowych
(Peterson i Herskowitz, 1992). Z kolei geny z grupy SNF okazały się potrzebne m. in. do transkrypcji SUC2
(Neigeborn i Carlson, 1984). Dalsze badania pokazały, że produkty genów SWI/SNF tworzą kompleks
białkowy, który destabilizuje strukturę chromatyny. Zidentyfikowano mutacje w genach SIN zdolne do
częściowej supresji mutacji w genach SWI (Sternberg i wsp., 1987; Kruger i wsp., 1995). Mutacje te lokowały
się w histonach H3 i H4 w rejonach odpowiedzialnych m. in. za wiązanie histonów do DNA i znosiły efekt
braku kompleksu SWI/SNF (Kruger i wsp., 1995). Również obniżenie poziomu histonów H2A i H2B suprymuje
fenotyp swi/snf (Hirschhorn i wsp., 1992). Powyższe dane sugerują, że kompleks SWI/SNF oddziałuje z
białkami chromatyny destabilizując jej strukturę i ułatwiając dostęp czynników transkrypcyjnych do DNA.
Stwierdzono, że kompleks aktywatorowy SWI/SNF jest ATP-azą zależną od DNA (Laurent i wsp., 1993; Cô té i
wsp., 1994), zaś destabilizacja chromatyny polega prawdopodobnie na indukowaniu przez SWI/SNF
pozytywnych superskrętów na nici DNA (Quinn i wsp., 1996). Znanych jest szereg genów homologicznych do
drożdżowych SWI/SNF, m. in. ludzkie geny Brg1 i hBrm (Khavari i wsp., 1993; Muchardt i Yaniv, 1993) oraz
geny Brahma z Drosophila (Kennison i Tamkun, 1988; Tamkun i wsp., 1992). Produkty tych genów wykazują
aktywność ATP-azową i powodują dysrupcję chromatyny (Imbalzano i wsp., 1994; Kwon i wsp., 1994).
Kompleks NURF z Drosophila
Czynnik NURF (ang. nucleosome remodeling factor) jest zależnym od ATP kompleksem białkowym
współdziałającym in vitro z czynnikiem GAGA w reorganizacji struktury chromatyny (Tsukijama i Wu, 1995).
W indukowane przez NURF zmiany struktury nukleosomowej zaangażowane są prawdopodobnie N-końce
histonów rdzeniowych (Georgel i wsp., 1997). Gen ISWI (ang. imitation switch) koduje jedną z podjednostek
kompleksu i jest podobny w części kodującej domenę ATP-azową do genu SNF2/SWI2 z drożdży (Elfring i
wsp., 1994), wykazuje także wysoką homologię do genu hSNF2 człowieka (Okabe i wsp., 1992) i genu YB95
drożdży (Tsukijama i wsp., 1995).
Specyficzne aktywatory transkrypcji
Ta klasa aktywatorów stanowi grupę białek działających pojedynczo (nie w kompleksach) i wyłącznie na
matrycę chromatynową. Należą tu m. in. czynnik GAGA u Drosophila i białko LEF-1 u ssaków. Czynnik
GAGA bierze udział w zależnym od ATP ustalaniu struktury nukleosomowej na promotorach genów hsp 26 i
hsp70 (Lis i Wu, 1993; Wall i wsp., 1995), przeorganizowuje strukturę chromatyny w kooperacji z kompleksem
NURF (Tsukijama i wsp., 1994) i znosi represyjny efekt histonu H1 (Crosten i wsp., 1991) (por. Wstęp,
rozdziały 2.2.1.2 i 2.2.4.1). Białko LEF-1 bierze udział w ustalaniu właściwej struktury przestrzennej
enhancerów poprzez wyginanie nici DNA (Geise i wsp., 1992).
2.2.3.2 Represory transkrypcji
Białka SIR u S. cerevisiae
Białka SIR (ang. silent information regulator) obok histonów H3 i H4 biorą udział w wyciszaniu transkrypcji
genów w obszarach SML (ang. silent mating loci) oraz w okolicach telomerów u drożdży. Obszary te wykazują
wiele cech heterochromatyny. Białko SIR oddziałuje bezpośrednio z N-końcami histonów H3 i H4 (Hecht i
wsp., 1995; Roth, 1995), kompleksem ORC (ang. origin recognition complex) (Newlon, 1993; Palladino i
Gasser, 1994) oraz czynnikiem RAP1. Białko RAP1 identyfikuje sekwencje DNA, które mają zostać wyciszone
i specyficznie się z nim wiąże. Związanie czynnika RAP1 umożliwia interakcję białek SIR z histonami H3 i H4,
a powstały kompleks represorowy rozprzestrzenia się w chromatynie, indukując zmiany jej struktury (Moretti i
wsp., 1994). W regulację represji związanej z telomerami zaangażowanych jest prawdopodobnie więcej
czynników, a sam jej mechanizm nie jest do końca poznany. Wydaje się jednak pewne, że struktura chromatyny
ma kluczowe znaczenie w wyciszaniu transkrypcji genów (Kingston i wsp., 1996).
Białka SSN6/TUP1 u S. cerevisiae
Czynniki SSN6 i TUP1 u drożdży decydują o represji genów, które były aktywne w określonych warunkach
wzrostu, m. in. genów SUC2 i GAL1/GAL10 (Johnson, 1995; Roth, 1995). Mechanizm represji polega na
porządkowaniu struktury nukleosomowej w kontrolowanym obszarze genu pod wpływem białek SSN6 i TUP1,
które jednak same nie łączą się z DNA, a jedynie oddziałują na inne białka związane z DNA, na przykład a
2/MCM1 (Johnson, 1995). Represja może zostać zniesiona w odpowiednich warunkach wzrostu. Po zniesieniu
stanu represji ułożenie nukleosomów ulega całkowitej zmianie (Roth i wsp., 1990; Shimizu i wsp., 1991;
Axelrod i wsp., 1993; Cavalli i Thoma, 1993; Cooper i wsp., 1994; Hirschhorn i wsp., 1995). Prawdopodobnie
mechanizm represji wywołanej przez białko TUP1 polega na oddziaływaniu z �ogonami� histonów H3 i H4,
gdyż mutacje w N-końcowej części tych histonów znoszą narzucony przez TUP1 stan represji genów
(Edmondson i wsp., 1996).
Kompleks Polycomb z Drosophila
Geny grupy Pc-G (ang. Polycomb-group) są represorami genów homeotycznych i zostały znalezione przy okazji
badania mutacji w tych genach (Simon, 1995). Białka Pc zawierają konserwowany ewolucyjnie motyw
�
chromodomeny� zidentyfikowany w specyficznie związanym z heterochromatyną białku HP1 (Paro i
Hogness, 1991). Samo białko Pc nie ma zdolności wiązania się z DNA i przypuszczalnie działa w kooperacji z
innymi czynnikami (Kingston i wsp., 1996). Funkcją produktów genów Pc-G jest ustalanie represyjnego stanu
chromatyny w obszarze genów homeotycznych. Dowodów na to dostarczyły prace, w których badano efekt
termowrażliwej mutacji w jednym z genów grupy Pc-G, genie E(z) (ang. enhancer of zeste). Zaobserwowano
rozluźnienie struktury nukleosomów politenicznych i rozpad kompleksu Pc-G skorelowane z termiczną
inaktywacją produktu genu E(z) (Rastelli i wsp., 1993). Utworzona przy udziale białek Pc-G represyjna struktura
chromatyny utrzymywana jest przez wiele podziałów komórkowych prawdopodobnie wskutek dziedziczenia
epigenetycznego (Kingston i wsp., 1996). Mechanizm tworzenia się takiej struktury jest jednak jak dotąd
nieznany, a system in vitro, w którym można by wykazać związek między formowaniem się nukleosomów a
obecnością białek Pc-G, nie istnieje (Kingston i wsp., 1996).
2.2.4 Histon H1
W cząsteczce histonu H1 nie ma typowej dla histonów rdzeniowych i uznawanej za najstarszą ewolucyjnie
domeny �zwinięcia� (ang. histone fold) (Arents i Moudrianakis, 1995). Również samo położenie H1 w
stosunku do DNA w chromosomie jest odmienne od pozostałych histonów (zob. Wstęp, rozdział 1.1). Nie
można wykluczyć możliwości, że H1 był w przeszłości czynnikiem transkrypcyjnym, który z czasem zaczął
pełnić dodatkową rolę elementu strukturalnego w chromatynie. Istotne są tu dane wskazujące na duże
podobieństwo struktury domeny wiążącej DNA histonu H1 ze strukturą domeny wiążącej DNA czynnika
transkrypcyjnego HNF-3 (Clark i wsp., 1993).
2.2.4.1 Ogólna represja transkrypcji przez H1 w układach in vitro
Histon H1 zaangażowany jest w formowanie włókna 30 nm i wyższych struktur chromatynowych, które
poważnie utrudniają transkrypcję. Z tego powodu H1 można uznać za czynnik determinujący powstawanie
nieaktywnych transkrypcyjnie obszarów chromatyny. Już wczesne doniesienia wskazywały, że H1 wiąże się w
odmienny sposób w aktywnych transkrypcyjnie rejonach chromatyny niż w obszarach wyciszonych (Weintraub,
1984). W układach in vitro histon H1 zachowuje się jak ogólny represor transkrypcji zarówno wtedy, gdy
matrycą jest nagi DNA, jak również w przypadku matryc chromatynowych, z których wcześniej usunięto H1
(zob. niżej). Represja transkrypcji skorelowana jest ze zdolnością H1 do indukowania struktur wyższego rzędu,
w których polimeraza i czynniki trans mają ograniczony dostęp do DNA (Hannon i wsp., 1984).
W układzie in vitro z plazmidem niosącym 18 kopii genu 5S RNA jeżowca Lytechinus variegatus badano
transkrypcję z użyciem polimerazy RNA z faga T7 (O�Neill i wsp., 1992; O�Neill i wsp., 1995). Uzyskane
wyniki pokazują, że histon H1 blokuje transkrypcję z nagiego DNA oraz jeszcze silniej z matryc
chromatynowych. Hamowaniu podlega zarówno proces inicjacji jak i elongacji transkrypcji, a mechanizm
polega w każdym przypadku na indukowaniu struktur chromatyny nieaktywnych transkrypcyjnie (O�Neill i
wsp., 1995). Usunięcie H1 przywraca aktywność transkrypcyjną w chromatynie zrekonstruowanej in vitro, a
utworzenie stabilnych kompleksów transkrypcyjnych zapobiega represji przez H1 (Shimamura i wsp., 1989).
Istnieją dane wskazujące, że wbudowanie histonu H1 do sztucznej chromatyny rekonstruowanej na
plazmidowym DNA powoduje spadek syntezy RNA przez polimerazę II do wartości 1-4 % w stosunku do
poziomu transkrypcji z nagiego DNA (Laybourn i Kadonaga, 1991). Mechanizm represji polega tu
prawdopodobnie na blokowaniu miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych i pozostaje w dynamicznej
równowadze z procesem wiązania antyrepresorów (np. czynników Sp1, GAL4-VP16 i GAGA) konkurujących z
H1 o dostęp do tych miejsc (Crosten i wsp., 1991; Pazin i wsp., 1994).
Zbadano również efekt histonu H1 na zależną od ATP reorganizację struktury chromatyny w obszarze
promotora genów szoku cieplnego u Drosophila. H1 osłabia (choć nie znosi całkowicie) wiązanie czynnika
GAGA i zmniejsza dostępność DNA dla endonukleaz restrykcyjnych w promotorach genów hsp26 i hsp70
(Tsukiyama i wsp., 1994; Varga-Weisz i wsp., 1995) (por. Wstęp, rozdział 2.2.1.2). Stwierdzono również, że
dodanie H1 ogranicza ruchliwość nukleosomów i hamuje transkrypcję przez polimerazę RNA III (Ura i wsp.,
1995).
2.2.4.2 Specyficzna regulacja transkrypcji genów przez histon H1 w układach in vivo
Działanie H1 jako specyficznego regulatora transkrypcji genów zostało najlepiej poznane w związku z ekspresją
genów 5S RNA u Xenopus laevis. Profil transkrypcji genów 5S RNA zmienia się w rozwoju embrionalnym
Xenopus. W początkowych fazach rozwoju transkrybowane są dwie rodziny tych genów: geny oocytarne, które
występują w około 20000 kopii na genom haploidalny, i geny somatyczne, których rodzina składa się z około
400 powtarzających się jednostek (Wolffe, 1994b). Pojedyncza jednostka oocytarna zawiera gen 5S RNA o
długości 120 par zasad oraz niefunkcjonalny pseudogen. Od strony 5� gen poprzedzony jest sekwencją
oskrzydlającą o różnej długości (360-570 par zasad), która - podobnie jak odcinek między genem a
pseudogenem - jest bogata w nukleotydy adeninowe i tyminowe (pary AT) (Korn i Brown, 1978; Peterson i
wsp., 1980). Jednostka somatyczna zbudowana jest z genu 5S RNA długości 120 par zasad sąsiadującego od
strony 5� z sekwencją długości około 600 par zasad i od strony 3� z fragmentem około 80 par zasad, obydwie
sekwencje są bogate w nukleotydy guaninowe i cytozynowe (pary GC). Somatyczny gen 5S RNA różni się od
oocytarnego zaledwie 8 mutacjami punktowymi (Peterson i wsp., 1980).
Począwszy od stadium późnej gastruli transkrypcja oocytarnych jednostek genu 5S RNA jest wyłączona,
podczas gdy geny somatyczne pozostają aktywne do końca życia organizmu. Przez długi czas brano pod uwagę
dwie hipotezy wyjaśniające mechanizm wyłączania genów 5S RNA. Pierwsza z nich przypisywała histonowi H1
rolę represora transkrypcji tych genów, a jej potwierdzeniem miały być wyniki badań in vitro, w których
wykazano, że do represji oocytarnych genów 5S RNA niezbędny jest H1 (Schlissel i Brown, 1984), oraz
obserwacje, że wyłączenie transkrypcji oocytarnegu genu 5S jest skorelowane w czasie z pojawieniem się u
Xenopus somatycznego wariantu histonu H1, który zaczyna być akumulowany dopiero podczas embriogenezy
(Smith i wsp., 1988; Chipev i Wolffe, 1992; Dworkin-Rastl i wsp., 1994), a nie ma go w oocytach (Dimitrov i
wsp., 1993). Druga z hipotez zakładała, że przyczyną hamowania transkrypcji badanych genów jest deficyt
czynnika transkrypcyjnego TFIIIA, a jej potwierdzeniem mogły być wyniki badań, w których po sztucznym
podniesieniu stężenia TFIIIA w zarodkach Xenopus uzyskiwano krótkotrwałą aktywację transkrypcji
oocytarnych genów 5S RNA (Andrews i Brown, 1987). Dopiero jednak doświadczenie in vivo, w którym
odblokowano wyłączone oocytarne geny 5S RNA, eliminując ekspresję H1 przy pomocy specyficznego
rybozymu (Kandolf, 1994), oraz doświadczenie polegające na wyłączeniu ekspresji aktywnego oocytarnego
genu 5S w zarodkach Xenopus przez sztucznie podniesienie poziomu histonu H1 w obecności TFIIIA (Bouvet i
wsp., 1994), potwierdziły rolę histonu H1 w selektywnej represji transkrypcji genów 5S RNA u Xenopus.
Istniało kilka innych hipotez wyjaśniających mechanizm regulacji transkrypcji tych genów. Sugerowano między
innymi, że aktywne geny somatyczne 5S RNA mogą ulegać replikacji wcześniej (gdy obecne są czynniki
transkrypcyjne) niż nieaktywne jednostki oocytarne (Gottesfeld i Bloomer, 1982; Wormington i wsp., 1982), jak
również przypisywano czynnikowi TFIIIA różnice w wiązaniu się do jednostki oocytarnej i somatycznej (Kmiec
i wsp., 1986; Blanco i wsp., 1989).
Dalsze próby wyjaśnienia mechanizmu selektywnej represji genów 5S RNA doprowadziły do znalezienia różnic
w strukturze chromatyny tych genów. Okazało się, że in vivo nieaktywne oocytarne jednostki genu 5S
zorganizowane są w luźno spozycjonowane nukleosomy i są chronione przed działaniem nukleaz, podczas gdy
aktywne geny somatyczne są dostępne dla enzymów i nie wykazują struktury nukleosomowej. Stwierdzono, że
odpowiedzialny za ustalanie nukleosomowej struktury chromatyny w obszarze oocytarnych jednostek 5S RNA
jest histon H1 (Chipev i Wolffe, 1992). Z kolei w badaniach in vitro wykazano, że zamiana sekwencji
oskrzydlających pomiędzy genami obu typów powoduje analogiczną zamianę wzoru represji transkrypcji tych
genów przez histon H1; wyłączanie transkrypcji obydwu typów genów zachodziło wtedy, gdy były one w
otoczeniu sekwencji bogatych w pary AT, pochodzących z jednostki oocytarnej genu 5S. Pokazano, że
przyczyna represji transkrypcji tkwi w selektywnym wiązaniu się histonu H1 do sekwencji AT-bogatych
otaczających oocytarny gen 5S RNA (Jerzmanowski i Cole, 1990).
Histon H1 narzuca więc stan stabilnej represji w obszarze oocytarnego genu 5S RNA, oddziałując z odcinkami
bogatymi w pary AT (Jerzmanowski i Cole, 1990). In vivo efekt H1 przejawia się w postaci znacznych różnic w
strukturze chromatyny między dwoma typami genów 5S (Chipev i Wolffe, 1992). Nieznany jest jednak
mechanizm kierowanego przez H1 procesu reorganizacji struktury chromatyny w wyniku oddziaływań histonu z
AT-bogatymi sekwencjami, w szczególności nie wiadomo, jakiej długości musi być obszar bogaty w AT i na
jaką odległość od genu może działać.
Niedawne doświadczenia z dysrupcją genów kodujących histon H1 u pierwotniaka Tetrahymena thermophila
pokazały, że H1 może również odgrywać rolę selektywnego aktywatora transkrypcji. Zidentyfikowano gen CyP,
którego transkrypcja jest hamowana pod nieobecność H1 (Shen i Gorovsky, 1996). Z tego powodu histon H1
określa się jako specyficzny regulator (pozytywny lub negatywny) ekspresji wybranych genów u Eukaryota.
Nie jest natomiast H1 ogólnym represorem transkrypcji genów w układach in vivo. Doświadczenia z
transgenicznymi roślinami tytoniu, w których następowała całkowita wymiana endogennego histonu H1 na H1
kodowany przez obcy gen, pokazały, że histonu H1 nie należy uznawać za globalny represor transkrypcji in
vivo, można natomiast przypisać mu udział w kontrolowaniu specyficznych programów rozwojowych
(Prymakowska-Bosak i wsp., 1996). Również z prac nad dysrupcją genów kodujących H1 u Tetrahymena
thermophila wynika, że obniżenie poziomu H1 nie prowadzi do istotnych zmian profilu transkrypcji genów
zależnych od polimeraz RNA I i III (Shen i Gorovsky, 1996). Histon H1 zwiększa jedynie stopień upakowania
materiału genetycznego, biorąc udział w tworzeniu struktur wyższego rzędu w chromatynie (Shen i wsp., 1995).
3. BADANIA IN VITRO
3.1 REKONSTYTUCJA CHROMATYNY
W komórce proces składania chromatyny jest sprzężony z replikacją DNA (Almouzni i Wolffe, 1993). Najpierw
odkładane są tetramery histonów H3/H4, następnie dimery H2A-H2B oraz histon H1, który wiąże się jako
ostatni (Wolffe, 1991; Wolffe, 1994). Część puli histonów H1, H2A i H2B jest syntetyzowana i włączana do
chromatyny w procesie aktywnej wymiany (Louters i Chalkley, 1985). W układach in vitro nukleosomy można
rekonstruować dwoma sposobami: w systemie związanym z replikacją DNA (Mé chali i Harland, 1982) lub
niezależnie od replikacji (zob. rozdziały 3.1.1 i 3.1.2). Aby uzyskać poprawną rekonstrukcję chromatyny,
konieczne jest spełnienie dwóch kryteriów: po pierwsze, musi dojść do powstania podstawowej jednostki
strukturalnej chromatyny poprzez nawinięcie nici DNA wokół oktameru histonowego, po drugie,
zrekonstruowane w ten sposób nukleosomy muszą zostać regularnie rozmieszczone na DNA. Chromatynę, która
spełnia obydwa kryteria, otrzymuje się in vitro stosując dwie grupy metod: albo rekonstytucję w
nieoczyszczonych ekstraktach wolnokomórkowych (ang. crude cell-free extracts) (zob. rozdział 3.1.1) będących
ź
ródłem endogennych histonów, albo rekonstytucję z czystych składników (ang. pure components) (zob.
rozdział 3.1.2). Uzyskiwane odległości między oktamerami w chromatynie zrekonstruowanej in vitro zbliżone są
do naturalnych (Stein, 1996).
3.1.1 Rekonstytucja przy pomocy nieoczyszczonych ekstraktów wolnokomórkowych
Po raz pierwszy sztuczną chromatynę uzyskano w ekstraktach Xenopus, wykorzystując do tego celu supernatant
zawierający endogenne histony. Po wprowadzeniu do takiego układu DNA wirusa SV40 (o długości 5243 par
zasad) DNA tworzyło strukturę nukleoproteinową tworząc tzw. minichromosom (Laskey i wsp., 1977).
Następne udane próby przeprowadzono z supernatantem S-150 z oocytów Xenopus (Rodriguez-Campos i wsp.,
1989). Ponieważ ekstrakt z oocytów nie zawiera histonu H1, do układu musi być dodawany H1 egzogenny,
którego ilość ma wpływ na odległości między nukleosomami. W latach 90-ych opracowano również systemy
rekonstytucji chromatyny w oparciu o ekstrakty z zarodków Drosophila, zawierające endogenną pulę histonów
(Becker i Wu, 1992; Kamakaka i wsp., 1993).
Badania mechanizmu rekonstytucji chromatyny in vitro doprowadziły do zidentyfikowania nukleoplazminy -
czynnika odpowiedzialnego za odkładanie nukleosomów (ang. nucleosome assembly factor) (Laskey i wsp.,
1978; Earnshaw i wsp., 1980), oraz kolejnych czynników N1/N2 (Kleinschmidt i Franke, 1982; Kleinschmidt i
wsp., 1986) (por. Wstęp, rozdział 1.1). Wykazano, że istotną rolę w procesie składania chromatyny pełni
również deacetylacja histonu H4 (Shimamura i Worcel, 1989) oraz aktywność topoizomerazy I (Sekiguchi i
Kmiec, 1988). Z kolei topoizomeraza II, która jest nieodzowna w tworzeniu struktur chromatyny wyższego
rzędu związanych z kondensacją chromosomów w mitozie (Adachi i wsp., 1991; Hirano i Mitchison, 1991), nie
jest konieczna do powstawania nukleosomów (Almouzni i Mé chali, 1988). Jednak niedawno wysunięto
przypuszczenie, że topoizomeraza II musi brać udział w rozpętlaniu i relaksacji DNA przed uformowaniem
nukleosomu (Rodriguez-Campos, 1996).
W znacznie mniejszym stopniu poznano mechanizmy rekonstytucji in vitro związane z replikacją cząsteczek
DNA (Mé chali i Harland, 1982; Almouzni i wsp., 1990b).
Zaletą wszystkich powyższych systemów jest ich niezawodność, natomiast za wadę należy uznać
zanieczyszczenie ekstraktów dużymi ilościami białek i aktywności enzymatycznych, których nie da się
kontrolować.
3.1.2 Rekonstytucja z czystych składników
Metody rekonstytucji chromatyny in vitro opierają się na stopniowym obniżaniu stężenia soli w roztworze, w
którym DNA i histony nie oddziałują ze sobą (powyżej 1.2 M NaCl) aż do uzyskania stężeń fizjologicznych, w
których histony wiążą się z DNA (Oudet i wsp., 1975; Hansen i wsp., 1991). Zrekonstruowana chromatyna ma
strukturę nieregularną, a produktem trawienia uzyskanego w ten sposób minichromosomu są fragmenty DNA
równe całkowitej wielokrotności 150 par zasad. Dodanie H1 do takiego układu prowadzi do niespecyficznej
agregacji, gdyż H1 oddziałuje kooperacyjnie z nieosłoniętymi odcinkami DNA (Stein, 1989; Dimitrov i Wolffe,
1995). Stosowane metody pozwalają na przeciwdziałanie agregacji histonów z DNA.
3.1.2.1 Systemy oparte na kwasie poliglutaminowym
Kwas poliglutaminowy (ang. polyglutamic acid, PGA) oraz jego sól sodowa są polianionami zaangażowanymi w
osłabianie niespecyficznych agregacji białek i DNA podczas rekonstrukcji minichromosomów. Związki te pełnią
funkcję analogiczną do roli nukleoplazminy in vivo (por. rozdział 3.1.1), kontrolując dołączanie heterodimerów
H2A-H2B do formowanego nukleosomu (Krude i Elgin, 1996). PGA umożliwia także histonowi H1
organizowanie regularnej struktury nukleosomowej na DNA, głównie dzięki wyższemu powinowactwu H1 do
nukleosomów niż do nagiego DNA (Hayes i Wolffe, 1993). Mechanizm reorganizacji nukleosomów przez histon
H1 pozostaje jednak nieznany, gdyż nie jest do końca wiadomo, w jaki sposób H1 oddziałuje z oktamerem. In
vitro zaobserwowano wyraźne preferencje histonów łącznikowych do miejsc krzyżowania się dwuniciowego
DNA (ang. crossovers) (Krylov i wsp., 1993). Preferencje te mogą przemawiać za modelem, w którym histon H1
spina DNA wchodzące i schodzące z oktameru i w ten sposób, zwiększając długość DNA nawiniętego na rdzeń,
rozsuwa nuklesomy (Stein, 1996). Z kolei asymetryczne wiązanie histonu H1/H5 do nukleosomowego DNA
oraz częściowo do DNA linkera (Hayes i wsp., 1994; Pruss i wsp., 1996) może prowadzić do usztywnienia DNA
w obszarze łącznikowym i w rezultacie do odwinięcia DNA z nukleosomów oraz do ich przemieszczenia (Stein,
1996).
3.1.2.2 Systemy oparte na syntetycznych fragmentach DNA
In vitro poprawnie zrekonstruowaną chromatynę z nukleosomami odległymi o 210 ą 5 par zasad łatwo się
uzyskuje na syntetycznych sekwencjach typu poli(dA-dT) w obecności PGA. Decydującą rolę w rozsuwaniu
upakowanych na DNA cząstek rdzeniowych przypisuje się histonom H5/H1, bowiem pod ich nieobecność
nukleosomy nie tworzą uporządkowanych struktur (Stein i Bina, 1984). Łatwość rekonstytucji chromatyny na
sekwencjach poli(dA-dT) tłumaczy się wysokim ich powinowactwem do H1 oraz wyeliminowaniem przez nie
innych sekwencji, wobec których nukleosomy mogłyby wykazywać preferencje.
3.1.2.3 Systemy oparte na naturalnych sekwencjach pozycjonujących nukleosomy
W genomie eukariotycznym prawdopodobnie istnieją sygnały decydujące o sposobie rozmieszczenia
nukleosomów w chromatynie (Simpson, 1991; Stein, 1996). Zidentyfikowano kilka takich sygnałów i zaczęto je
stosować w układach in vitro jako tzw. sekwencje �pozycjonujące� nukleosomy i reorganizujące strukturę
chromatyny. Pierwszą znalezioną sekwencją tego typu był fragment genu 5S rRNA jeżowca Lytechinus
variegatus, który zawiera silny sygnał pozycjonujący dla oktameru histonowego (Gottesfeld, 1987). Wykazano,
ż
e po dodaniu histonów H1/H5 plazmid niosący kilkanaście powtórzeń tego genu zdolny jest do regularnego
rozmieszczania nukleosomów (ang. alignment) na sekwencjach 5S rDNA (Simpson i wsp., 1985; Meersseman i
wsp., 1991). Podobne właściwości, polegające na zdolności rozsuwania ciasno upakowanych nukleosomów po
włączeniu H5, zaobserwowano dla intronów w genie owoalbuminy kurzej, które w testowanym układzie in vitro
rozsuwały nukleosomy na odległość 196 par zasad (Lauderdale i Stein, 1992), dla kurzego genu beta-globiny
(odpowiednio 180 par zasad) (Liu i wsp., 1993) oraz dla intronów w szczurzym genie hormonu wzrostu
(odpowiednio 195 par zasad) (Liu i wsp., 1995). W bakteryjnym plazmidzie pBR327 (o długości 3274 par zasad)
zidentyfikowano obszar COR (ang. chromatin organizing region) odpowiedzialny za pozycjonowanie i
reorganizację nukleosomów w obecności histonów H1/H5 (Jeong i wsp., 1991). Zaproponowano mechanizm
rozsuwania oktamerów polegający na pozycjonowaniu 2 nukleosomów co 210 par zasad w obrębie COR, a
następnie rozprzestrzenianiu się tego regularnego układu na sąsiednie obszary plazmidu. Poddano analizie
kilkadziesiąt konstrukcji plazmidowych pod kątem ich przydatności do rekonstrukcji chromatyny in vitro.
Uzyskane dane wskazują, że matryce do rekonstytucji oparte na pochodnych plazmidu pBR327 muszą
dodatkowo spełniać następujące warunki: ich długość powinna być równa całkowitej wielokrotności 210 ą 3 par
zasad oraz nie mogą mieć naruszonej ciągłości obszaru COR (Lauderdale i Stein, 1993).
3.2 TRANSKRYPCJA IN VITRO
W doświadczeniach stosuje się kilka metod badania transkrypcji danego genu: system wykorzystujący oocyty X.
laevis polega na wstrzyknięciu DNA do oocytu Xenopus i uzyskaniu transkrypcji, w systemach transfekcji
wprowadza się egzogenny DNA do hodowli komórkowej i uzyskuje krótkotrwałą (ang. transient assay) lub
długotrwałą (ang. stable) ekspresję genu, systemy transgeniczne polegają na wprowadzeniu genu do linii
zarodkowej zwierzęcia i uzyskaniu w niej ekspresji takiego transgenu, system in vitro polega na otrzymaniu
transkryptu w ściśle kontrolowanych warunkach w probówce (Lewin, 1997).
Metoda transkrypcji in vitro jest najszybszym testem poziomu transkrypcji badanego genu, pozwalającym na
dokonywanie zmian w sekwencjach DNA oraz w składzie białek regulatorowych. Technika ta umożliwia m. in.
badanie selektywnej regulacji inicjacji transkrypcji (Gorski i wsp., 1986), identyfikację białek zaangażowanych
w regulację ekspresji (Hirai i wsp., 1986), jak również prowadzenie badań z zastosowaniem rekonstytuowanej
chromatyny (Nakanishi i wsp., 1986).
Znane są dwa systemy transkrypcji in vitro: pierwszy opiera się na ekstraktach sporządzonych z całych komórek
(ang. whole cell extracts, WCE) lub jąder komórkowych (ang. nuclear extracts) (Manley i wsp., 1983; Dignam i
wsp., 1983a), w drugim stosuje się oczyszczone czynniki transkrypcyjne i polimerazy RNA (Dignam i wsp.,
1983b). Do przygotowania ekstraktów transkrypcyjnych typu WCE używa się zwykle komórek z linii
nowotworowej HeLa lub komórek raka Ehrlicha (Dignam i wsp., 1983a), jak również z tkanki mózgowej i
wątroby ssaków (Gorski i wsp., 1986). Gotowy ekstrakt jest źródłem polimeraz RNA i czynników
transkrypcyjnych.
Transkrypcja wykorzystująca oczyszczone składniki jest trudniejsza do przeprowadzenia ze względu na
problemy z przygotowaniem czynników transkrypcyjnych i polimeraz w stopniu czystości dającym gwarancję
pełnej kontroli składu mieszaniny.