Katedra Mikrobiologii
Uniwersytet Gda
ń
ski
Instrukcja do
ć
wicze
ń
z immunologii
dla studentów II roku Biologii studiów
stacjonarnych
Anna-Karina Kaczorowska
Katedra Mikrobiologii
Uniwersytet Gda
ń
ski
Instrukcja do
ć
wicze
ń
z immunologii
dla studentów II roku Biologii studiów
stacjonarnych
Anna-Karina Kaczorowska
Instrukcje do
ć
wicze
ń
z immunologii
Katedra Mikrobiologii UG
Opracowała: dr Anna-Karina Kaczorowska, 20 lutego 2009 r.
-2-
Ć
WICZENIE 1
(V tydzie
ń
semestru letniego)
Reakcje serologiczne w diagnostyce bakterii z rodzajów
Staphylococcus i Streptococcus
Jedn
ą
z podstawowych umiej
ę
tno
ś
ci ka
ż
dego mikrobiologa jest zdolno
ść
do szybkiej identyfikacji bakterii
wyizolowanych z ich naturalnego
ś
rodowiska. Diagnostyka mikrobiologiczna w pierwszym rz
ę
dzie zakłada
wyodr
ę
bnienie drobnoustroju w postaci czystej kultury. Potrzebna jest do tego umiej
ę
tno
ść
wykonywania
prawidłowego posiewu izolacyjnego. Obserwacje morfologii pojedynczych kolonii, techniki barwienia bakterii,
testy biochemiczne, oporno
ść
na antybiotyki oraz reakcje serologiczne pozwalaj
ą
na szybk
ą
identyfikacj
ę
wyizolowanego mikroorganizmu.
Instrukcje do
ć
wicze
ń
z immunologii
Katedra Mikrobiologii UG
Opracowała: dr Anna-Karina Kaczorowska, 20 lutego 2009 r.
-3-
Na dzisiejszych zaj
ę
ciach przedstawione zostan
ą
zasady identyfikacji bakterii z rodzajów Staphylococcus i
Streptococcus, w oparciu o pewne cechy biochemiczne oraz obecno
ść
charakterystycznych antygenów.
Ka
ż
da para studentów otrzyma płytk
ę
z hodowl
ą
bakteryjn
ą
. Jedynie prowadz
ą
cy b
ę
dzie wiedział, czy jest to
hodowla gronkowców czy paciorkowców. Zadanie polega na zidentyfikowaniu bakterii. Schemat przebiegu
poszczególnych etapów procesu identyfikacji bakterii podano na rys. 1.
Pierwszym krokiem b
ę
dzie przeprowadzenie barwienia metod
ą
Grama i okre
ś
lenie na podstawie testu na
katalaz
ę
, czy Wasze bakterie wytwarzaj
ą
ten enzym. Dalsza identyfikacja bakterii b
ę
dzie polegała
przeprowadzeniu odpowiedniego testu aglutynacji lateksowej i okre
ś
leniu wła
ś
ciwo
ś
ci antygenowych bakterii.
Do
ś
wiadczenia wykonujemy w parach.
Do
ś
wiadczenie 1.1
Barwienie metod
ą
Grama bakterii z podło
ż
a stałego
1)
Nanie
ś
bakterie na odtłuszczone szkiełko podstawowe
W przypadku wykonywania preparatu z bakterii wyrosłych na podło
ż
ach stałych nale
ż
y materiał pobra
ć
jałow
ą
ez
ą
(czyli opalon
ą
w
płomieniu palnika), a nast
ę
pnie zawiesi
ć
bakterie w kropli soli fizjologicznej naniesionej na szkiełko podstawowe. W przypadku
wykonywania preparatu z hodowli płynnej wystarczy nanie
ść
na szkiełko kropl
ę
hodowli lub pobra
ć
odrobin
ę
bakterii jałow
ą
ez
ą
i
rozprowadzi
ć
zawiesin
ę
na powierzchni szkiełka). Zabiegi te maj
ą
na celu przygotowanie bakterii w postaci niezbyt g
ę
stej zawiesiny.
2)
Po wysuszeniu, utrwal preparat przez przeci
ą
gniecie szkiełka podstawowego nad płomieniem palnika.
Nale
ż
y uwa
ż
a
ć
, by nie trwało to zbyt długo.
3)
Na utrwalone bakterie nakropl fiolet krystaliczny w ten sposób, aby pokrył on powierzchni
ę
, na któr
ą
naniesiono bakterie. Barwnik pozostawi
ć
na 2 minuty. Po tym czasie zmy
ć
fiolet wod
ą
destylowan
ą
.
4)
Nanie
ś
płyn Lugola na 1 minut
ę
. Płyn nale
ż
y obficie spłuka
ć
, najpierw alkoholem etylowym, a pó
ź
niej
wod
ą
destylowan
ą
5)
Nanie
ś
na preparat roztwór fuksyny zasadowej na 40 sekund. Po tym czasie spłucz szkiełko wod
ą
destylowan
ą
i wysusz preparat.
6)
Przed umieszczeniem preparatu na stoliku mikroskopu nanie
ś
na szkiełko kropl
ę
olejku immersyjnego.
Ogl
ą
daj u
ż
ywaj
ą
c obiektywu daj
ą
cego stukrotne powi
ę
kszenie.
Do
ś
wiadczenie 1.2
Test na obecno
ść
katalazy
1) Na szkiełko podstawowe nanie
ś
ez
ą
kropl
ę
jałowego roztworu soli fizjologicznej (0,85%
NaCl) i równomiernie zawie
ś
w nim niewielk
ą
ilo
ść
masy bakteryjnej pobranej z podło
ż
a
stałego.
2) Do otrzymanej zawiesiny bakteryjnej dodaj
kilka kropli wody utlenionej (3% r-r H
2
O
2
).
Obserwuj preparat (gołym okiem).
Pojawienie si
ę
piany (b
ą
belków)
w preparacie
ś
wiadczy o obecno
ś
ci katalazy
(wynik dodatni).
Katalaza rozkłada nadtlenek wodoru, wyst
ę
puje
u niemal wszystkich organizmów oddychaj
ą
cych
tlenowo.
szczepy katalazo-dodatnie: rodzaj
Staphylococcus, Enterobacter, Pseudomonas,
Citrobacter, Escherichia, Klebsiella,
szczepy katalazo-ujemne: rodzaj
Enterococcus, Streptococcus, Aerococcus,
Lactococcus oraz wi
ę
kszo
ść
bakterii
beztlenowych (jeden znany wyj
ą
tek)
Instrukcje do
ć
wicze
ń
z immunologii
Katedra Mikrobiologii UG
Opracowała: dr Anna-Karina Kaczorowska, 20 lutego 2009 r.
-4-
→
Studenci, którzy stwierdzili w obrazie mikroskopowym obecno
ść
skupie
ń
Gram-dodatnich ziarniaków
oraz uzyskali dodatni wynik w te
ś
cie na katalaz
ę
wykonuj
ą
t e s t a g l u t y n a c j i p r z y u
ż
y c i u z e s t a w u
M i c r o g e n S t a p h firmy Microgen Bioproducts Ltd (Wielka Brytania). Test ten słu
ż
y do wykrywania na
drodze reakcji serologicznej obecno
ś
ci białka A oraz czynnika koaguluj
ą
cego.
→
Studenci, którzy stwierdzili w obrazie mikroskopowym obecno
ść
Gram-dodatnich bakterii w postaci
ła
ń
cuszków oraz uzyskali ujemny wynik w te
ś
cie na katalaz
ę
wykonuj
ą
t e s t a g l u t y n a c j i p r z y u
ż
y c i u
z e s t a w u M i c r o g e n S t r e p firmy Microgen Bioproducts Ltd (Wielka Brytania).
Do
ś
wiadczenie 1.3a
Identyfikacja szczepów Staphylococcus aureus - wykrywanie obecno
ś
ci czynnika
koaguluj
ą
cego i białka A przy pomocy testu aglutynacji Microgen Staph
W te
ś
cie Microgen Staph cz
ą
steczki lateksu opłaszczone s
ą
króliczymi przeciwciałami swoistymi wobec czynnika koaguluj
ą
cego oraz
białka A unikatowego dla bakterii Staphylococcus ureus
1) Temperatur
ę
odczynników z zestawu do aglutynacji
Microgen Staph (Emapol) nale
ż
y doprowadzi
ć
do
temperatury pokojowej. Odczynniki przechowywane
s
ą
w temp. 4°C.
2) Na pole testowe nakropl roztwór przeciwciał swoistych
wobec białek wytwarzanych przez bakterie gronkowca
złocistego: białka A oraz czynnika koaguluj
ą
cego
osocze. Obok nanie
ś
ez
ą
niewielk
ą
obj
ę
to
ść
roztworu
soli fizjologicznej.
3) W roztworze soli zawie
ś
niewielk
ą
ilo
ść
masy
bakteryjnej (4-5 kolonii bakterii pobranych z podło
ż
a
stałego).
4) Obydwie krople wymieszaj ez
ą
(za ka
ż
dym razem ez
ę
nale
ż
y wy
ż
arzy
ć
i schłodzi
ć
) i obserwuj, delikatnie
kołysz
ą
c płytk
ą
.
Odczyt: Obecno
ść
kłaczków (widocznych
gołym okiem)
ś
wiadczy o zaj
ś
ciu aglutynacji.
W przypadku braku aglutynacji obserwuje si
ę
jednolit
ą
mieszanin
ę
o mlecznym zabarwieniu.
Białko A i czynnik koaguluj
ą
cy osocze
(CF) s
ą
jednymi z wielu czynników
wirulencji gronkowca złocistego.
Białko (SpA) wi
ąż
e si
ę
z fragmentem Fc
przeciwciał IgG uniemo
ż
liwiaj
ą
c tym
samym wi
ą
zanie si
ę
tych przeciwciał z
receptorami Fc
γ
R obecnymi na
powierzchni komórek
ż
ernych. Chroni to
bakterie przed fagocytoz
ą
.
Czynnik koaguluj
ą
cy osocze (CF) ułatwia
gronkowcom kolonizacj
ę
gospodarza,
swoj
ą
nazw
ę
zawdzi
ę
cza zdolno
ś
ci do
koagulacji osocza. Zwi
ą
zany jest z
obecno
ś
ci
ą
dwóch niezale
ż
nych białek -
adhezyn ClfA i ClfB, które s
ą
zakotwiczone w
ś
cianie bakterii. ClfA
wi
ąż
e si
ę
z fibrynogenem, ClfB wi
ąż
e poza
fibrynogenem tak
ż
e cytokeratyn
ę
10.
Instrukcje do
ć
wicze
ń
z immunologii
Katedra Mikrobiologii UG
Opracowała: dr Anna-Karina Kaczorowska, 20 lutego 2009 r.
-5-
Test aglutynacji Microgen Staph
Dodatni: Staphylococcus aureus
Ujemny: gronkowce koagulazo-ujemne:
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus saprophyticus
Do
ś
wiadczenie 1.3b
Serotypowanie paciorkowców nale
żą
cych do grup A, B lub D
przy pomocy testu aglutynacji Microgen Strep
W te
ś
cie Microgen Strep cz
ą
steczki lateksu opłaszczone s
ą
króliczymi przeciwciałami swoistymi wobec antygenów paciorkowców grup
A, B, C, D, F, G.
Kolonie paciorkowców pobrane ez
ą
z płytki inkubowane s
ą
w roztworze enzymu pochodz
ą
cego ekstrahuj
ą
cego antygeny izolowanego z
promieniowców Streptomyces globisporus. Ekstrakt anygenowy mo
ż
e by
ć
równie
ż
otrzymywany przez traktowanie bakterii takimi
zwi
ą
zkami jak azotyn sodu i kwas octowy, kwas hydrochlorowy, kwas azotowy czy formamid. Wyekstrahowane antygeny s
ą
nast
ę
pnie
testowane na płytce przy u
ż
yciu 6 opłaszczonych przeciwciałami cz
ą
steczek reagentów lateksowych (ka
ż
dy swoisty wobec jednej z grup
A, B, C, D, F lub G paciorkowców).
1) Temperatur
ę
odczynników z zestawu do aglutynacji Microgen Strep (Emapol) nale
ż
y doprowadzi
ć
do
temperatury pokojowej. Odczynniki przechowywane s
ą
w temp. 4°C.
2) Do próbówki Eppendorfa przenie
ś
0,4 ml roztworu zawieraj
ą
cego substancje ekstrahuj
ą
ce antygeny
paciorkowcowe (odczynnik M47x).
3) W roztworze zawie
ś
4-5 kolonii bakterii pobranych z podło
ż
a stałego. Uzyskan
ą
mieszanin
ę
inkubuj w
ła
ź
ni wodnej w temp. 37°C przez 5 min. Po tym czasie w strz
ąś
nij zawarto
ść
próbówki.
4) Na ka
ż
de pole czarnej płytki pipet
ą
automatyczn
ą
nanie
ś
po 1 kropli inkubowanej mieszaniny (ok. 10
µ
l).
Obok, przy pomocy kroplomierza, nanie
ś
zawiesin
ę
cz
ą
steczek lateksowych opłaszczonych
przeciwciałami swoistymi wobec okre
ś
lonego antygenu grupowego paciorkowców.
5) Obydwie krople wymieszaj ez
ą
(za ka
ż
dym razem ez
ę
nale
ż
y wy
ż
arzy
ć
i schłodzi
ć
) i obserwuj, delikatnie
kołysz
ą
c płytk
ą
.
Odczyt: Obecno
ść
kłaczków (widocznych gołym
okiem)
ś
wiadczy o zaj
ś
ciu aglutynacji.
W przypadku braku aglutynacji obserwuje si
ę
jednolit
ą
mieszanin
ę
o mlecznym zabarwieniu.
Bakterie wykorzystane w do
ś
wiadczeniach:
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus
pyogenes, Enterococcus (Streptococcus) faecalis, S. agalactiae.
Stosowane skróty:
SpA – S. aureus protein A
CF – clumping factor
Grupa serologiczna
Przedstawiciele
paciorkowce grupy A
S. pyogenes
paciorkowce grupy B
S. agalactiae
paciorkowce grupy C
-
paciorkowce grupy D
Enterococcus
(Streptococcus) faecalis,
Enterococcus faecium
paciorkowce grupy F
-
paciorkowce grupy G
-
System klasyfikacji paciorkowców w oparciu
o ich wła
ś
ciwo
ś
ci antygenowe zaproponowała
w 1933 r. Rebecca Lancefield. Na podstawie
reakcji serologicznej bakterii paciorkowców
z odpowiedni
ą
surowic
ą
grupow
ą
oznacza si
ę
przynale
ż
no
ść
do jednej z grup serologicznych
(od A do V).
O przynale
ż
no
ś
ci paciorkowców do grupy
A, B, C, F, G decyduje budowa
polisacharydów wchodz
ą
cych w skład
ś
ciany bakteryjnej paciorkowców.
O przynale
ż
no
ś
ci paciorkowców do grupy D
decyduje struktura kwasów
lipotejchojowych.