07 Transkrypcja i rola RNA w komórce

Zasada transkrypcji z DNA do RNA

W czasie transkrypcji nici DNA rozdzielaj

na stosunkowo krótkim odcinku: jedna ni

jest czynna jako matryca (template) a druga bierna. Nawet gdy geny le

Ŝą

blisko siebie,

to nie zawsze ta sama ni

jest czynna, co sprawia,

e kierunek przesuwania si

polimerazy RNA wzd

chromosomu jest ró

ny w ró

nych genach

Transkrypcja u bakterii -

inicjacja

Na transkrypcj

adaj

trzy etapy:

- inicjacja: polimeraza RNA rozpoznaje promotory czyli odcinki DNA zawieraj

specyficzne sekwencje; u E.coli około 35 zasad przed pocz

tkiem transkrypcji wyst

puje

sekwencja TTGACAT, a około10 zasad przed tym pocz

tkiem sekwencja TATAAT

2. Transkrypcja u bakterii

- elongacja: dodawanie nukleotydów
z wykorzystaniem energii
zgromadzonej w dostarczanych do tej
reakcji nukleotydów z trójfosforanem

;

jeden gen mo

e by

odczytywany

przez wiele kompleksów polimerazy
RNA na raz, dlatego produkcja mRNA
mo

e by

obfita

... co wi

cej, do nieuko

czonych

ła

cuchów RNA doczepiaj

rybosomy i rozpoczyna si

translacja;

w ten sposób z jednego odcinka DNA
powstaje od razu wiele polipeptydów
(w genach gdzie transkrypcja jest
intensywna)

2. Transkrypcja u bakterii

- terminacja, zale

y cz

sto od sekwencji DNA, która le

y za genem; typow

przyczyn

terminacji u E. coli jest taka sekwencja DNA, która

transkrybowana na mRNA powoduje,

e tworzy ono p

tle b

ce sygna

dla polimerazy RNA by od

łą

czy

od DNA

2. Transkrypcja u bakterii

Obróbka zsyntetyzowanego bakteryjnego RNA jest mało intensywna.
Bakteryjny mRNA nie jest modyfikowany, nadaje si

od razu do translacji.

Natomiast bakteryjne rRNA (wchodzi w skład rybosomów) i tRNA
(transportuj

cy) wchodz

w skład długich pre-RNA, które s

potem ci

przez specyficzne rybonukleazy (w przykładzie M5, M16, M23)

2. Transkrypcja u bakterii
- operon.

- ekspresja stała
(konstytutywna) wyst

puje

w przypadku wielu genów,
których produkty s

zawsze

potrzebne w komórce (na
rycinie obok stale jest
produkowane białko
represora słu

Ŝą

normalnie do wyciszenia
operonu laktozy)

-ekspresja indukowana:
(a) operon laktozy -
regulacja negatywna –
normalnie wył

czony,

obecno

ść

laktozy go

uruchamia

3. RNA eukariontów

W komórkach eukariontów s

trzy polimerazy RNA, ka

da transkrybuje inne rodzaje RNA

mRNA – transkrypty genów daj

cych bialka (protein coding RNA)

tRNA – transport aminokwasów do rybosomu
rRNA – rybosomalne RNA, komponent rybosomów, stanowi 80% całego RNA w komórce
snRNA – small nuclear RNA, bior

udział w przycinaniu pre-mRNA do dojrzałego mRNA

snoRNA – w j

derku, uczestnicz

w dojrzewaniu rRNA

miRNA – mikro RNA – małe cz

steczki RNA, reguluj

ekspresj

indywidualnych genów

siRNA – short interfering RNA, reguluj

ekspresj

indywidualnych genów

3. RNA eukariontów

mRNA, czyli informacja z genów koduj

cych to bardzo mała cz

ęść

RNA, ogromna

kszo

ść

to RNA funkcjonuj

ca w ró

nych procesach (głównie translacji). RNA

eukariontów jest znacznie bardziej zró

nicowane ni

RNA prokariontów

4. Regulacja transkrypcji u eukariontów

da z polimeraz RNA ma swoje typowe promotory

W dalszej cz

ęś

ci wykładu zajmiemy si

głównie polimeraz

RNA II bo jej aktywno

ść

ma zwi

zek z regulacj

ekspresji genów.

W wi

kszej odleg

ci od

promotora (tysi

ce bp) mog

inne sekwencje DNA podnosz

(enhancers) lub obni

(silencers) prawdopodobie

stwo

utworzenia kompleksu
transkrypcyjnego – s

to odleg

(distant) elementy typu cis.

W dowolnych miejscach genomu
(inne chromosomy) le

Ŝą

geny

koduj

ce bia

ka, które w

łą

czaj

w kompleks transkrypcyjny – s

bia

ka regulatorowe typu trans.

Bia

łą

z polimeraz

RNA

i s

oplatane nici

DNA. Jest to

kompleks transkrypcyjny, którego

atwo

ść

tworzenia, czyli

intensywno

ść

transkrypcji, mo

precyzyjnie regulowana

poprzez zmiany we wszystkich
elementach.

4. Regulacja transkrypcji u eukariontów
Transkrypt eukariotycznego mRNA jest modyfikowany poprzez dodanie czapeczki (cap)
i ogonka (tail).

Czapeczka to zmetylowany GTP (guanozynotrójfosforan) dodawany przed pierwszy

rybonukleotyd transkryptu (czyli na jego ko

cu 5’). Nast

puje to gdy transkrypt ma

zaledwie 30 nukleotydów.

W terminalnej cz

ęś

ci transkryptu znajduje si

sekwencja 5’-AAUAAA-3’ (czyli w DNA jest

to 3’-TTATTT-5’). Ta sekwencja transkryptu jest sygnałem do ci

cia i

dodania ci

gu około 250 adenin jako ogona w odległo

ci około 20 nukleotydów za

sekwencj

5’-AAUAAA-3’ (czyli na ko

cu 3’ transkryptu)

4. Regulacja transkrypcji u eukariontów

Poliadenylacja ma wpływ na terminacj

transkrypcji. Do kompleksu polimerazy II

doczepione jest białko CPSF. Gdy w transkrypcie pojawi si

sekwencja poli(A), CPSF

przenosi si

na t

sekwencj

transkryptu, co jest sygnałem do rozwi

zania kompleksu

polimerazy.

5. Usuwanie intronów

Znaczna wi

kszo

ść

intronów zaczyna si

od 5’-GU-3’ a ko

czy na 5’-AG-3’. S

to miejsca

cia (splice sites). U wy

szych eukariontów cz

sto wyst

puje te

odcinek

polipirymidynowy. Te sekwencje maj

swoj

rol

w procesie usuwania intronów.

5. Usuwanie intronów

W ogólnym zarysie, wycinanie
intronów rozpoczyna si

tego,

e grupa hydroksylowa

jednej z adenin w

rodku

intronu doprowadza do rozbicia
wi

zania fosforanowego przed

pierwszym nukleotydem intronu
(5’-G). W drugim etapie, grupa
hydroksylowa (3’-OH) z
ko

ca poprzedzaj

cego egzonu

doprowadza do rozbicia
wi

zania fosforanowego

za ostatni

zasada intronu (G-

3’). Egzony si

, intron

ulega degradacji.

Operacja ta jest katalizowana
przez zespół snRNA, z których
ka

dy jest poł

czony z białkiem

(tutaj oznaczone 1-6). Tworz

one razem spliceosome.

6. Aternatywne składanie egzonów (alternative spiling)

Wyci

cie wszystkich egzonów prowadziłoby do powstania zawsze takiego samego

cowego mRNA.

U eukariontów cz

ste jest jednak wycinanie niektórych egzonów przy okazji wycinania

intronów. Jest to alternatywne składanie egzonów, z jednego genu powstaj

rózne mRNA!

6. Aternatywne składanie egzonów

Regulacja alternatywnego składania jest słabo poznana, ale wiadomo,

e jego efekty mog

ne funkcjonalnie. U ludzi wyst

puje gen slo koduj

cy białko reguluj

ce przepływ

jonów potasu prze błon

komórkow

. Ma on 35 egzonów, z których 8 (na zielono) mog

wyst

powa

lub nie w ró

nych kombinacjach. Znanych jest około 500 alternatywnych form

tego białka.

Gen slo jest aktywny w uchu wewn

trznym, w otoczeniu włosów słuchowych. Alternatywne

aktywno

ci form kodowanego przez niego białka daj

wra

liwo

ść

na ró

ne cz

stotliwo

ci fal

kowych, od 20 do 20.000 Hz.

7. Degradacja RNA

Czas

ycia mRNA liczy si

minut w bakteriach do godzin u
ssaków. Usuni

cie mRNA

zapobiega powstawaniu białka,
tym samym mo

e by

elementem

regulacji ekspresji genów. Istnieje
kilka sposobów usuwania
wewn

trzkomórkowego DNA.

Jednym z lepiej poznanych
mechanizmów (deanylation
dependent decapping) wymaga by
najpierw usuni

ty został ogon

poli(A) a potem czapeczka
metyloguaniny. Ogon staje si

dost

pny dla egzonukleaz, gdy

odł

białka, które normalnie

go stabilizuj

. Koniec 5’ staje si

dost

pny dla egzonukleazy gdy

czapeczka nie zwi

ąŜ

e si

białkami stymuluj

cymi translacj

8. Wyciszanie RNA (RNA
silencing)

Eukarionty potrafia rozpozna

usun

ąć

obce RNA z komórki,

jest to zabezpieczenie przed
np. retrowirusami. W
przeciwie

stwie do mRNA, RNA

wirusów jest dwuniciowe
(cho

by przej

ciowo).

Rybonukleaza Dicer tnie
dwuniciowe RNA na kawałki po
21-28 nukleotydów nazywane
siRNA (short interfering RNA).
Najciekawsze jest to,

e siRNA

jest rozdzielane na pojedyncze
nici i wtedy mo

e odszuka

komplementarne mRNA wirusa,
który zd

ąŜ

ył ju

namno

Te odcinki dwuniciowe
przywołuj

kompleks białkowy

RISC, który rozkłada tak
wyznakowany RNA. Inwazja
wirusa jest powstrzymana.

8. Wyciszanie RNA (RNA silencing)
Bardzo podobne systemy s

ywane do selektywnego usuwania własnego mRNA. W

ró

nych miejscach w genomie kodowane s

krótkie odcinki RNA, które daj

podwójna ni

po transkrypcji (bo maj

odwrócone powtórzenia). Sa one ci

te przez Dicer a powstałe

jednoniciowe RNA okazuje si

komplementarne do mRNA komórki, np. w odcinku

terminalnym mRNA nie podlegaj

cym translacji. mRNA z doł

czonymi miRNA jest

usuwane z komórki. Coraz wi

cej miRNA jest znajdowane w genomach eukariontów.

Nasuwa si

podejrzenie,

e taka regulacja ekspresji jest cz

sta i wa

na. Biotechnolodzy

wykorzystuj

to do wyciszenia aktywno

ci genów bez przeprowadzania ich delecji!

9. Transportowanie RNA

RNA wydostaje si

na zewn

trz

dra na drodze aktywnego

transportu poprzez kanały w
błonie j

drowej. W transporcie

uczestnicz

białka karioferyny

(ro

ne dla ró

nych rodzajów

RNA) i zu

ywana jest energia

(hydroliza GTP).

Niektóre rodzaje RNA, takie jak
snRNA i snoRNA wydostaj

na zewn

trz j

dra ł

kompleksy z odpowiednimi
białkami i takie połaczone
cz

steczki wracaj

do j

dra

gdzie uczestnicz

przekształcaniu/dojrzewaniu
j

drowego RNA.