Generated by Unregistered Batch DOC & DOCX Converter 2011.3.114.1454, please register!
Regulacja inicjacji transkrypcji u bakterii (Cd.):
- zależna od działania białek regulatorowych
Poprzez operatory – regiony sąsiadujące z promotorem i regulujące proces inicjacji
transkrypcji operonu.
Z operatorem mogą łączyć się represory – białka wiążące się z DNA i umożliwiające
przyłączenie polimerazy i blokujące inicjację transkrypcji.
Z represorem mogą łączyć się induktory (substrat szlaku metabolicznego kontrolowanego
przez dany operon) uniemożliwiające jego przyłączenie do operatora, co umożliwia polimerazie
dostęp do promotora i inicjuje transkrypcję.
Z represorem może wiązać się korepresor – produkt szlaku bioch. Gdy obecny jest produkt
szlaku to szlak pozostaje wyłączony.
Regulacja transkrypcji u Eucaryota.
Moduły promotora podstawowego zapewniają podstawowy poziom transkrypcji.
Sekwencje regulatorowe znajdują się w obrębie promotorów i enhanterów (wzmacniaczy).
Moduły promotorowe występują w regionach tuz powyżej genu
Wzmacniacze – sekw. o dług. 200-300 bp położone są powyżej lub poniżej regulowanego genu.
Regulacji uczestniczą białka wiążące się z sekwencjami regulatorowymi.
U Euc. W przeciwieństwie do Proc., składanie kompleksu inicjacyjnego jest mało wydajne, czyli u Euc.
aktywatory odgrywają większą rolę niż rep resory.
Na ekspresję genu może wpływać struktura chromatyny poprzez kontrolowanie dostępności
promotora dla polimerazy i czynników transkrypcyjnych.
Aktywatory i koaktywatory.
Białko stymulujące inicjację transkrypcji nazywa się:
- aktywatorem jeśli specyficznie wiąże się do konkretnych sekw. DNA
Koaktywatorem jeśli wiąże się niespecyficznie lub oddziałuje poprzez inne białko.
Aktywatory rozpoznają bądź sekw. promotorowe położone powyżej lub sekwencje wzmacniaczy.
W oddziaływaniach miedzy aktywatorem a kompleksem reinicjacyjnym polimerazy II pośredniczy
mediator – kompleks ok. 20-30 białek, który przekazuje sygnał aktywujący.
Pomimo, że niski podstawowy poziom inicjacji transkrypcji polimeraz II i II wskazuje, że represja nie
odgrywa większej roli u Euc. to okazuje się, ze jednak ma ona miejsce.
Białka wiążące DNA uczestniczące w represji inicjacji transkrypcji – represory – oddziałują z
elementami położonymi powyżej promotora podstawowego lub z bardziej oddalonymi wyciskaczami.
Elongacja, terminacja i in. u Procaryota
Budowanie ………. Kompleksów inicjacyjnych.
W czasie elongacji bakteryjna polimeraza RNA występuje w postaci rdzenia enz. z 4 podjednostek.
Synteza RNA bakteryjnych
Po zsyntezowaniu 8-9 nt RNA czynnik sigma jest uwalniany do budowania kolejnych kompleksów
inicjacyjnych.
W czasie elongacji bakteryjna polimeraza RNA występuje w postaci rdzenia enz. z 4 podjednostek.
Generated by Unregistered Batch DOC & DOCX Converter 2011.3.114.1454, please register!
Polimeraza pokrywa rejon 30bp, w tym 12-14 tworzących pęcherzyk transkrypcyjny.
W obrębie pęcherzyka transkrypcyjnego jest utrzymywany pzre osiem par zasad RNA-DNA.
Polimeraza RNA syntetyzuje z prędkością 30-50 nt/sek.
DNA ulega rozpleceniu na krótkim odcinku helisy i ponownie się zwija tuz po przejściu enzymu.
Polimeraza nie syntetyzuje transkryptu w sposób ciągły 0 szybka elongacja jest przerywana pauzami,
kiedy polimeraza zatrzymuje się, a nawet cofa dokonując wyboru opcji termodynamicznie
korzystniejszej między elongacja a germinacją- dysocjacją.
U bakterii dwa sposoby terminacji
- samodzielne terminatory – w obrębie sekwencji nici matrycowej DNA, która zawiera odwrócony
palindrom, a za nim ciąg nukleotydów adenozynowych.
Transkrypcja odwróconego palindromu powoduje powstanie na RNA struktury spinki do włosów i
redukuje obszar oddziaływania DNA-RNA faworyzując dysocjację, która jest dodatkowo wspomagana
poprzez syntezę ciągu par A-U o podwójnych wiązaniach.
- Zależny od Rho – jest to białko o aktywności helikazy, które rozrywa wiązania RNA-DNA i
wykorzystuje moment, kiedy polimeraza zatrzymuje się na strukturze spinki do włosów.
Regulacja syntezy tran skryptów bakteryjnych:
- antyterminacja – polimeraza ignoruje sygnał terminacji i kontynuuje syntezę, aż do napotkania
drugiego sygnału końca. Umożliwia regulację liczby transkrybowanych genów w obrębie operonu –
kontrolowana przez białko antyterminacyjne.
- atentacja – u proc. RNA nie dojrzewa i praktycznie już w trakcie syntezy może ulegać translacji.
Translacja towarzysząca transkrypcji umożliwia utworzenie sygnału germinacji, dzięki prowadzącemu
translacje rybosomowi i zapobieganiu dalszej transkrypcji opronu.
Niekiedy atentacja nie musi mieć związku z tempem przesuwania rybosomu – pośredniczy w niej
białko wiążące się z RNA np. TRAP, ktrego przyłączenie prowadzi do powstania sygnału treminacji i
zakończenia transkrypcji.
Dojrzewanie bakteryjnego RNA.
Wyjściowy transkrypt większości genów bakt. Kodujących białka jest funkcjonalnym mRNA i może
natychmiast ulegać translacji. Natomiast tRNA i rRNA sa najpierw transkrybowane jako pre-RNA,
który musi ulec cięciu i modyfikacjom chemicznym.
Ciecie pre-RNA uwalnia dojrzałe rRNA i tRNA
Trzy geny rRNA (5S, 16S i 23S) są połączone w jednostkę transkrypcyjna, która zwykle wytepuje w
wielu kopiach.
Cięcie przeprowadzają rybonukleazy III, P i F w wyznaczonych miejscach.
Końce powstałe po cieciu są następnie przycinane przez rybonukleazy M16, M23 i M5, co daje
dojrzałe rRNA.
Wszystkie pre-tRNA dojrzewają podobnie, cząsteczka prekursorowi ma strukturę Liśca koniczyny a z
obu stron tworzą się struktury spinki do włosów, odcinane przez rybonukleazy w trakcie
dojrzewania.
Wszystkie dojrzałe RNA musza się kończyć trójką nukl. 5’ – CCA-3’, przy braku tej sekwencji jest ona
dodawana przez nukleotydylotransferazę tRNA.
Generated by Unregistered Batch DOC & DOCX Converter 2011.3.114.1454, please register!
Modyfikacje nukl. Poszerzają właściwości chem. tRNA i rRNA.
Znanych jest ok. 50 różnych modyfikacji.
Najprawdopodobniej modyfikacje tRNA umożliwiają rozpoznawanie więcej niż jednego kodonu.
W przypadku rRNA występują dwa typy modyfikacji:metyzacja grup OH oraz przekształcenie urydyny
do pseudourydyny.
Najprawdopodobniej wpływa to na aktywność tych cząsteczek w rybosomach.
Degradacja bakteryjnego RNA:
Degradacja mRNA jest jednym ze sposobów regulacji ekspresji genomu. Tempo degradacji jest
różnicowane przebiega w kier 3’-5’ i prowadzone jest przez
- RNazę E i III
-RNazę II
Fosforylazę polinukleotydową – PNP
W komórkach RNaza E i PNP występują w wielobiałkowym kompleksie, który nazwano
degradosomem.
Elongacja transkrypcji u Eucariota
Końcowym etapem inicjacji transkrypcji genów kodujących mRNA u Euc. Jest fosforylacja domeny
CTD największej podjednostki polimerazy RNA II.
Proces elongacji poprzedzony jest:
1) Uwolnieniem promotora i rozpoczęciem syntezy tran skryptu( przekształcenie kompleksu
reinicjacyjnego w kompleks syntetyzujący RNA)
2) Opuszczeniem promotora, czyli oddaleniem się polimerazy od regionu promotorowego.
Polimeraza nabywa zdolność wydajnej syntezy.
Elongacja jest procesem nieciągłym – polimeraza zatrzymuje się co jakis czas dokonując wyboru
między elongacją a germinacją.
W jądrze komórkowym przerwaniu reakcji syntezy przeciwdziałają czynniki elongacyjne – białka,
które wiążą się z polimerazą po uwolnieniu promotora.
Regulacja transkrypcji ma miejsce głównie na etapie inicjacji. Istanieją jednak mechanizmy regulacji
na tapie elongacji:
- z udziałem czynnika TFIIS, który uaktywnia polimerazę
- poprzez różny stopień fosforylacji domeny CTD polimerazy
-możliwość alternatywnej poliadenylacji – wykorzystanie różnych sygnałów poliadenylacji w różnych
tkankach.
Elongacja u pozostałych polimeraz RNA, I i III, przebiega podobnie. Róznice dotyczą szybkości
transkrypcji.
Polimeraza I – polimeryzuje 20nt/min, podczas gdy polimeraza II - 2000nt/min.
Kolejna różnica to brak czapeczki u tran skryptów polimeraz i i III.
Przebiega z udziałem różnych czynników elongacyjnych często o aktywności helikazy.
Generated by Unregistered Batch DOC & DOCX Converter 2011.3.114.1454, please register!
Terminacja transkrypcji u Eucariota
Terminacja transkrypcji prowadzonej przez polimerazę II zazwyczaj połączona jest z poliadenylacją
końca 3’ – przez polimerazę poli(A) dodawana jest seria do 250 adenozyn.
Sekwencja stanowiąca sygnał poliadenylacji znajduje się między 10 a 30 nt przed miejscem
poliadenylacji, a 10-20 nt za miejscem poliadenylacji znajduje się rejon bogaty w GU. Sa to rejony
wiązania białek, które uczestniczą w przyłączaniu polimerazy poli(A).
Transkrypcja zatrzymuje się wkrótce po pojawieniu się w RNA sekwencji sygnałowej dla poliA.
mRNA nie ulegające poliadenylacji stanowi bardzo małą grupę i sa to m.in. mRNA kodujące białka
histonowe.
Terminacja transkrypcji przez polimerazę I przebiega z udziałem białka wiążącego się do DNA, które
blokuje polimerazę oraz inne białka, które powoduje oddysocjowanie polimerazy i uwolnienie tran
skryptu.
Terminacja transkrypcji przez polimerazę III jest najmniej poznana. Najprawdopodobniej wystepuje
tu, odobnie jak u bakterii ciąg adenozyn, ale nie zidentyfikowano struktury spinki do włosów, więc
proces ten nie jest analogiczny do bakteryjnego.
Euc. Pre-mRNA podlega dojrzewaniu jeszcze w trakcie syntezy tran skryptu.
Dojrzewanie mRNA polega na:
- dołączeniu czapeczki do końca 5’ natychmiast po zapoczątkowaniu transkrypcji, (ok. 20-30nt)
- większość tran skryptów jest również poliadenylowana poprzez dodanie serii adenozyn do konca 3’
– poliadenylacja, opisana wcześniej, będąca częścią mechanizmu germinacji transkrypcji.
-wiele tran skryptów zawiera introny i podlega procesowi składania
Niektóre transkrypty sa redagowane.
Cząsteczka GTP tworzy wiązanie tri fosforanowe z końcem 5’ mRNA. Następnie guanozyna ulega
metyzacji w pozycji N7 zasady azotowej.
Wycinanie intronów z jądrowego pre-mRNA
U Euc. Rozróznia się 7 typów i dodatkowe formy u Archeonów.
Aby pierwotny transkrypt mógł funkcjonować jako dojrzały mRNA wszystkie itrony muszą zostać
wycięte, a eksony połączone w poprawnym porządku.
W genach Euc. Kodujących białka występują dwa typy intronów:
- GU-AG( przeważają)
-AU-AC
Introny GU-AG
Miejsca składania po stronie 5’ jest nazwane miejscem donorowym, a po stronie 3’ intronu –
akceptorowym. Introny wyższych Euc. Zawierają trakt polipirymidynowy – tuz przed końcem 3’
intronu.
Wycinanie intronów jest efektem dwóch reakcji trans estryfikacji;
1) Cięcie w miejscu składania po stronie 5’ intronu (donorowym) następuje poprzez reakcje
trans estryfikacji, w której bierze udział grupa hydroksylowa przyłączona do drugiego wegla
adenozyny położonej w obrębie sekwencji intronowej. Cięciu towarzyszy utworzenie nowego
Generated by Unregistered Batch DOC & DOCX Converter 2011.3.114.1454, please register!
wiązania 5’-2’ fosfodiestrowego łączącego pierwszy nukleotyd intronu (G z motywu GU) z
wewnętrzną adenozyną. Intron zawija sie w pętlę tworząc strukturę lassa.
2) Cięcie w miejscu składania po stronie 3’ intronu (akceptorowego) i połączenie eksonów jest
wynikiem drugiej reakcji transestryfilacji w wyniku ataku hydrofilowego grupy 3’OH na końcu
eksonu poprzedzającego intron na wiązanie fosfodiestrowe w miejscu składania 3’. Przecięcie
powoduje uwolnienie intronu w postaci lassa, który przekształcany następnie w formę
liniową ulega degradacji. Koniec 3’ poprzedniego eksonu łączy się z końcem 5’ kolejnego
eksonu – następuje składanie.
Głownymi składnikami aparatu do wycinania intronów sa sarna – krótkie cząsteczki RNA:
U1,U2,U3,U4, U5 i U6, które wiążą się z czynnikami białkowymi tworząc snRNP – małe jądrowe
rybonukleoproteiny. Łącząc się z innymi białkami tworzą one kompleksy składania RNA -
spliceosomy.
Spliceosom formowany jest w trzech etapach:
- połączenie poszczególnych składników w kompleks aranżujący
- Prespliceosom – wstępne fałdowanie intronu i miejsce rozgałęzienia
- spileosom – dalsze fałdowanie zbliżające miejsca składania po stronie 3’ do pozostałych.
Jednym z czynników niezbędnych do składania RNA sa białka SR bogate w serynę (S) i argininę które
oddziałują z eksonowymi wzmacniaczami składania RNA (ESE).
Introny AU-AC pomimo, ze sam proces wycinania jest identyczny wymagają odmiennego aparatu
wycinania, który budowany jest przez zupełnie inne rybo nukleoproteidy – snRNP.
Alternatywne składanie RNA:
- z jednego tran skryptu mogą powstawać różne mRNA i różne białka. Uważa się, ze ok. 35% ludzkich
genów podlega alternatywnemu składaniu.
Analiza proteomu – 80-100 tys. Gwnów, a jest ich ok. 35tys.
Z jednego genu może powstawac wiele tran skryptów przy udziale:
-alternatywnych promotorów
-alternatywnych miejsc poliadenylacji
-alternatywnego splicingu