UNIWERSYTET GDAŃSKI
WYDZIAŁ CHEMII
Katedra Analizy Środowiska
Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych z przedmiotu "Chromatografia"
ĆWICZENIE 2
Chromatografia gazowa – analiza ilościowa
związków aromatycznych metodą wzorca
wewnętrznego, dodatku wzorca oraz normalizacji
wewnętrznej
Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej
2
1. Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest porównanie metod analizy ilościowej, stosowanych w chromatografii
gazowej. Próbka zawierająca trzy związki aromatyczne (toluen, etylobenzen i p-ksylen) o
nieznanym stęŜeniu będzie analizowana metodą normalizacji wewnętrznej, dodatku wzorca oraz
wzorca wewnętrznego. Zadaniem studenta jest porównanie wyników poszczególnych analiz oraz
wskazanie przyczyn ewentualnych róŜnic.
2. Wprowadzenie do chromatografii gazowej
Termin "chromatografia" opisuje wszystkie te metody rozdzielania mieszanin związków, w
których poszczególne składniki mieszaniny ulegają podziałowi między dwie fazy – stacjonarną i
ruchomą, ze względu na róŜnice we właściwościach fizykochemicznych. JeŜeli mamy do czynienia
z układem, w którym fazą ruchomą (mobilną) jest gaz, to mówimy o chromatografii gazowej (gas
chromatography, GC). MoŜliwa jest chromatografia w układzie gaz – ciało stałe (adsorpcyjna
chromatografia gazowa, GSC) lub częściej stosowana chromatografia w układzie gaz – ciecz
(podziałowa chromatografia gazowa, GLC). W drugim przypadku rozdzielanie mieszanin na
składniki jest uwarunkowane róŜnicami w powinowactwie poszczególnych związków do fazy
stacjonarnej, co wyraŜa się róŜnicami w wartościach współczynnika podziału K
c
, wyraŜonego
wzorem:
m
s
c
c
c
K
=
(1)
gdzie: c
s
i c
m
oznaczają stęŜenia substancji badanej odpowiednio w fazie stacjonarnej
i ruchomej.
Chromatografia gazowa słuŜy nie tylko do rozdzielania mieszanin, ale takŜe do analizy ilościowej i
w mniejszym stopniu, analizy jakościowej szerokiej gamy związków chemicznych.
2.1. Podstawowe pojęcia i definicje w chromatografii
KaŜda analiza metodą chromatografii gazowej polega na selektywnym wymywaniu (elucji)
związków z próbki wprowadzonej na kolumnę chromatograficzną za pomocą gazu nośnego.
Poszczególne składniki są wykrywane przez detektor, którego sygnał jest rejestrowany za pomocą
komputera, integratora bądź rejestratora. Uzyskany wykres zaleŜności wskazań detektora od czasu
nazywany jest chromatogramem. Poszczególne sygnały (piki) obecne na chromatogramie moŜna
Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej
3
scharakteryzować za pomocą szeregu parametrów retencyjnych (retencja = zatrzymywanie):
•
Całkowity czas retencji t
R
danego składnika to czas liczony od momentu
wprowadzenia próbki (iniekcji) do momentu pojawienia się na chromatogramie
maksimum sygnału związku, czyli do pojawienia się na wyjściu z kolumny jego
maksymalnego stęŜenia. Stąd całkowita objętość retencji to:
V
R
= t
R
· F
c
(2)
gdzie F
c
to objętościowa prędkość wypływu fazy ruchomej z kolumny [ml/min]
Całkowitą objętość retencji, współczynnik podziału oraz objętości faz: mobilnej i
stacjonarnej (odpowiednio V
m
i V
s
) łączy równanie:
V
R
=V
m
+K
C
V
s
(3)
Posługiwanie się objętościami faz i objętościami retencji jest w chromatografii gazowej
mało wygodne, jednak na podstawie równania (3) moŜna ustalić, Ŝe wzrost wartości
współczynnika podziału K
c
powoduje wzrost czasu retencji. NaleŜy równieŜ pamiętać,
Ŝ
e czas retencji wydłuŜa się, gdy wzrasta długość kolumny, zaś skraca się, gdy
zwiększamy prędkość przepływu fazy ruchomej. Wyprowadzenie wzoru (3) moŜna
znaleźć w literaturze, której spis jest podany na końcu instrukcji.
•
Zerowy czas retencji t
M
to czas przebywania na kolumnie substancji, która nie
oddziałuje z fazą stacjonarną (w przypadku chromatografii gazowej np. hel, metan). Stąd
zerowa objętość retencji wyraŜana jest wzorem:
V
M
= t
M
· F
c
(4)
•
Zredukowany czas retencji t'
R
to róŜnica pomiędzy całkowitym czasem retencji
danego składnika a zerowym czasem retencji:
M
R
R
t
t
t
−
=
'
(5)
Wielkość ta charakteryzuje zatrzymywanie się danego składnika na fazie stacjonarnej.
Pojęcia całkowitego, zerowego i zredukowanego czasu retencji ilustruje Rys. 1.
Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej
4
Rys. 1. Przykładowy chromatogram, wyjaśniający pojęcia: całkowity czas retencji (t
RA
, t
RB
), zerowy czas retencji
(t
M
) oraz zredukowany czas retencji (t`
RA
, t`
RB
).
•
Zredukowana objętość retencji to:
M
R
R
V
V
V
−
=
'
(6)
•
Względny czas retencji równy:
'
'
,
Rw
Ri
w
i
t
t
r
=
(7)
gdzie: indeks "i" oznacza dowolną substancję, a indeks "w" oznacza wzorzec
•
Współczynnik retencji k, zdefiniowany wzorem:
M
R
M
M
R
t
t
t
t
t
k
'
=
−
=
(8)
lub:
m
s
C
m
m
s
s
m
s
V
V
K
V
c
V
c
n
n
k
=
=
=
(8a)
gdzie: n oznacza liczbę moli substancji, c jej stęŜenie, V objętość fazy,
K
c
to współczynnik podziału, zaś indeksy "s" i "m" dotyczą odpowiednio fazy
stacjonarnej i ruchomej.
Im większą wartość przyjmuje współczynnik k, tym silniej substancja jest
zatrzymywana przez fazę stacjonarną.
•
Indeks retencji Kovátsa I
X
– wielkość charakterystyczna dla danej substancji,
analizowanej na danej fazie stacjonarnej, słuŜąca do analizy jakościowej; z definicji dla
n-alkanów indeksy retencji są równe 100-krotności liczby atomów węgla w cząsteczce
(np. indeks retencji dla n-heksanu wynosi 600, dla n-dekanu 1000). Indeksy retencji
Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej
5
wyznacza się wobec dwóch n-alkanów o z oraz z+m atomach węgla w cząsteczce, z
których pierwszy jest eluowany z kolumny przed badanym związkiem, a drugi – po tym
związku. Stosuje się wtedy wzór:
'
'
)
(
'
'
log
log
log
log
100
100
Rz
m
z
R
Rz
Rx
X
t
t
t
t
m
z
I
−
−
+
=
+
(9)
gdzie:
I
X
– indeks retencji nieznanego związku,
t´
Rx
– zredukowany czas retencji
nieznanego związku,
t´
Rz
– zredukowany czas retencji alkanu zawierającego
z atomów węgla,
t´
R(z+m)
– zredukowany czas retencji alkanu zawierającego
z+m atomów węgla.
Wzór (9) moŜna stosować w przypadku analizy w stałej temperaturze (w izotermie).
Dla analiz w programowanej temperaturze stosuje się wzór van den Doola i Kratza:
Rz
m
z
R
Rz
Rx
Tp
T
T
T
T
m
z
I
−
−
+
=
+
)
(
100
100
(10)
gdzie:
I
Tp
– indeks retencji nieznanego związku,
T
R
– temperatura w Kelvinach,
przy której dany związek eluuje z kolumny (temperatura retencji)
lub całkowity czas retencji. Wyjaśnienie indeksów x, z, m, z+m jak we
wzorze (9).
2.2. Aparatura do chromatografii gazowej
W chromatografii gazowej gaz nośny jest oczyszczany i dostarczany do kolumny
chromatograficznej, umieszczonej w piecu chromatografu. Poprzez dozownik wprowadzamy
próbkę do strumienia gazu nośnego i dalej na kolumnę. Próbka jest rozdzielana i poszczególne
składniki trafiają do detektora. Kolumna, dozownik i detektor są utrzymywane w zaprogramowanej
temperaturze. Sygnał elektryczny z detektora jest wzmacniany i przekazywany do urządzenia
rejestrującego, którym moŜe być rejestrator, integrator (pozwala na automatyczne określanie
między innymi czasów retencji i powierzchni sygnałów poszczególnych związków) lub, we
współczesnych zestawach, komputer. Współczesne chromatografy gazowe składają się z kilku
podstawowych części, które zostały pokazane na schemacie blokowym (Rys. 2).
Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej
6
Rys. 2. Schemat blokowy chromatografu gazowego: 1 – zbiornik gazu nośnego, 2 – regulacja przepływu, 3 –
filtry, 4 – dozownik, 5 – kolumna chromatograficzna, 6 – detektor, 7 – piec chromatografu, 8 – wzmacniacz
sygnału, 9 – urządzenie rejestrujące.
2.2.1. Zbiorniki gazu nośnego
Podstawowe cechy dobrego gazu nośnego to obojętność wobec fazy stacjonarnej,
elementów przyrządu oraz składników badanych mieszanin. Warunki te spełniają: hel, argon, azot
oraz wodór i te właśnie gazy stosowane są najczęściej. Gaz nośny jest zwykle dostarczany z butli
ciśnieniowych, wyjątkiem jest wodór, który moŜna takŜe dostarczać do chromatografu przy uŜyciu
generatorów elektrolitycznych. WaŜny jest równieŜ stopień czystości gazu nośnego, gdyŜ
zanieczyszczenia mogą powodować zakłócenia pracy detektora i dezaktywację faz stacjonarnych.
Przed kolumną zwykle znajdują się zatem filtry (róŜnego rodzaju adsorbenty), słuŜąc do usuwania
tlenu, wody i zanieczyszczeń organicznych. Przed wlotem na kolumnę znajdują się równieŜ
regulatory przepływu, pozwalające na utrzymanie stałego ciśnienia gazu na poŜądanym poziomie.
Gaz nośny dobiera się często pod kątem przydatności do pracy w zestawie z konkretnym
detektorem (patrz punkt 2.2.4).
2.2.2. Dozowniki
Chromatografia gazowa słuŜy do rozdzielania substancji, które w warunkach analizy mają
postać par lub gazów. Są to zatem te substancje, których temperatura wrzenia lub sublimacji nie
przekracza około 300-400°C (w zaleŜności od moŜliwości konkretnego modelu chromatografu).
Dozowanie próbki musi przebiegać moŜliwie powtarzalnie i powinno wprowadzać na kolumnę
moŜliwie małe ilości próbki. Dozowniki pozwalają na wprowadzenie do strumienia gazu nośnego
analizowanych substancji. Często dozownik jest ogrzewany do takiej temperatury, by juŜ w jego
obrębie wprowadzone substancje przeszły w stan gazu. W przypadku kolumn kapilarnych stosuje
się zwykle dwa typy dozowników:
•
dozowniki z dzieleniem strumienia (ze spliterem, split injection) – w tym przypadku do
Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej
7
gorącego dozownika wprowadza się próbkę za pomocą strzykawki przez membranę;
większość odparowanej próbki jest usuwana na zewnątrz przyrządu ze strumieniem gazu
nośnego, tylko niewielka jej część trafia wraz z gazem do kolumny; pozwala to na
dozowanie próbki w ilości optymalnej dla kolumn kapilarnych o małej średnicy,
natomiast problemem jest zapewnienie stałego stopnia podziału strumienia gazu tak, by
dozowano zawsze taką samą część próbki; obecne rozwiązania pozwalają na zmianę
stopnia podziału strumienia aŜ do takiego stanu, Ŝe dozowana jest cała próbka
(dozownik split – splitless)
•
dozowniki typu on-column – w tym przypadku ciekła próbka jest dozowana poprzez
nieogrzewany dozownik bezpośrednio na kolumnę o temperaturze 20-60°C, po czym
kolumna jest ogrzewana, odparowuje rozpuszczalnik, a następnie składniki próbki;
metoda ta zmniejsza prawdopodobieństwo termicznego rozkładu związków o małej
stabilności w wyŜszych temperaturach, jednak powoduje powstanie ryzyka
zanieczyszczenia początkowego odcinka kolumny substancjami nielotnymi lub słabo
lotnymi, wprowadzanymi razem z próbką
W rutynowych analizach często stosuje się obecnie dozowniki automatyczne, które w
zaprogramowany sposób dozują poszczególne próbki. Cały proces obejmuje programowanie
kolejności i ilości nastrzyków kaŜdej próbki, płukania strzykawki i innych czynności.
2.2.3. Kolumny chromatograficzne
Współczesna chromatografia gazowa opiera się głównie na zastosowaniu tzw. kolumn
kapilarnych (o przekroju otwartym, open tubular, OT). MoŜna wyróŜnić trzy podstawowe typy tych
kolumn:
•
kolumny do chromatografii w układzie gaz – ciało stałe z porowatą warstwą adsorbentu
na ściankach (porous layer open tubular, PLOT)
•
kolumny z naniesionym na ścianki nośnikiem nasyconym ciekłą fazą stacjonarną
(support coated open tubular, SCOT)
•
kolumny ze ściankami pokrytymi ciekłą fazą stacjonarną (wall-coated open tubular,
WCOT)
W dalszej części instrukcji omawiane będą tylko kolumny z ciekłą fazą stacjonarną.
Kolumny kapilarne wykonane są zwykle ze stopionego kwarcu, co zapewnia im wymaganą
elastyczność i trwałość. Ich długość wynosi od 10 do nawet 300 metrów, ale najpowszechniejsze są
Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej
8
kolumny o długości 15-60 metrów. Średnica wewnętrzna takich kolumn to zwykle 0,2-0,3 mm, zaś
warstwa filmu ciekłej fazy stacjonarnej, pokrywającej ściankę wewnętrzną, ma zwykle grubość
rzędu ułamka mikrometra. Kolumny kapilarne wyparły tzw. kolumny pakunkowe (z wypełnieniem
fazy stacjonarnej), które są krótsze i mają większą średnicę. Stało się tak ze względu na znacznie
większą sprawność kolumn kapilarnych, która pozwoliła na osiąganie znacznie lepszych
rozdziałów.
PoniŜej zostaną omówione ciekłe fazy stacjonarne, stosowane zarówno w kolumnach typu
SCOT, jak i WCOT. NaleŜy pamiętać, Ŝe wybór odpowiedniej fazy stacjonarnej, dopasowanej do
właściwości próbki, ma kluczowe znaczenie dla jakości wyników analizy.
Ciekła faza stacjonarna powinna:
•
rozpuszczać składniki rozdzielanej próbki,
•
wykazywać chemiczną obojętność wobec składników próbki oraz nośnika,
•
charakteryzować się małą lotnością oraz wysoką stabilnością termiczną w warunkach
analizy,
•
małą lepkością,
•
duŜą selektywnością wobec rozdzielanych składników.
Wybór fazy stacjonarnej zaleŜy od temperatury wrzenia poszczególnych związków w
próbce (faza musi wytrzymać warunki termiczne, w jakich prowadzimy analizę) oraz od ich
polarności. Stosuje się regułę mówiącą, Ŝe związki o danej polarności najlepiej rozpuszczają się w
substancjach o podobnej polarności. Stąd wniosek, Ŝe związki niepolarne na niepolarnych fazach
stacjonarnych są wymywane później, niŜ związki polarne o zbliŜonych temperaturach wrzenia
(związek niepolarny lepiej rozpuszcza się w fazie stacjonarnej, a zatem jego współczynnik podziału
jest większy). Analogicznie, na fazach polarnych związki polarne mają większe wartości czasów
retencji, niŜ związki niepolarne o zbliŜonych temperaturach wrzenia.
Ogólny podział faz stacjonarnych ze względu na ich polarność obejmuje trzy grupy:
•
fazy niepolarne – węglowodory, które dobrze rozpuszczają substancje niepolarne;
alkany mają na tych fazach duŜe czasy (objętości) retencji, zaś związki polarne są
szybko eluowane; przykłady takich faz to skwalan lub Apolan-87 (Rys. 3); fazy
niepolarne charakteryzują się zwykle wysokim limitem temperatury, w której mogą
pracować
•
fazy średnio polarne – głównie silikony modyfikowane róŜnymi podstawnikami (grupy
metylowe, fenylowe, cyjanoalkilowe; Rys. 4); w zaleŜności od rodzaju podstawników i
Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej
9
ich ilości polarność moŜe zmieniać się w dość szerokim zakresie; przykłady faz to OV-
1, SE-30 (dimetylosilikony), OV-3, OV-7, OV-17 (fenylosilikony o rosnącym udziale
grup fenylowych), OV-225 (25% grup cyjanopropylowych)
Rys. 3. Popularne niepolarne ciekłe fazy stacjonarne w chromatografii gazowej.
•
fazy polarne – poliglikole (na przykład poliglikol etylenowy; fazy PEG oraz Carbowax),
róŜnego rodzaju estry
Struktury faz stacjonarnych i zawartości grup modyfikujących moŜna znaleźć w licznych
katalogach producentów kolumn kapilarnych.
Rys. 4. Średnio polarne ciekłe fazy stacjonarne w chromatografii gazowej – silikony.
2.2.4. Detektory
Zadaniem
detektora
jest
wykrywanie
substancji,
które
opuszczają
kolumnę
chromatograficzną. Obecność w gazie nośnym innej substancji powoduje powstanie sygnału
elektrycznego, rejestrowanego przez komputer, integrator bądź rejestrator. PoŜądane cechy
detektora to: duŜa czułość i wykrywalność, moŜliwie szeroki zakres liniowości wskazań (to jest,
proporcjonalności powstającego sygnału do stęŜenia związku), niski poziom szumów linii zerowej,
a takŜe, jak w przypadku kaŜdego sprzętu, moŜliwie niska cena i łatwość obsługi.
Detektory w chromatografii gazowej moŜna podzielić na dwie zasadnicze grupy: detektory
uniwersalne (reagujące na związki z wielu róŜnych grup) oraz selektywne (wykrywające tylko
wybrane anality).
Spośród detektorów uniwersalnych, w powszechnym uŜyciu znajduje się detektor
Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej
10
płomieniowo–jonizacyjny (flame ionization detector, FID). Wykrywa on związki organiczne,
natomiast nie reaguje sygnałem na substancje nieorganiczne i takie związki węgla, jak CO, CO
2
,
CS
2
, HCOOH i COCl
2
. Sygnał detektora FID jest proporcjonalny do liczby atomów węgla, które
nie są związane z tlenem, a więc do masy substancji. NaleŜy przy tym pamiętać, Ŝe wielkość
sygnału zaleŜy takŜe od charakteru substancji (zagadnienie to zostanie omówione w rozdziale
poświęconym analizie ilościowej). Detektor FID jest czuły, pozwala wykryć juŜ 10
-12
g substancji
badanej. Zasada działania polega na pomiarze zmian przewodności elektrycznej atmosfery
płomienia w detektorze. Jeśli w płomieniu pojawi się związek organiczny, w wyniku jego spalania
powstają karbojony. Powstający prąd jonizacyjny jest wzmacniany i rejestrowany. Płomień
uzyskuje się, stosując mieszaninę wodoru i powietrza, doprowadzanych z butli ciśnieniowych.
Odpowiedni gaz nośny dla detektora FID to azot, hel lub argon.
Innym detektorem uniwersalnym jest katarometr, czyli detektor termokondukto-
metryczny (cieplno-przewodnościowy, thermal conductivity detector, TCD). Jego działanie polega
na pomiarze róŜnic w przewodności cieplnej czystego gazu nośnego oraz gazu opuszczającego
kolumnę. Jest to zatem detektor róŜnicowy. Wykrywa wszystkie związki, których przewodność
cieplna róŜni się od przewodności gazu nośnego. Jest detektorem stęŜeniowym (sygnał jest
proporcjonalny do stęŜenia substancji). Stosowane gazy nośne to wodór i hel. Wadami tego
urządzenia są: mniejsza niŜ w przypadku detektora FID czułość (pozwala wykryć 10
-7
– 10
-8
g
substancji w cm
3
fazy ruchomej), mniejszy zakres liniowości wskazań oraz konieczność
zachowania stałej temperatury detektora przez cały czas analizy (z dokładnością do dziesiątych
części stopnia Celsjusza), aby uzyskać wiarygodne wyniki.
Spośród detektorów selektywnych, na uwagę zasługują: detektor płomieniowo-
fotometryczny (flame photometric detector, FPD), słuŜący do wykrywania związków siarki i
fosforu, detektor termojonowy (thermionic detector, TID), przydatny w analizie związków azotu i
fosforu, oraz detektor wychwytu elektronów (electron capture detector, ECD), który znalazł
zastosowanie w analizie substancji o znacznym powinowactwie elektronowym, głównie związków
halogenoorganicznych. BliŜej zostanie omówiony tylko ten ostatni.
Detektor ECD jest detektorem radiojonizacyjnym, a zatem zachodzi w nim proces jonizacji
analizowanych substancji za pomocą promieniowania jonizującego. Źródłem promieniowania β jest
folia z
63
Ni. W komorze detektora znajduje się równieŜ katoda oraz anoda. Gaz nośny (azot lub
argon) jest jonizowany przez cząstki β:
e
N
N
+
→
+
+
2
2
β
Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej
11
Wskutek powstania elektronów otrzymujemy prąd tła, który odpowiada linii podstawowej na
chromatogramie. Jeśli do detektora trafia substancja o duŜym powinowactwie elektronowym,
wychwytuje ona elektrony, tworząc jony ujemne:
−
→
+
X
e
X
Te z kolei rekombinują z dodatnimi jonami gazu nośnego, tworząc cząsteczki obojętne:
2
2
N
X
N
X
+
→
+
+
−
PowyŜsze reakcje powodują spadek natęŜenia prądu tła, co w efekcie prowadzi do zarejestrowania
sygnału. Detektor ECD jest powszechnie uŜywany w analizie chlorowcopestycydów. Wykrywa
nawet 10
-14
g Cl/cm
3
gazu nośnego.
NaleŜy jeszcze wspomnieć o połączeniu chromatografii gazowej z technikami
spektroskopowymi. W takim układzie moŜna mówić albo o wykorzystaniu spektroskopów lub
spektrometrów jako detektorów w GC, bądź teŜ o wykorzystaniu chromatografu gazowego jako
układu wprowadzania próbki do przyrządu mierzącego widmo. Do analizy związków organicznych
szczególnie przydatne jest połączenie chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC-MS),
które pozwala na uzyskanie wielu dokładnych danych na temat struktury poszczególnych związków
oraz ustalenie ich mas cząsteczkowych. Informacje na temat obecności w cząsteczce analizowanej
substancji róŜnych grup funkcyjnych daje połączenie GC ze spektroskopią w podczerwieni (GC-
IR). Istnieją równieŜ połączenia chromatografii gazowej i spektroskopii atomowej, zarówno
absorpcyjnej, jak i emisyjnej, przydatne np. w analizie związków metaloorganicznych.
2.3. Parametry opisujące jakość rozdziału i sprawność kolumny
2.3.1. Jakość rozdziału chromatograficznego
Miarą skuteczności rozdzielenia składników mieszaniny jest:
•
współczynnik selektywności α (retencja względna; zdolność fazy stacjonarnej do
rozdzielenia dwóch składników) dla sygnałów związków A i B jest wyraŜany wzorem:
A
B
M
RA
M
RB
k
k
t
t
t
t
=
−
−
=
α
(11)
•
zdolność rozdzielcza kolumny R
S
:
B
A
RA
RB
S
w
w
t
t
R
+
−
=
2
(12)
gdzie: w
A
i w
B
oznaczają szerokości pików substancji A i B mierzone przy podstawie.
Rozdzielczość zaleŜy od wielu czynników aparaturowych. Znaczący wpływ ma temperatura
Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej
12
analizy, co zostanie bliŜej omówione w dalszej części instrukcji.
2.3.2. Sprawność kolumny – pojęcie półki teoretycznej
Sprawność kolumny decyduje o tym, jaka będzie jakość uzyskanego chromatogramu.
Wysoka sprawność objawia się ostrymi, wąskimi pikami substancji chromatografowanych i dobrym
rozdziałem mieszaniny. Miarą sprawności kolumny chromatograficznej jest
wysokość równowaŜna
półce teoretycznej (WRPT lub HETP, height equivalent to a theoretical plate).
Półka teoretyczna – objętość kolumny, w której osiągany jest stan równowagi między stęŜeniami
substancji chromatografowanej w fazie ruchomej i stacjonarnej. Im więcej półek teoretycznych
(mniejsza wartość WRPT) ma kolumna, tym większa jest jej sprawność.
KaŜda kolumna składa się z N hipotetycznych półek teoretycznych, czyli:
NH
L
=
(13)
oraz:
H
L
N
=
(14)
gdzie: L – długość kolumny, H – wysokość równowaŜna półce teoretycznej (WRPT).
Liczbę półek teoretycznych moŜna obliczyć, wykorzystując w tym celu substancję testową o
współczynniku retencji k w zakresie 5-10, pod warunkiem, Ŝe pik tej substancji ma kształt krzywej
Gaussa. Wtedy:
2
2
/
1
54
,
5
=
w
t
N
R
(15)
lub:
2
16
=
B
R
w
t
N
(16)
gdzie: t
R
– czas retencji (wygodnie jest zastąpić go odległością retencji na wydruku
chromatogramu), w
1/2
– szerokość piku w połowie jego wysokości, w
B
–
szerokość piku przy podstawie (
szerokości piku i czas retencji wyraŜamy
zawsze w takich samych jednostkach - czasu lub odległości).
Analogicznie obliczamy efektywną liczbę półek teoretycznych, ale zamiast całkowitych
czasów retencji uŜywamy w tym celu czasów zredukowanych. Kolumny kapilarne osiągają
wartości 4000-5000 półek teoretycznych na metr, co czyni je kilkukrotnie bardziej sprawnymi od
kolumn pakunkowych i wielokrotnie – od kolumn do niskociśnieniowej chromatografii cieczowej.
Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej
13
Wartość WRPT w chromatografii podziałowej zaleŜy od trzech zasadniczych czynników:
•
dyfuzji wirowej gazu nośnego (
A), wprost proporcjonalnej do średnicy ziaren
wypełnienia kolumny (w przypadku kolumn kapilarnych z ciekłą fazą stacjonarną – do
parametrów nośnika tej fazy),
•
dyfuzji podłuŜnej (
B) w fazie ruchomej (dyfuzji cząsteczek wzdłuŜ kolumny w obu jej
kierunkach), zaleŜnej od krętości drogi gazu nośnego w obrębie ziaren wypełnienia,
•
oporu przenoszenia masy w fazie stacjonarnej (
C), zaleŜnego od współczynnika retencji
k, grubości filmu fazy stacjonarnej oraz od współczynnika dyfuzji danego związku w
ciekłej fazie stacjonarnej.
Biorąc pod uwagę te trzy czynniki, moŜna je połączyć w jedno uproszczone równanie,
opisujące sprawność kolumny i zwane
równaniem van Deemtera:
u
C
u
B
A
H
+
+
=
(17)
gdzie: ū oznacza liniową prędkość przepływu gazu nośnego.
ZaleŜność ta jest równaniem hiperboli o róŜnym przebiegu dla róŜnych gazów nośnych (Rys. 5).
Analogiczną do wzoru (17) zaleŜność moŜna napisać, zamieniając w równaniu wartość
prędkości przepływu gazu nośnego temperaturą. Oznacza to, Ŝe dana kolumna z określoną fazą
stacjonarną ma zarówno optimum termiczne, w którym osiąga maksymalną sprawność, jak i
optymalną wartość ū. Zwykle stosowane są temperatury i prędkości przepływu gazu większe, niŜ
wartości optymalne, obliczone z równania van Deemtera. WiąŜe się to z faktem, Ŝe pewien spadek
sprawności kolumny jest rekompensowany krótszym czasem analizy.
Zagadnienie teorii półek teoretycznych jest znacznie szerzej opisane w literaturze
poświęconej chromatografii.
Rys. 5. ZaleŜność WRPT od prędkości przepływu gazu nośnego dla azotu, helu i wodoru.
Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej
14
2.4. Czynniki wpływające na przebieg i jakość rozdziału
Wysoka sprawność kolumny, objawiająca się małymi wartościami WRPT, decyduje w
głównej mierze o tym, jak wyglądają piki analizowanych substancji. Im wyŜsza sprawność, tym
piki węŜsze i ostrzejsze. Aby jednak dwie substancje rozdzieliły się w wystarczającym stopniu,
wymagana jest równieŜ dostateczna selektywność na danej fazie stacjonarnej (patrz wzór 11). Rys.
6 przedstawia chromatogramy uzyskane na kolumnie o tej samej sprawności, ale róŜnej
selektywności fazy stacjonarnej wobec rozdzielanych składników.
Rys. 6. Chromatogramy tych samych związków, uzyskane podczas analizy na fazie stacjonarnej o zbyt małej (z
lewej) i wystarczającej (z prawej) selektywności [2].
Uzyskane chromatogramy wskazują, Ŝe w pierwszym przypadku rozdzielczość była zbyt
niska (patrz wzór 12). Przyjmuje się, Ŝe składniki są dobrze rozdzielone, gdy rozdzielczość jest nie
mniejsza niŜ 1, natomiast rozdzielenie pików do linii podstawowej uzyskujemy przy R
S
=1,15.
Zakładając Ŝądaną rozdzielczość i uwzględniając parametry rozdzielania, moŜemy obliczyć ilość
półek teoretycznych N (a zatem takŜe długość kolumny), potrzebną do osiągnięcia załoŜonej
rozdzielczości:
2
2
1
1
16
+
−
=
k
k
R
N
S
α
α
(18)
gdzie: zdolność rozdzielcza kolumny R
S
, α – współczynnik selektywności,
k – współczynnik retencji.
Znaczny wpływ na rozdział mieszaniny składników mogą mieć procesy zachodzące na
powierzchni wewnętrznych ścianek kolumny, które zostały pozbawione warstwy ciekłej fazy
stacjonarnej. Im dłuŜszy czas uŜywania kolumny i bardziej drastyczne warunki analizy (wysoka
temperatura), tym większe fragmenty ścianki kolumny mogą być odsłaniane. Sprawia to, Ŝe związki
o większej polarności (zawierające grupy hydroksylowe, aminowe czy karboksylowe) są
adsorbowane na powierzchni ścianki kolumny. NaleŜy pamiętać, Ŝe szklane i kwarcowe kolumny
kapilarne wykazują aktywność adsorpcyjną ze względu na obecność na ich powierzchni grup
Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej
15
silanolowych. Efektem powyŜej opisanego zjawiska moŜe być: zmiana czasów retencji związków,
poszerzenie pików (związane ze zwiększeniem WRPT), zmniejszenie powierzchni pików
(powoduje błędy w analizie ilościowej) i deformacja kształtu sygnałów (tzw. ogonowanie, Rys. 7).
Wszystkie te zjawiska zaburzają uzyskane chromatogramy i mogą prowadzić do błędnej
interpretacji uzyskanych wyników. Związki zawierające w swej budowie wymienione grupy
funkcyjne często analizuje się w postaci pochodnych, co nie tylko ułatwia analizę np. poprzez
zwiększenie lotności, ale równieŜ niweluje w duŜym stopniu wspomniane zakłócenia.
Rys. 7. Deformacje kształtu sygnałów chromatograficznych powstałe: (a) w wyniku przeładowania kolumny
(wprowadzenia zbyt duŜej ilości związku na kolumnę); (b) z powodu oddziaływań o charakterze adsorpcyjnym
ze ściankami kolumny.
Jakość kolumn kapilarnych pod kątem występowania omówionych zjawisk adsorpcyjnych
moŜna ocenić, stosując test Groba. Polega on na przeprowadzeniu analizy mieszaniny, zawierającej
ś
ciśle określone ilości konkretnych związków chemicznych o róŜnych właściwościach. Jedna
analiza z moŜliwością zastosowania programu temperaturowego pozwala na oszacowanie, w jakim
stopniu zachodzi adsorpcja na ściankach kolumny.
Na jakość rozdziału wpływają takŜe inne czynniki aparaturowe, takie jak róŜnego rodzaju
procesy dyfuzyjne występujące w dozowniku i w połączeniu kolumny z detektorem. Wszelkie
przestrzenie, do których gaz nośny ma utrudniony dostęp oraz róŜnice w średnicach przekroju
przewodów zwiększają wpływ tych efektów na jakość rozdziału.
Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej
16
2.4.1. Wpływ temperatury na jakość rozdziału
Temperatura analizy jest, obok rodzaju kolumny i fazy stacjonarnej, czynnikiem
decydującym o jakości uzyskanych wyników. Wybór odpowiedniej temperatury kolumny zaleŜy od
temperatury wrzenia analizowanych związków oraz od zastosowanej fazy stacjonarnej. NaleŜy
pamiętać, aby sprawdzić limit temperatury dla kolumny, której uŜycie planujemy. Generalnie
stosuje się temperatury nieco niŜsze niŜ maksymalne dopuszczalne. Polarne fazy stacjonarne mają
zwykle niŜsze limity temperatury niŜ fazy niepolarne. Dostępne są kolumny do
wysokotemperaturowej chromatografii gazowej (HT-GC), których limity przekraczają nawet
400°C. Kolumny takie, oznaczane literami HT (np. DB-1HT, RTX-1HT), posiadają zazwyczaj
niepolarne fazy stacjonarne.
Temperatury analizy w chromatografii podziałowej są zwykle nieco niŜsze od temperatury
wrzenia analizowanych substancji. Dobór sposobu analizy zaleŜy w duŜym stopniu od
spodziewanych róŜnic w temperaturach wrzenia analizowanych związków. MoŜliwe są dwie
podstawowe metody analizy:
•
analiza w stałej temperaturze (w izotermie) – gdy temperatury wrzenia poszczególnych
składników nie róŜnią się o więcej niŜ kilkadziesiąt stopni Celsjusza,
•
analiza w programowanej temperaturze, polegająca na podwyŜszaniu temperatury
kolumny o stałą wartość, zwykle od 1 do 10°C na minutę; często na początku i końcu
takiej analizy stosuje się izotermy (w temperaturze startowej oraz końcowej).
W obu przypadkach, znalezienie optymalnych warunków analizy polega na znalezieniu "złotego
ś
rodka" pomiędzy czasem analizy a jakością uzyskanego chromatogramu.
Analiza w izotermie wymaga dobrego dopasowania temperatury procesu, aby zarówno czas
analizy, jak i jakość uzyskanych wyników były zadowalające. NaleŜy pamiętać, Ŝe wyŜsza
temperatura pozwala skrócić czas analizy, ale pogarsza rozdzielczość. Niska temperatura z kolei
pozwala na lepsze rozdzielenie składników mieszaniny, ale wydłuŜa czas analizy i powoduje
poszerzenie i asymetryczność pików. W skrajnych przypadkach zbyt niska temperatura moŜe nie
pozwolić na elucję wszystkich składników, natomiast zbyt wysoka – uniemoŜliwić rozdzielenie
substancji, które będą eluowały prawie w tym samym czasie. W praktyce, dla mieszanin związków
róŜniących się temperaturą wrzenia o około 100°C i więcej, znalezienie optymalnej temperatury
analizy w izotermie często okazuje się niemoŜliwe. W takim przypadku, naleŜy zastosować analizę
w programowanej temperaturze.
Liniowy wzrost temperatury podczas analizy przynosi wiele korzyści. Po pierwsze –
Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej
17
moŜliwe jest rozpoczęcie chromatografowania od tak niskiej temperatury, Ŝe wszystkie związki
zatrzymają się na początku kolumny i będą przez nią migrować wraz ze wzrostem temperatury.
Dzięki temu unikamy stosowania zbyt wysokiej temperatury początkowej, powodującej słabe
rozdzielenie składników mieszaniny o najniŜszych temperaturach wrzenia. Po drugie – moŜemy tak
dobrać szybkość wzrostu temperatury, Ŝe wszystkie składniki zostaną rozdzielone w zbliŜony
sposób i w rozsądnym czasie. NaleŜy pamiętać, Ŝe im szybszy wzrost temperatury, tym gorszy efekt
rozdzielania i krótszy czas analizy. Do analizy duŜej grupy związków o skrajnie róŜnych
temperaturach wrzenia (a taki charakter mają często próbki naturalne), analiza w programowanej
temperaturze jest jedynym moŜliwym wyborem, pozwalającym na zadowalające rozdzielenie
wszystkich składników w rozsądnym czasie.
Analiza w programowanej temperaturze wymaga stosowania faz stacjonarnych o duŜej
stabilności termicznej w szerokim zakresie temperatur. Mniej stabilne fazy mogą być stopniowo
wynoszone z kolumny wraz ze wzrostem temperatury, przez co wyniki analiz ulegają pogorszeniu,
a czas Ŝycia kolumny bardzo się skraca. Widocznym efektem tego zjawiska jest dryf (podnoszenie
się) linii podstawowej chromatogramu.
Rys. 8. Chromatogramy mieszanin n-alkanów w: moŜliwie dobrze dobranej izotermie (a, zwróć uwagę na
poszerzenie ostatnich pików), w izotermie w zbyt wysokiej temperaturze (b) oraz w programie temperaturowym
(c) [2].
Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej
18
2.5. Analiza jakościowa i ilościowa w chromatografii gazowej.
2.5.1. Analiza jakościowa
Chromatografia gazowa nie jest idealnym narzędziem do identyfikacji rozdzielanych
substancji, jednak daje pewne moŜliwości w analizie jakościowej. Podstawowym sposobem
postępowania jest wykorzystywanie parametrów retencji i porównywanie ich z danymi dostępnymi
w literaturze. Często stosuje się:
•
względne czasy retencji, wyznaczane wobec określonej substancji
•
indeksy retencji (patrz wzory 9, 10)
NaleŜy pamiętać, Ŝe wszelkie parametry retencji są, dla danego związku, charakterystyczne na
określonej (lub bardzo podobnej) fazy stacjonarnej. W pewnym stopniu zaleŜą teŜ od warunków
analizy, głównie od temperatury.
Związki organiczne naleŜące do jednego szeregu homologicznego (szereg homologiczny
tworzą związki róŜniące się w budowie jedynie kolejnymi grupami – CH
2
–) wykazują ciekawą
cechę. ZaleŜność logarytmów ich zredukowanych czasów bądź objętości retencji od liczby atomów
węgla lub temperatury wrzenia ma przebieg w przybliŜeniu prostoliniowy, jak przedstawiono to na
Rys. 9. Jeśli mamy dane retencyjne dwóch związków z szeregu homologicznego, moŜemy w miarę
dokładnie przewidzieć parametry retencyjne innych związków z tego szeregu.
Rys. 9. ZaleŜność logarytmów zredukowanych objętości retencji (lub zredukowanych czasów retencji) od liczby
atomów węgla w cząsteczce dla związków z jednego szeregu homologicznego. Linia przerywana wskazuje na
odchylenia od prostoliniowości tej zaleŜności, istniejące dla pierwszych związków szeregu. Podobne odchylenia
wykazują homologi o bardzo duŜych masach cząsteczkowych.
Stosunkowo duŜe moŜliwości daje wykorzystanie detektorów selektywnych. UŜycie detektora
ECD pozwala na wykrycie nawet bardzo małych ilości związków chlorowcopochodnych w
mieszaninie. Podobnie detektor FPD słuŜy do analizy związków organicznych zawierających siarkę i
fosfor, a detektor termojonowy pozwala selektywnie wykrywać związki zawierające fosfor lub azot.
Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej
19
Nieporównywalnie większe moŜliwości w porównaniu z wyŜej wymienionymi metodami
mają układy łączące chromatografię gazową z metodami spektroskopowymi. W analizie związków
organicznych połączenie GC ze spektrometrią mas (GC-MS) jest obecnie rutynowo
wykorzystywane we wszelkich analizach, szczególnie skomplikowanych mieszanin pochodzenia
naturalnego. MoŜliwość zarejestrowania widm mas poszczególnych związków połączona z
otrzymaniem parametrów retencyjnych substancji daje bardzo duŜe moŜliwości ustalenia struktury
związku organicznego. Dodatkowe informacje, często w pełni wystarczające do identyfikacji
analizowanych substancji, moŜna otrzymać dzięki analizie róŜnego rodzaju pochodnych. RównieŜ
cenne informacje, chociaŜ rzadko wystarczające do pełnej identyfikacji związków, daje połączenie
GC-IR, które pozwala często na określenie przynaleŜności badanych substancji do danej grupy
związków organicznych.
2.5.2. Analiza ilościowa
Chromatografia gazowa jest powszechnie wykorzystywana do wykonywania analizy
ilościowej nawet bardzo złoŜonych mieszanin. Warunkami wykonania poprawnych pomiarów są:
zachowanie stałych warunków analizy (jak np. stały przepływ gazu nośnego, stała lub zmieniająca
się o stałą wartość temperatura kolumny), moŜliwie duŜa powtarzalność kolejnych analiz,
znajomość sposobu, w jaki detektor reaguje na konkretne związki. DuŜe znaczenie ma zakres
liniowości wskazań detektora (zakres mas lub stęŜeń, dla których odpowiedź detektora jest
liniowa). W obrębie tego zakresu powierzchnia lub wysokość piku substancji jest wprost
proporcjonalna do masy/stęŜenia związku. Najpowszechniej wykorzystywanym detektorem w
analizach ilościowych jest detektor płomieniowo-jonizacyjny, dlatego teŜ omawiane zagadnienia
będą dotyczyły głównie tego detektora.
Najdokładniejszą metodą wyznaczania odpowiedzi detektora jest określanie powierzchni pików.
Wysokości pików są mniej przydatne, gdyŜ w przypadku, gdy część sygnałów jest poszerzona, uzyskane
wartości nie będą proporcjonalne do udziału poszczególnych substancji w mieszaninie (patrz Rys. 8a).
Obecnie powierzchnie pików są zwykle wyznaczane automatycznie przez komputer lub rejestrator. Jeśli
chcemy obliczyć powierzchnię sygnału symetrycznego, moŜemy uŜyć jednego ze wzorów:
h
hw
S
2
/
1
=
(19a)
b
hw
S
5
,
0
=
(19b)
gdzie: S – powierzchnia piku, h – jego wysokość, w
1/2h
– szerokość w połowie
wysokości, w
b
– szerokość przy podstawie.
Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej
20
Powierzchnię sygnału niesymetrycznego obliczamy ze wzoru:
2
85
,
0
15
,
0
w
w
h
S
+
=
(20)
gdzie: w
0,15
i w
0,85
oznaczają szerokość piku na 15 i 85% jego wysokości.
Jak juŜ wspomniano, detektor FID nie reaguje jednakowo na takie same masy róŜnych
substancji. Aby otrzymane wyniki analiz ilościowych odpowiadały rzeczywistości, wprowadza się
współczynniki odpowiedzi (korekcyjne) f. Współczynnik korekcyjny jest liczbą, przez którą
naleŜy pomnoŜyć powierzchnię piku, aby uzyskać wartość wprost proporcjonalną do masy
związku. Wartości te ustala się wobec głównego składnika próbki lub stosowanego wzorca (dla
tego związku przyjmujemy f = 1). W takim przypadku:
W
S
W
S
Y
Y
f
m
m
=
(21)
stąd:
S
W
W
S
Y
m
Y
m
f
=
(22)
gdzie: m
S
i m
W
oznaczają masę substancji badanej i wzorca, f – współczynnik
odpowiedzi, Y
S
i Y
W
– powierzchnie lub wysokości pików substancji i wzorca.
RóŜnice we wskazaniach detektora FID dla róŜnych substancji moŜna zaobserwować,
analizując roztwór zawierający równe masy tych substancji. Odpowiedzi detektora (a zatem
powierzchnie pików) nie będą jednakowe. Analizując złoŜone mieszaniny związków pochodzenia
naturalnego, dla których trudno zdobyć wzorce, często przyjmuje się, Ŝe wartości współczynników
odpowiedzi są jednakowe (równe 1) dla wszystkich substancji. Jest to źródłem pewnego błędu. Aby
zminimalizować jego znaczenie, stosuje się wzorce dla kaŜdego szeregu homologicznego, z którego
związki są obecne w próbce. Współczynniki odpowiedzi dla homologów, które nie róŜnią się
zbytnio masą (liczbą atomów węgla w cząsteczce), są w przybliŜeniu jednakowe.
Istnieje kilka metod analizy ilościowej, stosowanych w chromatografii gazowej:
•
metoda normalizacji wewnętrznej,
•
metoda kalibracji bezwzględnej,
•
metoda dodatku wzorca,
•
metoda wzorca wewnętrznego.
Metoda normalizacji wewnętrznej polega na wyznaczeniu udziału procentowego wszystkich
substancji w próbce. Powierzchnie sygnałów mierzy się, a ich sumę przyjmuje za 100% próbki.
Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej
21
Powierzchnia sygnału związku A
i
w stosunku do sumy powierzchni wszystkich sygnałów
odpowiada zawartości związku w próbce:
100
%
∑
=
A
A
i
i
(23)
Jeśli analizujemy związki zbliŜone strukturalnie, nie jest konieczne wyznaczanie współczynników
odpowiedzi. Dla substancji o róŜnej budowie naleŜy je wyznaczyć, w przeciwnym wypadku
otrzymamy tylko szacunkowe wyniki.
Metoda kalibracji bezwzględnej słuŜy do określania ilości jednego lub kilku składników próbki,
które są zidentyfikowane. Dla kaŜdego związku, którego ilość w próbce chcemy wyznaczyć,
sporządza się kilka (3-5) roztworów o róŜnych stęŜeniach i kilkukrotnie wykonuje się analizę
chromatograficzną dla kaŜdego z tych roztworów. Następnie oblicza się średnią powierzchnię lub
wysokość piku i wykreśla
krzywą kalibracyjną, przedstawiająca zaleŜność powierzchni piku od
stęŜenia substancji. Wynik analizy próbki o nieznanym stęŜeniu związku odczytywany jest z krzywej.
Problemem w tej metodzie jest uzyskanie takiej powtarzalności dozowania kolejnych próbek, by
krzywa kalibracyjna była wiarygodna. Kłopotliwe jest juŜ pobranie za kaŜdym razem takiej samej
objętości roztworu do strzykawki. NaleŜy teŜ pamiętać, Ŝe dozownik ze spliterem, powszechnie
stosowany w chromatografii gazowej, nie utrzymuje w czasie stałego stopnia podziału strumienia
gazu nośnego, a zatem nie wprowadza zawsze takiej samej ilości próbki na kolumnę. Sprawia to, Ŝe
zastosowanie omawianej metody w analizie ilościowej za pomocą GC jest niewielkie.
Metoda dodatku wzorca polega na wykonaniu dwóch równoległych analiz – badanej próbki
(próbka A) oraz takiej samej próbki, do której dodana została ściśle określona ilość
wzorca,
będącego jednocześnie oznaczaną substancją (próbka B). Porównując uzyskane chromatogramy,
łatwo zauwaŜyć, Ŝe w próbce B udział analitu będącego jednocześnie wzorcem jest większy. Jest to
oczywiście związane z faktem dodania pewnej jego ilości do próbki, a przyrost odpowiedzi
detektora jest wprost proporcjonalny do tej ilości. Mierzymy powierzchnie sygnałów analitu-
wzorca (A) oraz innej analizowanej substancji (B) w pierwszej (Y
A
oraz Y
B
) i drugiej (Y
A
* oraz Y
B
*)
próbce. MoŜemy zatem napisać:
B
A
B
A
Y
Y
m
m
=
(24a)
oraz:
*
*
B
A
B
WZ
A
Y
Y
m
m
m
=
−
(24b)
Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej
22
Pierwsze równanie dotyczy próbki bez dodatku wzorca, drugie – próbki z dodanym wzorcem. Po
rozwiązaniu układu równań, utworzonego z (24a) i (24b) otrzymujemy:
*
*
*
B
A
B
A
B
A
WZ
A
Y
Y
Y
Y
Y
Y
m
m
−
=
(25a)
oraz
A
B
A
B
Y
Y
m
m
=
(25b)
Korzystając z powyŜszych równań moŜna obliczyć ilość wszystkich analitów obecnych w próbce.
Wprowadzenie współczynników odpowiedzi dodatkowo komplikuje obliczenia (jeśli chcesz to
sprawdzić, rozwiąŜ układ równań, wprowadzając te współczynniki). Analiza bez współczynników
będzie wiarygodna tylko dla substancji bardzo zbliŜonych strukturalnie (np. naleŜących do jednego
szeregu homologicznego).
Metoda wzorca wewnętrznego jest najbardziej rozpowszechnioną i dającą najbardziej wiarygodne
wyniki metodą analizy ilościowej w chromatografii gazowej. Polega na dodaniu do próbki
określonej ilości
wzorca wewnętrznego, który nie jest jednym z analizowanych związków. Jeśli
analiza obejmuje szereg etapów wstępnych, typu ekstrakcja czy oczyszczanie, wzorzec naleŜy
dodać przed pierwszym z nich, na samym początku procesu analitycznego. Pozwala to na
zniwelowanie strat analitów, występujących na kaŜdym etapie analizy, o ile stopień odzysku wzorca
i analizowanych substancji będzie zbliŜony. Zwykle stosuje się wzorce moŜliwie zbliŜone
strukturalnie do związków obecnych w próbce i o podobnej temperaturze wrzenia. Warunkiem jest
rozdzielanie się wzorca i analitów podczas analizy chromatograficznej. Jeśli znamy współczynniki
odpowiedzi badanych związków wobec wzorca, stosujemy wzór (21). Często nie mamy moŜliwości
wyznaczenia współczynników (np. z powodu niedostępności wzorców), wtedy przyjmuje się, Ŝe dla
wszystkich związków f = 1.
2.5. Wybrane wielkości w statystycznej analizie wyników
Analiza statystyczna pozwala na ocenę uzyskanych wyników w kategoriach
matematycznych. PoniŜej przedstawione zostaną tylko wybrane, podstawowe wzory.
•
Średnia arytmetyczna z n wyników wyraŜana jest wzorem:
n
x
x
i
∑
=
(26)
gdzie x
i
oznacza pojedynczy wynik.
Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej
23
•
Odchylenie standardowe pojedynczego wyniku (SD, standard deviation), które jest
miarą rozrzutu wartości indywidualnych wokół średniej, obliczamy ze wzoru:
(
)
1
2
−
−
=
∑
n
x
x
SD
i
(27)
•
Błąd standardowy, zwany odchyleniem standardowym średniej arytmetycznej (SE,
standard error), wyraŜa się wzorem:
(
)
(
)
1
2
−
−
=
=
∑
n
n
x
x
n
SD
SE
i
(28)
•
Względne odchylenie standardowe średniej arytmetycznej (RSE, relative standard
error) określa wielkość błędu standardowego wobec wartości średniej i wyraŜane jest w
%:
100
x
SE
RSE
=
(29)
3. Część doświadczalna
Analizowane będą roztwory trzech związków (toluen, etylobenzen,
p-ksylen), których
struktury oraz gęstości są podane na Rys. 10. Jako rozpuszczalnik zastosowano disiarczek węgla
CS
2
(zastanów się, dlaczego). Wzorcem wewnętrznym jest izooktan (2,2,4-trimetylopentan) o
gęstości 0,6919 g/ml. Związki zawarte w próbce na kolumnie z niepolarną fazą stacjonarną eluują w
następującej kolejności: izooktan, toluen, etylobenzen,
p-ksylen. Zastanów się, jaka własność
izooktanu sprawia, Ŝe jest on wymywany z kolumny jako pierwszy.
Rys. 10. Wzory strukturalne i gęstości związków analizowanych w ćwiczeniu.
Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej
24
3.1. Chromatograf gazowy i warunki analizy chromatograficznej
•
chromatograf gazowy Varian Aerograph 1440 z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym,
•
kolumna kapilarna WCOT FUSED SILICA o wymiarach 30 m x 0,25 mm, z filmem
fazy stacjonarnej CP SIL 5CB o grubości 0,25 µm,
•
temperatura dozownika i detektora 175°C, kolumny 30°C,
•
gaz nośny – argon
3.2. Warunki pracy i obsługa integratora
•
model ChromJet Integrator (Thermo Separation Products)
•
po włączeniu integratora naleŜy ustawić następujące parametry: atenuacja 16 (ATTEN
16 Enter), przesuw papieru 1 (CHART SPEED 1 Enter), PLOT AUTO
•
do rozpoczęcia analizy i jej zakończenia słuŜy przycisk INJ/END A; raport zostanie
wydrukowany automatycznie
3.3. Sprzęt i odczynniki
•
roztwory wzorcowe i badane:
PRÓBKA BADANA o nieznanych stęŜeniach toluenu, etylobenzenu i
p-ksylenu,
PRÓBKA Z DODATKIEM WZORCA (próbka badana + 10 µl toluenu/10 ml
roztworu),
PRÓBKA DO WYZNACZANIA WSPÓŁCZYNNIKÓW ODPOWIEDZI (zawiera
po 20 µl izooktanu, toluenu, etylobenzenu i
p-ksylenu w 10 ml roztworu),
PRÓBKA Z WZORCEM WEWNĘTRZNYM (próbka badana + 10 µl izooktanu/10
ml roztworu);
•
disiarczek węgla,
•
strzykawka o pojemności 10 µl.
3.4. Obsługa chromatografu i integratora
•
odkręcić zawory argonu, powietrza i wodoru.
•
włączyć zasilanie chromatografu.
•
włączyć grzałkę dozownika i detektora.
•
po osiągnięciu przez detektor temperatury 100°C zapalić palnik detektora FID (zapalenie
Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej
25
go w niŜszej temperaturze spowoduje kondensację pary wodnej w obudowie) ;
ww.
czynności wykonuje prowadzący!,
•
włączyć i zaprogramować integrator według wskazówek z punktu 3.2.
•
po ustaleniu się temperatury dozownika i detektora na poziomie 170-180°C rozpocząć
analizy;
UWAGA – DOZOWNIK JEST GORĄCY!
•
po skończonych analizach wyłączyć grzałkę i zasilanie chromatografu oraz zakręcić
zawory na butlach z gazami;
wykonuje prowadzący!
3.5. Wykonanie analiz
•
sprawdzić, czy przez kolumnę przepływa gaz nośny, wykonując nastrzyk około 1 µl
toluenu,
•
wykonać analizę próbki badanej
(A) oraz próbki z dodatkiem wzorca (B); wykonać 4
powtórzenia kaŜdej z próbek, nastrzykując je na przemian,
•
pięciokrotnie wykonać analizę próbki do wyznaczania współczynników odpowiedzi
(C),
•
wykonać pięć analiz próbki z wzorcem wewnętrznym
(D).
KaŜda analiza trwa około 6-7 minut. NaleŜy nastrzykiwać po około 1,5 µl próbki za pomocą
strzykawki 10 µl. Strzykawkę naleŜy myć w disiarczku węgla. UŜycie innych rozpuszczalników
spowoduje pojawienie się na chromatogramie dodatkowego sygnału. Raport z analizy obejmuje
szereg wielkości, w tym czasy retencji oraz powierzchnie pików.
4. Opracowanie wyników
•
Na podstawie podanych wyŜej gęstości związków, oblicz masy toluenu, etylobenzenu,
p-ksylenu oraz izooktanu w próbkach
C i D oraz masę toluenu dodanego do próbki
badanej (
B).
•
Zidentyfikuj poszczególne związki na chromatogramach.
•
Oblicz udział procentowy trzech badanych związków w próbce badanej, korzystając z
wyników analiz dla próbki
A. Bierz pod uwagę tylko powierzchnie pików tych
substancji. Wyniki przedstaw jako średnie arytmetyczne.
•
Korzystając z wyników analiz dla próbek
A i B, oblicz masy poszczególnych analitów w
próbce badanej, korzystając z wzorów podanych przy opisie
metody dodatku wzorca.
Wykonaj obliczenia dla kaŜdej pary pomiarów, następnie policz średnie arytmetyczne
Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej
26
oraz odchylenia standardowe tych średnich (wzór 28). Oceń, jaki jest rozmiar
względnych odchyleń standardowych średniej (wzór 29). Czy analizy były
powtarzalne (względny błąd standardowy na poziomie 5% moŜna uznać za
zadowalający wynik)? Czy uzyskane wyniki pokrywają się z wynikami uzyskanymi
przy wyznaczaniu udziału procentowego związków w próbce badanej?
•
Dla kaŜdej analizy próbki
C oblicz współczynniki odpowiedzi trzech badanych
związków względem izooktanu (wzór 22). Pamiętaj, Ŝe dla izooktanu przyjmujemy
f = 1.
•
Oblicz masy analitów w próbce, korzystając z wyników analiz próbki
D (wzór 21).
Pamiętaj o wyznaczonych wcześniej współczynnikach odpowiedzi! Wyniki przedstaw
jako średnie arytmetyczne. Oblicz SE i RSE dla tych średnich. Jaki jest błąd analizy?
•
Porównaj wyniki z analiz próbki
D (metoda wzorca wewnętrznego) z wynikami
uzyskanymi przy zastosowaniu
metody dodatku wzorca. Z czego wynikają róŜnice w
uzyskanych wartościach? Która metoda daje Twoim zdaniem bardziej wiarygodne
wyniki i dlaczego?
5. Literatura
1. W. Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, Warszawa 2005
2. Z. Witkiewicz, J. Hepter, Chromatografia gazowa, WNT, Warszawa 2001
3. Z. Witkiewicz, Podstawy chromatografii, WNT, Warszawa 2005