1
Metabolizm bakterii – procesy oddechowe
Oddychanie – przemiany substratu polegające na oderwanie elektronu i
przekazanie go na ostateczny akceptor
Oddychanie tlenowe:
Najbardziej wydajne energetycznie, długi łańcuch oddechowy, całkowite utlenienie
substratu oddechowego; energia wytwarzana na drodze fosforylacji oksydacyjnej;
ostateczny akceptor e - tlen
Oddychanie beztlenowe:
→
egzogenny akceptor elektronów
Mniej wydajne, ostateczne akceptory elektronów – utlenione związki nieograniczne z
podłoŜa, np. azotany, siarczany; krótszy łańcuch; energia wytwarzana na drodze
fosforylacji oksydacyjnej
a.
azotanowe (denitryfikacja) – dysymilacyjna redukcja azotanów
prowadzona przez względne tlenowce w warunkach beztlenowych, przy obecności
azotanu w podłoŜu; chemoorganoheterotrofy
ostateczny akceptor elektronów – azotan
wymagana obecność reduktazy azotanowej dysymilacyjnej (enzym błonowy
związany z cytochromami)
NO
3
-
→
NO
2
-
→
NO
→
N
2
O
↑
→
N
2
↑
Energia uzyskana trochę mniejsza niŜ w oddychaniu tlenowym
Np.
Pseudomonas stuzzeri,
Pseudomonas fluorescens
b.
siarczanowe – dysymilacyjna redukcja sierczanów
bezwzględne beztlenowce
SO
4
2-
→
S
2
-
Bakterie
Desulfo-
Podział ze względu zapotrzebowania na tlen:
•
Tlenowce
bezwzględne – wymagają tlenu 21%
względne – lepiej rosną w obecności tlenu, lecz nie wymagają go bezwzględnie
Np.
Escherichia coli
mikroaerofile – wymagają tlenu, lecz nie tolerują tak wysokiego stęŜenia jakie
jest w powietrzu, lepiej rosną przy stęŜeniu tlenu od 1 do 15 %
Np.
Enterococcus faecalis
(bardzo słabo rośnie na agarze odŜywczym, dobrze gdy
mało tlenu – np. w kolbie)
•
Beztlenowce
Nie wykorzystują tlenu, na ogół nie rosną w atmosferze tlenowej
aerotolerancyje – tolerują niskie stęŜenia tlenu przez krótki czas
bezwzględne – nawet krótka ekspozycja na tlen jest dla nich letalna
Brak enzymów zabezpieczających przed powstawaniem ponadtlenków, np.
2
Dysmutazy
– wszystko rozkładają do H2O2
Peroksydazy
– łączy się z H2O2 bez uwalniania tlenu
Katalazy
– redukują H2O2 z wydzieleniem tlenu
Techniki badania bakterii beztlenowych i mikroaerofili
chemiczne usuwanie tlenu - gazpaki,
eksykator (świeczka),
wysoki słup poŜywki, ogrzany + zredukowany związek org. (np.glukoza), który
obniŜa potencjał redoks podłoŜa + agar (zmniejsza dyfuzję tlenu; zalewamy
parafiną; posiew wgłębny
mikronisze stworzone w laboratorium (2 szalki wylane po brzegi poŜywką,
bakterie beztl + tl
1.
Określanie stosunku bakterii do tlenu
Posiew bakterii na niskim i na wysokim słupie:
Na niskim słupie rosną wszystkie wysiane bakterie, co świadczy o braku
bezwzględnych beztlenowców
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Pseudomonas fluorescens
Serratia marcescens
(róŜowe zabarwienie – barwnik prodigiozyna wytwarzana w
30 st i poniŜej, w warunkach tlenowych)
Enterococcus faecalis
(bardzo słabo, bo jest aerotolerancyjny)
Micrococcus luteus
Na wysokim słupie rosną:
Escherichia coli
Serratia marcescens
(wzrost nie jest róŜowy – brak warunków tlenowych)
Enterococcus faecalis
(lepiej niŜ na niskim)
Nie obserwuje się wzrostu:
Pseudomonas fluorescens
(bardzo słabo lub wcale)
Micrococcus luteus
Bacillus subtilis
2.
Test na obecność katalazy:
Wysiewane bakterie:
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Enterococcus faecalis
Obserwujemy wydzielanie pęcherzyków gazu przy posiewie:
Escherichia coli
3
Bacillus subtilis
Co świadczy o obecności katalazy u bakterii tlenowych i względnie beztlenowych
Nie obserwujemy bąbelków przy posiewie
Enterococcus faecalis
Co świadczy o braku katalazy, która redukuje H2O2 do wody i tlenu
cząsteczkowego
3.
oddychanie azotanowe: denitryfikacja
warunki hodowli:
→
bulion odŜywczy + KNO3
akceptor elektronów
→
wysoki słup (warunki beztlenowe stymulują bakterie do przestawienia
oddychania z tlenowego na beztlenowe z wykorzystaniem NO
3
-
jako ostatecznego
akceptora elektronów)
→
rurka Durhama do zbierania wydzielającego się gazu
Posiew bakterii:
Escherichia coli
Pseudomonas stuzzeri
Obecność jonu NO
2
-
wykrywamy przez dodanie krpoli mieszaniny
α
-
naftyloaminy z kwasem sulfanilowym. Zmiana zabarwienia na róŜowe świadczy o
obecności jonów
Escherichia coli
– zachodzi uboczna redukcja dysymilacyjna
Pseudomonas stuzzeri
Obecność gazu w rurce Durhama świadczy o wydzielaniu azotu
cząsteczkowego i N
2
0
Escherichia coli
Pseudomonas stuzzeri
– zachodzi pełna denitryfikacja
4.
Fermentacja i peptonizacja mleka
Mleko + lakmus
wskaźnik zakwaszenia
Posiew bakterii:
Enterococcus faecalis
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Enterococcus faecalis:
- wykorzystuje laktozę, nie wykorzystuje kazeiny
- zachodzi homofermentacja mlekowa (akceptor elektronu – pirogronin),
zakwaszenie środowiska, co powoduje wytrącenie kazeiny w postaci gładkiego
4
skrzepu, nie ma wydzielania gazu (skrzep jednorodny); zmiana barwy lakmusu w
poŜywce z fioletowego na róŜowy (zakwaszenie)
Escherichia coli:
- wykorzystuje laktozę, nie wykorzystuje kazeiny
- zachodzi heterofermantacja mlekowa (róŜne akceptory elektronów); skrzep
porozrywany, bo wydzielany jest gaz, który uwięziony jest w skrzepie;
zakwaszenie środowiska, co powoduje wytrącenie kazeiny; zmiana barwy lakmusu
w poŜywce z fioletowego na róŜowy (zakwaszenie)
Bacillus subtilis:
- nie wykorzystuje laktozy, wykorzystuje kazeinę
- powstaje skrzep gąbczasty, tzw. słodki., wytwarzany przez enzym podpuszczki;
powstaje środowisko alkaliczne, następnie zachodzi peptonizacja kazeiny; zmiana
barwy lakmusu w poŜywce na niebieską, następnie się redukuje, odbarwia i
ostatecznie tworzy się Ŝółta, półprzezroczysta serwatka
5.
redukcja błękitu metylenowego jako demonstracja procesu oddechowego
posiew bakterii
Escherichia coli
Błękit metylenowy w momencie zachodzenia procesu oddychania tlenowego
zabarwiony jest na niebiesko
W wyniku podgrzewania probówek usuwamy tlen z hodowli – odbarwienie
błękitu.
5
I Nitryfikacja i utlenianie nieorganicznych związków siarki
Pozyskiwanie energii przez chemolitoautotrofy, tlenowce
ź
ródło węgla – CO2
ź
ródło energii – zredukowane związki nieorganiczne azotowe (np. sole amonowe)
akceptor elektronów – tlen
a. nitryfikacja
I faza: NH
4
+
→
NH
2
OH
→
NO
2
-
- faza mniej energetyczna (Nitroso-)
II faza: NO
2
-
→
NO
3
- - bardziej energetyczna (Nitro-)
b. utlenianie nieorganicznych związków siarki
Na
2
S
2
O
3
→
SO
4
2-
Halothiobacillus neapolitanus
II asymilacja azotu atmosferycznego
Wymaga obecności nitrogenazy – kompleksu enzymatycznego, wymagającego
obecności molibdenu, Ŝelaza, wraŜliwa na tlen
N
≡
N
→
HN=NH
→
H2N–NH2
→
NH3
dwuamid hydrazyna
Reakcja przeprowadzana przez:
Azotobacter sp. (chemoorganoheterotrof)
Clostridium pasterianum (chemoorganoheterotrof)
III Fermentacja
Proces metaboliczny słuŜący odtwarzaniu energii; najmniej wydajna energetycznie,
brak łańcucha oddechowego, energia powstaje na drodze fosforylacji substratowej,
powstaje produkt organiczny;
Akceptor elektronów – endogenny związek organiczny
Proces przeprowadzany przez chemoorganotrofy
IV Asymilacyjna redukcja azotanów
Sposób na pozyskiwanie azotu budulcowego – wykorzystywany przez autotrofy i
heterotrofy
Reduktaza azotanowa asymilacyjna – enzym cytoplazmatyczny uruchamiany
obecnością NO3
-
i hamowany NH4
+
NO3
-
NO2
-
NH2OH
NH4
+
Reduktaza azostnowa hydroksyamina