Technik_tech_zywnosci_321[09]_Z4.04

„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego”

SPIS TREŚCI

1. Wprowadzenie

2. Wymagania wstępne

3. Cele kształcenia

4. Materiał nauczania

4.1. Sprzęt i materiały do badań mikrobiologicznych

4.1.1. Materiał nauczania

4.1.2. Pytania sprawdzające

4.1.3. Ćwiczenia

4.1.4. Sprawdzian postępów

4.2. Wykonywanie oznaczeń bakteriologicznych w zakładach przetwórstwa

spożywczego

4.2.1. Materiał nauczania

4.2.2. Pytania sprawdzające

4.2.3. Ćwiczenia

4.2.4. Sprawdzian postępów

5. Sprawdzian osiągnięć

6. Literatura

„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego”

1. WPROWADZENIE

Poradnik

będzie

pomocny

przyswajaniu

wiedzy

dotyczącej

badań

mikrobiologicznych mających na celu wykrycie grup drobnoustrojów występujących
w badanym produkcie oraz określenie ich liczby w analizowanej próbce.

W poradniku zamieszczono:

−

wymagania wstępne, w których określono co powinieneś umieć przystępując do realizacji
tej jednostki modułowej,

−

cele kształcenia, które określają umiejętności jakie powinieneś opanować w wyniku
procesu kształcenia,

−

materiał nauczania, który pomoże Ci samodzielne przygotować się do wykonania ćwiczeń
i zaliczenia sprawdzianów. Wykorzystaj do poszerzenia wiedzy wskazaną literaturę oraz
inne źródła informacji. Obejmuje on również ćwiczenia zawierające polecenie, sposób
wykonania oraz wyposażenie stanowiska pracy.

−

sprawdzian postępów, który umożliwi Ci sprawdzenie poziomu wiedzy po wykonaniu
ćwiczeń,

−

wykaz literatury.
Sprawdzian osiągnięć opracowany jest w formie testu zawierającego:

−

instrukcję,

−

zestaw zadań testowych,

−

punktację zadań,

−

kartę odpowiedzi.

Bezpieczeństwo i higiena pracy

Przebywając w laboratorium analizy żywności musisz przestrzegać regulaminu pracowni,

przepisów  bezpieczeństwa  i  higieny  pracy  oraz  przepisów  przeciwpożarowych.  Przy
wykonywaniu  ćwiczeń  zachowaj  ostrożność  podczas  ogrzewania  roztworów.  Postępuj
ostrożnie  z  roztworami  kwasów  i  zasad  szczególnie  stężonych.  Kwasy  do  pipety  naciągaj  za
pomocą pompki, a nie ustami.

„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego”

2. WYMAGANIA WSTĘPNE

Przystępując do realizacji programu jednostki modułowej powinieneś umieć:

−

korzystać z różnych źródeł informacji,

−

posługiwać się sprzętem laboratoryjnym,

−

korzystać z wag technicznych i analitycznych,

−

sączyć roztwory,

−

wskazywać zagrożenia związane z pracą w laboratorium oraz podczas wykonywania
ćwiczenia,

−

przeliczać stężenia,

−

interpretować wyniki badań laboratoryjnych,

−

stosować metody Dobrej Praktyki Laboratoryjnej,

−

korzystać z programów komputerowych,

−

korzystać z dokumentacji technicznej i technologicznej przy wykonywaniu badań
mikrobiologicznych,

−

ustalać punkty kontroli w procesach produkcji artykułów spożywczych poprzez
wykonywanie monitorujących analiz żywności,

−

zastosować zasady bezpieczeństwa i higieny pracy, ochrony przeciwpożarowej oraz
ochrony środowiska.

„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego”

3. CELE KSZTAŁCENIA

W wyniku realizacji programu jednostki modułowej powinieneś umieć:

−

określić niepożądane rodzaje drobnoustrojów w produktach spożywczych,

−

scharakteryzować czynniki i warunki przeciwdziałające rozwojowi szkodliwej mikroflory
w środkach spożywczych i przetwórniach surowców spożywczych,

−

określić wpływ zanieczyszczeń mikrobiologicznych żywności na zdrowie człowieka,

−

skorzystać z dokumentacji technicznej i technologicznej przy wykonywaniu badań
mikrobiologicznych żywności,

−

przygotować próbki do badań mikrobiologicznych,

−

wykonać badania mikrobiologiczne żywności,

−

wykonać badania mikrobiologiczne w zakładach przetwórstwa spożywczego,

−

zinterpretować wyniki badań mikrobiologicznych,

−

zarejestrować wyniki badań,

−

zastosować zasady Dobrej Praktyki Laboratoryjnej,

−

ustalić krytyczne punkty kontroli w procesach produkcji artykułów spożywczych poprzez
wykonywanie monitorujących analiz żywności (HACCP),

−

zastosować zasady bezpieczeństwa i higieny pracy, ochrony przeciwpożarowej oraz
ochrony środowiska,

−

skorzystać z różnych źródeł informacji zawodowej.

„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego”

4. MATERIAŁ NAUCZANIA

4.1. Sprzęt i materiały do badań mikrobiologicznych

4.1.1. Materiał nauczania

Szkło i sprzęt laboratoryjny

Sprzęt i materiały do badań powinny być czyste i wyjałowione. Szkło używane

w pracowniach  mikrobiologicznych  jeśli  jest  nowe  należy  przetrzymać  je  przez  kilkanaście
minut  w  ok.  1-procentowym  roztworze  węglanu  sodu  w  temperaturze  ok.  50°C,  a  potem
umyć  pod bieżącą  ciepłą wodą. Na koniec należy umyć w zimnej wodzie destylowanej. Szkło
używane  nie  zawierające  nie  zawierające  drobnoustrojów  należy  umyć  w  2-procentowym
ciepłym  roztworze  mydła  lub  detergentu,  następnie  opłukać  w  zimnej  wodzie  destylowanej.
Naczynia  zawierające  hodowle  mikroorganizmów  należy  moczyć  w  10-procentowym
roztworze  kwasu  solnego  lub  w  środkach  odkażających  w  celu  ich  zabicia.  Środkiem
odkażającym  może  być  lizol.  Naczynia  można  także  wyjaławiać  w  temperaturze 121°C  przez
30 minut potem, umyć w ciepłej wodzie bieżącej, a na koniec w zimnej destylowanej. Suszenie
szkła  odbywa  się  na  rozłożonych  arkuszach  czystego  papieru  lub  bibuły  filtracyjnej.  Można
również  suszyć  je  w  suszarkach  o  temperaturze  40÷60°C.  Wysuszone  szkło  poddaje  się
wyjaławianiu. Kolby, butelki, probówki należy zatkać korkiem z waty. Do pipet należy włożyć
odpowiedniej  wielkości  tamponiki  z  waty.  Pipety  i  probówki  pakować  należy  po  kilka  sztuk
zawijając w papier. Butelki wyjaławiane są z korkami zakładając pomiędzy korki i szyjki paski
papieru.  Same  korki  i  szyjki  również  owijane  są  papierem  i  obwiązywane  sznurkiem.  Płytki
Petriego  wyjaławiane  są  w  specjalnie  do  tego  celu  przygotowanych  metalowych  puszkach,
owinięte także papierem jak inne szkło. Przygotowany sprzęt wyjaławiany jest przez 2 godziny
w  suszarce  o  temperaturze  160°C  lub  w  autoklawie  przez  30 minut  w  temperaturze  121°C.
Naczynia  szklane  wstawiane  do  autoklawu  owija  się  w pergamin.  Sprzęt  pomocniczy  można
wyjaławiać  przed  użyciem  zanurzając  w  96-procentowym  etanolu  i  opalenie  w  płomieniu
palnika gazowego.

Pożywki i podłoża hodowlane

Do hodowli drobnoustrojów oraz ich identyfikacji jakościowych lub ilościowych

stosowane  są  pożywki  hodowlane.  Pożywki  są  to  roztwory  wodne  substancji  odżywczych.
Podłoża  hodowlane  to  pożywki  zestalone  agar-agarem  lub  żelatyną.  Podobnie  jak  pożywki
służą  do  identyfikacji  jakościowej  oraz  do  ilościowego  oznaczania  drobnoustrojów.  Dobór
pożywek  i  podłóż  do  hodowli  drobnoustrojów  jest  zależny  od  właściwości  fizycznych
i chemicznych  środowiska.  Powinny  one  spełniać  określone  wymagania  w  zakresie  jakości,
mianowicie:

−

muszą zawierać wszystkie składniki pokarmowe w odpowiednich stężeniach niezbędnych
do optymalnego wzrostu drobnoustrojów,

−

wykazywać właściwy odczyn środowiska,

−

powinny być przejrzyste, ponieważ ułatwiona jest wówczas obserwacja wzrostu i liczenie
kolonii drobnoustrojów,

−

muszą być jałowe, nie zawierać żywych drobnoustrojów, ich form przetrwalnikujących ani
zarodników.

„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego”

Pożywki  i  podłoża  mogą  być  ogólne  i  wybiórcze.  Do  najczęściej  stosowanych  ogólnych
pożywek  w  analizie  mikrobiologicznej  jest  niechmielona  brzeczka  piwna  oraz  bulion  czyli
wyciąg mięsny z dodatkiem peptonu i chlorku sodu doprowadzony do pH 7,8.
Brzeczka  piwna  stosowana  jest  do  hodowli  pleśni  i  drożdży,  natomiast  bulion  do  hodowli
bakterii. Pożywki hodowlane wybiórcze przygotowywane są z mleka odtłuszczonego, serwatki
lub hydrolizatów białkowych.

Przygotowanie pożywek i podłóż hodowlanych

Wyciąg mięsny otrzymywany jest z mięsa końskiego lub wołowego oczyszczonego ze

ścięgien  i  tłuszczu.  Rozdrobnione  mięso  zalewa  się  wodą  w  stosunku  1:  2  i  pozostawia
w lodówce  na  12÷15  godzin.  Po  upływie  tego  czasu  gotuje  się  całość  przez  30  minut,
następnie sączy przez lnianą  tkaninę. Otrzymany wyciąg rozlewa się do butelek i wyjaławia w
autoklawie przez 30 minut w temperaturze 121°C. Wyciąg można przechowywać w lodówce i
używać  jako  składnika  pożywek  i  podłoży  hodowlanych  po  uprzednim  przesączeniu  przez
sączek z waty.

Podłoże Endo:
bulion zwykły – 1000 cm

woda destylowana doprowadzona do pH 6,5 – 2000 cm

pepton,
chlorek sodu – 10 g,
agar – 60 g,
laktoza – 30 g,
fuksyna zasadowa roztwór alkoholowy 3% – 30 cm

siarczyn sodu, roztwór wodny 10% - 160 cm

wodorotlenek sodu, roztwór wodny 10% - do zobojętnienia.

Do zlewki o pojemności 4 dm

odmierzyć wodę destylowaną, dodać agar-agar i ogrzewać

w autoklawie do chwili upłynnienia. Dodać bulion mięsny, pepton, chlorek sodu i laktozę.
Mieszać do rozpuszczenia się składników. Doprowadzić pH do 7,8 dodając z biurety 10%
roztwór NaOH. Tak przygotowane podłoże rozlać do kolb stożkowych o pojemności 150 cm

każda i wyjaławiać 30 minut w temperaturze 117°C. Przed użyciem do badań podłoże należy
upłynnić ogrzewając kolby w kąpieli wodnej. Następnie dodaje się fuksyny zasadowej
(1÷1,5 cm

na każde 150 cm

płynu) oraz 10% roztwór siarczynu sodu do chwili zabarwienia

się podłoża na bladoróżowy kolor. Podłoże rozlewa się na płytki Petriego i przechowuje
w ciemnym miejscu do czasu prowadzenia badań mikrobiologicznych, nie dłużej jednak niż
dwa dni.

Pożywka Eijkmana:
woda destylowana – 1000cm

pepton – 10 g,
chlorek sodu – 5 g,
laktoza – 10 g,
purpura bromokrezolowa, 1% roztwór w 50% etanolu – 1cm

wodorotlenek sodu, roztwór wodny 10% - do zobojętnienia.

Odmierzyć wodę destylowaną do zlewki o pojemności 2 dm

, dodać pepton i chlorek

sodu,  mieszać  bagietką  do  rozpuszczenia  składników.  Doprowadzić  roztwór  do  pH  6,8÷7,0
dodając  z biurety  10%  roztwór  NaOH.  Zawartość  zlewki  ogrzać  do  wrzenia  i  sączyć  na
gorąco  przez  bibułę  filtracyjną.  Do  przesączu  dodać  laktozę  i  wskaźnik.  Pożywkę  rozlać  do

„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego”

probówek z rurkami Durhama, zamknąć korkami z waty i wyjaławiać 30 minut w temperaturze
117°C.
Roztwór soli fizjologicznej:
woda destylowana – 1000 cm

chlorek sodu – 9 g,
Chlorek sodu rozpuszcza się w wodzie destylowanej, rozlewa roztwór do kolb stożkowych
i wyjaławia 10 minut w temperaturze 121°C.

Płyn Lugola:
woda destylowana – 300cm

jodek potasu – 2g,
jod – 1g.

Pobrać 20 cm

wody destylowanej do butelki z ciemnego szkła zamykanej doszlifowanym

korkiem, dodać jodek potasu, a po jego rozpuszczeniu jod. Całość mieszać do rozpuszczenia
jodu. Dodać pozostałą część wody destylowanej i wymieszać. Przechowywać do czasu badań
analitycznych.
Sporządzanie preparatów bakterioskopowych. Barwienie metodą Grama.

Charakter lub liczbę drobnoustrojów w badanym produkcie określa się za pomocą

preparatów mikroskopowych. Oglądane są one pod mikroskopem przy odpowiednio
dobranym powiększeniu.

Preparaty bakteriskopowe można wykonać np. z mięsa lub jego przetworów. Są to

preparaty odciskowe, które barwi się metodą Grama. Kolejność postępowania przy barwieniu
metodą Grama jest następująca:

−

przygotowanie preparatu odciskowego z mięsa chudego,

−

wysuszenie preparatu,

−

barwienie roztworem fioletu krystalicznego,

−

działanie na preparat płynem Lugola,

−

spłukiwanie preparatu 96% alkoholem etylowym do odbarwienia,

−

barwienie fuksyną fenolową,

−

spłukiwanie wodą destylowaną,

−

suszenie preparatu bibułą i obserwacja pod mikroskopem.

Barwienie  preparatu  metodą  Grama  umożliwia  rozpoznanie  charakteru  występującej
mikroflory.  Do  bakterii  Gram-dodatnich,  które  barwią  się na fioletowo, należą między innymi
bakterie  z  rodziny  Bacillaceae  (rodzaje  Bacillus  –  tlenowe  laseczki  przetrwalnikujące
i Clostridium  –  beztlenowe  laseczki  przetrwalnikujące,  gronkowce  chorobotwórcze  oraz
bakterie  fermentacji  mlekowej).  Natomiast  do  bakterii  Gram-ujemnych,  które  barwią  się  na
czerwono,  zalicza  sięrodzinę  Enterobacteraceae  (są  to  pałeczki  z  grupy  okrężnicy,  z  grupy
Salmonella i inne).

Płyn Ringera
woda destylowana – 1000cm

chlorek sodu – 9g,
chlorek potasu – 0,42g,
chlorek wapnia bezwodny – 0,24g,
wodorowęglan sodu – 0,20g,
Wodę destylowaną należy ogrzać do wrzenia, dodać pozostałe składniki, mieszać do
całkowitego rozpuszczenia. Płyn rozlać do kolb stożkowych i wyjaławiać przez 20 minut
w temperaturze 121°C.

„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego”

Rys. 1. Cieplarka laboratoryjna CLN 53 [8]

Cieplarka posiada naturalny obieg powietrza i mikroprocesorowy sterownik temperatury
i czasu. Wnętrze i obudowa komory zbudowane są ze stali nierdzewnej.

4.1.2. Pytania sprawdzające

Odpowiadając na pytania, sprawdzisz, czy jesteś przygotowany do wykonania ćwiczeń.

1. Jakie znasz metody badań mikrobiologicznych?
2. Jakich roztworów należy używać do mycia naczyń i sprzętu w laboratorium

mikrobiologicznym?

3.  Jakie są warunki wyjaławiania sprzętu do badań mikrobiologicznych?
4.  Jakie znasz rodzaje pożywek i podłóż hodowlanych?
5.  Jak przygotować preparat bakterioskopowy?

4.1.3. Ćwiczenia

Ćwiczenie 1

Porównaj wyposażenie i urządzenia laboratorium szkolnego i zakładowego.

Sposób wykonania ćwiczenia

Aby wykonać ćwiczenie powinieneś:

1)  wymienić sprzęt i szkło znajdujące się w laboratorium szkolnym,
2)  wymienić sprzęt i szkło stosowane w laboratorium zakładowym,
3)  porównać wyposażenie, urządzenia i sprzęt laboratoriów zakładowego i szkolnego,
4)  wyciągnąć  wnioski  dotyczące  różnicy  w  oznaczeniach  wykonywanych  w  laboratorium

szkolnym i zakładowym.

Wyposażenie stanowiska pracy:

−

schemat, mikrobiologicznego laboratorium zakładowego,

−

foldery z urządzonymi laboratoriami zakładów przetwórstwa spożywczego,

−

zdjęcia, foldery mikrobiologicznego laboratorium analiz żywności Terenowej Stacji
Sanitarno- Epidemiologicznej ewentualnie spostrzeżenia z wycieczki.

„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego”

Ćwiczenie 2

Przygotuj sprzęt i szkło do badań mikrobiologicznych.

Sposób wykonania ćwiczenia

Aby wykonać ćwiczenie powinieneś:

1) przetrzymać nowe szkło w 1- procentowym roztworze węglanu sodu w temperaturze

50°C,

2)  umyć w bieżącej, ciepłej wodzie,
3)  umyć w zimnej wodzie destylowanej,
4)  odstawić  do  suszenia  w  powietrzu  rozłożone  na  arkuszach  czystego  papieru  lub  bibuły

filtracyjnej lub suszyć w suszarkach o temperaturze 40÷60°C,

5)  umyć szkło używane w 2-procentowym ciepłym roztworze mydła lub detergentu,
6)  wypłukać w ciepłej wodzie bieżącej, a potem w zimnej destylowanej,
7)  suszyć jak w punkcie 4,
8)  namoczyć  naczynia  zawierające  hodowle  drobnoustrojów  w  10-procentowym  roztworze

kwasu siarkowego lub w środkach odkażających np. w 2-procentowym lizolu,

9)  umyć w ciepłej bieżącej wodzie,
10)  umyć w zimnej wodzie destylowanej,
11)  suszyć jak podano w punkcie 4,
12)  zatkać korkami z waty kolby, butelki, probówki, pipety,
13)  zapakować w papier pipety i probówki (po kilka sztuk),
14)  włożyć paski papieru pomiędzy korki i szyjki butelek z doszlifowanymi korkami,
15)  owinąć korki i szyjki butelek papierem i obwiązać sznurkiem,
16)  wyjaławiać  sprzęt  przez  2  godziny  w  suszarce  o  temperaturze  160°C  lub  30  minut

w autoklawie o temperaturze 121°C,

17) zanurzyć sprzęt metalowy w 96-procentowym etanolu,
18) opalić w płomieniu palnika gazowego.

Wyposażenie stanowiska pracy:

−

sprzęt i szkło laboratoryjne,

−

roztwory do mycia: 1-procentowy roztwór węglanu sodu, 2-procentowy roztwór mydła,

−

woda destylowana,

−

lizol,

−

10%H

−

wata,

−

papier,

−

bibuła,

−

palnik gazowy,

−

suszarki do wyjaławiania szkła laboratoryjnego

Ćwiczenie 3

Przygotuj 1500 cm

niechmielonej brzeczki piwnej.

Sposób wykonania ćwiczenia

Aby wykonać ćwiczenie powinieneś:

1) wytarować garnek emaliowany z łopatką,
2) dodać 200 g słodu mielonego oraz 1,2 dm

wody wodociągowej,

„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego”

3)  ustawić garnek z zawartością na trójnogu,
4)  ogrzewać do temperatury 45°C utrzymując w tym stanie przez 30 minut,
5)  ogrzewać garnek do temperatury 70°C (1°C na 1 minutę),
6)  utrzymywaać temperaturę końcową przez 10 minut,
7)  sprawdzić stopień scukrzenia przenosząc bagietką kroplę zacieru na bloczek gipsowy,
8)  zadać  kroplą  płynu  Lugola,  (żółte  zabarwienie  świadczy  o  pełnym  scukrzeniu,  niebieskie

o niepełnym),

9)  schłodzić po osiągnięciu pełnego scukrzenia,
10)  uzupełnić wodą masę do 1800 g,
11)  wymieszać, odsączyć przez lnianą tkaninę,
12)  zebrać przesącz do kolby okrągłodennej o pojemności 1,5 dm

13)  wyjałowić w temperaturze 121° przez 30 minut,
14)  schłodzić i sklarować utrwaloną brzeczkę pozostawiając na kilka godzin,
15)  sprawdzić gęstość areometrem Ballinga,
16)  doprowadzić stężenie do 10°Blg przez dodanie odpowiedniej ilości wody,
17)  przesączyć brzeczkę przez sączek z bibuły filtracyjnej,
18)  rozlewać do butelek o pojemności 250 cm

19) zamknąć butelki korkami z waty,
20) utrwalić brzeczkę temperaturze 117°C w czasie 30 minut.

Wyposażenie stanowiska pracy:

–

słód browarniany mielony – 200 g,

–

garnek emaliowany o pojemności 2 dm

–

łopatka drewniana,

–

trójnóg,

–

pinceta,

–

palnik gazowy,

–

termometr o zakresie temperatur 0÷150°C,

–

bagietka szklana,

–

bloczek gipsowy,

–

areometr Ballinga o zakresie 0 ÷25°Blg,

–

cylinder szklany o pojemności 250 cm

–

tkanina lniana,

–

sączek z bibuły filtracyjnej,

–

butelki o pojemności 250 cm

– 6 sztuk,

–

kolba okrągłodenna o pojemności 1,5 dm

–

autoklaw.

Ćwiczenie 4

Przygotuj bulion zwykły.

Sposób wykonania ćwiczenia

Aby wykonać ćwiczenie powinieneś:

1) przygotować wyciąg mięsny według niżej podanego przepisu,

a) rozdrobnić w maszynce do mięsa 1 kg mięsa wołowego lub końskiego,
b) przełożyć do garnka emaliowanego i zalać 2,2 dm

wody destylowanej,

c) wstawić do lodówki na 12÷15 godzin,
d) gotować następnego dnia 30 minut,

„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego”

e)  przesączyć przez płótno,
f)  rozlać do kolb lub butelek,
g)  wyjaławiać przez 20 minut w temperaturze 121°C,
h)  wyciąg  przechowywać  w  chłodni,  a  przed  użyciem,  jako  składnika  podłoży

przesączyć przez watę,

2) przygotować bulion zwykły zgodnie z podanym niżej przepisem,

a) zmieszać 1000cm

wyciągu mięsnego z 10g peptonu i 5g chlorku sodu w garnku

emaliowanym,

b)  doprowadzić odczyn do pH 7,8 za pomocą 10-procentowego NaOH,
c)  ogrzewać 30 minut w temperaturze 121°C,
d)  skorygować odczyn do pH 7,8,
e)  przesączyć przez bibułę i rozlać do kolb lub probówek,
f)  wyjaławiać w temperaturze 121°C przez 20 minut, pH 7,4÷ 7,6.

Wyposażenie stanowiska pracy:

−

mięso wołowe lub końskie 1 kg,

−

woda destylowana,

−

wyciąg mięsny,

−

pepton,

−

chlorek sodu,

−

garnek emaliowany,

−

butelki,

−

autoklaw.

Ćwiczenie 5

Przygotuj preparaty do badań mikroskopowych.

Sposób wykonania ćwiczenia

Aby wykonać ćwiczenie powinieneś:

1) przygotować preparat odciskowy z mięsa chudego (przeprowadź odtłuszczanie szkiełka

wyjętego z etanolu, wycierając go miękką ściereczką do sucha, a następnie przetrzeć
kawałkiem suchego mydła i ponownie wytrzeć ściereczką. Szkiełko przepalić w płomieniu
i odcisnąć na nim powierzchnię cięcia badanej próbki mięsa tak, aby otrzymany ślad był
wyraźny, cienki i bez wolnych przestrzeni),

2)  wysuszyć przygotowany preparat,
3)  utrwalić preparat,
4)  barwić preparat roztworem fioletu krystalicznego,
5)  działać na preparat płynem Lugola,
6)  spłukać preparat 96-procentowym alkoholem etylowym, aż do odbarwienia,
7)  barwić preparat fuksyną fenolową (rozcieńczoną dziesięciokrotnie),
8)  spłukać wodą destylowaną,
9)  osuszyć  preparat  bibułą  i  obserwować  pod  mikroskopem  używając  obiektywu

immersyjnego,

10) określić charakter mikroflory licząc w 40 polach widzenia ziarniaki, pałeczki Gram-

dodatnie oraz pałeczki Gram-ujemne.

„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego”

Wyposażenie stanowiska pracy:

−

mięso chude,

−

roztwór fioletu krystalicznego,

−

płyn Lugola,

−

alkohol etylowy,

−

fuksyna fenolowa,

−

bibuła,

−

szkiełko przedmiotowe,

−

mikroskop.

4.1.4. Sprawdzian postępów

Czy potrafisz:

Tak

Nie

1)  zdefiniować pojęcia pożywki i podłoża hodowlanego?
2)  przygotować sprzęt i materiały do badań mikrobiologicznych?
3)  przygotować podłoża i roztwory do badań bakteriologicznych?
4)  dobrać  pożywki  i  podłoża  hodowlane  zależnie  od  wymagań

drobnoustrojów?

5)  wyjałowić szkło i sprzęt laboratoryjny?
6)  przygotować płytki Petriego do posiewu?
7)  przygotować probówki z rurkami Durhama do posiewu?



„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego”

4.2. Wykonywanie oznaczeń bakteriologicznych w zakładach

przetwórstwa spożywczego

4.2.1. Materiał nauczania

Zasady przygotowania próbek do badań i posiewów

Przygotowanie próbek do orientacyjnego określenia stopnia zakażenia polega na jałowym

podzieleniu próbki (ok. mięsa) wielkości 20 g w taki sposób, aby otrzymać jeden kawałek
wielkości 10 g (przeznaczony do posiewów na podłoże stałe), natomiast resztę należy
podzielić na kawałki ok. 1 g (przeznaczenie na podłoże płynne).

Przygotowanie próbek do badań ilościowych polega na wykonaniu rozcieńczeń.

Rozróżnia się dwa sposoby rozcieńczeń. Pierwszy sposób stosowany jest w przypadku
oznaczania ogólnej liczby drobnoustrojów w 1 g lub miana. Drugi sposób ma miejsce, gdy
celem badań jest określenie liczby drobnoustrojów na powierzchni 1 cm

lub miana z 1 cm

Oznaczanie ogólnej liczby drobnoustrojów
Produkty spożywcze, surowce roślinne i zwierzęce stanowią dobre źródło rozwoju

drobnoustrojów,  które  powodują  niekorzystne  zmiany  sensoryczne,  a  także  zmiany  składu
chemicznego.  Zachodzi  konieczność  dokonywania  oceny  żywności  pod  względem  zakażenia
drobnoustrojami.  Wynik  oznaczania  ogólnej  liczby  drobnoustrojów  w  surowcach  pozwala  na
określenie  jakości  higienicznej  surowców,  ich  przydatności  do  przerobu,  jakości  i  trwałości
otrzymanych  z  tych  surowców  produktów.  W  przypadku  oznaczania  ogólnej  liczby
drobnoustrojów w wyrobach gotowych wynik pozwala dokonać oceny:

−

prawidłowości procesów technologicznych,

−

warunków higienicznych, w jakich odbywała się produkcja,

−

jakości i trwałości mikrobiologicznej ocenianych wyrobów.

Wymagania ilościowe podane są w normach jakościowych. Do oznaczania ogólnej liczby
drobnoustrojów stosowane są dwie metody:

−

metoda reduktazowa,

−

hodowlana metoda płytkowa.
Metoda reduktazowa należy do metod orientacyjnych i sprowadza się do określenia

stopnia zakażenia środowisk drobnoustrojami. Polega na obserwacji czasu odbarwiania się
barwników oksydoredukcyjnych (błękit metylenowy, rezazuryna) w badanych środowiskach,
po inkubacji w określonych warunkach temperatury.

Metodę reduktazową stosuje się do szybkiej oceny jakości bakteriologicznej mleka

surowego. Stwierdzono, że czas odbarwiania barwników oksydoredukcyjnych w mleku jest
tym krótszy, im więcej zawiera ono drobnoustrojów.

Drobnoustroje w wyniku procesu oddychania wydzielają wodór, który wiąże najpierw tlen

zawarty w mleku, a po wyczerpaniu się tlenu akceptorami wodoru są dodane barwniki
oksydoredukcyjne: błękit metylenowy lub rezazuryna. Barwniki redukując się przechodzą
w bezbarwne formy, czyli leuko.

Błękit metylenowy dodany do mleka barwi je na niebiesko. Po redukcji błękitu

metylenowego  do  formy  leukozwiązku  barwa  znika.  W  próbie z rezazuryną  bezpośrednio  po
jej wymieszaniu z mlekiem barwa jest stalowoniebieska, następnie przechodzi w różową, a po
całkowitej  redukcji  rezazuryny  następuje  całkowicie  odbarwia  się.  Czas  odbarwiania
barwników  w  mleku  waha  się  od  kilku  minut  do  kilku  godzin  w  zależności  od  zakażenia
mleka. Im bardziej zakażone tym czas odbarwiania dłuższy.

Hodowlana metoda płytkowa sprowadza się do posiewu pewnych ilości środowisk

(surowca, produktu) do podłoża ogólnego w płytkach Petriego i policzenia kolonii wyrosłych

„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego”

drobnoustrojów na zestalonym podłożu. Pod pojęciem kolonii drobnoustrojów rozumie się
zespół komórek widoczny makroskopowo, powstały z rozmnożenia jednej komórki na
podłożu stałym, w odizolowaniu od innych komórek.

Używaną do posiewu ilość surowca lub produktu uzależnia się od spodziewanej w nim

liczby drobnoustrojów.  Zakłada  się,  że z jednej  komórki  wyrasta  kolonia i że każda komórka
jest  w  stanie  rozmnożyć  się  i  utworzyć  swoją  kolonię.  Nie  zawsze  założenia  te  są  ścisłe.
Czasami  poza  pojedynczymi  komórkami  mogą  występować  zespoły  komórek  w  postaci
gronek  lub  łańcuszków,  które  dają  pojedyncze  kolonie.  Ponadto  nie  wszystkie  komórki
rozwijają  swoje  kolonie  ze  względu  na  brak  optymalnych  warunków  rozwoju.  Metodę
płytkową  uważa  się  za  porównawczą.  Określa  ona  liczbę  żywych  komórek  w  badanych
środowiskach,  zdolnych  do  rozwoju  na  użytych  podłożach  i  w  danych  warunkach  hodowli.
W zależności od badanego środowiska stosuje się różne podłoża hodowlane. W celu uzyskania
porównywalnych  wyników  oznaczeń  ogólnej  liczby  drobnoustrojów  metodą  płytkową  należy
przestrzegać  ściśle  tego  samego  sposobu  postępowania,  w  którym  wyróżnia  się  podstawowe
etapy:

−

przygotowanie odpowiedniego rozcieńczenia badanego środowiska,

−

dokonanie posiewu,

−

hodowla drobnoustrojów,

−

liczenie kolonii i interpretacja wyników.
Surowce roślinne zawierają zwykle dużą liczbę drobnoustrojów, dlatego przed posiewem

na  zestalone  podłoże  należy  je  rozcieńczyć jałowym  roztworem  soli fizjologicznej  lub płynem
Ringera  w  odpowiednim  stosunku,  aby  po  inkubacji  liczba  kolonii  wyrosłych  na  płytce
Petriego  mieściła  się  w  zakresie  30÷300.  Rozcieńczenia  wykonuje  się  w  butelkach
o pojemności  200  cm

lub 20 cm

, do których pobiera się odpowiednio 90 lub 9 cm

rozcieńczalników, (sól fizjologiczna, płyn Ringera). Rozcieńczalnik może być wyjałowiony lub
można go wyjaławiać w butelkach w autoklawie. Z badanej próbki surowca należy pobrać
10cm

produktu lub odważyć 10 g i przenieść do butelki zawierającej 90 cm

rozcieńczalnika.

Zawartość butelki wymieszać dokładnie. W ten sposób otrzymuje się rozcieńczenie próbki
pierwotnej 1:10. Pobierając z tej próbki inną jałową pipetą 1 cm

i przenosząc do następnej

butelki zawierającej 9 cm

rozcieńczalnika uzyskuje się rozcieńczenie 1:100 itd. Schematycznie

sposób rozcieńczania przedstawia rysunek 1. Postępując analogicznie uzyskuje się żądane
rozcieńczenie próbki pierwotnej. Z ostatniego rozcieńczenia pobiera się 1 cm

do posiewu na

podłoże hodowlane w płytce Petriego.

Rys. 2. Schemat przygotowywania rozcieńczeń do posiewu [3, s. 406]

„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego”

Rys.3. Przykłady posiewu rysowego [3, s. 104]

Rys. 4. Różne kształty kolonii drobnoustrojów [3, s. 99]

W celu wykonania posiewu należy pobrać pipetą 1 cm

płynu z odpowiedniego

rozcieńczenia,  uchylić  lekko  wieczko  płytki  Petriego  wprowadzić  koniec  pipety  do  środka
i wdmuchnąć  delikatnie  zawartość  pipety  nie  dotykając dna  płytki  i unikając rozprysku płynu.
Następnie  należy  wlać  podłoże  hodowlane  uprzednio  upłynnione  we  wrzącej  łaźni  wodnej
i ochłodzone  do  temperatury  47÷50°C.  Przed  wylaniem  podłoża  na  płytki  Petriego  naczynie
z pożywką  otwiera  się  tuż  przy  płomieniu  palnika  gazowego,  opala  się  brzegi  i  szyjkę,
a następnie  wylewa  płynne  podłoże  do  płytki  mieszając  ruchem  kołowym.  Płytki  pozostawia
się  na  ok.  15  minut  na  czas  skrzepnięcia  agaru,  po  czym  odwraca  do  góry  dnem  w  celu
zapobieżenia kondensacji pary wodnej na powierzchni podłoży. Płytki wstawia się do cieplarki,
układając  jedną  na  drugiej,  nie  więcej  niż  4  w  jednym  słupku.  Jednocześnie  wkłada  się  do
cieplarki dwie płytki kontrolne.

Hodowlę prowadzi się w temperaturze 28÷30°C przy swobodnym dostępie tlenu do

podłoża, gdyż najczęściej oznacza się liczbę drobnoustrojów tlenowych, mezofilnych. Czas
hodowli wynosi trzy doby, co zapewnia możliwość obserwacji kolonii wyrosłych gołym okiem.

Liczenie kolonii odbywa się przy wykorzystaniu płytek kontrolnych całkowicie wolnych

od drobnoustrojów. Do obliczeń pobiera się płytki z posiewami z dwu kolejnych rozcieńczeń,
z liczbą  kolonii  mieszczącą  się  w  zakresie  10÷300,  a  policzone  kolonie  zaznacza  się
dermatografem  na  zewnętrznej  powierzchni  denka  płytki.  Sumuje  się  liczby  kolonii
z poszczególnych  płytek  dla  tego  samego  rozcieńczenia  i  dzieli  przez  liczbę płytek uzyskując

średnią liczbę kolonii dla jednej płytki.

„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego”

Liczbę mnoży się przez dzielnik krotności rozcieńczenia (10, 100, itd.) co daje liczbę

kolonii drobnoustrojów w 1cm

lub 1g badanego surowca lub produktu. Jeżeli wyniki

oznaczeń dla dwu kolejnych rozcieńczeń nie różnią się o więcej niż 10% jako ostateczny wynik
przyjmuje się wartość średniej arytmetycznej uzyskanych wyników. W innym przypadku za
podstawę przyjmuje się wyniki uzyskane przy zastosowaniu większego rozcieńczenia.

Kolonie wyrosłe w postaci smug przyjmuje się za kolonie pojedyncze. Jeśli kolonie

zajmują więcej niż połowę powierzchni podłoża płytki eliminuje się z oznaczeń, jako płytki
zalane.

Uzyskane wyniki ogólnej liczby drobnoustrojów w surowcach lub produktach przemysłu

spożywczego porównuje się z wymaganiami norm jakościowych. Zgodność uzyskiwanych
wyników z normami jest podstawą do uznania wyrobu za nadający się do spożycia. Po analizie
sensorycznej i składu chemicznego do zaliczenia wyrobu do odpowiedniej klasy jakości.

Oznaczanie miana coli w produktach spożywczych
W przemyśle spożywczym znajdują się bardzo dobre warunki do rozwoju bakterii coli

czyli  pałeczki  okrężnicy  należącej  do  enterobakterii.  Bakterie  te  występują  w  przewodzie
pokarmowym,  a  także  w  odchodach,  skąd  dostają  się  do  wody.  Obecność  większej  liczby
bakterii  coli  świadczy  o  niskim  poziomie  higieny  produkcji  w  zakładach  przetwórstwa
spożywczego.  Dodatkowym  źródłem  zanieczyszczeń  może  być  brak  higieny  osobistej
personelu  zatrudnionego  przy  produkcji.  W  analizie  mikrobiologicznej  produktów
spożywczych  oznacza  się  bakterie  coli  jako  miano  coli  tj.  najmniejszą  ilość  produktu
(w gramach  lub  cm

), w której stwierdza się jeszcze występowanie pałeczki okrężnicy. Do

oznaczeń stosuje się metodę hodowlaną w pożywce płynnej. Wykorzystuje się zdolność
bakterii coli do fermentacji laktozy z wytworzeniem gazów CO

i H

, które zbierają się

w zanurzonych  w  pożywce  rurkach  Durhama.  Do  oznaczania  miana  coli  konieczne  jest
dokonywanie posiewów z wielu rozcieńczeń badanego produktu do pożywki płynnej. Pożywki
poddaje  się  inkubacji  w  temperaturze  37°C  przez  48  godzin,  następnie  prowadzi  się
obserwację,  czy  w  rurkach  Durhama  pojawia  się  gaz.  Rozcieńczenia  muszą  być  tak dobrane,
by  co  najmniej  w  jednej  probówce  z  posiewem odpowiadającym największemu  rozcieńczeniu
badanego  produktu  nie  było  już  wzrostu  bakterii  Coli  (brak  gazu  w  rurce).  W  przeciwnym
wypadku  wynik  oznaczenia  nie  będzie  ściśle  określony.  Największe  rozcieńczenie  przyjmuje
się za podstawę obliczeń miana coli, przy czym ilość gazu w rurce Durhama musi wynosić co
najmniej 10% objętości rurki.

Rys. 5. Probówki z pożywką i rurkami Durhama [4, s. 409]

a) rurka Durhama wypełniona pożywką (bez gazu), b) rurka Durhama częściowo napełniona gazem

„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego”

Miano coli zapisuje się w postaci ułamka dziesiętnego, który oznacza ilość badanego

produktu wprowadzonego do probówki z pożywką. Jeśli na przykład gaz występuje w rurkach
Durhama w probówkach, do których posiano po 1 cm

z rozcieńczeń 10

-1

i 10

-3

, a przy

posianiu dalszych rozcieńczeń gaz już nie występuje wówczas miano coli wynosi 0,001.
Oznacza to, że w objętości 0,001 cm

próbki pierwotnej występowała co najmniej jedna

komórka  bakterii  coli.  Gdy  gaz  był  obecny  we  wszystkich  próbkach  z  przygotowanych
rozcieńczeń  badanego produktu wówczas podaje się słownie, że miano coli jest niższe od ok.
0,01;  0,001.  Jeśli  nie  stwierdza  się  obecności  coli  w  żadnym  z  rozcieńczeń  należy  podać,  ze
miano coli jest wyższe od najmniejszego rozcieńczenia, ok. od 0,1 lub 0,001.

Rys.6. Anaerostat [3, s.107]

Zasady hodowli beztlenowców

Wyhodowanie beztlenowców wymaga usunięcia tlenu ze środowiska, gdyż przy dostępie

tlenu komórki wegetatywne beztlenowców szybko giną. Występuje kilka metod hodowli
bakterii beztlenowych, mianowicie:

−

hodowla na pożywce płynnej pod warstwą oleju parafinowego, przy czym do pożywki
dodaje się substancje pochłaniające tlen(np. kostki wątroby w podłożu Wrzoska),

−

hodowla w specjalnych aparatach aerostatach (rys. 6), z których usuwa się powietrze za
pomocą pompy próżniowej (po uprzednim umieszczeniu hodowli), a następnie wstawia się
je do cieplarki,

−

hodowla w wysokim słupku agaru lub żelatyny, na powierzchnię którego wprowadza się
dodatkowo warstwę agaru lub żelatyny, przez co zamyka się dostęp powietrza do podłoża,

−

hodowla w warunkach beztlenowych wywołanych usunięciem tlenu środkami
chemicznymi,

−

hodowla symbiotyczna beztlenowców z tlenowcami polegająca na tym, że na jednej
połowie płytki posiewa się bakterie tlenowe, a na drugiej beztlenowe. Płytkę z posiewami
zamyka się szklaną taflą, a brzegi oblepia plasteliną. Tlenowce w czasie wzrostu zużywają
tlen zawarty w podłożu i naczyniu, stwarzając w ten sposób odpowiednie warunki
rozwoju beztlenowców.

„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego”

Oznaczanie obecności pałeczek duru i czerwonki

Badania obecności pałeczek duru i czerwonki wykonuje się w przypadku wystąpienia

zatruć pokarmowych lub podejrzenia o zakażenie produktów tymi bakteriami. W badaniach
wstępnych stosowane są:

−

dwa płynne podłoża namnażające: podłoże z czterotionianem sodu według Kauffmana
oraz podłoże z kwaśnym selenitem sodu (podłoże SF);

−

podłoża stałe wybiórczo-różnicujące: podłoże Mac Conkeya i podłoże „SS”.
W wymienionych badaniach należy posiać duże ilości badanego materiału (25g) w celu

zwiększenia możliwości wykrycia bakterii rodzaju Salmonella i Shiggella, ponieważ nie mają
one warunków do rozwoju w produktach spożywczych.
Podłoże z czterotionianem sodu według Kauffmana

−

Bulion o pH 7,4÷7,6

- 900,0 cm

−

Węglan wapnia

- 45,0 g

−

Jod w roztworze wodnym jodku potasu

- 20,0 cm

−

Tiosiarczan sodu (Na

· 5H

- 100,0 cm

−

Zieleń brylantowa, roztwór 0.1%

- 10,0 cm

−

Żółć bydlęca

- 50,0 cm

Przygotowanie składników:

1. Węglan wapnia wyjałowić w kolbie poj. 2dm

w suszarce w temp. 160ºC w ciągu 60 min.

2. W 100 cm

wody destylowanej rozpuścić 25g jodku potasu, a następnie 20g jodu.

3. 50 g tiosiarczanu sodu rozpuścić w 100cm

wody destylowanej i wyjałowić w autoklawie

w temp.120ºC w ciągu 15 min.

4. Żółć bydlęcą przesączyć przez watę i wyjaławiać w autoklawie w temp.120ºC w ciągu

30 min.
Przygotowanie podłoża

Do kolby z węglanem wapnia dodać w sposób jałowy bulion, roztwór jodu, tiosiarczan sodu,
żółć i zieleń brylantową, dokładnie wymieszać i rozlać do kolb po 200 cm

. Wyjaławiać

dwukrotnie w parze bieżącej przez 20 minut.

Oczyszczanie ścieków

Ścieki są to odpływy powstające przy wykorzystywaniu wody w gospodarstwach

domowych,  dla  celów  sanitarnych  i  przemysłowych,  zawierające  składniki  charakterystyczne
dla środowiska, w którym użyto wodę. Rozróżnia się ścieki domowe lub bytowo-gospodarcze,
wody  opadowe,  ścieki  poprodukcyjne,  ścieki  miejskie.  Charakter  i  skład  ścieków
przemysłowych jest różny i zmienny, zależny od rodzaju przemysłu, użytych surowców, metod
produkcji.  Na  ogół  we  wszystkich  ściekach  zawierających  substancje  organiczne  znajdują  się
bakterie  i  inne  drobnoustroje.  Liczba  bakterii  w  ściekach  zależy  od  wielu  czynników  np.  od
rodzaju  i  stężenia  ścieków, pH, stanu świeżości, temperatury itd. Jest ona zmienna i może się
wahać od kilkuset do wielu milionów komórek w 1 dm

ścieków.

Zdolność do samooczyszczania się wód naturalnego odbiornika ścieków jest ograniczona.

Nie  chcąc  doprowadzić  przez  przeciążenie  odbiornika  ściekami  do  zniszczenia  jego  wartości
użytkowych  należy  zawsze  rozważyć  i  ustalić, czy dana  ilość  ścieków  mieści  się  w  granicach
dopuszczalnych  procesami  samooczyszczania  się,  Granice  te  ustalają  odpowiednie  przepisy
prawne.  Biorąc  pod  uwagę  specyficzne  właściwości  ścieków  oraz  obowiązujące  przepisy,
w większości  przypadków  ścieki  miejskie  i  przemysłowe  wymagają  oczyszczenia  przed
odprowadzeniem ich do naturalnych odbiorników. Wybór metody oczyszczania ścieków zależy
od wielkości odbiornika oraz jakości i ilości ścieków. Metody mechaniczne pozwalają usunąć
ze  ścieków  substancje  pływające  zawieszone.  Metodami  fizyko-chemicznymi  usuwa  się  ze
ścieków  substancje  koloidalne    i  zawiesinę  nie  opadającą.  W  metodach  biologicznych

„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego”

drobnoustroje głównie bakterie rozkładają zawarte w ściekach substancje organiczne
rozpuszczone, koloidalne lub występujące w postaci drobnej zawiesiny. Całość procesów
oczyszczania rozdzielono umownie na 4 fazy zwane stopniami oczyszczania:

−

oczyszczanie I stopnia – wstępne (najczęściej fizyczne),

−

oczyszczanie II stopnia – biologiczne,

−

oczyszczanie III stopnia – doczyszczanie ścieków z usuwaniem substancji biogennych,

−

oczyszczanie IV stopnia – odnowa wody.
Oczyszczanie I stopnia oczyszczania mogą być niekiedy poprzedzane dodatkowym

napowietrzaniem  w  odrębnych  komorach  przed  osadnikami  wstępnymi.  W  ramach
oczyszczania  I  stopnia  stosuje  się  proste  operacje  mechaniczne  i  procesy  fizyczne:  cedzenie,
sedymentacja, filtrowanie, przez które zmierza się do wydzielania większych ciał pływających i
wleczonych  (skratki),  cząstek  ziarnistych  o  umownym  zakresie  0,1  mm  i  większych  (piasek),
zawiesin łatwo opadających (osady wstępne), olejów i tłuszczów podatnych na wydzielanie.

Oczyszczanie biologiczne przeprowadza się z reguły przy udziale przystosowanej do tego

biocenozy. Zanieczyszczenia te służą mikroorganizmom jako pokarm i jako budulec nowych
komórek. Dzięki tym procesom życiowym następuje rozkład, utlenianie i ubytek zawartych

w ściekach zanieczyszczeń – w tym zwłaszcza organicznych. Oczyszczone biologicznie

ścieki  są  mniej  podatne  na  zagniwanie,  a  tym  samym  w  mniejszym  stopniu  naruszają
równowagę  tlenową  wód  płynących.  Podstawową  miarą  efektywności  pracy  oczyszczalni
II stopnia jest zdolność obniżania ładunku zanieczyszczeń organicznych podatnych na rozkład i
wyrażonych  przez  ubytek  BZT

. Umownie wyróżnia się niepełne biologiczne oczyszczanie,

gdy osiąga się 85% obniżenia BZT (biochemiczne zapotrzebowanie tlenu) i pełne, gdy osiąga
się efektywność powyżej 85% (zwykle 95%), a stężenie zawiesin nie przekracza 30 mg/dm

Dodatkowymi  miernikami  II  stopnia  oczyszczania są ubytki CHZT bakterii, a także usuwanie
zanieczyszczeń  biogennych.  Najbardziej  rozpowszechniły  się  dwie  formy  oczyszczania
biologicznego:

−

z biocenozą osiadłą – złoża biologiczne,

−

z biocenozą pływającą – komory z osadem czynnym.

Mikroflora powietrza

Wyniki badań mikrobiologicznych wykazały, że powietrze zawiera różne ilości

drobnoustrojów.  Mikroflora  powietrza  jest  reprezentowana  przez  różne  gatunki  bakterii
i grzybów. Spotyka się bakterie dające kolonie różnej barwy (białe, żółte, pomarańczowe), jak
np.  ziarniaki  –  Micrococcus,  pakietowce  –  Sarcina,  pałeczki  z  rodzaju  Achromobacter,
laseczki,  jak  np.  Bacillus  subtilis  i  inne.  Spośród  drożdży  spotyka  się  gatunki  z  rodzaju
Torulopsis i Rhodotorula. Występują też pleśnie z rodzaju Aspergillus, Penicillum, Rhizopus,
Mucor,  Cladosporium,  Dematitum  i  wielw  innych.  Wśród  mikroflory  powietrza  mogą
znajdować  się  różne  zarazki  groźnych  chorób  zakaźnych  dostających  się  do  powietrza
z kurzem  lub  rozsiewane  przez  chorych.  Jedną  z  podstaw  oceny  sanitarno-higienicznej
zakładów  spożywczych  jest  stan  ilościowy i  jakościowy mikroflory  powietrza. Drobnoustroje
dostają  się  z  opadającym  pyłem  na  produkty  spożywcze,  surowce  roślinne  lub  zwierzęce  –
zakażają  je  w  stanie  surowym  lub  w  czasie  produkcji.  Produkty  spożywcze  oraz  surowce
służące  do  ich  wytwarzania  są  dobrym  podłożem  do  rozwoju  drobnoustrojów.  Powodują
psucie  się  zarówno  surowców,  jak  i  półproduktów  oraz  gotowych  wyrobów  spożywczych
odpowiednio  nie  zabezpieczonych.  Pył  opada  również  na  przedmioty,  z  którymi  styka  się
gotowy  produkt  lub  surowiec.  Dlatego  utrzymanie  powietrza  w  stanie  optymalnej  czystości
mikrobiologicznej  ma  specjalnie  duże  znaczenie  we  wszystkich  zakładach  przemysłu
spożywczego  wytwarzających  artykuły  żywnościowe  dla  człowieka,  jak  również  produkty
paszowe dla zwierząt.

„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego”

Do oczyszczania powietrza stosowane są specjalne filtry, przez które przepuszczane jest

powietrze. Zatrzymują one całkowicie pyły znajdujące się w powietrzu łącznie
z drobnoustrojami. Stosuje się także odkażanie powietrza promieniami ultrafioletowymi,
emitowanymi przez różne lampy rtęciowe.

4.2.2. Pytania sprawdzające

Odpowiadając na pytania, sprawdzisz, czy jesteś przygotowany do wykonania ćwiczeń.

1.  Na czym polega próba reduktazowa oznaczania ogólnej liczby drobnoustrojów?
2.  Jak oznaczyć ogólną liczbę drobnoustrojów hodowlaną metodą płytkową?
3.  W jaki sposób dokonać rozcieńczenia badanych środowisk?
4.  Jak wykonać posiew na płytkę Petriego?
5.  Jak oznaczyć miano coli?
6.  Jak zinterpretować wynik otrzymany przy oznaczaniu miana coli?

4.2.3. Ćwiczenia

Ćwiczenie 1

Oznacz ogólną liczbę drobnoustrojów tlenowych w mięsie.

Sposób wykonania ćwiczenia

Aby wykonać ćwiczenie powinieneś:

1) przygotować szablony do badania stopnia zakażenia powierzchni,
2) wyciąć z blachy do wyrobu puszek okienko w kształcie kwadratu, prostokąta lub koła

o powierzchni 25 cm

3) pozostawić obramowanie dookoła okienka o szerokości 2 cm z rączką do trzymania

szablonu,

4) opiłować brzegi szablonu, wyjałowić przed użyciem w autoklawie w temperaturze nie

niższej niż 117°C przez 15 minut,

5) przyłożyć szablon do powierzchni badanej próbki,
6) uchwycić pincetą wyjałowiony tampon z gazy wielkości ok. 2 cm

7)  zanurzyć tampon w jałowym płynie do rozcieńczeń,
8)  wycisnąć płyn z tamponu przez przyciśnięcie go do wewnętrznej powierzchni kolby,
9)  wykonać  tamponem  dokładny  wymaz  z  całej  powierzchni  próbki  znajdującej  się

w okienku szablonu,

10)  przenieść tampon do kolby i wstrząsać ok. 1000 razy,
11)  wypłukać tampon, sporządzić rozcieńczenia,
12)  umieścić kolby z agarem odżywczym w łaźni wodnej,
13)  ogrzewać w temperaturze 100°C do całkowitego rozpłynnienia podłoża,
14)  oziębić pożywkę do temperatury ok. 45°C,
15)  przygotować odpowiednia liczbę płytek Petriego,
16)  przeznaczyć po dwie płytki na każde rozcieńczenie,
17)  zaznaczyć dermatografem na płytce rodzaj próbki, datę badania i wielkość rozcieńczenia
18)  przenieść kolejno na płytki po 1 cm

z poszczególnych rozcieńczeń, używając do każdego

rozcieńczenia innej pipety,

19) wykonać po dwa równoległe posiewy z każdego rozcieńczenia,

„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego”

20) zalać posiewy ostudzonym podłożem agarowym, uchylając nieco pokrywkę i wylewając

na płytkę po ok. 10 cm

pożywki,

21)  wymieszać ruchem kołowym płytkę i pozostawić do zastygnięcia,
22)  wstawić płytki do góry dnem do cieplarki o temperaturze 30°C na 72 godziny,
23)  policzyć wyrosłe kolonie po zakończeniu hodowli,
24)  podać liczbę drobnoustrojów na powierzchni 1cm

produktu,

25) dokonać analizy i interpretacji wyników. Na przykład do obliczeń wybrano płytki

z posiewami z rozcieńczenia 1:100. Na jednej z nich wyrosło 43 kolonie, na drugiej – 47.
Średnia liczba kolonii na jednej płytce wynosiła 45. Zatem liczba kolonii na powierzchni 1
cm

produktu była: 45 · 100 = 4500, czyli 4,5 · 10

26) interpretacja wyników. Dokonać analizy uzyskanych wyników, wykorzystując informacje

z biologii i podane w materiale nauczania. Oceń przydatność technologiczną badanego
mięsa.

Wyposażenie stanowiska pracy:

−

taca z próbką,

−

szablon o powierzchni 25cm

−

tampon z gazy,

−

kolba o pojemności 250

300cm

zawierająca 25cm

płynu do rozcieńczeń,

−

pinceta, probówki z 9cm

płynu do rozcieńczeń,

−

pipety poj.1 cm

(10 sztuk),

−

płytki Petriego (10 sztuk),

−

agar odżywczy (ok.100cm

−

cieplarka,

−

normy jakościowe.

Ćwiczenie 2

Oznacz miano coli w wodzie pitnej.

Sposób wykonania ćwiczenia

Aby wykonać ćwiczenie powinieneś:

1)  przetrzeć kran tamponem z waty zwilżonym denaturatem i opalić w płomieniu,
2)  otworzyć kran całkowicie i spuszczać wodę przez 10 minut,
3)  pobrać 150cm

wody do butelki i przystąpić do dokonania posiewu,

4) posiewać do 10 probówek z podwójną pożywką Eijkmana jeśli z wody wodociągowej

korzysta ponad 50 tysięcy mieszkańców,

5) posiewać do 5 probówek z podwójną pożywką Eijkmana jeśli z wodociągu korzysta mniej

niż 50 tysięcy mieszkańców,

6) umieścić statyw z probówkami w liczbie 5 lub 10, do których posiano po 10 cm

badanej

wody w cieplarce temperaturze 37ºC na 48 godzin,

7) wyjąć statyw z probówkami i obserwować kolejno probówki na obecność gazu w rurkach

Durhama,

8) zinterpretować wyniki. Jeżeli nie stwierdza się obecności gazu (powyżej 10% objętości

rurki) w żadnej z probówek oznacza to, że miano coli jest niższe od 50 lub 100, co
jednocześnie dyskwalifikuje badaną wodę jako przydatną do spożycia.

„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego”

Wyposażenie stanowiska pracy:

−

pożywka Eijkmana (podwójna) w probówkach z rurkami Durhama,

−

jałowe szkło: butelka o pojemności 200 cm

−

pipeta o pojemności 10 cm

−

statyw do probówek,

−

wata,

−

denaturat,

−

cieplarka.

Ćwiczenie 3

Oznacz obecność pałeczek Salmonella w mięsie.

Sposób wykonania ćwiczenia

Aby wykonać ćwiczenie powinieneś:

1)  przygotować próbkę mięsa podejrzanego o zakażenie pierwotne,
2)  opalić próbkę w płomieniu palnika i rozciąć jałowym nożem,
3)  pobrać materiał z głębi próbki,
4)  rozdrobnić  próbkę  za  pomocą  noża,  albo maszynki  do  mięsa,  z  zachowaniem  warunków

jałowości,

5) wprowadzić próbkę wielkości 25g pincetą do kolbki z podłożem czterotionianu sodu

według Kauffmana,

6)  zanurzyć lub wymieszać z podłożem,
7)  inkubować posiewy w temperaturze 37ºC przez trzy dni, wstrząsając co 24 godziny,
8)  dokonać obserwacji,
9)  zinterpretować  wyniki.  Posiew  do  podłoża  z  czterotionianem  sodu  jest  namnażaniem

selektywnym. Wzrost wskazuje na prawdopodobieństwo zakażenia mięsa bakteriami
z grupy Salmonella.

Wyposażenie stanowiska pracy:

−

taca z próbką mięsa,

−

nóż,

−

maszynka do mięsa,

−

pinceta,

−

palnik,

−

kolbka z 200 cm

podłoża z czterotionianem sodu.

Ćwiczenie 4

Porównaj mikrobiologiczne metody oczyszczania ścieków w zakładach przetwórstwa

spożywczego.

Sposób wykonania ćwiczenia

Aby wykonać ćwiczenie powinieneś:

1) pobrać próbki ścieków z zakładu przemysłu spożywczego,
2) porównać stan ogólny wód ściekowych z wymaganiami i warunkami dotyczącymi

odprowadzanych wód ściekowych (wykorzystać normy),

3) wskazać mikroorganizmy wykorzystywane do oczyszczania ścieków,

„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego”

4) porównać

metody

mikrobiologicznego

oczyszczania

ścieków

metodami

fizykochemicznymi,

5) zinterpretować przepisy dotyczące oczyszczania ścieków.

Wyposażenie stanowiska pracy:

–

próbki ścieków z zakładów przemysłowych.

–

tekst dotyczący biologicznych i fizykochemicznych metod oczyszczania ścieków,

–

normy dla wód ściekowych.

Ćwiczenie 5

Oznacz stopień zakażenia powietrza w zakładzie przetwórstwa spożywczego.

Sposób wykonania ćwiczenia

Aby wykonać ćwiczenie powinieneś:

1)  przygotować dwie płytki Petriego z agarem odżywczym,
2)  ustawić otwarte płytki w hali produkcyjnej zakładu przetwórczego na 5÷15 minut,
3)  zamknąć płytki zaznaczając na wieczku miejsce pobrania próby i czas trwania posiewu,
4)  wstawić płytki z posiewem (dnem do góry), do termostatu o stałej temperaturze 37°C na

48 godzin,

5) po okresie inkubacji wyjąć płytki z termostatu,
6) obliczać wyrosłe kolonie przy zamkniętych płytkach. Zakładając, że każda kolonia

rozwinęła się z pojedynczej komórki obliczyć liczbę drobnoustrojów x znajdujących się w
10dm

powietrza według wzoru:

⋅

100

gdzie:
a – średnia arytmetyczna z liczby kolonii wyrosłych na dwóch płytkach z tym samym
podłożem,
b – powierzchnia płytki w cm

(dla płytki o średnicy 10 cm powierzchnia wynosi 78,5 cm

k – współczynnik czasu ekspozycji płytki, dla 5 minut k=1; dla 10 minut k=2; dla 15 minut
k=3,
100 – przeliczenie płytki na 100 cm

100 – przeliczenie płytki na 100 dm

Powietrze można uznać za bardzo czyste jeśli liczba drobnoustrojów w 10dm

nie jest większa

niż 10. Zakażenie przekraczające 100 uważa się za bardzo duże.
7) zinterpretować wyniki.

Wyposażenie stanowiska pracy:

−

płytki Petriego,

−

agar,

−

woda destylowana,

−

termostat.

„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego”

4.2.4 Sprawdzian postępów

Czy potrafisz:

Tak

Nie

1) zdefiniować pojęcia metoda reduktazowa, miano coli, metoda

płytkowa?

2) dokonać

rozcieńczeń

badanego

produktu

badań

mokrobiologicznych?

3)  oznaczyć miano coli?
4)  policzyć wyrośnięte kolonie na płytkach Petriego i zinterpretować wynik?
5)  ustalić  kolejność  postępowania  przy  barwieniu  preparatów  metodą

Grama?

6) określić techniki mikroskopowania oraz zasady przygotowywania

preparatów?



„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego”

5. SPRAWDZIAN OSIĄGNIĘĆ

INSTRUKCJA DLA UCZNIA

1.  Przeczytaj uważnie instrukcję.
2.  Podpisz imieniem i nazwiskiem kartę odpowiedzi.
3.  Zapoznaj się z zestawem zadań testowych.
4.  Test zawiera 20 zadań dotyczących mikrobiologicznych badań żywności.
5.  Udzielaj odpowiedzi tylko na załączonej karcie odpowiedzi.
6.  Pracuj samodzielnie, bo tylko wtedy będziesz miał satysfakcję z wykonanego zadania.
7.  Kiedy udzielenie odpowiedzi będzie Ci sprawiało trudność, wtedy odłóż jego rozwiązanie

na później i wróć do niego, gdy zostanie Ci wolny czas.

8. Trudności mogą przysporzyć Ci zadania: 15-20, gdyż są one na poziomie trudniejszym niż

pozostałe.

9. Na rozwiązanie testu masz 45 min.

ZESTAW ZADAŃ TESTOWYCH

1. Próbki do badań mikrobiologicznych można przechowywać w temperaturach:

a)  0÷20°C.
b)  0÷15°C.
c)  0÷10°C.
d)  0÷5°C.

2. Pożywki hodowlane to roztwory wodne substancji odżywczych do:

a)  badań wybiórczych.
b)  utrwalania preparatów mikroskopowych.
c)  hodowli drobnoustrojów.
d)  barwienia preparatów.

3. Naczynia zawierające hodowle drobnoustrojów moczy się w 10% roztworze:

a) H

lub 2% roztworze lizolu.

b)  HCl lub 3% roztworze lizolu.
c)  NaOH lub 1% roztworze lizolu.
d)  H

lub 4% roztworze lizolu.

4. Bakterie coli to mikroorganizmy bytujące w wodzie zanieczyszczonej

a)  pestycydami.
b)  siarczanami.
c)  odchodami.
d)  azotanami.

5. Brzeczka jest pożywką, której sucha masa zawiera:

a)  chlorek sodu, dekstryny, amylazę.
b)  maltozę, dekstryny, sacharozę.
c)  amylazę, laktozę, bulion.
d)  pepton, wyciąg mięsny, wodę destylowaną.

„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego”

6. Do oznaczania ogólnej liczby drobnoustrojów stosuje się metodę:

a)  Grama.
b)  porównawczą.
c)  reduktazową.
d)  rezazurynową.

7. Do badań bakterioskopowych stosuje się preparaty odciskowe barwione metodą

a)  Leifsona.
b)  Grama.
c)  Browna.
d)  Schaeffera-Fultona.

8. Bakterie gnilne wywołują:

a)  rozkład tłuszczów.
b)  redukcję azotynów.
c)  rozkład cukrów.
d)  rozkład białek.

9. Wyciąg mięsny stosowany do podłoży i pożywek otrzymywany jest ze ścięgien i tłuszczu

mięsa:
a)  wieprzowego lub kurzego.
b)  baraniego lub cielęcego.
c)  wołowego lub końskiego.
d)  koziego lub oślego.

10. Płytki Petriego przeznaczone do wyjaławiania umieszcza się w:

a)  puszkach metalowych.
b)  folii aluminiowej.
c)  bibule do sączenia.
d)  szmatce lnianej.

11. Do hodowli drobnoustrojów w metodzie płytkowej używane są:

a)  rurki Durhama.
b)  płytki Petriego.
c)  szkiełka mikroskopowe.
d)  anaerostaty.

12. Do oznaczania laseczek beztlenowych przetrwalnikujących używa się:

a)  podłoża Wrzoska.
b)  agaru wodnego.
c)  podłoża Wilson- Blaira.
d)  wyciągu mięsnego.

13. W rurkach Durhama o obecności drobnoustrojów świadczy zmętnienie i gazy:

a) CO

i H

b) CH

i NH

c) CO

i O

d) CO i NH

„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego”

14. Pałeczki odmieńca mają właściwości:

a)  fermentacyjne.
b)  gnilne.
c)  rozkładania cukrowców.
d)  porażania mięśni.

15. Pożywki i podłoża stosowane do hodowli drobnoustrojów muszą:

a)  zawierać wszystkie składniki pokarmowe.
b)  wykazywać właściwy odczyn środowiska.
c)  być jałowe i przejrzyste.
d)  spełniać wymienione wyżej warunki.

16. Roztwór fizjologiczny soli zawiera

a)  NaCl i wodę destylowaną.
b)  Laktozę i KCl.
c)  CaCl i wodę destylowaną.
d)  Na

i wodę destylowaną.

17. Jeżeli nie ma wzrostu bakterii coli to miano wynosi:

a)  0,5 lub 5.
b)  0,1 lub1,0.
c)  1,5 lub 15.
d)  2,0 lub 20.

18. Do podłóż o przeznaczeniu ogólnym zalicza się:

a)  bulion mięsny, agar.
b)  podłoże Wrzoska.
c)  podłoże Endo.
d)  fuksynę fenolową.

19. Do oznaczania pałeczek duru i czerwonki stosuje się podłoże:

a)  z czterotionianem sodu.
b)  z kwaśnym seleninem sodu.
c)  Mac Conkeya i „SS”.
d)  wszystkie odpowiedzi są prawdziwe.

20. W skład płynu Lugola wchodzi:

a)  jod i jodek potasu.
b)  alkohol i błękit metylenowy.
c)  chlorek sodu i woda destylowana.
d)  laktoza i wodorotlenek potasu.

„Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego”

KARTA ODPOWIEDZI

Imię i nazwisko..........................................................................................

Wykonywanie mikrobiologicznych badań żywności

Zakreśl poprawną odpowiedź

zadania

Odpowiedź

Punkty

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

Razem: