M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
– studia zaoczne
Ćwiczenie 5
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
Ć
WICZENIE
5: M
YCIE I
D
EZYNFEKCJA
Wstęp
W badaniach mikrobiologicznych ogromny wpływ na uzyskiwane wyniki ma
higiena osobista oraz jałowość pomieszczeń, sprzętu i pożywek, które są wykorzystywane w
pracy. W metodach jałowienia, wykorzystywanych również w medycynie, zakładach
przetwórstwa rolno-spożywczego i w życiu codziennym, zastosowanie mają następujące
procesy:
MYCIE – usuwa wszelkie resztki za danej powierzchni. Jest bardzo ważnym
etapem, gdyż pozostałości białka i tłuszczu osłabiają efekt przeprowadzonego
następnie odkażania.
DEZYNFEKCJA. Terminem tym określa się “proces zabicia wszystkich form
wegetatywnych mikroorganizmów chorobotwórczych i niechorobotwórczych za pomocą
metod fizycznych, chemicznych i mechanicznych”. Proces ten nie zapewnia całkowitej
jałowości, gdyż pozostają aktywne formy przetrwalne bakterii.
STERYLIZACJA. W ujęciu mikrobiologicznym sterylizacja (wyjaławianie) to „proces
polegający na zabiciu wszystkich mikroorganizmów - niezależnie od stadium rozwojowego, a
więc zarówno form wegetatywnych, jak też form przetrwalnych”.
Wyjaławianie przeprowadza się najczęściej przy użyciu metod fizycznych
(temperatura, promieniowanie), mechanicznych (odfiltrowanie, odwirowanie) lub
chemicznych.
1.
M
ETODY FIZYCZNE
1.1.
Z
ASTOSOWANIE WYSOKICH TEMPERATUR
(
NA SUCHO
)
• Wyżarzanie i opalanie. Ezy i igły wyżarza się do czerwoności w
świecącej części płomienia palnika spirytusowego lub gazowego.
Czynność tą wykonuje się przed i po każdym ich użyciu. Wyloty
probówek, kolb i wszelkich naczyń, które są zamykane korkami,
opala się po otworzeniu w płomieniu palnika, co zapobiega
zanieczyszczeniu hodowli. Pincety, skalpele, noże, bagietki,
głaszczki opala się w płomieniu po uprzednim zanurzeniu w
alkoholu.
Rys. 1. Wyżarzanie ezy i opalanie wylotu probówki
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
1
M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
– studia zaoczne
Ćwiczenie 5
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
•
Gorące i suche powietrze o temperaturze 160-180°C wykorzystuje się do
wyjaławiania szkła oraz niektórych związków chemicznych np. węglanu wapnia, związków
oleistych, wosku. Zabieg ten przeprowadza się w suszarkach laboratoryjnych. Ponieważ
szkło nowe lub nieużywane wykazuje odczyn alkaliczny stąd przed sterylizacją i użyciem
należy je wygotować w wodzie z dodatkiem 1% HCl (30 min), wypłukać i ponownie
wygotować w 1% roztworze Na
2
CO
3
(30 minut). Po dokładnym wypłukaniu w wodzie
bieżącej i destylowanej, wysuszeniu, pakuje się je w papier, folię aluminiową lub też
umieszcza się w metalowych puszkach i sterylizuje przez 2 godz. w temperaturze 160°C.
Przed włożeniem do suszarki kolby, probówki i pipety zamyka się korkami. Z uwagi na
możliwość samozapłonu i zwęglenia nie można przekraczać temperatury 180°C podczas
sterylizacji probówek z korkami z waty lub ligniny oraz szkła opakowanego w papier.
Wysokie temperatury obniżają także trwałość szkła laboratoryjnego, a niedokładne
wysuszenie powoduje jego pękanie.
Rys. 2. Tubusy do sterylizacji płytek Petriego
1.2.
Z
ASTOSOWANIE WYSOKICH TEMPERATUR
(
NA MOKRO
)
•
Gotowanie. Szkiełka podstawowe i nakrywkowe gotuje się w roztworze mydła lub
środka myjącego, a następnie dokładnie płucze stosując na koniec wodę destylowaną. Po
umyciu przechowuje się je na sucho w specjalnych pojemnikach, bądź też na mokro w 95%
etanolu. Również metalowe narzędzia po oczyszczeniu można wygotować (20–30 minut) lub
wyjałowić w autoklawie (temperatura 121
0
C, 20 minut).
•
Gorąca bieżąca para wodna. Jest wykorzystywana w procesie pasteryzacji (łagodnej
sterylizacji) w aparacie Kocha (rys. 3.). Jest to lekki, metalowy kocioł parowy z dodatkowym
ażurowym dnem, pod którym znajduje się zbiornik z wodą. Kocioł przykryty jest luźną
pokrywą z otworem na termometr i wylot pary wodnej. W obudowie znajduje się również
wskaźnik poziomu wody. Źródłem wytwarzanej pary jest woda znajdująca się na dnie kotła,
którą doprowadza do wrzenia system grzałek. Czynnikiem wyjawiającym jest bieżąca para
wodna o temperaturze około 100°C. Służy do wyjaławiania pożywek mikrobiologicznych
zawierających termowrażliwe składniki. Wyjaławiany materiał ustawia się na ażurowych
półkach.
•
Pasteryzacja polega na jednokrotnym ogrzaniu wyjaławianego materiału do
temperatury ok. 100°C. W procesie tym giną jedynie formy wegetatywne, natomiast nie
ulegają zniszczeniu formy przetrwalne bakterii, które wytrzymują wielogodzinne gotowanie.
Proces pasteryzacji stosuje się w przypadku podłoży mikrobiologicznych i produktów
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
2
M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
– studia zaoczne
Ćwiczenie 5
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
żywnościowych, których składniki w temperaturach powyżej 100°C mogą ulegać rozkładowi,
a także konserw o pH poniżej 4,5 (mikroorganizmy acidofilne charakteryzuje obniżona
odporność cieplna).
Sterylizacja parowa osiąga pełny efekt jeśli para oddziaływuje na
sterylizowany materiał przez ściśle określony czas. Wszystkie
powierzchnie materiału muszą mieć kontakt z parą.
Ważnym
czynnikiem jest całkowite usunięcie powietrza z komory
autoklawu (stosuje się odpowietrzanie przepływowe, w którym
powietrze jest wypierane ze zbiornika przez nasyconą parę lub
odpowietrzanie próżniowe gdzie powietrze jest usuwane przez
wytworzenie próżni, następnie wprowadzana jest para wodna).
Jest to metoda uniwersalna, pewna, szybka, nietoksyczna i
ekonomiczna. Powinna być stosowana wszędzie tam , gdzie to
możliwe.
Rys. 3. Aparat Kocha
Większość podłoży mikrobiologicznych poddaje się działaniu temperatury w granicach
100°C przez od 15 - 30 minut. Wrażliwe na wysokie temperatury produkty (mleko, śmietanki,
moszcz, soki, piwo i inne) wyjaławia się wykorzystując modyfikacje tego procesu.
Jest to pasteryzacja:
•długotrwała (niska; LTLT – Low Temperature Short Time): temperatura 62 -
65°C / 20 - 30 minut;
•krótkotrwała (wysoka; HTST – High Temperature Short Time); temperatura
72°C / 15 sekund;
•momentalna: temperatura 85 - 90°C / 1 – 2 s.
Z praktycznego punktu widzenia pasteryzacja jest zabiegiem wystarczającym, jeśli następnie
produkt zostanie schłodzony do 2-4°C i hermetycznie zamknięty, co uniemożliwia rozwój
przeżywających ten zabieg mikroorganizmów.
•
Odmianą pasteryzacji jest tyndalizacja (pasteryzacja frakcjonowana). Jest to
trzykrotna pasteryzacja przeprowadzana w odstępach co 24 godziny
. W pierwszej fazie
giną formy wegetatywne. Okres przerwy po pierwszej pasteryzacji pozwala na
wykiełkowanie form przetrwalnych, które nie uległy zabiciu. Druga pasteryzacja zabija formy
wegetatywne, które rozwinęły się z form przetrwalnych, a trzecia upewnia nas o zabiciu
wszystkich drobnoustrojów.
•
Gorąca para wodna pod ciśnieniem.
Aby uzyskać właściwy efekt sterylizacji w
autoklawie
proces musi przebiegać w optymalnej temperaturze, przy odpowiednim ciśnieniu
i przez określony czas.
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
3
M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
– studia zaoczne
Ćwiczenie 5
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
Autoklaw
(rys. 4.) to hermetycznie
zamknięty kocioł stalowy o podwójnych
ścianach i dnie, w którym uzyskuje się
wysokie ciśnienie. Jest zaopatrzony w
manometr, termometr, zawór
bezpieczeństwa i elektryczny system
grzewczy. Czynnikiem jałowiącym w
autoklawie jest przegrzana nasycona para
wodna pod zwiększonym ciśnieniem
. W
aparacie gotująca woda doprowadza do
nadciśnienia parę wodną, która ulega
nasyceniu po zupełnym wyparciu powietrza.
Manometr znajdujący się w obudowie
wskazuje wzrost ciśnienia po zamknięciu
zaworu odpowietrzającego.
Ponieważ autoklaw to kocioł pracujący pod
wysokim ciśnieniem, stąd osoby go
obsługujące muszą przejść odpowiednie
szkolenie.
Rys. 4. Budowa autoklawu (1. Gałka zaworu bezpieczeństwa,2. Manometr komory
sterylizacyjnej,3. Manometr kotła, 4. Zawór trójdrożny manometru, 5. Termometr tarczowy
wskazujący temperaturę w komorze, 6. Rączka zamka pokrywy, 7. Dźwignia zaworu
sterującego, 8. Zawór doprowadzający parę do kotła, 9. Dźwignia zaworu selekcyjnego, 10.
Wskaźnik poziomu wody w komorze, 11. Zawór odpowietrzający komorę, 12. Zawór
odprowadzający kondensat z komory sterylizacyjnej)
Pomiędzy ciśnieniem a temperaturą wewnątrz autoklawu, a także pomiędzy temperaturą a
efektem sterylizacji istnieją ścisłe zależności. Przy nadciśnieniu:
•0,0 atm. temperatura w autoklawie wynosi
100ºC
•0,5 atm. -
111,7° (112°) C
•1,0 atm. -
120,6° (121°) C
•2,0 atm. -
133,9° (134°) C.
Podobne efekty odkażania uzyskuje się dla takich parametrów temperatury i czasu ekspozycji:
121°C przez 2 minuty = 110°C przez 20 minut = 100°C przez 200 minut.
Zatem im wyższe jest ciśnienie wewnątrz kotła tym wyższe są temperatury, a im wyższe
temperatury tym krótszy okres sterylizacji.
Stosując zwiększone ciśnienie, uzyskuje się
zatem możliwość zniszczenia zarówno form wegetatywnych, jak i przetrwalnych.
Czas sterylizacji zależy także od objętości materiału i rodzaju przedmiotów poddawanych
sterylizacji (tab. 1.).
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
4
M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
– studia zaoczne
Ćwiczenie 5
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
Tabela 1. Czas sterylizacji w zależności od objętości materiału
Objętość (cm
3
)
Czas sterylizacji w temperaturze 121°C (min)
10 – 50
200
1000
2000
9000
12 – 14
12 – 15
20 – 25
30 – 35
50 – 55
Ze sterylizacją termiczną związane są dwa terminy:
Czas śmierci cieplnej
- czas potrzebny do zabicia wszystkich drobnoustrojów tego samego
gatunku przy określonej temperaturze i składzie pożywki.
Punkt śmierci cieplnej
- temperatura, która zabija hodowlę bakteryjną w ciągu 10 minut.
Podłoża i produkty nie zawierające składników wrażliwych na wysokie temperatury
sterylizuje się w autoklawie w temp. 121°C przez 15-20 min lub w temperaturze 117°C przez
15-30 minut. Procesowi sterylizacji poddaje się także konserwy o pH powyżej 4,5. Eliminacja
form przetrwalnych zapobiega możliwości pojawienia się form wegetatywnych bakterii, które
w warunkach niskiej kwasowości znajdują odpowiednie warunki do rozwoju.
Niektóre termowrażliwe produkty płynne (np. mleko) poddaje się sterylizacji
błyskawicznej
(UHT – Ultra High Temperature) w systemie przepływowym lub poprzez
wtrysk pary wodnej o temperaturze 135-150°C w czasie od 2 - 9 s. Procedura ta niszczy
formy wegetatywne i przetrwalne w stopniu zapewniającym trwałość handlową produktu
(jeśli zostanie zapakowany w sterylnych warunkach).
Szkło używane, zawierające hodowle drobnoustrojów sterylizuje się w autoklawie w
temperaturze co najmniej 134°C przez okres od 30–90 minut (w zależności od ilości i
objętości sterylizowanego materiału). Po sterylizacji szkło należy opróżnić i umyć w wodzie z
detergentem lub wygotować w roztworze mydła. Po dokładnym wypłukaniu w wodzie
destylowanej sterylizujemy je ponownie w suszarce (160°C / 2 godz.).
1.2. Z
ASTOSOWANIE PROMIENIOWANIA
(UV, X
I GAMMA
)
W praktyce mikrobiologicznej wykorzystuje się najczęściej hamujące lub zabójcze
działanie na mikroorganizmy nadfioletowej części widma słonecznego o długości fali
250-260 nm, a więc tą część widma, która jest najsilniej absorbowana przez kwasy
nukleinowe.
Źródłem promieniowania są lampy kwarcowe, wypełnione oparami rtęci, emitujące w 95%
promieniowanie o długości fali 258 nm. Promieniowanie UV jest wykorzystywane do
niszczenia mikroorganizmów występujących w powietrzu i na odkrytych powierzchniach
zamkniętych pomieszczeń o niewielkim zapyleniu (silosów, magazynów, chłodni, ładowni
statków, laboratoriów, kamer). Ponieważ charakteryzuje się słabą przenikliwością – nie
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
5
M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
– studia zaoczne
Ćwiczenie 5
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
przenika przez zwykłe szkło, stąd promieniowanie UV nie jest wykorzystywane do
wyjaławiania szkła i podłoży agarowych w szklanych naczyniach
.
Efekt biobójczy
promieniowania zależy między innymi od objętości napromienianego
powietrza, wielkości powierzchni, odległości i ustawienia lamp UV. Czas emisji
promieniowania nie powinien być krótszy niż 30 min, odległość lampy od sterylizowanej
powierzchni nie może przekraczać 3 m, a lampy winny być ustawione prostopadle do
powierzchni.
Do sterylizacji sprzętu medycznego jednorazowego użytku, surowców i preparatów
farmaceutycznych oraz utrwalania produktów spożywczych (świeżych i suszonych owoców i
warzyw, mięsa drobiowego, ryb, przypraw i ziół, a zwłaszcza do niszczenia
mikroorganizmów w zamkniętych pojemnikach, np. w konserwach) wykorzystuje się
niekiedy promieniowanie jonizujące (X, gamma), które charakteryzuje się bardzo dużą
przenikliwością, energią i aktywnością biologiczną. Ponieważ stosowanie dawek
promieniowania pow.10 kGy (radiopasteryzacja, radiosterylizacja) powoduje zmiany
właściwości organoleptycznych, odżywczych i zdrowotnych produktów, stąd do ich
sterylizacji stosuje się dawki promieniowania nie przekraczające tej wartości (raduryzacja,
radycydacja
). Raduryzacja to zmniejszenie ogólnej liczby mikroorganizmów i
zahamowanie rozwoju form przeżywających ten zabieg; radycydacja – zmniejszenie
liczebności populacji mikroorganizmów patogennych (np. Clostridium, Salmonella) i
zahamowanie produkcji toksyn bakteryjnych (np. jadu kiełbasianego przez Clostridium
botulinum
). Stosowanie tych metod jest dozwolone tylko w niektórych krajach UE.
2.
M
ETODY MECHANICZNE
2.1. F
ILTROWANIE
Zabieg ten stosujemy w przypadku. gdy mamy do czynienia z materiałami, które w
podwyższonej temperaturze ulegają zmianom fizycznym i chemicznym. Są to zwykle
pożywki zawierające witaminy, aminokwasy, surowicę, mocznik i termolabilne składniki
dodawane do podłoży. Do wyjaławiania używa się najczęściej filtry membranowe o porach
od 0,20-0,40 (0,75) µm średnicy. Ponieważ pory są mniejsze od wymiarów bakterii,
odfiltrowane drobnoustroje osadzają się na filtrze, a uzyskany filtrat jest jałowy.
Stosowane są:
filtry z ziemi okrzemkowej
filtry ze szkłą spiekanego
filtry azbestowe
filtry membranowe
2.2. W
IROWANIE
Jest zabiegiem dzięki któremu następuje oddzielanie komórek mikroorganizmów od
zawiesiny. Wykonujemy je w wirówkach z regulowanymi obrotami i czasem działania, a
materiał wirowany umieszcza się w specjalnie przygotowanych pojemnikach.
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
6
M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
– studia zaoczne
Ćwiczenie 5
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
3.
M
ETODY CHEMICZNE
Do sterylizacji podłóg, ścian i powierzchni roboczych, linii technologicznych, czy też
maszyn lub ich części stosuje się także (zgodnie z zaleceniami producenta) różne środki
dezynfekcyjne. Różnią się one aktywnością biologiczną i mechanizmami działania.
Aktywność biologiczna środków dezynfekcyjnych zależy od rodzaju związku chemicznego;
gatunku mikroorganizmów, ich wieku i liczebności populacji; czynników środowiskowych -
temperatura, kwasowość podłoża i obecność w nim innych związków chemicznych,
zwłaszcza organicznych
3.1. W
AŻNIEJSZE GRUPY ZWIĄZKÓW
Fenol i pochodne
Czwartorzędowe związki amoniowe
Związki chloru
Związki jodu
Alkohole
Aldehydy
Związki rtęci
Związki srebra
Barwniki
• Czwartorzędowe sole amoniowe
Charakteryzuje je szerokie spektrum działania (bakterie G+ i G-, grzyby pleśniowe,
drożdże, wirusy), długotrwały efekt sterylizacyjny i przyjemny zapach. Ujemną stroną tych
preparatów jest silna presja selekcyjna i możliwość uodpornienia się bakterii G- (np. Proteus
vulgaris
i Serratia marcescens), co wymusza konieczność przemiennego ich stosowania z
preparatami o odmiennych mechanizmach działania (związkami nadtlenowymi,
podchlorynem). Ich aktywność ulega osłabieniu w obecności białka, tłuszczu, mleka i mydła.
Najważniesze to Sterinol (10% bromek benzylododecylo-dwumetyloamoniowy – używany
jako środek dezynfekcyjno-myjący) i Laurosept (25% bromek dwumetylaurylobenzylo-
amoniowy). Obecnie ogranicza się stosowanie tych preparatów ze względu na istnienie wielu
szczepów opornych. Inne preparaty to np. Zephirol, Dezogen, Bradosol, Cetavlon, Asepsol.
Względnie mały zakres działania i właściwości prowadzące do powstawania opornych
szczepów pałeczek gram ujemnych , ograniczają ich stosowanie w szpitalach.
• Związki nadtlenowe
Należą tu m.in. kwas nadoctowy, nadtlenek wodoru, nadsiarczan potasowy.
Najpowszechniej stosowany kwas nadoctowy jest aktywny w stosunku do form
wegetatywnych i przetrwalnych bakterii. Ponieważ związek ten nie wykazuje właściwości
korozyjnych i łatwo ulega rozkładowi na produkty nieszkodliwe (woda, tlen, kwas octowy)
dla produktów spożywczych, może być stosowany do dezynfekcji systemów zamkniętych
(np. w browarnictwie i winiarstwie) bez konieczności przepłukiwania ich wodą. Taka
procedura zapobiega powtórnemu skażeniu systemu, gdy jakość mikrobiologiczna będącej do
dyspozycji wody nie jest najlepsza. Ponadto związek ten może być użyty do sterylizacji
przedmiotów termowrażliwych i dezynfekcji rąk. Związki nadtlenowe (kwas nadoctowy,
nadboran sodu, nadsiarczan potasu) – są wrażliwe na obecność substancji organicznych.
Kwas nadoctowy może działać sporobójczo.
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
7
M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
– studia zaoczne
Ćwiczenie 5
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
• Alkohole (etanol, izopropanol).
Charakteryzuje je szerokie działanie biobójcze (formy wegetatywne bakterii G+ i G-)
uwarunkowane obecnością wody. Z tego też względu działają najsilniej jako 50-70% roztwór
wodny. Aktywność alkoholi wzrasta wraz ze wzrostem liczby molowej i liczby C w łańcuchu,
a maleje w obecności substancji organicznej. Są wykorzystywane do dezynfekcji systemów
zamkniętych bez konieczności płukania wodą, powierzchni roboczych, sprzętu i rąk.
Alkohole etylowy, propylowy, działają bakteriobójczo również na prątki gruźlicy oraz
niektóre wirusy. Mają słabą zdolność ścinania białka i zdolność penetracji dlatego mogą być
stosowane tylko do czystych powierzchni. Stosowane również do dezynfekcji rąk.
• Związki chloru
Najczęściej stosowany jest podchloryn sodowy (NaOCl), którego aktywność zależy od
równowagi w roztworze pomiędzy HClO/OCl
-
. Kwas podchlorawy jest 10-20 razy
możniejszym czynnikiem dezynfekującym niż postać anionowa. Najsilniejsze działanie
wykazują w środowisku kwaśnym.(pH 5.0-6.0). Wykorzystywany jest przy dezynfekcji ścian,
powierzchni chłodni i komór przechowalniczych. W zetknięciu z komórkami drobnoustrojów
wydziela zjonizowany tlen, który denaturuje białka, niszczy błonę plazmatyczną oraz
inaktywuje enzymy z grupami –SH. Działa biobójczo w stosunku do bakterii, drożdży,
grzybów i wirusów.
Oprócz podchlorynu sodowego stosowana jest także chloramina T, najaktywniej działająca w
środowisku o pH 6.0-6.2. Do dezynfekcji rąk stosuje się roztwory 0,5-1%, natomiast do ścian,
sufitów, podłóg czy stołów 5%.
• Jodofory
To
kompleksowe
połączenia jodu z polimerami, biopolimerami lub związkami
powierzchniowo czynnymi spełniającymi rolę nośników. Ich aktywność bójcza polega na
uwalnianiu jodu, który utlenia grupy SH oraz wytwarza kompleksy z białkami błony
cytoplazmatycznej. Maksymalną aktywność wykazują w pH 2.0-4.0. Wykazują szerokie
spektrum działania, niszczą bakterie, grzyby pleśniowe, drożdże i wirusy już przy stężeniach
12-25 ppm. Ze względu na wywoływanie korozji metali oraz przebarwianie tworzyw
sztucznych zastosowanie jodoforów w przemyśle spożywczym i biotechnologicznym jest
ograniczone do dezynfekcji powierzchni nie mających kontaktu z żywnością.
• Aldehydy
Jako środki dezynfekujące wykorzystywane są aldehyd mrówkowy i glutarowy
(aktywny w pH 7.5-8.5, bójczy wobec bakterii, wirusów, grzybów i prątków gruźlicy), jednak
ze względu na toksyczność nie mogą być wykorzystywane do dezynfekcji powierzchni
mających kontakt z żywnością.
Dość powszechnie stosowanym preparatem jest formalina (wodny lub alkoholowy 3-20%
roztwór formaldehydu). Działa na formy wegetatywne i przetrwalne bakterii, grzyby i wirusy.
• Sole metali ciężkich
To przede wszystkim sole srebra. Tworzą one połączenia z grupami SH enzymów i
białek strukturalnych komórki. W aseptyce znajdują zastosowanie azotany, cytryniany i
mleczany srebra.
• Barwniki
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
8
Są stosowane głównie jako łagodne antyseptyki, np. fiolet krystaliczny, zieleń
malachitowa i brylantowa, barwniki akrydynowe. Jako związki zasadowe łatwo przenikają
M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
– studia zaoczne
Ćwiczenie 5
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
przez błony i reagują z kwasami nukleinowymi powodując zahamowanie syntezy DNA i
śmierć komórki.
UWAGA:
Wykorzystanie takich środków dezynfekcyjnych, jak: aldehydy (mrówkowy, glutarowy,
formalina), związki fenolowe i pochodne fenoli (fenol, lizol, kwas karbolowy), związki chloru
(podchloryn sodowy, chloramina T), jodofory (połączenia jodu z polimerami lub SPC),
związki azotu (pochodne biguanidyny kw. glutaminowego i pirydyny), metale ciężkie, jest
bardzo często ograniczone jedynie do dezynfekcji powierzchni roboczych nie mających
kontaktu z żywnością, a w niektórych krajach (zwłaszcza UE) wręcz zakazane. Wynika to z ich
toksyczności (alergie, zakłócenia metabolizmu), wywoływania podrażnień skóry i błon
śluzowych, słabej biodegradacji, długotrwałego przykrego zapachu, działania korozyjnego,
wysokiej presji selekcyjnej i możliwości wykształcenia się form odpornych, uwarunkowania
ich aktywności od czynników środowiskowych.
Preparaty dezynfekcyjne stosowane w zakładach przemysłu spożywczego i w
procesach biotechnologicznych muszą być pozytywnie zaopiniowane przez Państwowy Zakład
Higieny, a preparaty aseptyczne mieć certyfikat MZiOS.
4. M
ECHANIZM
DZIAŁANIA
Mechanizm działania związany jest w pierwszym rzędzie ze strukturą chemiczną
i właściwościami substancji biologicznie czynnej związku. W zależności od tych czynników,
a także od stężenia efektem może być zahamowanie wzrostu i rozwoju mikroorganizmów
(działanie statyczne) lub w następstwie oddziaływania na zasadnicze struktury lub szlaki
metaboliczne ich zabicie (działanie biobójcze). Polegać ono może na: uszkadzaniu lub
zmianie przepuszczalności ściany komórkowej i błony cytoplazmatycznej oraz wypływie do
środowiska zewnętrznego składników komórki; utlenianiu struktur komórkowych i
zakłóceniu procesów metabolicznych mikroorganizmów; tworzeniu kompleksów z białkami -
blokowaniu grup funkcyjnych (-NH2, -SH, -COOH); dezaktywacji enzymów; spowodowaniu
koagulacji cytoplazmy i denaturacji białek (cytoplazmatycznych, enzymatycznych, kwasów
nukleinowych).
Metody
Czynnik
Sposób działania
działanie wysoką
temperaturą
denaturacja białek i kwasów nukleinowych, rozerwanie wiązań
wodorowych
"suche gorąco" denaturacja
białek i kwasów nukleinowych
promieniowanie
UV
tworzenie się dimerów tyminowych w DNA, działanie mutagenne
fizyczne
promieniowanie
jonizujące (gamma)
jonizacja cząsteczek wody
tlenek etylenu
reaguje z grupami –NH
2
, -SH, -COOH i -OH białek, oraz z DNA i z
RNA.
alkohole denaturacja
białek, rozpuszczanie lipidów
aldehydy alkilacja,
reagują z grupami –NH
2
, -SH, -COOH
chlorowce
w reakcji z wodą tworzą kwas podchlorawy, wydziela się
zjonizowany tlen, który denaturuje białka, niszczy błonę
cytoplazmatyczną i inaktywuje enzymy z grupami -SH
chemiczne
fenole denaturacja
białek, rozrywanie błon komórkowych
mechaniczne
filtr z porach o
średnicy 0,22
mikrometrów
bakterie osadzają się na filtrze
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
9
M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
– studia zaoczne
Ćwiczenie 5
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
5. O
KREŚLANIE SIŁY DZIAŁANIA ŚRODKÓW DEZYNFEKCYJNYCH
Siła działania preparatów zależy od wielu czynników, dlatego opracowano metody oceny ich
działania. W myśl przepisów przeprowadzenie właściwej oceny badanego preparatu wymaga
określenia jego:
działania bakteriostatycznego,
działania bakteriobójczego,
stężenia użytkowego.
Przy oznaczaniu przeciwbakteryjnego działania preparatów używane są szczepy: Staphylococcus
aureus NCTC
1
4163, Escherichia coli NCTC 8196, Proteus vulgaris NCTC 4635 i Pseudomonas
aeruginosa NCTC 6749. Działanie przeciwgrzybicze ocenia się używając szczepów Trichophyton
gypseum, Microsporum gypseum i Candida albicans. Do oceny antywirusowej nie ustalono dotąd
szczepów wzorcowych, najczęściej stosuje się Poliomyelitis typ 1, 2 i 3, wirus VSV, Herpes hominis
typ 1 i 2, adenowirusy typ 12 i 14 oraz wirus Vaccini (ospy krowiej).
5.1. O
KREŚLANIE DZIAŁANIA BAKTERIOSTATYCZNEGO
Celem jest ustalenie najmniejszego stężenia związku lub preparatu hamującego wzrost
bakterii. Wartość tę nazywamy MIC (minimal inhibitory concentration).
W celu oznaczenia działania bakteriostatycznego preparatu, z roztworu wyjściowego przygotowuje się
szereg rozcieńczeń w dowolnym stosunku (np. 1:10, 1:15, 1:20, 1:25 itd.). Roztwory przygotowuje się
w jałowej wodzie destylowanej. Następnie do szeregu probówek zawierających po 9 ml podłoża
bulionowego przenosi się po 1 ml każdego rozcieńczenia (rys. 5.) i po 0,05 ml odpowiednio
rozcieńczonej 24-godziennej hodowli bulionowej szczepu wzorcowego. Hodowle inkubuje się w 37ºC
przez 72 h.
Probówkę zawierającą największe rozcieńczenie preparatu, w której nie wystąpił wzrost, przyjmuje
się za graniczną, a stężenie środka za najmniejsze hamujące wzrost dla danego stosunku rozcieńczeń.
Można następnie tę wartość uściślić wykonując kolejny szereg rozcieńczeń (np. 1:10, 1:11, 1:12, 1:13
itd.). Jeśli preparat powoduje zmętnienie bulionu i uniemożliwia ocenę wizualną, należy wysiać ezą z
każdej probówki na podłoże stałe i ocenę po 48-godzinnej inkubacji w 37ºC.
Rys. 5. Wyznaczanie wartości MIC metodą
zawiesinową
1
NCTC = The National Collection of Type Cultures
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
10
M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
– studia zaoczne
Ćwiczenie 5
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
5.2. O
KREŚLANIE DZIAŁANIA BAKTERIOBÓJCZEGO
Polega na ustaleniu najmniejszego stężenia preparatu lub związku dezynfekującego
działającego bakteriobójczo. Najmniejsze stężenie bakteriobójcze oznacza się jako MBC
(minimal bactericidal concentration). Wartość MBC ustala się po określeniu MIC. W
badaniach używa się 2 z 4 szczepów wzorcowych, dla których wartości MIC były największe.
Oceniając wartości MBC dla badanego preparatu, zawsze porównuje się je z wartościami
MBC dla preparatu standardowego (dla tych samych szczepów), i tak dla pochodnych
fenolowych jest to fenol, dla związków chloru – podchloryn sodowy i chloramina o znanym
stężeniu. Do badania używa się 24-godzinnej hodowli szczepów standardowych w podłożu
bulionowym.
Z preparatu wzorcowego (o znanej zawartości związku czynnego) oraz z preparatu
badanego sporządza się szereg rozcieńczeń. Probówki z rozcieńczeniami wzorca oraz
badanego środka dezynfekującego (po 5 ml) oraz probówki z hodowlami bulionowymi
mikroorganizmu umieszcza się w łaźni wodnej o temperaturze 20ºC. Po upływie 15 minut do
pierwszej probówki z wzorcem lub badanym środkiem dodaje się 0,5 ml hodowli bulionowej,
miesza przez wirowanie i dokładnie po 30 sekundach dokonuje się posiewu do drugiej, a
następnie w odstępach 30 sekundowych do kolejnych probówek. Po upływie 5 minut od
posiania I probówki wstrząsa się jej zawartością i posiewa 1 oczko ezy do probówki
zawierającej 5 ml jałowego bulionu (z odpowiednim inaktywatorem). W 30-sekundowych
odstępach analogicznie wykonuje się następne posiewy. Całą serię posiewów powtarza się po
10 i 15 minutach. Probówki z posiewami umieszcza się w cieplarce o temp. 37ºC i inkubuje
48 h. Odczyt wyników polega na wizualnej ocenie wzrostu bakterii w podłożu (+) lub
stwierdzeniu braku wzrostu (-). Przykład zestawienia wyników podano w tabeli 2.
Tabela 2. Zapis wyników przy określaniu MBC
Czas działania [min]
Środek
dezynfekcyjny
Stężenie środka dezynf.
[mg lub %]
5
10
15
związek wzorcowy
5
10
15
20
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
związek badany
5
10
15
20
25
30
35
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
-
-
-
+
+
-
-
-
-
-
Wyniki uzyskane przy oznaczaniu wartości MBC dla preparatu wzorcowego i badanego pozwalają
obliczyć tzw. współczynnik aktywności, za pomocą którego można obliczyć, ile razy badany preparat
jest słabszy lub silniejszy od środka przyjętego jako wzorcowy.
Obliczając ten współczynnik dzieli się najmniejsze stężenie preparatu wzorcowego nie niszczące
bakterii w czasie 5 minut, ale zabijające drobnoustroje w czasie 10 min, przez najmniejsze stężenie
preparatu badanego o takim samym działaniu. Dla danych z tabeli współczynnik będzie wynosił:
6
,
0
25
15
.
.
=
=
adanego
preparatub
wspól
zorcowego
preparatuw
wspól
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
11
M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
– studia zaoczne
Ćwiczenie 5
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
Otrzymana wartość 0,6 oznacza, że badany środek dezynfekcyjny ma aktywność równą 60%
aktywności preparatu wzorcowego, czyli działa o 40% słabiej. Jeśli wartość wyliczonego
współczynnika byłaby >1, tzn. że badany preparat działa tylokrotnie silniej od preparatu wzorcowego.
5.3. U
STALANIE STĘŻENIA UŻYTKOWEGO
Najczęściej stosowana jest metoda nośnikowa, w której używa się cylinderków
(metalowych, szklanych lub porcelanowych), stosowanych także do oznaczania mocy
antybiotyków. Cylinderki zanurza się w 0,1% roztworze asparaginy i wyjaławia przez 20
minut. Na powstałej błonce asparaginy łatwo przyczepiają się drobnoustroje. 20 takich
jałowych, ostudzonych cylinderków przenosi się do 20 ml 48-godzinnych hodowli
bulionowych odpowiednich szczepów. Po 15 minutach jałowo przenosi się je na szalki
Petriego wyłożone krążkami jałowej bibuły filtracyjnej i umieszcza całość w cieplarce na
37ºC na 45 minut w celu osuszenia. Następnie po jednym cylinderku przekłada się do
probówek z 10 ml danego rozcieńczenia badanego środka dezynfekcyjnego. Działanie
każdego rozcieńczenia powinno być badane przy użyciu 10 cylinderków. Po upływie 10
minut cylinderki przenosi się do osobnych probówek zawierających podłoże bulionowe ze
środkiem unieczynniającym i inkubuje się 48 h w 47ºC. Największe rozcieńczenie środka, w
którym w żadnej z 10 probówek nie wystąpi wzrost, stanowi stężenie użytkowe, to jest takie,
które użyte w praktyce spowoduje zniszczenie drobnoustrojów. Jeśli uzyskuje się wyniki
odmienne dla różnych szczepów, za stężenie użytkowe przyjmuje się największe
rozcieńczenie działające jeszcze bakteriobójczo na najbardziej oporny szczep użyty do
badania. Oprócz tej próby laboratoryjnej, zwykle przeprowadza się jeszcze badania w
warunkach, w których ma być wykonana dezynfekcja.
5.4. O
CENA SKUTECZNOŚCI PROCESÓW WYJAŁAWIANIA
:
W celu sprawdzenia skuteczności procesów wyjaławiania stosuje się kilka metod:
Do procesów wyjaławiania termicznego wykorzystuje się głównie metody
fizykochemiczne
. Polegają one na określeniu stopienia się czystej substancji
chemicznej umieszczonej w kapilarze (w komorze autoklawu) bądź na użyciu
substancji chemicznych zmieniających zabarwienie po osiągnięciu odpowiedniej
temperatury w danym procesie wyjaławiania (rys. 6.).
Rys. 6. Taśma impregnowana z napisem AUTOCLAVED
pojawiającym się po 15 minutach ekspozycji na temperaturę
121ºC w parze wodnej w autoklawie.
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
12
M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
– studia zaoczne
Ćwiczenie 5
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
Metody biologiczne polegają na użyciu próbek odpowiednio przygotowanych
przetrwalników drobnoustrojów z rodzaju Bacillus lub Clostridium. Probówki
zawierające przetrwalniki sterylizuje się razem z innymi produktami poddanymi temu
procesowi. Po zakończeniu sterylizacji przetrwalniki zalewa się pożywką bulionową i
hoduje w termostacie. Wzrost bakterii na pożywce dowodzi nieprawidłowości procesu
wyjaławiania. Handlowo dostępne są testy Sporal A i Sporal S. Pierwszy zawiera
przetrwalniki Bacillus stearothermophilus w papierowych torebkach, służy do kontroli
procesu wyjaławiania w gorącej parze wodnej pod ciśnieniem. Sporal A ulega
wyjałowieniu tylko wtedy gdy temperatura autoklawu wynosi minimum 121ºC przez
20 minut. Sporal S służy do kontroli suchego wyjaławiania, wymaga by temperatura
suszarki utrzymywała się przez 2 h na poziomie 160ºC lub odpowiednio 2,5 h –
150ºC, 3 h – 140ºC.
Metoda posiewu – polega na wysianiu próbki sterylizowanych produktów na
pożywki, brak wzrostu w ciągu określonego czasu świadczy o jałowości badanych
prób.
Metoda termostatowa – polega na umieszczeniu wyjałowionych produktów w temp.
37ºC przez 1-10 dni, ujemny wynik próby (brak wzrostu) potwierdza prawidłowość
procesu wyjaławiania
Kontrola przepuszczalności filtrów – podczas mycia i innych czynności porowata
struktura filtra może ulec uszkodzeniu, powodując że filtr przestaje zatrzymywać
drobnoustroje. Kontrola polega na przesączeniu przez badany filtr odpowiednio
rozcieńczonej zawiesiny hodowli bulionowej małej pałeczki Serratia marcescens.
Jałowość przesączu świadczy o zatrzymaniu komórek przez filtr.
6. Ź
RÓDŁA ZAKAŻEŃ W PRZEMYŚLE SPOŻYWCZYM
Zakażenia pierwotne – pochodzące spoza zakładu przemysłowego, przyczynami są;
o surowce
o woda
o powietrze
Zakażenia wtórne – wewnątrzzakładowe, wywołane przez:
o sprzęt technologiczny i aparaturę, przewody, węże, filtry i materiały
filtracyjne, maszyny do rozlewu i formowania, prasy i wagi
o powietrze w pomieszczeniach
o odzież i obuwie pracowników
o brudne ręce pracowników
6.1. K
ONTROLA CZYSTOŚCI W ZAKŁADACH PRZEMYSŁOWYCH
Pracownicy zakładu mogą być źródłem zakażenia na skutek choroby lub nosicielstwa, mogą
też przenosić drobnoustroje chorobotwórcze na swojej odzieży i skórze.Zapobieganie tym
zakażeniom polega na:
przestrzeganiu higieny osobistej personelu
wykonywaniu badań lekarskich przed przyjęciem do pracy (3-krotne badania kału na
nosicielstwo drobnoustrojów jelitowych, RTG klatki piersiowej, odczyn Wasermanna,
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
13
M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
– studia zaoczne
Ćwiczenie 5
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
badania w kierunku schorzeń skórnych, górnych dróg oddechowych i ogólnego stanu
zdrowia)
badania okresowe co pół roku
6.2. H
IGIENA PERSONELU
Elementy codziennej higieny osobistej:
pozostawienie odzieży w szatni, w wydzielonych szafkach i założenie odzieży ochronnej
(fartuch lub kombinezon, nakrycie głowy, obuwie)
zmiana odzieży ochronnej co najmniej co 2-3 dni (lub codziennie) i dostosowanie jej do
charakteru pracy (rodzaj, długość, dokładność zapięcia itp.)
stała troska pracownika o higienę rąk (krótkie paznokcie, dokładne i częste mycie),
używanie środka dezynfekującego, suszarki lub jednorazowych ręczników
używanie gumowych rękawiczek przy niektórych pracach, skaleczeniach lub chorobach
skórnych
unikanie dotykania żywności bezpośrednio dłonią, zasłanianie ust i nosa przy kaszlu i
kichaniu
zdejmowanie fartucha przed wejściem do ubikacji
niepalenie tytoniu w pomieszczeniach produkcyjnych
6.3. H
IGIENA POMIESZCZEŃ PRODUKCYJNYCH
Urządzenia, aparatura i sprzęt powinny być wykonane z materiałów nieszkodliwych
(w kontakcie z żywnością) i łatwych do utrzymania w czystości
Zabiegi mycia i odkażania powinny być traktowane jako jeden z etapów technologii
produkcji (środki, czas, odpowiedzialny i przeszkolony pracownik)
Odpowiedni sprzęt i środki chemiczne do mycia i dezynfekcji
Zapewniona w wystarczającej ilości woda o odpowiednich parametrach
Literatura:
1. Libudzisz Z., Kowal K.: Mikrobiologia techniczna (tom I i II), PŁ, Łódź, 2000
2. Duszkiewicz-Reinhard W., Grzybowski R., Sobczak E.: Teoria i ćwiczenia z
mikrobiologii ogólnej i technicznej, Wydawnictwo SGGW, Warszawa, 1999
3. Kędzia W. Materiały do ćwiczeń z mikrobiologii farmaceutycznej, PZWL, Warszawa
1984
4. Drewniak E., Drewniak T. Mikrobiologia żywności, WSiP, Warszawa 1998.
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
14