background image

Badanie mikrobiologiczne pasz

Wymagania mikrobiologiczne - wg PN 64 791:1994 dla pasz roślinnych 

Bakterie:ogólna licz drobnoustrojów tlenowych mezofilnych-nie więcej niż 3,0 x10

6

/1g

- beztlen laseczki przetrwalnikujące (Clostridium sp.)   - niedopuszczalne w 0,0001 g
- tlenowe laseczki przetrwalnikujące (laseczki wąglika)  - niedopuszczalne w 0,1 g
-gronkowce choro - niedopuszczalne pow. 10

4

/1g  -   Salmonella spp. - nieobecna w 25 g

Drożdże i pleśnie (dopuszczalna li w 1 g): 1.mieszaniki paszowe 2x10

5, 

premiksy 1x 10

5,

 poekstracyjna śruta z roślin 

oleistych 7x10

5

, inne surowce poch roslinnego 2x10

5

Wymagania mikrobiologiczne dla pasz pochodzenia zwierzęcego (obligatoryjne)
Rozporządzenie  Komisji nr 142/2011 z dnia 25 lutego 2011r. – (załącznik XIII, rozdział II) 
I. gryzaki dla psów oraz przetworzona karma 
Salmonella- nieobecna w 25 g/n = 5/c = 0/m = 0/M = 0;  
pałeczki jelitowe (Enterobacteriaceae): n = 5/c = 2 /m = 10/M = 300 jtk/1 g
II. Karma surowa Salmonella – nieobecna w 25 g/n = 5/c = 0/m = 0/M = 0;  
Pałeczki jelitowe (Enterobacteriaceae) n = 5/c = 2/m = 10 jtk/g/M = 5 000 jtk/g
n - ilość próbek, - liczba próbek, w których licz bakterii zawiera się między m i M, próbka jest w dalszym ciągu 
uznawana za zadowalającą, jeżeli liczba bakterii pozostałych próbek jest równa m lub mniej. 
- wartość graniczna liczby bakterii (jeśli wszystkie próbki poniżej m – wynik zadowalający)
M – maksymalna wartość dla liczby bakterii (jeżeli choć jedna próbka = M – wynik niezadowalający)
Metodyka badań mikrobiologicznych
1. Przygotowanie próbek do badań mikro  
zgodnie zPN-EN ISO 6887-4 – Mikro żywności i pasz. 
 Przygotowanie próbek, zawiesiny wyjściowej i rozcieńczeń dziesięciokrotnych do badań  mikrobiologicznych.

Pasze sypkie, twarde  20 g próbki + 180 ml roztworu fizjologicznego soli z peptonem,

Wymieszać, odstawić w temp. pokojowej na 30 min (jeśli zawiesina jest zbyt gęsta dodać roztwór soli z peptonem,aż do 
uzyskania rozcieńczenia 1 : 20), następnie homogenizacja przez 1 min
2. Oznaczanie ogólnej liczby drobnoustrojów żywych oraz pałeczek jelitowych

*zgodnie z PN-EN ISO 4833 – Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczby 
drobnoustrojów. Metoda płytkowa w temp. 30 

0

C

*PN-ISO 21528-2 - Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby 
Enterobacteriaceae
. Metoda płytkowa.
Schemat oznaczania ogólnej liczby drobnoustrojów żywych oraz pałeczek jelitowych
Wyliczanie liczby drobnoustrojów w 1 g paszy: a = [Σc /(n1 + 0,1 n2)] x d  →  Σc -  suma liczonych kolonii; n1 – liczba 
płytek z niższego rozcieńczenia; n2 - liczba płytek z wyższego rozcieńczenia; d – wskaźnik rozcieńczenia (stosujemy z 
mniejszego). 

3. Oznaczanie ogólnej liczby drożdży i pleśni  

*zgodnie z PN-ISO 21527-1 – Horyzontalna metoda oznaczania liczby drożdży i pleśni. 
Część 1: Metoda liczenia kolonii w produktach o aktywności wodnej wyższej niż 0,95. 
PN-ISO 21527-2 – 
Horyzontalna metoda oznaczania liczby drożdży i pleśni.

Część 2: Metoda liczenia kolonii w produktach o aktywności wodnej niższej niż 0,95.

 Jeśli a

≥ 0,95 płyn do rozcieńczeń – 0,1% roztwór wody peptonowej

podłoże DRBC: agar z dichloranem,różem bengalskim i chloramfenikolem- inkubacja 5 dni, 25 

0

Jeśli a

< 0,95płyn do rozcieńczeń – 0,1% roztwór wody peptonowej z dodatkiem 20 - 35% glukozy lub 

glicerolu(minimalizacja szoku osmofilnego dla pleśni kserofilnych i drożdży osmofilnych) 
podłoże DG18: agar z dichloranem,18% dodatkiem glicerolui chloramfenikolem- inkubacja 5-7 dni, 25 

0

C  

4. Oznaczanie pałeczek Salmonella

*zgodnie z PN-EN ISO 6579 -  Horyzontalna metoda wykrywania Salmonella spp.

Oznaczanie obecności  Salmonella sp. w próbkach żywności obejmuje kilka etapów: 

^I.Przednamnżanie na wodzie peptonowej (próbka żywnosci 25g/ml +woda peptonowa225ml → inkubacja 
37C/18+=3godz.
^II. Namnażanie selektywne na płynnych pożywkach selektywnych a)0,1 ml → pożywka RVS-10ml-
>inkubacja;41,5C/24h b) 1ml->pożywka KKTTn/10ml/-37C/24h 
^ III. Różnicowanie na podłożach agarowych a) podłorze XLD (inkubacja 27/24h) b)podłoze Hektonere c)podłozeBGA 
(ink.48C/24h) → podłorze agar 9ink. 37C/48h
^ IV. Identyfikacja w oparciu o testy biochemiczne i serologiczne 
5. Oznaczanie gronkowców koagulazo-dodatnich 
*PN-A-82055-9:1994 Mięso i przetwory mięsne. Badania mikrobiologiczne. Wykrywanie obecności liczby 
Staphylococcus aureus.
*PN-EN ISO 6888-1:2001/A1:2004  Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczby 
gronkowców koagulazo-dodatnich (S. aureus
 i innych gatunków). Część 1: Metoda z zastosowaniem pożywki 
agarowej Baird-Parkera.
*PN-EN ISO 6888-2:2001/A1:2004  Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczby 
gronkowców koagulazo-dodatnich (S. aureus
 i innych gatunków). Część 2: Metoda z zastosowaniem pożywki 
agarowej z plazmą króliczą i fibrynogenem.
*PN-EN ISO 6888-3:2004/AC:2005  Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczby 
gronkowców koagulazo-dodatnich (S. aureus
 i innych gatunków). Część 3: Wykrywanie obecności i oznaczanie 
małych liczb metodą NPL
Schemat badania (PN-A-820055-9:1994):
1.  20 g próbki + 180 ml wody peptonowej, mieszamy i rozdrabniamy w stomacherze, 
    (uzyskujemy rozcieńczenie badanego materiału 1:10)
2.  Wykonujemy kolejne dziesiętne rozcieńczenia 
3. Przesiewamy po 1ml próbki z danego rozcieńczenia do podłoża płynnego namnażającego Giolitti i Cantoni.
4. Posiewamy na podłoże stałe selektywne Baird-Parkera
5. Przesiew podejrzanych kolonii na podłoże płynne BHI (Brain Heart Infusion) 
    lub agar z krwią (w celu uzyskania czystego szczepu do dalszych badań)
6. Wykonujemy próbę na: a. zdolność wytwarzania koagulazy   b. Clumping factor (CF)     (tzw. czynnik zlepiający)     - 
przy wykorzystaniu plazmy krwi króliczej
6. Oznaczanie liczby Clostridium perfringens
*zgodnie zPN-EN ISO 7937 – Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania  liczby Clostridium 
perfringens
. Metoda liczenia koloni.
Wykonanie:
1.  20 g próbki + 180 ml wody peptonowej, mieszamy i rozdrabniamy w stomacherze,   (uzyskujemy rozcieńczenie 
badanego materiału 1:10)
Wykonujemy kolejne dziesiętne rozcieńczenia  3. Przesiewamy (posiew zalewowy) po 1ml próbki z danego 
rozcieńczenia do płytek Petriego i zalewamy dwukrotnie pożywką agarową z siarczanem (IV) i cykloseryną (SC) 
ink. 37 

0

C przez 20-22 h, w warunkach beztlenowych. 

4. liczymy podejrzane kolonie.-> Bakterie C. perfringens otoczone są czarną strefą precypitatu, spowodowanego 
redukcją siarczanów (IV) do siarczków, co powoduje także zaczernienie kolonii.
5. Potwierdzenie obecności podejrzanych kolonii jako C. perfringens
    
przy zastosowaniu pożywki: laktozowo-siarczanowej(IV)       lub   laktozowo-żelatynowej   lub  poprzez badanie 
zdolności ruchu i redukcji azotanów 
Potwierdzenie obecności C. perfringens  - pożywka laktozowo-siarczanowa(IV) 
Schemat badania:1. podejrzane kolonie przesiewamy do płynnej pożywki z tioglikolanem -  ink. 24 h, 37 

0

C, warunki 

beztlenowe,  2. po inkubacji przenosimy 5 kropli hodowli do płynnej pożywki laktozowo-siarczanowej – ink. w łaźni 
wodnej w temp. 46 

0

C, 24 h,

Interpretacja: wynik dodatni:  wypełnienie gazem probówek Durhama w więcej niż ¼    i obecność czarnego precypitatu. 
7. Oznaczanie Bacillus sp.   zgodnie z  PN-EN ISO 7932 -
    Horyzontalna metoda oznaczania liczby przypuszczalnych Bacillus cereus.
Metoda liczenia kolonii w temperaturze 30 

0

C.

Schemat badania:1. 20 g próbki + 180 ml wody peptonowej, mieszamy i rozdrabniamy w stomacherze,  (uzyskujemy 
rozcieńczenie badanego materiału 1:10) 2.  Wykonujemy kolejne dziesiętne rozcieńczenia   3. Przesiewamy po 0,1 ml 
(posiew powierzchniowy) próbki z danego rozcieńczenia do płytek Petriego z pożywką MYP (ekstrakt mięsny, 
mannitol, żółtko jaja, polimyksyna B  - Mannitol, Yolk, Polymyxin    ink. 30 

0

C przez 24-48 h, w warunkach tlenowych. 

4. Liczymy podejrzane (przypuszczalne) kolonie B. cereus    Kolonie B. cereus są: duże, - różowe - co wskazuje na 
fermentację mannitolu,    - otoczone strefą zmętnienia – co wskazuje na wytworzenie lecytynazy, 
Potwierdzenie obecności B. cereus: - test na hemolizę na pożywce agarowej z krwią  - podejrzane kolonie przesiewamy 
na podłoże agarowe z krwią baranią, ink. 30 

0

C przez 24h. Szczepy B. cereus powodują hemolizę.

dr hab. Jarosław Bystroń

Substancje niepożądane (ksenobiotyki) w paszach:*Dioksyny oraz PCB *Melamina *Pestycydy *Kokcydiostatyki 
jonoforowe *Histomonostatyki *Metale ciężkie *Antybiotykowe stymulatory wzrostu *Mykotoksyny *Produkty 
lecznicze skreślone z rejestru środków farmaceutycznych *Substancje aktywne w paszach leczniczych (np. tiamulina, 
doksycyklina, linkomycyna) *Toksyny roślinne *Nasiona chwastów *Sub radioaktywne - cez-134 i cez-137  Dioksyny – 
dzielimy na:1.  PCDD (polichlorowane dibenzodioksyny) 2.  PCDF (polichlorowane dibenzofurany) 3. dl-PCB 
(dioksynopodobne polichlorowane bifenyle)
TCDD 
(tetrachlorodibenzodioksyna) – najbardziej toksyczna dioksyna
*TEF - Toxic Equivalency Factor Przyjęty w celu oceny ryzyka zdrowia ludzkiego w trakcie posiedzenia Światowej 
Organizacji Zdrowia (WHO), które odbyło się w Sztokholmie w dniach 15–18 czerwca 1997 r.  
toksyczność- wywołują efekt toksyczny poprzez aktywację wewnątrzkomórkowego receptora węglowodorów 
aromatycznych (Ah),co prowadzi do modyfikacji ekspresji genów w komórce. - dioksyny należą do tzw. destruktorów 
endokrynowych, która objawia się głównie toksycznością reprodukcyjną (bezpłodność, poronienia) TDI (na dzień) dla 
człowieka-4 pq TEQ /kg m.c .TWI (Tol tyg pobranie)–14 pq TEQ /kg m.c.
Obecnie dzienne spożycie dioksyn w krajach UE wynosi: 1,2 – 3 pq TEQ /kg m.c.
 TEQ – Toxic Equivalent (ekwiwalent toksyczny)- ogólna zawartość dioksyn i związków pokrewnych (dioksynopodobne 
PCB) w postaci ekwiwalentu toksycznego 
Główne źródła dioksyn:- spalarnie komunalne i przemysłowe- produkcja tworzyw sztucznych na bazie PCV- produkcja 
pestycydów chlorowanych- produkcja papieru (proces wybielania masy celulozowej chlorem) - spalanie benzyny- 
dodawanie chloru do ścieków- pożary lasów → Dioksyny kumulowane są w roślinach oleistych → jako pasze trafiają do 
zwierząt  gospodarskich (odkładane są głównie w tkance tłuszczowej i wątrobie)  → żywność dla ludzi.     
Żywność pochodzenia zwierzęcego predysponowana do kumulacji dioksyn: mleko i produkty mleczne, tłuszcz 
zwierzęcy, wątroba, tłuste ryby z łowisk śródlądowych i przybrzeżnych,
Produkty żywnościowe stanowią źr 90% dziennej pobranej dawki dioksyn przez ludzi. 
Melamina  (2,4,6-triamino-1,3,5-triazyna): związek powszechnie stosowany w przemyśle chemicznym do produkcji 
plastików, niekiedy celowo dodawany do paszy i/lub żywności w celu zafałszowania wskaźnika zawartości białka. 
Toksyczność dla zw: dobrze się wchłania z p. pok., wydalana w 90% z moczem, u zw monogastrycznych praktycznie 
nie jest metabolizowana, toksyczność ostra jest niska, LD

50

 = 3300 mg/kg m.c. wielokrotne podawanie melaminy (tox 

przewlekła) wywołuje pojawienie się kamieni w kanalikach proksymalnych oraz w pęcherzu moczowym.  Efekty te  
zaobserwowano u psów po 90 dniach podawania melaminy w ilości 1200 mg/kg m.c./dzień     
Melamina –  dopuszczalna zawartość w paszach  - 2,5 mg/kg za wyjątkiem dodatków paszowych:  mocznika biuretu - 
niedopuszczalne  kwasu guanidynooctowego      
Metale ciężkie i substancje organiczne *Arsen *Kadm *Fluor *Ołów *Rtęć*Azotany
Arsen Materiały paszowe -  2 mg/kg z wyjątkiem:mączki sporządzonej z trawy, z suszonej lucerny i z suszonej 
koniczyny oraz suszonych wysłodków buraczanych i suszonych wysłodków buraczanych melasowanych -4 
mg/kg*makuchu z rdzenia palmy-4 mg/kg*fosforanów oraz morskich alg wapiennych-10 mg/kg*węglanu wapnia-15 
mg/kg*tlenku magnezu i węglanu magnezu-20 mg/kg*ryb, innych zwierząt wodnych i produktów z nich otrzymanych-
25 mg/kg *mączek z wodorostów morskich oraz materiałów paszowych uzyskanych z wodorostów morskich- 40 mg/kg 
Kadm Mat paszowe pochodzenia roślinnego1 mg/kg*Mat paszowe pochodzenia zwierzęcego 2 mg/kg*Mat paszowe 
pochodzenia mineralnego  2 mg/kg *Premiksy 15 mg/kg
Fluor Mat paszowe-150 mg/kg z wyjątkiem: — materiałów paszowych pochodzenia zwierzęcego, - 500 mg/kg - z 
wyjątkiem skorupiaków morskich, takich jak kryl morski    - skorupiaków morskich, takich jak kryl morski - 3 000 
mg/kg  )Mieszanki paszowe pełnoporcjowe- 150 mg/kg 
Ołów Materiały paszowe- 10 mg/kg z wyjątkiem(: — zielonki - 30 mg/kg — fosforanów oraz morskich alg wapiennych- 
15 mg/kg  )Premiksy- 200 mg/kg
Rtęć Materiały paszowe  - 0,1 mg/kg   z wyjątkiem: (— ryb, innych zwierząt wodnych i produktów z nich otrzymanych 
- 0,5 mg/kg  )Mieszanki paszowe  - 0,1 mg/kg 
Azotany Materiały paszowe -15 mg/kg (z wyjątkiem:  — mączki rybnej -  30 mg/kg) Mieszanki paszowe pełnoporcjowe 
-  15 mg/kg
Kokcydiostatyki jonoforowe → monenzyna, salinomycyna, narazyna, lasalocyd, maduramycyna, diklazuril, 
dekokwinat, nikarbazyna 
stosowane u drobiu i królików.
**Zagrożenia wynikające ze stosowania kokcydiostatyków w paszach; * niewielka różnica między dawką leczniczą a 
toksyczną 
*  przenoszenie kokcydiostatyków,(tzw. nieuniknione zanieczyszczenie krzyżowe)     
* W celu umożliwienia producentowi pasz kontroli nad nieuniknionym zanieczyszczeniem krzyżowym – w przypadku 
pasz dla mniej wrażliwych gatunków zwierząt
 –  uznaje się za możliwą do przyjęcia zawartość kokcydiostatyków w 
paszy, dla której substancje te nie są przeznaczone, na poziomie około 3 % max dopuszczalnej zawartości. 
W przypadku pasz dla wrażliwych gatunków zwierząt oraz pasz stosowanych w okresie poprzedzającym ubój 
należy uznać za możliwą do przyjęcia zawartość zanieczyszczeń w paszy, dla której substancje te nie są przeznaczone, 
na poziomie około 1 % maksymalnej dopuszczalnej zawartości. Kokcydiostatyki – dopuszczalne limity w paszach, w 
których, wskutek nieuniknionego zanieczyszczenia krzyżowego obecność kokcydiostatyków jest 
dopuszczonamg/kg*Lasalocid-1,25*Diklazuril-0,01*Dekokwinat -0,4 *Monenzyna-1,25 *Narazyna0,7
 Pestycydy (z grupy węglowodorów chlorowanych)
Dopuszczalne limity pozostałości wybranych pestycydów w paszachmg/kg* Aldryna-0,01 *Dieldryna-0,1*Kamfechlor-
0,02*Chlordan-0,02 *DDT-0,5*Endosulfan-0,1*Endryna-0,01*Heptachlor- 0,01*Heksachlorobenzen-
0,01*Heksachlorocykloheksan-0,02
Antybiotykowe stymulatory wzrostu ->Do 31 grudnia 2005 r. w krajach UE można było dodawać do pasz 
antybiotykowe stymulatory wzrostu. Od 1 stycznia 2006 obowiązuje całkowity zakaz ich stosowania. 
Produkty lecznicze skreślone z rejestru środków farmaceutycznych Amprolium Nitrofurany  Chloramfenikol   
Toksyny roślinne Kwas cyjanowodorowy  Teobromina Winylotiooksazolidon Lotny olejek gorczyczny
Nasiona chwastów(oraz niezmielone i nierozdrobnione owoce zawierające alkaloidy, glukozydy lub inne substancje 
toksyczne), Daturia sp. Crotalaria sp. Ricinus communis Croton tiglium niełuskane orzechy bukowe Gorczyca (Brassica 
sp.)Ambrosia sp. 

Uwarunkowania prawne stosowania w Polsce pasz zawierających GM
- „genetycznie zmodyfikowana pasza” oznacza paszę zawierającą, składającą się lub wyprodukowaną z GMO.
- „genetycznie zmodyfikowany organizm do użytku paszowego” oznacza GMO, który może być użyty, jako pasza 
lub materiał źródłowy do produkcji paszy.
**Zgodnie z Ustawą o Paszach z dnia 22 lipca 2006 roku, art. 15.:
Zabrania się wytwarzania, wprowadzania do obrotu i stosowania w żywieniu zwierząt:
pasz genetycznie zmodyfikowanych oraz organizmów genetycznie zmodyfikowanych przeznaczonych do użytku 
paszowego.-> 
Jednakże na podstawie nowelizacji ustawy o paszach - 
Ustawa z dnia 26 czerwca 2008 r. o zmianie ustawy o paszach z 2006 r. -
zezwala się na stosowanie pasz zawierających organizmy GMO do 31 grudnia 2012 roku
Za zagadnienia związane z wykorzystaniem organizmów genetycznie zmodyfikowanych w Polsce, odpowiada Minister 
Środowiska
 (Ustawa z dnia 22 czerwca 2001 roku o organizmach genetycznie zmodyfikowanych)
Do głównych obowiązków Ministra Środowiska należą m.in.: *wydawanie zezwoleń na prowadzenie zakładów 
inżynierii genetycznej, *przyjmowanie zgłoszeń zamkniętego użycia, *wydawanie decyzji w sprawach zamierzonego 
uwolnienia GMO do środowiska w celach doświadczalnych, *wydawanie decyzji w sprawach wprowadzenia do obrotu 
GMO jako produkt lub w produktach, *koordynacja kontroli i monitorowania działalności w zakresie GMO,  → W UE 
do zastosowania w żywieniu zwierząt możliwe są tylko i wyłącznie odmiany GMO zatwierdzone przez Komisję 
Europejską. → Komisja ustanawia i prowadzi wspólnotowy rejestr genetycznie zmodyfikowanej żywności i paszy, który 
udostępnia się publicznie.
Pasze GMO nie mogą: *wywierać szkodliwych skutków dla zdrowia ludzi, *zwierząt lub środowiska naturalnego, 
*wprowadzać użytkownika w błąd,*szkodzić ani wprowadzać konsumenta w błąd z powodu pogorszenia szczególnych 
cech produktów zwierzęcych, *nie mogą odbiegać jakością od pasz naturalnych.
>>> Zgodnie z rozporządzeniem 1830/2003 istnieje obowiązek etykietowania pasz zawierających GMO. Jednakże 
obowiązek ten nie dotyczy paszy zawierającej materiał, który składa się lub jest wyprodukowany z GMO w części nie 
większej niż 0,9% paszy
.
Każdy zmodyfikowany materiał paszowy oraz mieszanka zawierająca lub składająca się z GMO powinny, obok nazwy 
paszy, zawierać określenie „genetycznie zmodyfikowany (nazwa organizmu)”.  lub„wyprodukowano z genetycznie 
zmodyfikowanego (nazwa organizmu)
Na etykiecie powinny być także zawarte informacje o właściwościach paszy, jeśli odbiegają od właściwości pasz 
tradycyjnych. 
Zgodnie z rozporządzeniem 1830/2003 istnieje również obowiązek śledzenia (identyfikacji) pasz wyprodukowanych z 
GMO.Przy wprowadzaniu do obrotu pasz GMO, podmioty gospodarcze powinny przekazać kolejnym odbiorcom 
produktu:- informacje, że produkt zawiera GMO,- niepowtarzalny identyfikator nadany GMO,- określenie składnika/ 
składników wyprodukowanych z GMO.Podmioty gospodarcze powinny przechowywać informację (identyfikację 
produktu GMO) przez okres 5 lat po każdej transakcji kupna – sprzedaży.
 -----------------------------------------------------------------
 Oznaczanie zawartości włókna oraz azotynów i azotanów w paszach 
Azotyny i azotany-  Zagadnienie istotne gdyż… 
1. potencjalne zagrożenie dla zdrowia i życia ludzi oraz zwierząt 2. 
zagrożenie dla środowiska 3. wpływ na produkcję zwierzęcą- straty ekonomiczne 
Obieg azotu w przyrodzie  atmosfera ziemska- 78% N2 , główne źródło tego pierwiastka dla biosfery  rola azotu i 
jego związków  przyswajanie N2 z atmosfery >> bakterie azotowe przekształcające formę gazową w związki 
chemiczne, e. nitrogenaza >>NH4, glutamina  amoniak>>bakterie nitryfikacyjne>> NO3- i NO2- i zw. organiczne 
potrzebne dla funkcjonowania organizmów żywych  rośliny pobierają azot poprzez systemy korzeniowe w 
formiejonów azotanowych, azotynowych i amonowych 
Źródła azotynów i azotanów   nawozy sztuczne   nawozy naturalne: obornik, gnojowica   nieprzestrzeganie Zasad

 

Dobrej Praktyki Rolniczej w nawożeniu   nieszczelne szamba   zanieczyszczenie środowiska zw. przemysłem

 

azotowym, wytwarzaniem szkła, materiałów wybuchowych 
W produkcji żywności, jako substancje dodatkowe stosowane są:   azotyn sodu E250   azotyn potasu E249   azotan

 

sodu E251   azotan potasu E252 

 

najszersze zastosowanie w przemyśle mięsnym, 

 

ponadto sery dojrzewające, śledzie, szprotki marynowane w occie,  zahamowanie rozwoju drobnoustrojów...  

barwa, aromat  ADI azotany 0-3,7 mg/kg ; azotyny 0-0,07 mg/kg 

Źródła azotynów i azotanów 
w medycynie ludzkiej i weterynaryjnej pochodne tych związków stosowane są jako: 
1. środki rozszerzające oskrzela i naczynia krwionośne   2. w weterynarii: azotyn sodu używany miejscowo jako 
antyseptyk (prewencja mastitis etc.) 

Główne źródła narażenia zwierząt gospodarskich: 
*
azotany i azotyny obecne ‘naturalnie’ w roślinach przeznaczanych na paszę ,*niesprzyjające warunki atmosferyczne- 
jakie? *nieodpowiednie przygotowywanie i przechowywanie  *aktywność mikroorganizmów obecnych w paszy, pasza 
nadgniła, spleśniała  *pasze z obszarów intensywnie nawożonych substancje konserwujące dodawane do niektórych 
materiałów paszowych (kiszonka, pokarm dla zw. domowych, dawniej FM) pośrednio woda 
>>>zróżnicowana zawartość azotanów w roślinach przeznaczanych na paszę zależy od: 1. gatunku: istnieją gatunki 
roślin (ponad 80!) znane ze swej zdolności do kumulacji znacznych ilości azotanów 2. ‘okresu dojrzałości’ rośliny 3. 
intensywności nawożenia 4. warunków wzrostu (herbicydy, niskie temperatury lub przymrozki, zacienienie, susza) 5. 
części rośliny: łodygi, trzony, dolne liście/ nasiona 
 
„substancja niepożądana” 
oznacza jakąkolwiek substancję lub produkt, z wyjątkiem czynników patogennych, która jest 
obecna na zewnątrz lub wewnątrz produktu przeznaczonego do żywienia zwierząt oraz która stanowi potencjalne 
niebezpieczeostwo dla zdrowia zwierząt lub ludzi bądź dla środowiska lub może niekorzystnie wpływad na produkcję 
zwierzęcą  
Azotyny i azotany- niekorzystny wpływ na zwierzęta 
1. spadek mc 2. pomniejszenie śledziony, nerek, mięśnia sercowego 3. obniżenie parametrów nasienia 4. procesy 
nowotworzenia w obrębie pp 5. hematopoeza pozaszpikowa 6. działanie mutagenne- in vitro Salmonella Typhimurium 
szczep TA 100, ale brak reklasyfikacji jako subs. genotoksyczna (JECFA) 
- niekorzystny wpływ na zw. gospodarskie 
zróżnicowany, zależny od: 1. wieku 2. gatunku 3. stanu zdrowia, kondycji 4. zatrucia najczęściej notowane u Ru 5. gleba- 
zagrożenie dla zwierząt wypasanych 
Azoyny i azotany- niekorzystny wpływ na zw. Gospodarskie / gat szczególnie podatne na zatrucie: Bo(Ru), Su … 
szybki metabolizm i wydzielanie tych zawiązków- niskie prawdopodobieostwo kumulacji w tkankach zwierzęcych! 
/produkty pochodzenia zwierzęcego- niewiele danych ilościowych nt. pozostałości! 
najwięcej zatrud u bydła:  1. skarmianie znacznych ilości zielonek 2. uwarunkowania fizjologiczne (żwacz pH>5, gęsta 
populacja bakteryjna, ‘metabolic overload’) 
ostre obj zatrucia: wymioty, niestabilny chód, tachykardia, sinica, duszność, drżenia mięśniowe, osłabienie... 
toksycznośd przewlekła: spadek spożycia paszy, ronienia, obniżone wskaźniki płodności (niedobór wit., zaburzona 
steroidogeneza), działanie goitrogenne u drobiu, spadek mleczności krów mlecznych 
Methemoglobina, methemoglobinemia toksyczna >zasadnicze toksyczne oddziaływanie azotynów 
w warunkach prawidłowych żelazo w cząsteczce Hb występuje w postaci zredukowanej w RBC osób zdrowych- stały 
proces tworzenia i redukcji niewielkich ilości MtHb; układ reduktazy NADH- methemoglobiny 
działanie związków methemoglobinotwórczych- nadmiar MtHb przekraczający możliwości procesów redukcyjnych  gdy 
MtHb przekracza 20%... co sprzyja methemoglobinemii?  Methemoglobina, methemoglobinemia toksyczna / 
mechanizmy ochronne- methemoglobinemia 
Azotyny i azotany w produktach pochodzenia zwierzęcego  człowiek- narażenie na azotyny 20% stanowią źródła zw. z 
codzienną dietą: 11-41% owoce i warzywa 35-39% produkty pochodzenia zwierzęcego 5-7% woda inne pokarmy: 15%-
47% pozostałe 80% narażenia wynika z endogennych przemian azotanów (ślina!!!) 

 

NITROZOAMINY   Oznaczanie azotynów i azotanów w paszy  Oficjalna metody analityczna do określania zawartości 

azotynów i azotanów w paszy to metoda kolorymetryczna  

**Oznaczanie zawartości azotynów i azotanów w paszach po enzymatycznej redukcji azotanów do azotynów (PN-EN 
ISO 12014-3:2006) 

Zasada metody → Azotyny w wodnym ekstrakcie badanej próbki reagują z sulfanilamidem dichlorowodorkiem 
N-(1-naftylo)-etylenodiaminy
. Powstały, zabarwiony na czerwono związek, mierzony jest spektrofotometrycznie przy 
długości fali 540 nm. 
**Oznaczanie zawartości azotynów i azotanów w paszach po enzymatycznej redukcji azotanów do azotynów (PN-EN 
ISO 12014-3:2006) 
Zasada metody → Oznaczenie zawartości azotanów wymaga ich zredukowania do azotynów. Zawartośd azotanów 
obliczana jest z różnicy między pomiarami spektrofotometrycznymi. 
Włókno surowe 
włókno
- najtrudniej strawna część węglowodanów, najtrudniej ‘rozkładalna’ frakcja spośród wszystkich składników 
organicznych paszy  odpowiednia zawartość istotna w żywieniu loch... 
niezbędne w dawce pokarmowej, zwłaszcza Ru (niedobór: zahamowanie perystaltyki przedżołądków, obniżenie 
mleczności oraz zawartości tłuszczu w mleku, biegunki, zaburzenia mikroflory żwacza), ale... między zawartością 
włókna w paszy, a jej strawnością istnieje korelacja ujemna (Kellner, 1905) 
im wyższa zawartość włókna- tym niższa wartość paszy 
Włókno surowe → podział na 4 grupy związków: celulozę- 50-80% hemicelulozę- 20% ligninę-10-40% 
pektyny  w przypadku zwierząt monogastrycznych częściej stosuje się pojęcie włókna pokarmowego, szersze, 
obejmujące polisacharydy nieskrobiowe (NSP) i ligninę 
Włókno surowe 
Fizyczna obróbka komponentów paszowych (suszenie, śrutowanie, granulacja, obróbka hydrotermiczna) oraz 
oddziaływanie różnymi zw. chemicznymi, włączając kiszenie pasz, dodawanie kwasów, zasad lub zw. organicznych 
wpływa na wł. fizyczne i chemiczne włókna, zwiększając jego wykorzystanie przez zwierzęta, zwłaszcza monogastryczne 
zawartość włókna surowego(PN-EN ISO 6865)- ubytek masy po spopieleniu suchych pozostałości, otrzymanych w 
wyniku trawienia próbki kwasem oraz zasadą zgodnie z procedurą zamieszczoną w w/w normie, podzielony przez masę 
próbki analitycznej zawartość włókna surowego wyraża się gramach na kilogram; można również wyrażać jako udział 
masowy w procentach. 
*Oznaczanie zawartości włókna surowego w paszach metodą z pośrednią filtracją (PN-EN ISO 6865) 
Zasada metody → Metoda polega na potraktowaniu próbki wrzącym rozcieńczonym H2SO4oraz wrzącym r-rem KOH
Pozostałość odsącza się, przemywa, suszy i spopiela. Ubytek masy po spopieleniu odpowiada masie włókna w próbce 
analitycznej. 
*Oznaczanie zawartości włókna surowego w paszach metodą z pośrednią filtracją (PN-EN ISO 6865) 
 Wykrywanie azotynów i azotanów w paszach z zastosowaniem odczynnika dwufenyloaminowego pasze, treśd 
przewodu pokarmowego metoda kolorymetryczna (C6H5)2NH czy w roztworze azotyny czy azotany: próba z 
odczynnikiem Griess- Ilosvaya 
                                     
Mikroskopowa metoda oznaczania białka obcogatunkowego w paszach 
Przetworzone białko zwierzęce w środkach żywienia zwierząt mikroskopowa metoda wykrywania 
TSE TSE (Transmissible Spongiform Encephalopathies; pasażowalne, gąbczaste encefalopatie) 

 grupa chorób centralnego układu nerwowego, wywoływana przez białko prionowe PrPsc / PrPres ( 1981r. Prusiner,

 

Nagroda Nobla w 1997r.)   brak r. zapalnej i immunologicznej   długi, kilkuletni okres inkubacji   chroniczny,

 

kilkumiesięczny przebieg, kooczący się zawsze zejściem śmiertelnym   prowadzą docelowo do degeneracji komórek

 

nerwowych CUN 

TSE/BSE  → BSE (Bovine Spongiform Encephalopathy) 

 jedna z chorób zaliczanych do TSE. W obrazie histopatologicznym zmiany powstałe w wyniku choroby w obrębie CUN

 

mają wygląd gąbki    Bo: objawy ze strony układu nerwowego: porażenia, parestezje, osowiałośd lub nasilona

 

agresywnośd; anorexia, spadek mleczności, odstawanie od stada   wszystkie rasy bydła podatne w równym stopniu 

 

szczyt zachorowao u Bo w wieku 4-5 lat 

BSE, vCJD 
BSE   pierwsze przypadki u Bo w Wielkiej Brytanii w 1986r.   wprowadzony program eradykacyjny wiązał się z

 

eliminacją blisko 4,5mln sztuk pogłowia Bo w UK   straty liczone w mln € 

(n)vCJD- (new) variant Creutzfeldt-Jakob disease   ponad 200 przypadków do 2010r., w większości z nich

 

potwierdzone zostało spożycie wołowiny pochodzącej z zakażonego Bo   długoletni okres inkubacji, nawet kilkanaście

 

lat   obecnie notuje się poniżej 5 przypadków/rok   można zaliczyd do FBD 

TSE/BSE- prawdopodobna przyczyna epizoocji…    skarmianie bydła, zaliczanego do zw. roślinożernych mączkami

 

mięsno-kostnymi pozyskiwanymi z tkanek przeżuwaczy, co spowodowało rozprzestrzenienie się czynnika zakaźnego 

 mączki mięsno- kostne mogły pochodzid od owiec padłych na ‘scrapie’   do rozwoju epizoocji mogło się też

 

przyczynid obniżenie temperatury stosowanej podczas przetwarzania ubocznych produktów pochodzenia zwierzęcego 
przeznaczanych później na paszę (UK)    133°C, 3bary, 20min 

MBM- meat and bone meal  → MBM/MMK- mączki mięsno-kostne 

 uzyskiwane z ubocznych produktów pochodzenia zwierzęcego, a także ze zwłok zw. chorych- do 1987r powszechnie

 

używane w Europie jako dodatek wzbogacający paszę Bo w białko 
Dlaczego tak chętnie stosowane? 
 

cenny dodatek do mieszanek treściwych  zawartośd białka od 40-60%  niskie koszty wytwarzania, 

alternatywa dla maczki sojowej  wysoka strawnośd, nie zawierają włókna  bogate w aa egzogenne  
gwarantują otrzymywanie wysokich przyrostów masy ciała  ubogie w bezazotowe związki wyciągowe 

 PAP- processed animal proteins, przetworzone białko zwierzęce 
to pojęcie znacznie szersze niż MBM, obejmuje także: mączkę mięsną, rybną, mączkę z krwi, suszone osocze i inne 
produkty krwiopochodne, hydrolizowane białka, mączkę z racic, mączkę z rogów, mączkę z piór, mączkę z podrobów 

drobiowych, suszone skwarki, fosforan dwuwapniowy, żelatynę, a także wszelkie inne produkty włączając w to 
mieszanki, pasze, dodatki paszowe oraz premiksy, zawierające takie produkty 
PAP- wysokowartościowy dodatek do pasz 
przetworzone białko pochodzenia zwierzęcego stosowane w żywieniu zwierząt może pochodzid jedynie z materiału 
kategorii trzeciej! … 
TSE/BSE  → Środki zwalczania gąbczastych pasażowalnych encefalopatii: 
1. zakaz paszowy- feed ban  2. nakaz eliminacji materiału szczególnego ryzyka  3. Obecnie UE jest bliska 
wyeliminowania BSE ze swej populacji bydła, niezbędne jest jednak zachowanie czujności i stały monitoring sytuacji… na 
wypadek pojawienia się nowych ognisk BSE lub nowego czynnika wywołującego TSE w populacji bydła 

ROZPORZĄDZENIE 1069/ 2009  z dnia 21 października 2009 r.  określające przepisy sanitarne dotyczące produktów 
ubocznych pochodzenia zwierzęcego, nieprzeznaczonych do spożycia przez ludzi  Materiał kategorii I (w tym SRM) 
Materiał kategorii II  Materiał kategorii III . Do produkcji przetworzonych białek zwierzęcych i innych składników 
paszowych można wykorzystywać wyłącznie materiał kategorii III ! 
materiał kategorii III obejmuje m.in. : 
 

tusze i części tusz zwierząt poddanych ubojowi lub, w przypadku zwierząt łownych, całe zabite zwierzęta lub ich 

części, które nadają się do spożycia przez ludzi zgodnie z przepisami wspólnotowymi, lecz nie są przeznaczone do 
spożycia przez ludzi ze względów handlowych 
 

produkty uboczne pochodzenia zwierzęcego, powstałe podczas wytwarzania produktów przeznaczonych do 

spożycia przez ludzi, w tym odtłuszczone kości i skwarki 

 

produkty pochodzenia zwierzęcego lub środki spożywcze zaw. produkty pochodzenia zwierzęcego, które nie nadają 

się do spożycia przez ludzi z powodów handlowych lub w wyniku problemów powst. podczas w produkcji lub wad w 
pakowaniu lub innych wad, które nie stanowią żadnego zagrożenia dla zdrowia ludzi i zwierząt 

 

tusze i części pochodzące od zwierząt, które zostały poddane ubojowi w rzeźni i zostały uznane za nadające się do 

uboju w celu spożycia przez ludzi w następstwie kontroli przedubojowej, takie jak: łby drobiu, szczecina świoska, pióra 

 

krew, łożysko, wełna, rogi, ścinki z kopyt i surowe mleko pochodzące od żywych zwierząt, które nie wykazywały 

żadnych oznak choroby przenoszonych przez ten produkt na ludzi lub zwierzęta 

 

jaja, produkty uboczne z wylęgarni, jajeczne produkty uboczne poch. od zwierząt, które nie wykazywały żadnych 

objawów choroby przenoszonej przez ten materiał na ludzi lub zwierzęta 

SRM- Specified Risk Material 
SRM- materiał szczególnego ryzyka; zaklasyfikowany do materiału kategorii I 
Są to tkanki pozyskane od bydła, owiec i kóz, mogące zawierad w sobie czynnik będący przyczyną zachorowao na 
pasażowalne gąbczaste encepfalopatie 
Zakaz paszowy- feed ban obowiązujące przepisy 
Lipiec 1994- zakaz karmienia bydła, owiec i kóz mączką mięsno-kostną ze ssaków .Początkowo częściowy zakaz 
rozszerzony na całą UE (zarządzanie ryzykiem zanieczyszczenia krzyżowego pasz dla Ru) 
A z dniem 1.01.2001 całkowite, bezterminowe wstrzymanie stosowania przetworzonego białka zwierzęcego w paszach 
przeznaczonych dla wszystkich zwierząt hodowanych do produkcji żywności-tzw. food animals 
Zasada ‚zero tolerance’- co oznacza? Zakaz paszowy- feed ban obowiązujące przepisy   zwierzęta futerkowe a tzw. food

 

animals   zakaz paszowy – co można stosowad ? 

W żywieniu zwierząt gospodarskich innych niż przeżuwacze stosuje się następujące materiały paszowe pochodzące z 
tkanek zwierzęcych:  
 Mączka rybna   Fosforan dwuwapniowy i fosforan trójwapniowy   Produkty z krwi

 

pochodzące od zwierząt innych niż przeżuwacze   Mleko, produkty na bazie mleka i siara   Jaja i produkty jajeczne 

 

Żelatyna od zwierząt innych niż przeżuwacze   Hydrolizaty białkowe pochodzące od zwierząt innych niż przeżuwacze i

 

otrzymanych ze skór i skórek przeżuwaczy 
Zakaz paszowy- co można stosowad u Ru? 

 Mleko, produkty na bazie mleka i siara   Jaja i produkty jajeczne   Żelatyna od zwierząt innych niż przeżuwacze 

 

Hydrolizaty białkowe pochodzące od zwierząt innych niż przeżuwacze i otrzymanych ze skór i skórek przeżuwaczy 

Zakaz paszowy o Priorytet: bezpieczeostwo żywności i ochrona konsumenta! o Zakaz powtórnego przetwarzania 
wewnątrzgatunkowego (zakaz kanibalizmu) o Możliwośd uchylenia zakazu paszowego o Obecnie UE bliska 
wyeliminowania BSE ze swej populacji bydła o Pozytywna sytuacja epidemiologiczna w Europie pod względem BSE 
utrzymuje się od 2005 roku o Rozważane uchylenie zakazu w odniesieniu do stosowania w paszach przeznaczonych dla 
zw. innych niż przeżuwacze przetworzonego białka zwierzęcego pochodzącego od zwierząt innych przeżuwacze bez 
uchylania zakazu powtórnego przetwarzania wewnątrzgatunkowego 
Możliwość uchylenia zakazu paszowego  Ale aby zakaz został uchylony… 
Konieczne wiarygodne testy umożliwiające gatunkową identyfikację śladowej zawartości mączki mięsno-kostnej! 
Zakaz paszowy  Obecnie PAP objęte zakazem stosowania w paszach wykorzystuje się do produkcji nawozów, kompostu 
lub paliw dla cementowni 
MIKROSKOPOWA METODA WYKRYWANIA PAP W ŚRODKACH ŻYWIENIA ZWIERZĄT 
o Wdrożona do rutynowej diagnostyki laboratoryjnej w 2002r o Wymaga doświadczenia, zaangażowania, żmudnej 
pracy  met. analityczna o długiej tradycji w jakościowym i ilościowym oznaczaniu surowców roślinnych oraz 
identyfikacji tkanek roślinnych i zwierzęcych w paszach 

met. referencyjna- stosowana do badań rutynowych 

 pozwala wykrywać białka poddane obróbce termicznej, jakiej poddawane są pasze w czasie procesu produkcji 

 

podstawowa zaleta: możliwość wykrywania bardzo małych ilości składników pochodzenia zwierzęcego- nawet < 0,1% 

MIKROSKOPOWA METODA WYKRYWANIA PAP W ŚRODKACH ŻYWIENIA ZWIERZĄT 
Metoda polega na wykrywaniu PAP na podstawie charakterystycznych cech tkanek pochodzenia zwierzęcego: 1) 
włókien mięśniowych 2) kości, tkanki chrzęstnej, ości ryb 3) włosów, szczeciny, piór, łusek, rogów 4) skorup jaj 5) krwi 
MIKROSKOPOWA METODA WYKRYWANIA PAP W ŚRODKACH ŻYWIENIA ZWIERZĄT 
Wady metody mikroskopowej: 1) pracochłonność, czasochłonność- zbadanie jednej próbki środka żywienia zwierząt 
zajmuje ok. 2h  2) kosztowna 3 subiektywna

MIKROSKOPOWA METODA WYKRYWANIA PAP W ŚRODKACH ŻYWIENIA ZWIERZĄT 
Wytyczne do metody :  Rozporządzenie WE nr 152/2009 z dn. 27 stycznia 2009 
do badania min. 50g paszy/ próbki ; materiał granulowany rozdrobnić w moździerzu lub młynku 
tak przygotowany materiał przygotować dwie części o masie 5g każda- frakcję do analizy sitowej oraz do badania 
zagęszczonego osadu 
Schemat badania środków żywienia zwierząt metodą mikroskopową 
***frakcję sitową >0,5mm należy równomiernie rozsypać na płytce Petriego, systematycznie przeglądać pod 
mikroskopem stereoskopowym 
frakcję sitową< 0,5mm mikroskop biologiczny, różne powiększenia, poszukiwanie el. poch. zwierzęcego   po 
zagęszczaniu z tetracholoetylenem  osad + flotat  osad- obligatoryjnie badany pod mikroskopem stereoskopowym 
i biologicznym  flotat- badanie nie jest obligatoryjne 
***co w osadzie?  składniki kostne  ości  składniki mineralne  piasek  zdrewniałe elementy roślin 
co we flotacie?  włókna mięśniowe  chrząstki  włosy  pióra 
Tetrachloroetylen pozwala na oddzielenie el. kostnych od paszy oraz odtłuszczenie badanego materiału -> wyraźniejszy 
obraz pojedynczych cząstek pod mikroskopem! 
*** odłamki kostne ssaków- białe/ kremowe/szare  twarda konsystencja, zaokrąglone krawędzie  kości 
drobiowe- ciemniejsze, miękka konsystencja, kształt wydłużony, ostre krawędzie  kości „lądowych” są 
nieprzezroczyste, matowe  ości- przezroczyste i przejrzyste 
*** 

Identyfikacja gatunkowa składników kostnych na podstawie jamek kostnych (lacunae) i kanalików kostnych 

(caniculi) (200-400X) 

 

Jamki kostne z dobrze widocznymi kanalikami kostnymi. Zdjęcie ości ryby z mikroskopu biologicznego (200x).  

Jamki i kanaliki kostne  ssaki: jamki kostne eliptyczne, prawie okrągłe, z mało widocznymi kanalikami  drób: 
okrągłe i gęściej ułożone jamki kostne, kanaliki praktycznie niewidoczne, silne zagęszczenie jamek kostnych  el. 
kostne porowate, ostrokrawędziowe; nierówne krawędzie kruszenia ze względu na obecnośd jamek powietrznych  
ryby- jamki kostne wydłużone, z bardzo dobrze widocznymi kanalikami 

***tk. mięśniowa- gładka i poprzecznie prążkowana wchodzi w skład MBM 
 

wygląd włókien mięśniowych jest mało charakterystyczny gatunkowo, niemożliwe jest odróżnienie czy pochodzą 

one od ryb czy też „lądowych”   można dobarwiad solutio iodi aquosa  we fotacie 

***włosy lub pióra- odczynnik cystynowy 
krwinki- widoczna kulista struktura pod stereomikroskopem 
rogi- charakterystyczne elementy podobne do bursztynu  
***Podsumowanie: 
wykrycie składników pochodzenia zwierzęcego na bardzo niskich poziomach (<0,1%) o możliwe różnicowanie kości zw. 
lądowych i el. kostnych pochodzących od ryb o rozróżnienie kości pochodzących od ssaków i drobiu 

NIE jest możliwe określenie pochodzenia gat. tk. mięśniowej 
***MIKROSKOPOWA METODA WYKRYWANIA PAP W ŚRODKACH ŻYWIENIA ZWIERZĄT 
 

laboratoria urzędowe  badania przesiewowe- met. mikroskopowa  badania odwoławcze- również met. 

mikroskopowa + inne metody oraz testy pomocnicze  wynik ujemny w analizie przesiewowej jest ostateczny i nie 
wymaga potwierdzenia żadnym innym badaniem  wynik dodatni lub wątpliwy w badaniu przesiewowym wymaga 
potwierdzenia met. odwoławczą 

MIKROSKOPOWA METODA WYKRYWANIA PAP W ŚRODKACH ŻYWIENIA ZWIERZĄT 
 

co w sprawozdaniu z badania:  potwierdzenie/ wykluczenie obecności pap w badanej próbce  metoda 

pobierania próbek  użyta metoda badania  zastosowane próby i odczynniki  wszelkie informacje z zakresu 
postepowania badawczego  wszelkie informacje niezbędne do pełnej identyfikacji próby 

ALTERNATYWNE METODY WYKRYWANIA I IDENTYFIKACJI GATUNKOWEJ PAP W PASZACH 
 

Testy ELISA  PCR  BADANIA BIEGŁOŚCI LABORATORIÓW URZĘDOWYCH W ZAKRESIE WYKRYWA PAP METODĄ 

MIKROSKOPOWĄ 

 Kokcydiostatyki w paszach Metoda jakościowa wykrywania kokcydiostatyków jonoforowych 
Kokcydioza u drobiu → 
Gromada: Apicomplexa  Rodzaj : Eimeria    Kokcydioza (

Coccidiosis)- znana od ponad stu lat 

(Schneider 1875r., Fantham 1910r.), zaliczana do najistotniejszych parazytoz drobiu przełomu XX i XXI wieku   Prócz

 

drobiu podatne na zarażenie są także: bydło, owce, trzoda chlewna, króliki i in.   Kokcydioza największy problem

 

stanowi jednak w przypadku...   Gatunki patogenne dla kur: 

E.acervulina, E. tenella, E. maxima,   

E. necatrix, 

E.praecox, E. brunetti, E. mitis,   W przewadze inwazje mieszane   Cykl rozwojowy   Wysoka odpornośd oocyst   Z

 

czego wynika patogenne oddziaływanie kokcydiów? 
Wszystkie gatunki atakujące drób grzebiący lokalizują się w przewodzie pokarmowym (duża specyficznośd względem 
żywiciela...) Pasożyty wewnatrzkomórkowe! 
Objawy kliniczne: od przebiegu subklinicznego po ostrą postad kliniczną! 
Kokcydioza u drobiu → Co sprzyja jej wystąpieniu?  niewłaściwe warunki utrzymania ptaków (>obsada, >NH3, 
zawilgocenie ściółki, niedowentylowane kurniki)  żywienie (mikotoksyny, niedobory)  czynniki stresowe, w tym 
zakażenia wirusowe (MDV, IBDV, CAV, adeno- i reowirusy) 
Przebieg uzależniony od...   gatunku Eimeria   patogenności pasożyta...   dawki inwazyjnych oocyst   
wieku ptaków i ich kondycji   oporności Eimeria spp. na kokcydiostatyki (…)
*** 

Zwalczanie i kontrola kokcydiozy   bioasekuracja...  chemioprofilaktyka  immunoprofilaktyka  

postępowanie z wyboru: stosowanie kokcydiostatyków  chemioprofilaktyka polega na stałym(!) podawaniu ptakom 
preparatów kokcydiostatycznych w skarmianych mieszankach paszowych 

Kokcydiostatyki 
ROZPORZĄDZENIE (WE) NR 1831/2003 PARLAMENTU EUROPEJSKIEGO I RADY z dnia 22 sierpnia 2003 r. w sprawie 
dodatków stosowanych w żywieniu zwierząt 
dodatki paszowe: to substancje, drobnoustroje lub preparaty, inne niż materiał paszowy i premiksy, które są celowo 
dodawane do paszy lub wody w celu pełnienia, w szczególności, jednej lub więcej funkcji wymienionych w art. 5 ust.3... 
m.in.: korzystnie wpływają na cechy paszy, korzystnie wpływają na cechy produktów pochodzenia zwierzęcego 
,zaspokajają potrzeby żywienia zwierząt ,mają działanie kokcydiostatyczne lub histomonostatyczne 
ROZPORZĄDZENIE (WE) NR 1831/2003 PARLAMENTU EUROPEJSKIEGO I RADY z dnia 22 sierpnia 2003 r. w sprawie 
dodatków stosowanych w żywieniu zwierząt 
Obecnie do stosowania na terenie EU, na mocy powyższego rozporządzenia, dopuszczonych do stosowania jest 11 
kokcydiostatyków
, jako substancje dodatkowe stosowane w żywieniu zwierząt 
Dodatki te można stosować tylko u zwierząt, które wymienione są w poszczególnych aktach autoryzacyjnych! (gatunki i 
kategorie docelowe, tzw. ‘target-animals’) 

Kokcydiostatyki → dopuszczone kokcydiostatyki chemiczne: nikarbazyna   diklazuril  dekokwinat   halofuginon 
chlorowodorek robenidyny 

background image

→ dopuszczone kokcydiostatyki jonoforowe: narazyna  sól sodowa monenzyny sól sodowa salinomycyny   sól sodowa 
maduramycyny  sól sodowa semduramycyny  sól sodowa lazalocydu 
Kokcydiostatyki- stosowanie Typ paszy: Starter- tak Grower- tak   Finiszer- zakazane, przestrzeganie okresu karencji 
przed ubojem drobiu rzeźnego 
Programy stosowania: wymienny (DKA-Starter/DKA-Grower) rotacyjny (‘shuttle program’) 
Kokcydiostatyki jonoforowe 
 

Tzw. ‘jonofory’, zawierają ugrupowanie polieterowe  ‘70  Wytwarzane na drodze fermentacji z udziałem 

kilku szczepów Streptomyces spp. Actinomadura spp.  Mechanizm działania... 

Oporność na jonofory pojawia się wolniej niż na kokcydiostatyki chemiczne (charakter rekombinacji genetycznej, 
mutacje/ charakter adaptacyjny, zmiana biochemizmu komórkowego, przepuszczalności błony komórkowej) 
Groźne interakcje z innymi lekami weterynaryjnymi- np. tiamuliną 
Toksycznośd dla niektórych gatunków ‘non-target’ animals 
Kokcydiostatyki w paszach 
*Kokcydiostatyki dopuszczone do stosowania w paszach zwierzęcych nie są wykorzystywane do celów leczenia ludzi 
*Przygotowanie niosek do nieśności *Drób rzeźny- karencja przed ubojem (Finiszer!) 
Ocena ewentualnej szkodliwości kokcydiostatyków – badania EFSA 
Ocena bezpieczeństwa zwraca uwagę na ryzyko rozwoju oporności pierwotniaków oraz oporności krzyżowej w 
przypadku mikroorganizmów; teoretycznie możliwy rozwój oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe stosowane w 
leczeniu ludzi i zwierząt (vide awoparcyna!!!) 
Kokcydiostatyki Obecnie stosowane na olbrzymią skalę! W UE dodatki te stosuje się w: 97% pasz starter/grower dla 
indyków 86% pasz dla kurcząt broilerów 45% pasz dla królików 
DYREKTYWA 2002/32/WE PARLAMENTU EUROPEJSKIEGO I RADY z dnia 7 maja 2002 r. w sprawie niepożądanych 
substancji w paszach zwierzęcych 
ZAŁĄCZNIK I  SEKCJA VII: DODATKI PASZOWE, KTÓRYCH OBECNOŚD WSKUTEK NIEUNIKNIONEGO ZANIECZYSZCZENIA 
KRZYŻOWEGO JEST DOZWOLONA W PASZY, DLA KTÓREJ NIE SĄ ONE PRZEZNACZONE 
WYZNACZONE MAKSYMALE POZIOMY DLA 11 DOPUSZCZONYCH DO STOSOWANIA NA TERENIE UE KOKCYDIOSTATYKÓW 
(Maksymalna zawartośd w mg/kg (ppm) odpowiadająca paszy o zawartości wilg.12 %) 
ZMIANY W PRAWIE  od 1. 01. 2013 r. UE zakazuje profilaktycznego stosowania kokcydiostatyków w paszy   zakaz 
stosowania antybiotyków w paszach jako promotorów wzrostu od... 

Nowe regulacje prawne w zakresie kokcydiostatyków- wyzwanie  dla producentów pasz 

Prognozowany znaczny wzrost przypadków klinicznej kokcydiozy począwszy 2013r. Alternatywa dla 

kokcydiostatyków- szczepienia Czynny sposób zabezpieczania przed chorobą Stosowanie szczepionek na skalę 
przemysłową ‘92/2000 

Wiele klas szczepionek: *żywe w pełni zjadliwe  *żywe atenuowane (Livacox-Q,Paracox-8,Livacox-T, Paracox-5) *żywe 
oporne na kokcydiostatyki jonoforowe * szczepionki rekombinowane 
W najbliższym czasie znaczenie szczepionek w profilaktyce kokcydiozy będzie wzrastać- dlaczego? 
W stadach hodowlanych i u kur niosek jest to już główna metoda zapobiegania kokcydiozie 
 

Alternatywa dla kokcydiostatyków-szczepienia 

Tylko ptaki zdrowe, racjonalnie żywione, utrzymywane w dobrych warunkach 
Przez cały okres odchowu NIE dla kokcydiostatyków 
Gruba kropla, jeszcze w zakładzie wylęgowym, rozpylana nad pisklętami Z paszą, rozpylana nad karmidłami 
Z wodą (1-2h - H2O) 
Alternatywa dla kokcydiostatyków 
XXI wiek- nacisk na ekologiczny chów i hodowlę zwierząt 
Środki chemiczne? ‘naturalne dodatki paszowe’- wśród nich prym wiodą dodatki roślinne, ekstrakty substancji czynnych 
w formie standaryzowanej i stabilizowanej 
***W ekstraktach ziołowych liczne substancje prozdrowotne i stymulujące: FITOSTEROLE, FLAWONOIDY, 
KW.ORGANICZNE, OLEJKI ETERYCZNE, GARBNIKI 
Działanie: przeciwbakteryjne i przeciwpasożytnicze, immunostymulujące, immunomodulujące, antyoksydacyjne 
stymulują sekrecję kw. żółciowych i aktywność enzymatyczną pp 
poprawa wykorzystania paszy 
ZALETY EKSTRAKTÓW ROŚLINNYCH 
Alternatywa dla kokcydiostatyków- cd. ,‘Bariery’ utrudniające inwazję pp: zakwaszacze ,enzymy ,zawiesiny 
prebiotyków ,zawiesiny mikroorganizmów probiotycznych ,selekcja genetyczna zwierząt wzgl. oporności na oocysty 
Niestety.... Sprawozdanie Komisji dla Rady i Parlamentu Europejskiego ws. stosowania kokcydiostatyków jako dodatków 
paszowych: obecnie nie ma alternatywy dla ich stosowania, zapewniającej porównywalny stopień ochrony przed 
kokcydiozą! *COM (2008)2003+ 
Pilna potrzeba opracowania szybkich testów umożliwiających wykrywanie kokcydiostatyków w: 
Paszach (tzw. ‘non- target feed’) 
Produktach pochodzenia zwierzęcego (ML’s, rozporządzenie 124/2009) 

Zwłaszcza w perspektywie zmian wchodzących w życie z dn. 1.01.2013... 
Oznaczanie kokcydiostatyków w paszach- dlaczego tak istotne? 
Mniejszy nadzór instytucji państwowych nad produkcją dodatków paszowych niż produktów leczniczych, więc stos. 
kokcydiostatyków może spowodować częstsze występowanie pozostałości tych związków w żywności pochodzenia 
zwierzęcego 
Badania kontrolne w wielu krajach EU pokazały stosunkowo wysoki odsetek próbek tkanek drobiu i jaj, które zawierały 
kokcydiostatyki (SANCO/3269/2008) 
Oznaczanie kokcydiostatyków w paszach- dlaczego tak istotne/ kiedy badamy? 
Powszechność stosowania kokcydiostatyków w paszach dla kurcząt broilerów, indyków i królików 
Zagrożenie dla zdrowia ludzi i zwierząt 
Zatrucia ‘non-target’ animals 
Kurczęta u których zastosowano szczepienia ochronne p.kokcydiozie 
Kurczęta brojlery- pasza skarmiana przed ubojem (Finiszer)- zapobieżenie stratom hodowcy 
Gdy kokcydioza wystąpi w stadzie, mimo stosowania paszy z zadeklarowanym dodatkiem kokcydiostatyku 
Interakcje z niektórymi antybiotykami (upadki kur, indyków, świo, reakcje niepożądane możliwe także u kóz i bydła) 
Oznaczanie kokcydiostatyków w paszach- dlaczego tak istotne/ zanieczyszczenie krzyżowe 
‘cross-contamination’  Pewien stopień zanieczyszczenia pasz przeznaczonych dla zwierząt innych niż docelowe jest 
niemożliwy do uniknięcia ze względów technologicznych i ekonomicznych 
W wytwórniach pasz na tych samych liniach produkcyjnych wytwarzane są pasze dla różnych gatunków i kategorii 
zwierząt obniżenie stopnia zanieczyszczenia i ilości zanieczyszczonej paszy poprzez... 
zanieczyszczenie możliwe na wielu etapach produkcji, ale też podczas transportu! 

Oznaczanie kokcydiostatyków w paszach- dlaczego tak istotne? 
Zawartość kokcydiostatyków w paszach przeznaczonych dla zwierząt innych niż docelowe nie powinna przekraczać 1-3% 
max stężenia w paszy przeznaczonej dla zwierząt docelowych 
1% przyjęto dla pasz typu finiszer, pasz dla zwierząt dostarczających żywności w sposób ciągły oraz pasz gatunków 
szczególnie wrażliwych na ich działanie toksyczne (Eq-jonofory) Pasze pozostałe do 3% 
Zatrucia kokcydiostatykami u zwierząt  W przypadku jonoforów efekt toksyczny- zw. ze zmianą przepuszczalności błon 
biologicznych dla jonów  Oddziaływanie na układ krążenia, mięśnie szkieletowe i system nerwowy  Wrażliwe na 
zatrucie:  Eq > psy > małe przeżuwacze > kaczki  Wzrost ciśnienia krwi, dodatni efekt inotropowy, nekroza 
włókien mięśniowych poprzecznie prążkowanych , neuropatia obwodowa  Anoreksja, biegunka, osowiałośd, słabośd 
nóg, dusznośd, ataksja  Zatrucia kokcydiostatykami u zwierząt 

Eq :wyraźny efekt kardiotoksyczny ,poliuria, postępująca ataksja ,obfite pocenie się, kolki, zaleganie, zejścia 
śmiertelne ,sekcyjnie wyraźne wybroczyny w mięśniu sercowym, obrzęk płuc, hydrothorax,,ascites, reakcje zapalne w 
obrębie żołądka i jelit 
Pozostałości kokcydiostatyków w produktach pochodzenia zwierzęcego 
Badania kontrolne w wielu krajach EU pokazały stosunkowo wysoki odsetek próbek tkanek drobiu i jaj, które zawierały 
kokcydiostatyki (SANCO/3269/2008) 
Korelacja między stężeniem kokcydiostatyków w paszy a poziomem ich pozostałości w żywności 
Ustalono maksymalne limity (ML)zawartości kokcydiostatyków w żywności pochodzenia zwierzęcego  
ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (WE) NR 124/2009 z dnia 10 lutego 2009 r. 
ustalające maksymalne zawartości w żywności kokcydiostatyków i histomonostatyków 
pochodzących z nieuniknionego zanieczyszczenia krzyżowego tymi substancjami pasz, dla 
których nie są one przeznaczone 
Pozostałości kokcydiostatyków w produktach pochodzenia zwierzęcego 
Wynik zanieczyszczenia krzyżowego lub też skarmiania paszy nieprzeznaczonej dla danej kategorii zwierząt (pomyłki? 
działanie celowe?) Próby dodatnie zarejestrowano podczas badao przesiewowych- jaja, baranina, mięso kaczek i kurcząt 
brojlerów, wątroba kurza 
Pozostałości kokcydiostatyków w produktach pochodzenia zwierzęcego 
zagrożenie dla konsumenta??? 
Prawdopodobnie ‘ekspozycja’ wynikająca z konsumpcji żywności zawierającej pozostałości kokcydiostatyków, 
wynikające ze skarmiania paszy zanieczyszczonej krzyżowo- znacznie poniżej ADI 
Potrzeba dalszych badao 
-------------------------------------------------------------
Mikotoksyny – metody identyfikacji oraz aspekty prawne dotyczące ich obecności w paszach
Mikotoksyny produkowane są przez saprofityczne grzyby pleśniowe należące do rodzajów: Aspergillus, Penicillum, 
Fusarium Alternaria, Claviceps.
Do tej pory poznano ok. 300 mikotoksyn, z których ponad 20 stwierdza się w łańcuchu pokarmowym ludzi i zwierząt.
Za znaczące, z punktu widzenia toksykologicznego, uważa się:  - aflatoksyny B1, B2, G1, G2    - ochratoksyna A,    - 
zearalenon  - trichoteceny (deoksyniwalenol, toksyna T-2       toksyna HT-2)  - fumonizyny B1 i B2  
   
Mikotoksyny w różnym stopniu wykazują właściwości kancerogenne,teratogenne, estrogenne czy immunosupresyjne. 
Ich spożycie, w zależności od dawki i czasu podania, prowadzi do ostrej lub przewlekłej mikotoksykozy 
Mikotoksyny oznaczane w paszach: aflatoksyna B1 zearalenon  deoksyniwalenol ochratoksyna A fumonizyny B1, B2  
Jedynie oznaczanie aflatoksyny B1 ma podstawę prawną 
Rozporządzenie Komisji (UE) nr 574/2011 z dnia 16 czerwca 2011 r. zmieniające załącznik I do dyr. 2002/32/WE PE i 
Rady w odniesieniu do maksymalnych zawartości azotanu(III), melaminy, Ambrosia spp. oraz kokcydiostatyków i  
histomonostatyków pochodzących 
z zanieczyszczenia krzyżowego oraz konsolidujące załączniki I i II do tej dyrektywy. 
W przypadku pozostałych mikotoksyn stosuje się Zalecenia Komisji UE z dnia 17 sierpnia 2006 r. w sprawie obecności 
deoksyniwalenolu, zearalenonu, ochratoksyny A  oraz  fumonizyn w produktach przeznaczonych do żywienia zwierząt,  
jednakże ich  oznaczanie nie ma podstawy prawnej.
   
Aflatoksyna B1 - dopuszczalne limity
Materiały paszowe-0,02 mg/kg ;Mieszanki paszowe uzupełniające i pełnoporcjowe- 0,01 mg/kg
z wyjątkiem: — mieszanek paszowych pełnoporcjowych dla bydła mlecznego i cieląt, owiec mlecznych i jagniąt, kóz 
mlecznych i koźląt, prosiąt i młodego drobiu-0,005 mg/kg
- mieszanek paszowych pełnoporcjowych dla bydła (z wyjątkiem bydła mlecznego i cieląt), owiec (z wyjątkiem owiec 
mlecznych i jagniąt), kóz (z wyjątkiem kóz mlecznych i koźląt), świń (z wyjątkiem prosiąt) i drobiu (z wyjątkiem 
młodego drobiu)-0,02 mg/kg
Dopuszczalne, orientacyjne limity mikotoksyn wg Zalecenia Komisji UE z dnia 17 sierpnia 2006 r. 
Deoksyniwalenol- 900 -1200 μg/kg *Zearalenon- 100 -3000 μg/kg *Ochratoksyna A- 50 – 250 μg/kg *Fumonizyna B1 
+ B2- 5000 – 60000 μg/kg 
Analiza mikotoksyn w paszach Składa się z następujących etapów: 1. Pobieranie i przygotowanie reprezentatywnej 
próbki 2. Ekstrakcja 3. Oczyszczanie 4. Analiza ilościowa/jakościowa za pomocą wybranej techniki   5. Potwierdzenie 
otrzymanego rezultatu za pomocą innej techniki badawczej 
Metody analizy ilościowej/jakościowej mikotoksyn
Metody chromatograficzne Metody immunoenzymatyczne (np. testy ELISA) 
Metody chromatograficzne stosowane do identyfikacji mikotoksyn
Chromatografia cienkowarstwowa  
TLC -       Thin Layer Chromatography   HPTLC – High Pressure Thin Layer 
Chromatography
 Chromatografia cieczowa  (LC – Liquid Chromatography)   - do detekcji mikotoksyn stosuje się detektory 
fluoroscencyjne (FLD)  lub mas (MS)
 Chromatografia gazowa  (GC – Gas Chromatography   połączona ze spektrometrią mas (GC/MS) 

Budowa DNA
Nukleotydy składają się z dezoksyrybozy, zasady organicznej (A, T, G, C) oraz reszty kwasu fosforowego
Połączone nukleotydy tworzą podwójną helisę Nici podwójnej helisy są polarne – mają koniec 3` i 5` i w podwójnej 
helisie przebiegają antyrównolegle Sekwencja nukleotydów w DNA jest ściśle zdefiniowana
Komplementarność zasad w DNA. Adenozyna zawsze tworzy parę z tymidyną, a guanozyna z cytydyną. 
Odcinki DNA dodane do roztworu jednoniciowego DNA „odszukują” sekwencje komplementarne i łączą się z nimi ; 
Cząsteczki DNA ulegają denaturacji, polegającej na rozwinięciu dwuniciowej helisy i rozdzieleniu łańcuchów 
polinukleotydowych w wyniku rozerwania wiązań pomiędzy sąsiednimi zasadami azotowymi; Denaturację można 
uzyskać poprzez podwyższenie temperatury, zmianę pH, dodanie mocznika; Usunięcie czynnika denaturującego 
powoduje renaturację, czyli odtworzenie dwuniciowej struktury DNA w sposób bardzo precyzyjny (hybrydyzacja); 
Replikacja DNA – podwajanie cząsteczki DNA.; Substratami dla replikacji są matrycowa nić DNA i trifosforany 
nukleotydów.

Semikonserwatywność replikacji - w czasie replikacji do każdej nici macierzystej zostaje dobudowana nić potomna; 
Podstawowy enzym to polimeraza DNA.; Polimeraza DNA działa wyłącznie w kierunku 5` 

 3`. 

Nie może rozpocząć replikacji od samego końca cząsteczki, wymaga startera (primera)
W komórkach bakteryjnych istnieje system restrykcji – modyfikacji, jako obrona przed atakiem wirusów, można go 
porównać do systemu zgodności tkankowej ssaków
 Bakteria należąca do określonego szczepu w swoisty sposób metyluje swój DNA. 
Obcy DNA jest niszczony przez restryktazy
Enzymy restrykcyjne rozpoznają ściśle określone sekwencje DNA i przecinają cząsteczki DNA w obrębie tych 
sekwencji
Rozpoznawane sekwencje są zazwyczaj cztero lub sześcionukleotydowe i są palindromami – obydwie nici odczytane 
zgodnie z polarnością DNA mają te same sekwencje. Mają wiec oś symetrii
Nazewnictwo: Hin d III 
trzeci z enzymów wyizolowanych z Haemophilus influenzae, serotypu d

Odkrycie restryktaz w późnych latach sześćdziesiątych kilka lat później doprowadziło do 

gwałtownego rozwoju technik inżynierii genetycznej
PCR (Polymarase Chain Reaction) - reakcja łańcuchowa polimerazy
1983 – PCR1993 – Nagroda Nobla w dziedzinie chemii
PCR służy do powielania określonych sekwencji DNA odzwierciedlając naturalny proces replikacji.
Metodą tą można uzyskać miliony kopii określonego rejonu DNA, pod warunkiem, że znane są sekwencje oskrzydlające 
(flankujące) ten fragment (odcinki starterowe – primery).
Mieszanina reakcyjna zawiera
parę starterów (primerów) (20 – 30 nukleotydów), komplementarnych do amplifikowanej sekwencji, ograniczających 
długość syntetyzowanego fragmentu. Oba primery są komplementarne do sekwencji biegnących od końca 5` do końca 3` 
nici DNA, więc każdy z nich wiąże się tylko do jednej z nici
trójfosforany wszystkich czterech deoksyrybonukleotydów (dNTP), stanowiących substraty reakcji i dostarczających 
energii do jej przebiegu 
bufor o odpowiednim pH z jonami Mg+2
termostabilną polimerazę DNA
amplifikowany fragment DNA (matryca)
Cykl PCR obejmuje trzy etapy
1. denaturacja dwuniciowej matrycy, w temperaturze 95

°

C, przez 15 s

2. hybrydyzacja (annealing) starterów do jednoniciowej matrycy w temperaturze ok. 54

°

C. Startery są dodawane w 

takim nadmiarze, w stosunku do matrycy, że szansa ich przyłączenia do niej jest znacznie większa, niż szansa renaturacji 
matrycy.
3. synteza nici komplementarnej (elongacja) w temperaturze 72

°

C, optymalnej dla działania polimerazy Taq.  Enzym 

dodaje kolejne nukleotydy do końca 3` startera związanego z nicią DNA.
Polimeraza Taq jest enzymem izolowanym z termofilnych bakterii – Thermus aquaticus , żyjących w gorących źródłach 
w temperaturze 70-80

°

C. Enzym  znosi temperatury powyżej 90

°

C.

Etapy PCR powtarza się 20 - 40 razy. Wszystkie nowopowstałe cząsteczki DNA służą jako matryce w kolejnych cyklach 
PCR, co prowadzi do logarytmicznego wzrostu ilości produktu PCR.
Cechy PCR
nie musi być znana sekwencja powielanego odcinka DNA, jedynie sekwencje flankujące
powielany odcinek DNA może być znacznie dłuższy, niż startery. Możliwe jest powielanie odcinków 10 kz i 
dłuższych
PCR jest metodą bardzo specyficzną ze względu na dużą dokładność hybrydyzacji
PCR jest metodą niezwykle czułą, pozwalającą wykryć nawet pojedynczą cząsteczkę DNA
Metody analizy produktów PCR
elektroforeza (jeśli stosuje się startery specyficzne)
ZASTOSOWANIE PCR
wykrywanie zafałszowań w żywności (białka obcogatunkowego w paszach)
identyfikacja chorobotwórczych mikroorganizmów
diagnostyka chorób genetycznych
identyfikacja osobnicza (kryminalistyka, ustalanie ojcostwa)
sekwencjonowanie
RFLP (Restiction Fragment Length Polimorphism).
PCR-RFLP
Metoda pozwala na identyfikację gatunkową przetworzonego białka zwierzęcego w paszach
Amplifikacji poddaje się konserwatywny region mitochondrialnego DNA (16S rRNA, mt ATP synthase) – startery 
specyficzne dla danego gatunku (przeżuwacze)
trawienie produktu PCR odpowiednim enzymem restrykcyjnym (BlnI)
Za wrażliwość odpowiedzialna jest punktowa mutacja w genie mięśniowego receptora kontrolującego transport Ca++ z 
retikulum do sarkoplazmy
Mutacja c na t w genie RYR w pozycji 1843 powoduje zastąpienie argininy przez cysteinę. Efektem jest nadwrażliwość 
kanału wapniowego na bodźce powodujące jego otwarcie. 
Zwiększone stężenie Ca+2 w cytoplazmie powoduje skurcze mięśni, przegrzanie organizmu oraz hipermetabolizm 
prowadzący do nagromadzenia mleczanu
Wykrywanie chorobotwórczych mikroorganizmów
W porównaniu z np. ELISA, PCR jest 10-krotnie czulszy
Możliwość szybkiego typowania trudnych w hodowli bakterii  
Mycobacterium tuberculosis; Campylobacter sp. 
wymagających specyficznych warunków wzrostu ich identyfikacja metodami konwencjonalnymi zajmuje wiele dni; 
Odróżnianie szczepów chorobotwórczych od nie chorobotwórczych przez wykorzystanie jako celu PCR genów 
kodujących toksyny
Badania epidemiologiczne
Amplifikacji poddaje się powtarzające się i silnie zmienne elementy genomu bakterii lub fragmenty DNA 
rybosomalnego charakteryzujące się wysoką zmiennością 
Zakres identyfikacji genetycznej obejmuje 15 nie kodujących układów genomu ludzkiego (STR). 
Technika PCR, jaką posługujemy się w procesach badawczych, pozwala na identyfikację osoby (osób) na podstawie 
materiału biologicznego
Biologicznym materiałem badawczym dla celów identyfikacji genetycznej są:
plamy krwi, spermy oraz zabrudzenia usuwane (poprzez np: zmywanie, zapieranie, zeskrobywanie) materiał biologiczny 
z zasady niewidoczny (np.: ślina na gumie do żucia), 
wydzieliny ciała ludzkiego naniesione na inne podłoże w wyniku jego dotykania lub użytkowania (np.: butelki, używane 
szklanki, kierownice i lewarki kradzionych samochodów, niedopałki papierosów, chusteczki higieniczne, odzież, 
grzebienie, szczoteczki do zębów i inne)
   Ekspertyzy ojcostwa 
Wykonywane w laboratorium Instytutu Badań DNA prowadzone są w oparciu o zestaw typu multiplex PCR - 
"AmpFLSTR Identifiler", obejmujący aż 16 układów STR (wraz z markerem płci)
Uzyskiwane każdorazowo wyniki prawdopodobieństwa potwierdzenia ojcostwa są wyższe niż 99,999%
Ćw2./Metody izolacji DNA z paszy/komercyjne zestawy do izolacji/metoda Tartaglia- z buforem tiocyjanianu 
guanidyny, zawiesiny SiO

2

 i kazeiny/metoda Wanga – z usieciowanym polistyrenem Chelex-100/metoda z użyciem 

mieszaniny fenol:chloroform:alkohol izoamylowy
Metoda z użyciem mieszaniny fenol:chloroform:izoamyl Próbka paszy 0.5-1g+/ Bufor TSM 1ml (0.2M Tris pH 8.0, 
0.1M EDTA, 1% SDS) proteinaza K (20mg/ml)/ Inkubacja w 55

°

C przez noc

szereg fenolowo – chloroformowy +  wytrącanie DNA etanolem absolutnym z dodatkiem 7M octanu amonu
Próbka po lizie proteinazą K1.Wirować 5min RT/max speed2. Ekstrakcja DNA mieszaniną fenolu, chloroformu i 
alkoholu izoamylowego (przenieść do nowej probówki fazę wodną i dodać 300 µl mieszaniny)3. Wirować 5min RT/max 
speed4. Powtórzyć kroki 2-35.Wytrącanie alkoholem absolutnym z dodatkiem octanu amonu (do oczyszczonej fazy 
wodnej dodać 1ml alkoholu absolutnego i 30  µl  7M octanu amonu i schłodzić 10min/-20 

°

C 6. Wirować 5min/RT/max 

speed7.  Osuszyć i zawiesić w 50 µl wody
PCR Ruminant 16S rRNAPork 12S rRNAFish 12S rRNAPoultry 12S rRNA
Startery:  Bos sens + antysens Sus sens + antysens Fish sens + antysens Gallus sens + antysens 
Mieszanina fosforanów: dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Bufor: 10mM Tris-HCl pH 8.8, 50mM KCl, 0.08% NP40, 1.5mM MgCl

Polimeraza DNA 30 CYKLI PCR: 94 

°

C  - 15 

s 50 

°

C  - 30 s 72 

°

C  - 30 s Czas: ~ 1.5 h Polimeraza Taq z Thermus aquaticus Błędy 1 na 9,000 nukleotydów Szybkość 

2 000 pz / min.Polimeraza Pfu z Pyrrococcus furiosus  Błędy 1 na 1.3 milionów nukleotydów  Szybkość 500 pz / min. 
Polimerazy otrzymane na drodze inżynierii genetycznej:
Szybkość 6 000 pz / min. /Ograniczenia PCR/obróbka termiczna próbek/występowanie w paszach czynników 
hamujących, które mogą wiązać cząstki krzemioniki (m. Tartaglia)/DNA pochodzące z dozwolonych składników 
dodawanych do pasz (mleko)
Elektroforeza
Metoda pozwalająca na ocenę wielkości fragmentów DNA w mieszaninie. 
Ujemnie naładowane cząsteczki DNA w polu elektrycznym wędrują do elektrody dodatniej (anody). 
Usieciowanie żeli wywołuje różnice w prędkościach wędrówki cząsteczek, tak że najszybciej wędrują cząsteczki 
najmniejsze
Żele poliakrylamidowe stosuje się do rozdzielania fragmentów DNA do 500 bp. Żele agarozowe do fragmentów 
większych
Wraz z fragmentami DNA o nieznanych masach w żelach rozdziela się jednocześnie standardy masy – mieszaninę 
fragmentów DNA o znanych, ściśle określonych masach cząsteczkowych
Wizualizacja rozdzielonych fragmentów DNA
bromkiem etydyny w przypadku elektroforezy w agarozie, srebrem w przypadku elektroforezy w poliakrylamidzie
GMO –  ORGANIZM MODYFIKOWANY GENETYCZNIE
to organizm inny niż organizm człowieka, w którym materiał genetyczny został zmieniony w sposób nie zachodzący w 
warunkach naturalnych wskutek krzyżowania lub naturalnej rekombinacji, w szczególności przy zastosowaniu:
- technik rekombinacji DNA z użyciem wektorów, w tym tworzenia materiału genetycznego poprzez włączenie do 
wirusa, plazmidu lub każdego innego wektora cząsteczek DNA wytworzonych poza organizmem i włączenie ich do 
organizmu biorcy, w którym w warunkach naturalnych nie występują, ale w którym są zdolne do ciągłego powielania,
- technik stosujących bezpośrednie włączenie materiału dziedzicznego przygotowanego poza organizmem, a w 
szczególności: mikroiniekcji, makroiniekcji i mikrokapsułkowania,
- metod nie występujących w przyrodzie dla połączenia materiału genetycznego co najmniej dwóch różnych komórek, 
gdzie w wyniku zastosowanej procedury powstaje nowa komórka zdolna do przekazywania swego materiału 
genetycznego odmiennego od materiału wyjściowego komórkom potomnym.
Otrzymywanie roślin genetycznie zmodyfikowanych
Wprowadzanie genów do roślin
 Elektroporacja -  działanie polem elektrycznym na protoplasty celem zwiększenia przepuszczalności błon 
komórkowych. 
- Metoda chemiczna – dezorganizacja błon komórkowych i zwiększenie ich przepuszczalności za pomocą glikolu 
polietylenowego (PEG).
Rośliny modyfikowane genetycznie – cele modyfikacji
odporność na herbicydy - chemiczne środki ochrony roślin,
odporność na szkodniki - modyfikacja Bt,
odporność na choroby wirusowe, grzybowe, bakteryjne,
odporność na niekorzystne warunki środowiska (zasolenie gleby, mróz, susza, metale ciężkie),
poprawa lub nadanie nowych cech jakościowych.
Odporność na Herbicydy - Najpowszechniejsza modyfikacja (gł. soja i rzepak), pozwala na stosowanie herbicydu 
(środka chwastobójczego) bez obawy o zniszczenie uprawianych roślin. 
Do rośliny wprowadzany jest gen, który odpowiada za produkcję enzymu rozkładającego dany herbicyd (glifosat, 
glufosynat). 
Odporność na szkodniki – modyfikacja Bt - Wprowadza się geny z bakterii glebowej 

 

 Bacillus thuringensis

 

 ,   

odpowiedzialne za produkcję toksycznego dla owadów-szkodników białka (Cry) . Białko Cry jest toksyczne tylko dla 
określonych gatunków owadów. Związane jest to z występowaniem specyficznych receptorów dla białka Cry w 
przewodzie 
pokarmowym owadów. Tak modyfikowana jest głównie kukurydza (kukurydza MON 810), bawełna oraz ziemniaki 
przeciw stonce ziemniaczanej.
odporność na choroby wirusowe (Wprowadzenie genów kodujących białka otoczki wirusowej), grzybowe, bakteryjne 
(Wprowadzenie genów kodujących enzymy, które rozkładają ściany komórkowe - chitynazy, glukanazy).
Odporność na niekorzystne warunki środowiska - Odporność na niekorzystne warunki środowiska pozwala uprawiać 
rośliny na terenach gdzie wcześniej uprawa nie była możliwa. Dzięki modyfikacjom są one bardziej odporne na 
zasolenie gleby, suszę, mróz, czy zanieczyszczenie metalami ciężkimi. Tworząc rośliny akumulujące metale ciężkie 
próbuje się oczyszczać glebę z zanieczyszczeń (fitoremediacja).
poprawa lub nadanie nowych cech jakościowych - - kawa ze zmniejszoną o 70% ilością kofeiny. Uzyskano ten efekt 
poprzez zmniejszenie aktywności syntazy kofeiny,
- zwiększenie zawartości kwasu oleinowego w soi i rzepaku,
- uzyskanie tytoniu (Vector 21-40) o 20 razy mniejszej dawce nikotyny – ilość ta jest mniejsza od progu uzależnienia i 
15 razy mniejszej zawartości substancji rakotwórczych,
- goździki o intensywnej niebiesko-fioletowej barwie, uzyskano poprzez nadprodukcję karotenoidów, roślinę 
wyposażono dodatkowo w odporność na szkodniki typu Bt,
- trawa, która została specjalne stworzona do celu sportowych i rekreacyjnych. Wymaga znacznie mniej wody, 
herbicydów, fungicydów i mniejszego nakładu energii.
GMO w Polsce - W Polsce istnieje zakaz handlu ziarnami GMO z przeznaczeniem na wysiew. Natomiast sam wysiew 
nie jest zabroniony.
Genetycznie modyfikowana Żywność (Pasze) -Żywność genetycznie zmodyfikowana jest to żywność zawierająca GMO, 
składająca się z GMO lub wyprodukowana z GMO.
Za żywność genetycznie zmodyfikowaną nie uznaje się produktów zawierających GMO w ilości mniejszej niż 0,9% w 
odniesieniu do składnika.
Produkty zawierające w swoim składzie powyżej 0,9 % masy składników modyfikowanych genetyczne muszą zawierać 
stosowną informację na opakowaniu. 
Genetycznie modyfikowana Żywność
Obawy towarzyszące roślinom genetycznie modyfikowanym Powstanie super chwastów i super 

patogenów/Negatywny wpływ GM na organizmy niedocelowe/Niekontrolowane rozprzestrzenianie GMO/Uodparnianie 
mikroorganizmów na antybiotyki/Zagrożenia ekonomiczne. Uzależnienie produkcji rolnej od kilku koncernów.
Rozpoznanie i identyfikacja roślin GMO/Metody oparte na analizie DNA za pomocą PCR, Real Time PCR. / Metody 
oparte na detekcji białek bazujące na    reakcjach immunologicznych pomiędzy przeciwciałem a specyficznym 
antygenem, np. test ELISA./ Metody alternatywne: HPLC, MS, NIR
PCR w czasie rzeczywistym,Real-time PCR
Monitorowanie zmian stężenia produktu następuje poprzez pomiar fluorescencji proporcjonalnej do ilości 
produktu w mieszaninie
FLUORESCENCJA,
10 – 1000 razy czulsza od pomiaru absorpcji,SYBR Green I,Sondy 
oligonukleotydowe,TaqMan,Molecular beacons,Real-time PCR ultra czułość -limit detekcji to ok. 5 kopii DNA
DETEKCJA GMO/ Wybór genu referencyjnego housekeeping gene (kontrola wewnętrzna) – gen lektyny, inwertazy, 
zeiny /Wybór elementu rozpoznania organizmu transgenicznego (promotor, sekwencja kodująca, terminator, marker 
selekcyjny)
Najczęściej stosowane elementy rozpoznania organizmu transgenicznego
Promotory- P35S - promotor genu 35S wirusa choroby mozaikowej kalafiorów (CaMV35S) P-nos – promotor syntazy 
nopaliny Agrobacterium tumefaciens
Terminatory- T-nos - terminator syntazy nopaliny Agrobacterium tumefaciensT-35S - terminator genu 35S wirusa 
choroby mozaikowej kalafiorów
Sekwencje kodujące, gen cp4 epsps – oporność na glifosat, gen pat – oporność na pestycydy zawierające glufosynat 
amonowy, gen cry – odporność na niektóre szkodniki z rzędu Coleoptera
Wyznaczenie zawartości soi GM w próbce, Normalizacja soi GM względem całkowitej zawartości soi (∆C

T

), 

Sporządzenie krzywej standardowej,Wyznaczenie zawartości soi GM w próbce na podstawie krzywej standardowej