Instrukcja do ćwiczenia 2
BADANIE WŁASNOŚCI BIAŁEK
ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA
●
Budowa, podział i własności amfoteryczne aminokwasów
●
Właściwości białek, białka jako polielektrolity, wpływ pH na ładunek białek i ich rozpuszczalność, właściwości
amfoteryczne. Wiązanie wody i wpływ soli na rozpuszczalność białek
●
Główne frakcje białek osocza – skład, własności i funkcje.
1. Oznaczanie punktu izoelektrycznego (pI) kazeiny
Zasada: Białka są amfoterycznymi polielektrolitami. Ładunek cząsteczki białka zależy od stężenia jonów wodorowych w
środowisku i jego wartość zmienia się wraz ze zmianą pH. Wartość pH, w którym cząsteczka białka zawiera tę samą liczbę
zjonizowanych grup dodatnich i ujemnych, odpowiada punktowi izoelektrycznemu (pI) białka, wówczas jego sumaryczny
ładunek równy jest zero. Białko w tym punkcie nie wędruje w polu elektrycznym, ma najniższą rozpuszczalność i najmniejszą
lepkość, najłatwiej je wtedy wytrącić lub wykrystalizować. Białka w pI wykazują również najmniejsze ciśnienie osmotyczne,
najsłabiej pęcznieją i nie reagują z anionami ani z kationami.
Punkty izoelektryczne (pI) przykładowych białek
Pepsyna 1,0
Albumina osocza 4,8
Insulina 5,3
Globuliny osocza 5,0-7,0
Hemoglobina 6,8
Mioglobina 7,0
Histony 10-11
Trypsyna 10,5
Cytochrom c 10,6
Wykonanie:
10 probówek (wysokich) w statywie opisz nr od 1 do 10 i wprowadź do nich kolejno roztwory wg instrukcji w tabeli 1:
Numer probówki
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Roztwór
Dodana ilość (ml)
H
2
O
1,5M CH
3
COOH - tylko do 1
probówki, dalej kolejne rozcieńczanie:
przenosząc 5 ml z poprzedniej do
następnej probówki, po wymieszaniu
0,5% kazeina w 0,1M
CH
3
COONa (wymieszać)
5,5
4,5
1
5
5
1
5
5
1
5
5
1
5
5
1
5
5
1
5
5
1
5
5
1
5
5
1
5
5
1
5 ml
wylać
Stopień wytrącenia, po 20 min.
(w skali od 0 do +5)
Obliczona wartość pH
Zmierzona wartość pH
Ustal pI kazeiny, zinterpretuj uzyskane wyniki.
2. Hydratacja i wysalanie białek
Zasada: Rozpuszczalność białek zależy od zdolności cząsteczek do hydratacji czyli oddziaływania między polarnymi grupami
białka a dipolami wody. Na rozpuszczalność białek wpływa też obecność soli (małych stężeń) oraz wartość pH roztworu. Przez
hydratację zatem należy rozumieć otaczanie się cząsteczek białka płaszczem wodnym. Woda hydratacyjna, nieodłączna część
cząsteczki białka, wpływa na właściwości strukturalne i funkcjonalne białka. Cząsteczka białka wiąże dipole wody przez polarne
grupy hydrofilne łańcuchów bocznych aminokwasów oraz atomy N i O wiązań peptydowych. Białko rozpuszczone w niewielkiej
ilości wody wchłania ją i tworzy galaretowaty żel, w którego przestrzeniach gromadzą się cząsteczki H
2
O. Niewielkie ilości soli
nieorganicznych zwiększają rozpuszczalność białek – jest to wsalanie. Przypuszczalnie jony soli zobojętniają zjonizowane grupy
białek odpowiedzialne za przyciąganie między cząsteczkami. Jeśli jednak stężenie soli będzie wzrastać, korzystny wpływ jonów
soli na rozpuszczalność ustaje i przy dużym stężeniu soli białka rozpuszczalne w wodzie wytrącają się z roztworu, a proces ten
nazywa się wysalaniem białek. W celu wysalania stosuje się sole, których jony łatwo tworzą wodziany i pozbawiają białka
płaszcza wodnego, sprzyja to ich asocjacji w większe agregaty o zmniejszonej rozpuszczalności, dlatego agregaty białkowe
wypadają z roztworu. Stężenie soli potrzebne do wysalania białek zależy od ich właściwości oraz pH środowiska. Najłatwiej
wysolić białko w jego punkcie izoelektrycznym, ponieważ cząsteczki na zewnątrz obojętne łatwo asocjują w większe agregaty
wypadające z roztworu. Do wysalania najczęściej stosuje się (NH
4
)
2
SO
4
, Na
2
SO
4
, MgSO
4
. Wysalanie białek jest procesem
odwracalnym, usunięcie soli, np. przez dializę, sprawia, że wytrącone białko ponownie rozpuszcza się i wykazuje swe biologiczne
właściwości. Wysalanie stosuje się do wstępnego frakcjonowania białek, również osocza. Z osocza wytrąca się fibrynogen przy
25% nasyceniu siarczanem amonu, większość globulin osocza wytrąca się przy 50% nasyceniu siarczanem amonu, natomiast
albuminy i dobrze rozpuszczalne globuliny wysalane są dopiero przy 80% nasyceniu siarczanem amonu.
