Cz.1_ GENETYKA_Laboratorium_2013

Cz.1_ GENETYKA_Laboratorium_2013

Teoria

I. Podło

a mikrobiologiczne.

Podło

e mikrobiologiczne jest to sztucznie stworzone

rodowisko do hodowli

drobnoustrojów. Zawieraj

w postaci przyswajalnych zwi

zków, pierwiastki uczestnicz

ce w

tworzeniu masy komórkowej. Mikroorganizmy do wzrostu wymagaj

ródła energii i w

gla, siarki,

azotu, tlenu, soli mineralnych i czasem tzw. czynników wzrostowych. Czynniki wzrostowe to

substancje od

ywcze, takie jak witaminy, aminokwasy czy zasady purynowe i pirymidynowe.

Substancje te wchodz

w skład komórek, ale nie wszystkie organizmy potrafi

je syntetyzowa

Organizmy wymagaj

ce do wzrostu takich dodatkowych czynników nazywaj

auksotrofami ( np. auksotrof uracylu), w odró

nieniu do prototrofów, które nie s

uzale

nione od dodatkowych substancji od

ywczych.

Ze wzgl

du na skład, podło

a dzielimy na a) minimalne, b) pełne c) wzbogacone.

Podło

a a) minimalne zawieraj

tylko

ródło energii, w

gla i sole mineralne oraz czasem

pojedyncze czynniki wzrostowe (dla dro

dzy jest to np. podło

e SD, syntetic dextrose) . Odmian

podło

a SD jest tzw. SC, czyli minimalne z dodatkiem mieszaniny aminokwasów, lub bez

okre

lonego czynnika (np. SC-leu, bez leucyny) .

Podło

a b) pełne zawieraj

wszystkie substancje niezb

dne do dobrego wzrostu

drobnoustrojów (

ródło w

gla, azotu, sole mineralne, wiele czynników wzrostowych), (dla dro

jest to np. podło

e YPD, yeast peptone-dextrose).

Podło

a wzbogacone stosuje si

do hodowli drobnoustrojów słabo rosn

cych in vitro,

wymagaj

cych dodatkowych substancji od

ywczych. Jako czynniki wzbogacaj

ce podło

a stosuje

: krew, surowic

, płyny wysi

kowe, wyci

g w

trobowy, mleko,

ółtko jaj, sok z pomidorów.

Przykładowe po

ywki dro

owe:

Podło

e minimalne SD:

Zestaw soli mineralnych

6,7 g

Glukoza

20 g

Woda destylowana

1000 ml

Podło

e pełne YPD:

Bacto-Ekstrakt dro

owy

10 g

Bacto-Pepton

20 g

Glukoza

20 g

Agar

20 g

Woda destylowana

1000 ml

PYTANIA

1. Jak nazwiemy szczep który ro

nie na podło

u minimalnym

2. Jak nazwiemy szczep który nie potrafi syntetyzowa

leucyny?

3. Czy wyro

nie on na podło

u a) SD b) Sc-leu, c) YPD d) SD+leu

II. Dro

e Saccharomyces cerevisiae, genetyczny organizm modelowy

Dro

e Saccharomyces cerevisiae s

modelowym organizmem eukariotycznym. Cechuj

niewielkim genomem (zawieraj

cym około 6 ty

. genów), mał

liczb

chromosomów, oraz krótkim

czasem podziału komórkowego (w warunkach optymalnych 90 min). S

mikroorganizmami łatwymi do

hodowli (mo

na je zamra

, s

niewielkich rozmiarów itp.) i manipulacji genetycznych. Nie formuj

grzybni, rozmna

wegetatywnie przez p

czkowanie. Ogromn

zalet

dro

y jest mo

liwo

ść

utrzymywania ich zarówno jako haplo- b

diploidów. Haploidy mog

wyst

powa

jako dwa typy

kojarzeniowe: a lub

. Ró

od siebie genetycznie locus MAT, okre

laj

cym typ kojarzeniowy.

Wyst

puj

dwa allele tego locus: MATa i MAT

. Szczep MATa kojarzy si

ze szczepem MAT

poprzez

kompleksowy proces cytoplazmatycznej i j

drowej fuzji dzi

ki czemu powstaje komórka 2n (a/

Pod wzgl

dem zmienno

ci typu kojarzeniowego wyró

nia si

dro

e stabilne

(heterotalliczne) i niestabilne (homotalliczne). Jest to uzale

nione od genu HO, który odpowiada za

zmian

typu kojarzeniowego przy ka

dym podziale mejotycznym komórki. Naturalnie wyst

puj

szczepy dro

y s

diploidalne i maj

funkcjonalny allel genu HO, powoduj

cy spontaniczn

zmian

typu kojarzeniowego co ka

dy podział mitotyczny. Szczepy laboratoryjne maj

zmutowany/wydeletowany gen ho i dzi

ki temu mog

utrzymywane jako szczepy o

niezmiennym typie kojarzeniowym. Komórka o stabilnym typie kojarzeniowym dziel

c si

mitotycznie produkuje komórki potomne o takich samych typie kojarzeniowym. Istnienie stabilnej

fazy haploidalnej jest wyj

tkowo atrakcyjne dla genetyków ze wzgl

du na mo

liwo

ść

izolacji i

identyfikacji szczepów nios

cych recesywne mutacje. Istnienie stabilnego diploida jest równie

bardzo korzystne dla genetyków. Pozwala na okre

lenie recesywno

ci lub dominacji nowej mutacji

lub na przeprowadzenie testu komplementacji (czy szczepy nios

ce po jednej mutacji nios

allele

tego samego genu czy s

to mutacje w ró

nych genach). Gdy dro

e s

wystawione na stres

np. niekorzystne warunki pokarmowych, komórki diploidalne przechodz

mejoz

produkuj

cztery komórki potomne, zwane askosporami: dwie typu kojarzeniowego a- i dwie typu

kojarzeniowego

-Askospory tworz

tetrad

, która jest zawarta w pojedynczej strukturze

zwanej ascus (worek). Gdy przywróci si

odpowiednie warunki pokarmowe, ka

da z tych czterech

askospor wykiełkuje i zacznie si

rozmna

jako haploid.

ys.1.Schemat cyklu

yciowego

Sacharomyces cerevisiae.(za F. Sherman)

PYTANIA

1. Podaj przynajmniej dwa powody dla których dro

e s

dobrym organizmem a) do

pracy w laboratorium, b) dla genetyków

2. Jakie typy kojarzeniowe maj

haploidalne askospory pochodz

ce z jednej tetrady?

III.

Nomenklatura genetyczna

Akceptowane nazewnictwo chromosomalnych genów dro

y S. cerevisiae przedstawia

tabela 1. stosuj

c ARG2 jako przykład. Nazwy genów, alleli lub loci pisane s

kursyw

symbol

definicja

MATa

Typ kojarzeniowy a

MATa

Typ kojarzeniowy alfa

∆

delecja (usuni

cie genu HO) koduj

cego endonukleaz

umo

liwiaj

cego zamian

genów

ARG

Wszystkie allele typu dzikiego kontroluj

ce syntez

argininy

ARG2

locus lub dominuj

cy allel w szalku syntezy argininy

arg2

locus lub allel recesywny w szalku syntezy argininy haploidalny

arg2/arg2

locus lub allel recesywny w szalku syntezy argininy diploidalny

arg2-

∆

specyficzne całkowite lub cz

ęś

ciowe usuni

cie arg2

ARG2 :: LEU2

Wprowadzenie funkcjonalnego genu LEU2 w locus ARG2. Gen ARG2

pozostaje działaj

cy i dominuj

PYTANIA

1. Co według ciebie oznacza zapis genotypu:

BY: Mata; ADE, his, LEU3, lys2

2. Jak zapisałby

genotyp szczepu diploidalnego, prototrofa adeniny a auksotrofa

uracylu?

IV. Rekombinacja genetyczna i mapowanie mejotyczne (analiza tetrad)

Skutki rekombinacji genetycznej mo

na zaobserwowa

gdy w

ród genotypów potomstwa znajd

genotypy inne ni

rodziców. Prostym przykładem rekombinacji jest krzy

ówka:

F1:

AA BB (czyli AB/AB) x aa bb (ab/ab)

Gamety1:

Zygota

AaBb

Gamety 2: typ rodzicielski:

rekombinanty:

Pełna niezale

ść

dwóch loci jest zapewniona, gdy umieszczone s

one na osobnych

chromosomach, s

to loci „w pełni nie sprz

ęż

one”. Im dalej od siebie geny le

żą

na chromosomach

tym cz

ęś

ciej zachodzi mi

dzy nimi rekombinacja.

Jednostk

odległo

ci mapy genetycznej jest centymorgan (cM) liczony wg wzoru poni

ej:

liczba rekombinantów
------------------------------------- x 100 = liczba cM
całkowita liczba potomstwa

1 cM to 1% rekombinacji (rekombinantów w

ród potomstwa)

50 cM oznacza 50% rekombinacji; zachodzi gdy 2 geny le

żą

odpowiednio daleko na jednym

chromosomie lub na dwóch chromosomach.

Mapowanie oparte o analiz

produktów mejozy jest tradycyjn

metod

genetyki klasycznej

okre

lenia kolejno

ci i odległo

ci genów. Dro

e szczególnie dobrze nadaj

do zastosowania

tej metody poniewa

cztery haploidalne spory w ascus/worku s

produktami jednego wydarzenie

mejotycznego. Genetyczna analiza takich tetrad pozwala na ustalanie wzajemnego poło

enia

genów obecnych w stanie heterozygotycznym diploidzie. Mo

liwe jest równie

mapowanie

poło

enia genu w stosunku do jego centromeru. W tym przypadku nale

y u

krzy

ówki

organizmów zawieraj

cych gen sprz

ęż

ony z centromerem oraz drugi le

żą

cy w znanej odległo

ci od

niego.

Izolacja czterech spor z ascus jest jednym z trudniejszych technik genetyki dro

y, wymagaj

cych

pracy na mikromanipulatorze i du

ej praktyki. Analiza tetrad jest rutynowo wykonywana w

kszo

ci laboratoriów pracuj

cych z dro

ami. Obecnie stosuje si

te technik

nie do

mapowania genetycznego, lecz raczej do okre

lania tempa mutacji odpowiadaj

cych za zmiany w

pojedynczym locus, do „tworzenia” nowych szczepów i do badania interakcji genów.

Dla szczepu hybrydowego (AB x ab) który jest heterozygotyczny pod wzgl

dem markerów istniej

3 typy tetrad: PD (rodziców/parental ditype), NPD (bez rodziców/ nonparental ditype) i T (typ_tetra)

jak pokazano na rysunku poni

ej. Na podstawie wzajemnego stosunku ilo

ciowego tych tetrad

na wnioskowa

o sprz

ęż

eniach genowych i centromerowych

•

li dwa geny s

sprz

ęż

one to istnieje nadmiar tetrad typu PD w stosunku do NPD.

•

li dwa geny znajduj

na ró

nych chromosomach, i s

sprz

ęż

one ze swoimi centromerami

wyst

puje mniejsza proporcja tetrad typu T.

•

li oba geny le

żą

na ró

nych chromosomach, ale przynajmniej jeden z nich nie jest sprz

ęż

ony

ze swoim centromerem, lub geny le

żą

na jednym chromosomie ale sa daleko od siebie (odległo

ść

ksza ni

50cM) to wyst

puj

losowe proporcje rodzajów tetrad tj. PD: NPD: T wynosi 1: 1: 4.

Rys.2. Ró

ne rodzaje tetrad pochodz

cych z krzy

owania szczepów AB x ab.

sto

ść

wyst

powania tetrad typu: PD, NPD, i T mog

stosowane do okre

lenia odległo

ci na

mapie w cM (centimorgany) mi

dzy dwoma genami, wyliczanej wg. poni

szego wzoru:

PYTANIA

3. Rozrysuj podane krzy

owanie podstawiaj

c jaki

marker troficzny (np. ade –

liwo

c syntezy adeniny, leu – mo

liwo

ść

syntezy leucyny)

4. Jaki genotyp b

miały tetrady ka

dego z wymienionych typów?

Literatura

1. Schlegel Hans G. „Mikrobiologia ogólna”. 1996. Wydawnictwo Naukowe PWN
2. Sherman F. An Introduction to the Genetics and Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae.

1998. Department of Biochemistry and Biophysics. University of Rochester Medical School, Rochester, NY
14642. http://dbb.urmc.rochester.edu/labs/sherman_f/yeast/Index.html

3. Sherman F., Getting started with yeast, Methods Enzymol. 350, 3-41 (2002).

http://dbb.urmc.rochester.edu/labs/sherman_f/startedyeast.pdf

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Opracowała: dr Dominika Włoch-Salamon

Cz.1_ GENETYKA_Laboratorium_2012

wiczenia praktyczne

Dbaj o swoje miejsce pracy. Pozostaw go tak czystym jak go zastałe

. Jednorazowe

yte materiały wyrzu

, a materiały wielokrotnego u

ytku umyj.

Zadanie nr 1: Oznaczanie genotypu dro

y (wegetatywnych haploidów)

na podło

ach selekcyjnych

Podło

a, na których b

przeprowadzane testy to podło

a syntetyczne (Sc-), czyli w pełni

zdefiniowane o dokładnie poznanym składzie, w których brakuje pojedynczego czynnika

wzrostowego, w tym wypadku s

to poszczególne aminokwasy. Na takim podło

u mog

rosn

ąć

tylko te dro

e, które maj

sprawny szlak syntezy danego aminokwasu. Gdy szlak ten jest

uszkodzony na jakim

etapie, dro

e na takim podło

u nie rosn

i nazywane s

aksotrofami tego

poszczególnego nutrientu, np. szczep nie rosn

cy na podło

u SC-ura to auksotrof uracylu.

Materiały:

- szalki z wyro

tymi koloniami dro

y o nieznanym genotypie na podło

u pełnym bulionowym

YPD
- szalki z wykonanymi replikami (odbijaniem) na podło

ach selekcyjnych

Procedura:

Na podstawie wyników wzrostu kolonii odbitych na szalkach testowych okre

l genotypy

poszczególnych szczepów dro

Zadanie nr 2: Oznaczanie genotypu askospor na podło

ach selekcyjnych

ywaj

c mikromanipulatora mo

na rozdzieli

askospory pochodz

ce z jednej tetrady. Uzyskuje si

w ten sposób haploidy b

ce produktem mejozy jednej komórki diploidalnej. Podczas tworzenia

spor wi

kszo

ść

genów segreguje do komórek potomnych wg. praw genetyki mendlowskiej.

Heterozygotyczny marker (np. HIS/his) b

dzie segregował zgodnie z wzorcem 2:2.(dwia szczepy

potomne s

his a dwa HIS). W ten sposób mo

na otrzyma

szczepy o nowej kombinacji cech.

wiadczenie ma na celu okre

lenie genotypów askospor powstałych w wyniku sporulacji

diploidalnego szczepu dro

y, hetoryzygotycznego w ka

dym locus markerów troficznych oraz

okre

lenie, czy askospory rzeczywi

cie pochodz

z jednej tetrady.

Materiały:

- szalka z wyro

tymi koloniami powstałymi w wyniku rozło

enia za pomoc

mikromanipulatora

nadtrawionych tetrad na pełnym podło

u YPD

- szalki z wykonanymi replikami na podło

ach SC-lys, SC-ade, YPD+nat

Procedura:

Na podstawie wyników wzrostu kolonii odbitych na szalkach testowych okre

l genotypy

poszczególnych kolonii wyrosłych z pojedynczych askospor i okre

l na tej podstawie czy dana

tetrada jest tetrad

prawdziw

czy fałszyw

Zadanie nr 3: Mapa genetyczna (analiza sprz

ęż

genowych)

Skrzy

owano dwa szczepy:

Nr 1: haploid Y55

MAT a

his4 leu2 lys2

ade1 ura3

nr. 2: haploid Y55

MAT

HIS4 LEU2 LYS2 ADE1 URA3

Otrzymany szczep diploidalny poddano sporulacji. Tetrady spor rozdzielono za pomoc

mikromanipulatora. Otrzymano 4 kolonie haploidalne o ró

nych genotypach (patrz zadanie 5.)

Celem zadanie jest analiza sprz

ęż

2 par genów: leu i his; i ura i lys.

W ka

dym przypadku oce

ile jest okre

lonych typów tetrad (rodzicielski, nie rodzicielskie, typ-tetra)

w twoim zestawie szalek eksperymentalnych.

Po zebraniu danych ze wszystkich zestawów (praca całej grupy) mo

na zastosowa

wzór

(podany we wst

pie) i oszacowa

odległo

ść

dzy genami w cM a tym samym czy geny s

sprz

ęż

one.

MIKROBIOLOGIA _2012 SPRAWOZDANIE

Imi

i nazwisko _______________________________________

Data /Numer grupy _______________________________________

Zad.1. Oznaczanie genotypu dro

y wegetatywnych na podło

ach selekcyjnych

Nr Zestawu …..

Podaj genotypy

ADE

HIS

LYS

LEU

URA

szczep nr 1:

szczep nr 2:

szczep nr 3:

szczep nr 4:

szczep nr 5:

Zad.5. Oznaczanie genotypu askospor na podło

ach selekcyjnych.

Nr Zestawu …..

Podaj genotypy, napisz czy a) tetrada była prawdziwa czy fałszywa i b) dlaczego?

tetrada nr 1

tetrada nr 2

prawdziwa/fałszywa

tetrada nr 3

tetrada nr 4

prawdziwa/fałszywa

tetrada nr 5

tetrada nr 6

prawdziwa/fałszywa

Tetrada jest „fałszywa” jeśli……………………………………………………………

Zad.3. Mapa genetyczna (analiza sprz

ęż

genowych) (dla studentów biologii)

Nr Zestawu …..Podaj rodzaj tetrady (PT, NPT, T,) dla wszystkich prawdziwych tetrad w twoim zestawie

pod wzgl

dem 2 par genów: LEU i HIS oraz URA/LYS.

Ilo

ci odpowiednich rodzajów tetrad zostan

wypisane w zbiorczej tabeli (na tablicy)

Oce

odległo

ść

par genów w cM, oce

czy s

sprz

ęż

one (uzasadnij wniosek).

tetrada nr 1

tetrada nr 2

tetrada nr 3 tetrada nr 4

tetrada nr 5

tetrada nr 6

1. leu i his

2. ura i lys.