Wykład 9

30 kwietnia 2009

Biologiczne funkcje wolnych 

rodników

• Fotosynteza (pierwotny rozdział ładunku i 

przenoszenie elektronu w łańcuchu transportu e)

• Fosforylacja oksydacyjna w mitochondriach
• Biosynteza prostaglandyn i tromboksanów
• Utlenienie ksenobiotyków w mikrosomach
• Regulacja ciśnienia krwi
• Zabijanie bakterii w trakcie fagocytozy

•

Ponadto dość powszechny staje się pogląd, Ŝe wolne 
rodniki i tzw. „reaktywne formy tlenu” zaangaŜowane 
są w wielu procesach chorobowych, a nawet mogą
być odpowiedzialne za proces starzenia komórek

Do najwaŜniejszych i najbardziej 

badanych naleŜą:

•

rozedma płuc indukowana dymem papierosów

••••

reumatoidalne zapalenie stawów

••••

zatrucie alkoholowe

••••

zwłóknienie płuc indukowane azbestem

••••

zatrucie czterochlorkiem w

ę

gla

••••

zatrucie niektórymi metalami

••••

choroba Parkinsona

••••

choroba Alzheimera

••••

choroba Downa

••••

mia

Ŝ

d

Ŝ

yca

••••

uszkodzenie tkanek towarzysz

ą

ce reperfuzji po niedotlenieniu

••••

nowotwory

Metody detekcji wolnych rodników

• Bezpośrednie, przy uŜyciu rozdzielczych 

czasowo spektroskopii optycznych, metod 
polarograficznych oraz po zastosowaniu 
spektroskopii elektronowego rezonanu 
paramagnetycznego (EPR lub ESR)

• Pośrednie, poprzez oznaczanie produktów 

oddziaływania z wybranymi akceptorami, 
poprzez obserwację zaniku kluczowych 
reagentów

Podstawowe równania

• Podstaw

ę

ERP stanowi efekt Zeemana, 

polegaj

ą

cy na rozszczepieniu poziomów 

energetycznych cz

ą

stek paramagnetycznych 

pod wpływem zewn

ę

trznego pola 

magnetycznego. Po umieszczeniu cz

ą

stki o 

momencie magnetycznym 

µµµµ

w polu 

magnetycznym o indukcji B, cz

ą

stka ta

uzyskuje  energi

ę

E:

( )

E

B

= −

ρ ρ

µ

*

Podstawowe zale

Ŝ

no

ś

ci

• Dla atomu o całkowitym momencie p

ę

du J

dipolowy moment magnetyczny wynosi:

µµµµ

= - g

β

J

gdzie: g – współczynnik spektroskopowego 
rozszczepienia,

β

- magneton Bohra.

Tak wi

ę

c po umieszczeniu atomu w polu 

magnetycznym uzyskuje on energi

ę

:

E = g 

β

J B

Podstawowe zale

Ŝ

no

ś

ci

• Wektor J ka

Ŝ

dego atomu mo

Ŝ

e przybiera

ć

tylko pewne dozwolone orientacje okre

ś

lone 

zbiorem warto

ś

ci liczby kwantowej M

J

i 

dlatego energia zwi

ą

zana z przestrzenn

ą

orientacj

ą

atomu ograniczona jest do zbioru 

warto

ś

ci zale

Ŝ

nego od M

J

i wynosi:

E

J

= g M

J 

B

gdzie:M

J

=J, J-1, J-2,...-J.

Podstawowe zale

Ŝ

no

ś

ci

• Obserwacj

ę

sygnału ERP mo

Ŝ

na przeprowadzi

ć

mierz

ą

c zmiany rezonansowego pochłaniania energii w 

zale

Ŝ

no

ś

ci od cz

ę

stotliwo

ś

ci (

νννν))))

promieniowania 

elektromagnetycznego przy stałej warto

ś

ci indukcji 

zewn

ę

trznego pola magnetycznego, lub odwrotnie, 

zmieniaj

ą

c pole magnetyczne (B) przy stałej 

cz

ę

stotliwo

ś

ci (

νννν))))

. Ze wzgl

ę

dów technicznych w 

spektroskopii EPR wygodniejszy jest drugi sposób.

Schemat blokowy 
absorpcyjnego 
spektrometru optycznego
oraz spektrometru EPR

Spektrometr EPR firmy Bruker

Chla + A + h

ν 

ν 

ν 

ν 

Chla* + A 

Chla

+.

+ A-.

Podstawowe zale

Ŝ

no

ś

ci

• Równanie, które podaje warunek rezonansu dla 

swobodnego elektronu:

h

νννν

=g

β

B

,

jest zbyt du

Ŝ

ym uproszczeniem w przypadku 

wi

ę

kszo

ś

ci centrów paramagnetycznych. 

Koniecznym jest uwzgl

ę

dnienie wielu dodatkowych 

oddziaływa

ń

magnetycznych, które modyfikuj

ą

charakter wypadkowego widma EPR paramagnetyka. 
Te dodatkowe oddziaływanie uwzgl

ę

dnia si

ę

wprowadzaj

ą

c odpowiedni OPERATOR 

HAMILTONA, którego warto

ś

ci własne opisuj

ą

poziomy energetyczne elektronu

Podstawowe zale

Ŝ

no

ś

ci

• Wypadkowy Hamiltonian

H = H

Z

+ H

NS

+ H

NO

+...

Energia oddziaływa

ń

Zeemana: 0 -1 cm 

-1

Energia oddziaływa

ń

nadsubtelnych: 0 -10

-2

cm 

-1

Energia oddziaływa

ń

spin-orbitalnych: 0 -10

3

cm 

-1

STRUKTURA NADSUBTELNA WIDMA EPR

• To wynik lokalnego pola magnetycznego, które pochodzi 

od momentów magnetycznych pobliskich j

ą

der 

atomowych

B

lok

= B + am

I

gdzie: a - stała sprz

ęŜ

enia nadsubtelnego, która zale

Ŝ

y 

od momentu magnetycznego j

ą

dra i jego odległo

ś

ci od 

niesparowanego elektronu  

m

I

= ± ½ dla I = ½ oraz ±1, 0 dla I = 1

hv

1

=g 

β

(B+ ½a), hv

2

=g 

β

(B - ½a), 

hv

1

=g 

β

(B+ a), hv

2

=g 

β

B, hv

3

=g 

β

(B - a)

Jedno- i dwu-elektronowe utlenianie kwasu askorbinowego

Pomiar nietrwałych wolnych rodników w warunkach stanu
stacjonarnego, w którym kwas askorbinowy i jego oksydaza
mieszane są bezpośrednio przed pomiarem i przepuszczane
przez wnęke rezonansowa spektrometru EPR 

Schemat utlenienia
substratu (SH

2

) przez

H

2

O

2

katalizowany

peroksydazą chrzanu; 
widma EPR wolnych
rodników generowanych
w trakcie procesu

Podstawowe zale

Ŝ

no

ś

ci

• Dla centrów paramagnetycznych „unieruchomionych”

wzgl

ę

dem zewn

ę

trznego pola magnetycznego ( na 

skali czasu, któr

ą

rejestruje EPR, czyli 10

-8   -

10

–10

s), 

nale

Ŝ

y uwzgl

ę

dni

ć

anizotropi

ę

wła

ś

ciwo

ś

ci 

magnetycznych.

• Oznacza to, 

Ŝ

e oddziaływania Zeemana, nadsubtelne i 

spin-orbitalne opisywane powinno by

ć

s

ą

tensorami a 

nie parametrami skalarnymi.

Podstawowe zale

Ŝ

no

ś

ci

• W przypadku wolnego jonu współczynnik g 

ma własno

ś

ci izotropowe, natomiast w 

krysztale jego warto

ść

zale

Ŝ

y od kierunku 

zewn

ę

trznego pola magnetycznego w 

stosunku do osi symetrii wewn

ę

trznego pola 

krystalicznego.

Wspólczynnik spektroskopowego 

rozszczepienia

• Współczynnik g dla atomów:

(

) (

) (

)

(

)

1

2

1

1

1

1

+

+

−

+

+

+

+

=

J

J

L

L

S

S

J

J

g

J

• Współczynnik g dla cz

ą

steczek:

∑

−

Ψ

Ψ

Ψ

Ψ

−

=

0

0

0

2

E

E

L

L

g

g

n

n

j

n

i

e

ij

λ

Widma EPR róŜnych typów białek
zawierających jony Ŝelaza w 
centrach aktywnych:
(a) wysoko-spinowe Fe(III) w 
methemoglobinie,
(b) nisko-spinowe Fe(III) w 
ferricytochromie c, oraz
(c) zredukowane białko zawierające
niehemowe Ŝelazo

Widma EPR ferrodoksyny z 

Micrococcus lactilyticus

w stanie

częściowo i całkowicie zredukowanym, T = 77K

Widma EPR kompleksów
hemoglobiny z NO pod
nieobecność i w obecności
allosterycznego efektora
HB – sześciofosforanu 
inozitolu (IHP); monitoro-
wanie zmian stanu
konformacyjnego HB 

Pośrednia detekcja reaktywnych, 

krótkoŜyjących wolnych rodników

Zastosowanie pułapek spinowych:                  

ST + R

.

 ST-R

.

Nitronowe pułapki spinowe

• DMPO, 5,5-dimethylpyrroline N-oxide

• PBN/4-POBN, phenyl-N-t-butylnitrone

N

H

3

C

H

3

C

H

O

N

H

3

C

H

3

C

H

R

O.

R.

C

H

N

C(CH

3

)

3

O

C

H

N

C(CH

3

)

3

R

O.

R.

Dark

Light

Simultion

0.01 mM BB6,
1.0 mM NADH,
100 mM DMPO,
75% DMSO
0.24 mM O

2

Wytwarzania wolnych 
rodników tlenowych 
i innych RFT w 
peroksysomach

Mikrosomalny układ transpotu elektronów:
schemat procesów prowadzących do hydroksylacji 
ksenobiotyków i generowania RFT

Detoksyfikacja chinonów
w procesie dwu-
elektronowej redukcji
oraz ich aktywacja do
form mutagennych w
wyniku jedno-
elektronowej redukcji

Stryktury chemiczne
niektórych kseno-
biotyków

Generowanie wolnych rodników
przez hepatocyty traktowane
czterochlorkiem węgla.
Zarejestrowane widma adduktów
PBN świadczą o generowaniu 
przez układ mikrosomalny
hepatocytów rodnika .CCl

3

oraz,

wtórnie, .OOCCl

3

Wybuch tlenowy

Silnie zwiększona konsumpcja tlenu przez makrofagi 
i inne komórki zdolne do fagocytozy po ich pobudzeniu.
Konsumpcja ta nie zaleŜy od aktywności łańcucha
oddechowego mitochonrdiów kmórek.

Struktura neutrofilu obserwowana
przy pomocy TME; białe ciałka to 
sfagocytowane kuleczki lateksowe

Zdjęcie makrofaga
śledziony zrobione 
przy pomocy
skaningowego mikroskopu
elektronowego

Właściowości makrofagów

• Przez pojęcie oksydazy NADPH granulocytów rozumie się zespó

ł

co najmniej dwóch bia

ł

ek; flawoproteina przyjmuje elektrony od 

NADPH i przekazuje je cytochromowi b

558

, który redukuje tlen.

• Pobudzony granulocyt obojętnoch

ł

onny moŜe uwalniać 3,2 x10

6

cząsteczek O

2

-. 

i równowaŜną ilość H

2

O

2

.                                        

• Efektem braku aktywności oksydazy NADPH w fagocytach jest 

dziecięca postać ziarnicy z

ł

ośliwej.

• Zabijanie bakterii w wyniku wybuchu oddechowego moŜe 

zachodzić przy udziale:

H

2

O

2

i  O

2

-.

HOCl, HOBr, HOI generowanych w reakcjach nadtlenoazotynu,  

CL

-

+ H

2

O

2

→HOCl +OH

-

lub

nadtlenoazotynu: O

2

-. 

+  NO

. 

 ONOO

-

NADPH + 2O

2

 NADP

+

+ H

+

+ 2O

2

-.

Schemat struktury aktywnego kompleksu oksydazy NADPH

Widma EPR adduktu spinowego DMPO w zawiesinie aktywowanych
neutorfili; po 6 min (a)  lub 12 min (b) od ich aktywacji oraz w
obecności SOD (c). 1 – DMPO-CH

3

, 2 – DMPO-OH, 3 – DMPO-OOH