WYKŁAD 3

Inicjacja translacji u bakterii
W procesie inicjacji uczestniczą czynniki białkowe (IF), które stabilizują proces
1.mała podjednostka rybosomy 30S przyłącza się do miejsca wiązania na mRNA (sekwencja
Shine-Dalgarno)
2.przyłącza się inicjatorowi tRNA
3.przyłącza się duża podjednostka rybosomu 50S
Inicjacja translacji u eukariotów
1.składanie kompleksu preincjacyjnego , w skład którego wchodzą podjednostka 40S, inicjatory
tRNA

Met

, czynnik białkowy (lelF2)

2.kompleks reinicjacyjny łączy się z mRNA z końcem 5’ (z czapeczką). Dołączają niekolejne
czynniki białkowe
3.kompleks reinicjacyjny skanuje mRNA wzdłuż, że do momentu napotkania kodonu
inicjacyjnego, który znajduje się w sekwencji Kozak. Następuje dołączenie dużej podjednostki
Rybusom (80S)
Elongacja translacji
Cykl elongacyjny składa się z trzech etapów:
- dostarczenie aminoacylo-tRNA
- tworzenia wiązań peptydowych
- translokacji
Miejsce P (peptydylowe) zajęte jest przez inicjatorowi tRNA, naładowany metioniną lub N-
formylometioniną.
Miejsce A (akceptorowe) zajmuje odpowiednie aminoacylo-tRNA, umiejscowione przez czynnik
elongacyjny. Czynniki te należą do kalus białek G i wiążą one cząsteczkę GTP.
Późniejsza hydroliza GTP pozwoli na tworzenie wiązania peptydowego miedzy aminokwasami
Następuje połączenie dwóch aminokwasów wiązaniem peptydowym. Energia potrzebna na
wytworzenie wiązania pochodzi z hydrolizy GTP. Reakcje katalizuje enzym
peptydylotransferaza, która odłącza aminokwas od inicjatorowego tRNA i przenosi na
aminokwas znajdujący się w pozycji A
Następuje translokacja.
Rybosom przesuwa się przez trzy kolejne nukleotydy, następny kodon wchodzi w miejsce A.
Dipeptydylo-tRNA odpowiadający dwóm pierwszym kodonom zostaje „przesunie” w miejsce P.
Wolny tRNA (deacylowany) zostaje usunięty z rybosomu * u bakterii deacylowany tRNA
przesuwa siew miejsce E – miejsce wyjścia)
W miejsce A przyłącza się kolejny aminoacylo-tRNA. Z udziałem peptydylotransferazy
powstaje kolejne wiązanie peptydowe itd.
Terminacja translacji
Proces syntezy białka kończy się w momencie napotkania jednego z kodonów stop (UAA, UAG,
UGA) wówczas w miejsce A nie wchodzi cząsteczka tRNA.
W miejsce A przyłącza się czynnik uwalniający (ang. tease factor) – RF. U bakterii proces
terminacji nie wymaga energii, natomiast u eukariotów potrzebna jest energia uwalniana z
hydrolizy GTP.
Czynniki uwalniające powodują, że peptydyylortrafsferaza przenosi polipeptydu a cząsteczkę
wody, a nie na aminoacylowy tRNA i w ten sposób uwalnia nowe białko
Kiedy białko zostanie odłączone od rybosomu następuje oddysocjowanie poszczególnych
elementów od rybosomu tzw. deacylowanego tRNA, czynnika uwalniającego, podjednostek
rybosomy oraz mRNA
Białka – cząsteczki chemiczne spełniające różne funkcje
- zbudowane są z 20 aminokwasów
Co określa funkcję białka:
- funkcję białka określa jego struktura
Co określa strukturę białka:
- strukturę białka określa jego sekwencja aminokwasowa
Każde białko ma strukturę trójwymiarową:
- struktura pierwszorzędowa- kolejność aminokwasów stabilizowana przez wiązania peptydowe
- struktura drugorzędowa – łańcuchy polipeptydowe są poskręcane w helisy lub też inne
regularne struktury np. harmonijki, które są utrzymywane przez wiązania wodorowe

- struktura trzeciorzędowa- ponowne skręcenie lub pofałdowanie już skręconego białka, jest
stabilizowana przez wiązania wodorowe, kowalencyjne, oddziaływania hydrofobowe.
- struktura czwartorzędowa – tą strukturę posiadają niektóre białka zbudowane z kilki łańcuchów
polipeptydowych, stabilizowana przez wiązania wodorowe, oddziaływania hydrofobowe, mostki
dwusiarczkowe. W zależności od pełnionej funkcji białka ze strukturą 4-rzędową mogą rozpadać
się na składowe polipeptydy lub zmieniać swoje podjednostki.
Potranslacyjna obróbka białek:
- polipeptyd uwolniony z rybosomu jest nieaktywny i zanim będzie mógł spełniać swoje funkcje
musi zostać poddany obróbce
Są cztery typy mechanizmów obróbki potranslacyjnej:
- fałdowanie się białka
- proteolityczne rozszczepienie białka
- modyfikacje chemiczne
- wycinanie intein
Fałdowanie się białek:
- polipeptyd musi szybko przyjąć prawidłową strukturę przestrzenną. Fałdowanie odbywa się
poprzez chowanie się do środka hydrofobowych odcinków białka a eksponowanie na zewnątrz
odcinków hydrofilowych.
In vivo, białka „opiekuńcze” zabezpieczają przejściowo rejony hydrofobowe białek przed
niepoprawnym sfałdowaniem.
Fałdowanie białka proces fizykochemiczny, w którym łańcuch polipeptydowi przybiera strukturę
docelową, umożliwiając pełnienie określonej funkcji.
Błędne sfałdowanie białka:
- obecni znanych jest ok. 50 chorób wywołanych błędnym sfałdowaniem białek – choroba
Alzheimera, Parkinsona
Obróbka proteolityczna białka:
- aktywacja białka poprzez wycięcie niepotrzebnego fragmentu łańcucha polipeptydowego końca
N lub C (np. melityna, insulina)
- usunięcie sekwencji literowych (fragmentów łańcucha, które kierują białko do odpowiedniego
przedziału komórkowego)
- w przypadku poliprotein pocięcie na fragmenty, aktywuje każdy z otrzymanych fragmentów
(np. hormony peptydowe u kręgowców)
- usuwanie pierwszego aminokwasu (metioniny lub formylometioniny), występują u prawie 50%
wszystkich białek
Modyfikacje chemiczne:
- potranslacyjnym modyfikacjom chemicznym podlega 15 z 20 aminokwasów. Wyjątki –
alanina, walina, leucyna, izoleucyna i metionina. Do najczęstszych zmian zaliczamy:
* fosforyzację *defosforylację *karboksylację * acetylację *hydroksylację *acylację *metyzację
*glikozylację *prenylację
fosforylacja – dołączanie grupy fosforanowej do aminokwasów; gr. P z ATP na atom tlenu Ser,
Thr lub Tyr, białko zyskuje dwa ładunki ujemne, enzym kinazy; białko może być w ten sposób
chronione przed strawieniem
defosforylacja – usunięcie reszty P przez specyficzne enzymy – fosfatazy.
karboksylacja – np. glutaminianu do Y-karboksyglutaminianu w protrombinie co zwiększa
wiązanie jonów Ca2+; reakcja katalizowana przez system enzymatyczny zależny od wit. K;
aktywna trombina przekształca fibrynogen w fibrynę; karboksylacja lizyny w białku zwiększa jej
podatność na proteolizę.
acetylacja – dołączenie gr. acetylowej do gr. NH2 lizyny, reakcja odwracalna, enzym
acetylotransferaza; acetylację lizyny w histonach rdzeniowych towarzyszy aktywnej transkrypcji
chromatyny.
deacetylacja – usunięcie reszty octanu z białka odbywa się przy udziale deacetylazy
hydroksylacja – dołączenie gr. OH do Lys i Pro, enzym dioksygenazy; askorbinian utrzymuje w
niezmienionym stanie jon żelazowy znajdujący się w CA enzymu.
acylacja – dołączanie gr. acylowej do polipeptydu; mirystylacja – przeniesienie reszty kwasu
mirystynowego C14; palmitylacja – przeniesienie reszty kwasu palmitynowego C16; donorem
grupy acylowej jest mirystoilo CoA lub palmityno CoA

metylacja – dołączenie gr. CH3 do aminokwasu
glikozylacja – polega na przeniesieniu drzewka cukrowego z dolicholu na białko, zachodzi w
RE, enzym transferaza glikozylowa (np. białka błonowe)
Dolichol to poliizopropenoidowy alkohol pierwszorzędowy z nasyconą resztą izoprenowi, dł.
łańcucha 14-24 reszt izoprenowych.
prenylacja – przyłączanie do białek pochodnych izoprenowych takich jak jednostka frenazylowa
C15 lub geranylogeranylowa C20
Wycinanie intein:
- inteiny to sekwencje w białku, które są odpowiednikami intronów w mRNA; mają długość 300-
600 aminokwasów; wewnątrz inteiny znajdują się aminokwasy, które biorą udział w procesie
wycinania; po wycięciu intein eksteiny muszą być ze sobą połączone.
Gdzie występują inteiny:
- eukarionty
- bakterie
- Archaea
Funkcje białek:
- enzymatyczna – katalizowanie reakcji chemicznych
- sygnalizacyjna – detekcja hormonów i neuroprzekaźników
- transportowa – transport substancji (np. hemoglobina, transferryna)
- magazynowa – magazynowanie substancji i materiałów odżywczych (ferrytyna)
- strukturalna – budowa tkanek łącznych (kolagen, kreatyna)
- motoryczna – ruch mięśni (aktyna, miozyna)
- odżywianie – źródło aminokwasów w czasie wzrostu potomstwa
- odpornościowa – przeciwciała
- regulacyjna – czynniki regulujące ekspresję genów i rozwój
Białka są bezpośrednimi wykonawcami większości procesów życiowych.
Miejsce syntezy i przeznaczenie białek:
* rybosomy wolne - białka pozostają w cytoplazmie lub są włączane do organelli
Są to:
- rozpuszczalne białka cytozol (enzymy glikolizy)
- białka zewnętrznej powierzchni błon komórkowych
- białka mitochondriów i chloroplastów kodowane przez jądrowy DNA
- białka macierzy peroksysomów i glioksysomów
* rybosomy związane z reticulum endoplazmatycznym – białka kierowane są do wnętrza
reticulum i aparatu Golgiego, gdzie podlegają przekształceniom potranslacyjnym, a następnie
wydzielane są na zewnątrz komórki, wbudowywane w błony komórkowe lub transportowane do
lizosomów
Są to:
- białka integralne błony komórkowej
- białka błon wewnątrzkomórkowych, w tym białka ER
- białka wydzielane przez komórkę (białka sekrecyjne)
- enzymy lizosomowe
- enzymy aparatu Golgiego
Co się dzieje z białkiem po biosyntezie:
- białka uwalniane są bezpośrednio do cytoplazmy i same trafiają do docelowych miejsc
Lub
- jeszcze podczas translacji białka są transportowane do siateczki śródplazmatycznej i potem
trafiają do specjalnych pęcherzyków, które niosą białka do odpowiednich miejsc.
GENETYKA BAKTERII
- podstawą hodowli bakterii jest możliwość uzyskania kultur klonalnych, czyli potomków jednej
komórki. Uzyskuje się je jako posiew redukcyjny lub seryjne rozcieńczenie i naniesienie na
płytki (szalki) agarowe.
- bakterie typu dzikiego nazywamy prototrofami, potrafią one rosnąć na podłożach zawierających
jedynie związki nieorganiczne i jedno źródło węgla organicznego (np. glukozę). Markerami
genetycznymi są często geny zmutowane, uniemożliwiające wykonanie pewnych funkcji.

- takimi markerami genetycznymi są np. auksotrofy, czyli szczepy niezdolne do syntezy
niektórych związków, które muszą być dodane do podłoży, np. szczep Ade

(Ade minus)

wymaga dodatku adeniny do wzrostu.
- jako marker używana kest także niezdolność do rozkładu niektórych związków, np. szczep Lac

(Lac minus) nie potrafi rosnąć gdy jedynym źródłem węgla jest laktoza.
- markerem może też być wrażliwość lub oporność na różne substancje, np. streptomycynę, czyli
odpowiednio STR

lub STR

(R- odporne, S- wrażliwe).

Zalety bakterii w eksperymentach genetycznych:
- są haploidalne, nie ma maskowania genów
- nowe pokolenia są tworzone co 20 min.
- łatwo wyhodować olbrzymie ilości
- poszczególni osobnicy tych licznych populacji są genetycznie identyczni – tworzą naturalne
klony
3 główne typy przenoszenia informacji genetycznej u bakterii:
- transformacja – bakteria pobiera DNA ze środowiska zewnętrznego (Griffith, 1928)
- koniugacja – przeniesienie DNA od dawcy do biorcy, wymaga bezpośredniego kontaktu obu
komórek (Lederberg, Tatum, 1946)
- transdukcja – DNA przenoszone jest z komórki dawcy do biorcy za pośrednictwem faga
(Lederberg, Zinder, 1951)
Transformacja u bakterii:
- transformacja to pobranie ze środowiska nagiego DNA i zmiana fenotypu na skutek
wbudowania i odczytania zawartej tam informacji genetycznej
- wiele bakterii np. Haemophilus, Bacillus, mogą ulegać transformacji spontanicznie, a nawet
pobierać DNA aktywnie ze środowiska
- Escherichia nie transformuje naturalnie, ale można sztucznie osłabić jej ścianę komórkową
pomagając w przejściu DNA, wykorzystuje to inżynieria genetyczna.
Koniugacja
- czasowe połączenie komórek bakteryjnych
- wymaga by komórka dawcy jest nosicielem plazmidu F, bądź to w formie autonomicznej
(komórka F+) bądź w formie zintegrowanej z chromosomem (komórka Hfr); wytwarzanie pilusa
płciowego
- komórka biorcy musi być F-; posiada ona na powierzchni specyficzne receptory dla pilusa
płciowego
Transdukcja u bakterii
- wirusy bakteryjne to bakteriofagi lub fagi. Mają własne geny umożliwiające replikację ich
DNA lub RNA oraz produkcję powłok białkowych, ale mogą się rozmnażać tylko wewnątrz
komórek bakteryjnych wykorzystując ich metabolizm.
- fagi lityczne – namnażają się intensywnie po wejściu do komórek i doprowadzają do jej
rozpadu czyli lizy komórki
- fagi lizogeniczne – mogą wbudować swój DNA do chromosomu bakterii i w tej ukrytej formie
profaga dzielić się wraz z nim, zanim nastąpi produkcja fagów potomnych i rozpad komórki.
Koniugacja, transformacja i transdukcja to trzy drogi horyzontalnego transferu gnów pomiędzy
różnymi bakteriami i pomiędzy ich genomowymi pasożytami a zapewne też pomiędzy
gospodarzami bakterii.
Enzymy pozwalające na manipulację DNA:
- organizmy muszą właściwie utrzymać swój DNA czyli namnażać go, ciąć i sklejać. Dokonują
tego przy pomocy wyspecjalizowanych enzymów: polimeraz, nukleaz, ligaz
Polimerazy DNA:
- enzymy budujące DNA z pojedynczych nukleotydów
- potrzebują wzorca – matrycy, czyli istniejącej już nici DNA lub RNA
- zależne od matrycy RNA nazywane są też odwrotnymi transkryptazami (są u retrowirusów)
- potrzebny jest starter
Nukleazy
- enzymy tnące DNA w środku (endonukleazy) lub z końców (egzonukleazy)
Ligazy
- łączą końce DNA, z dwóch nici dają jedną nić, z jednej nici dają nić kolistą.

Ligazy DNA:
- katalizują formowanie wiązań fosfodiestrowych pomiędzy końcem hydroksylowym 3’ a
końcem 5’
Funkcje i zastosowanie ligaz:
- in vivo: udział w replikacji i reperacji DNA
- in vitro: tworzenie nowych układów DNA i łączenie ich z wektorami
Typy ligaz:
- zależne od ATP: ligaza DNA faga T4 (podstawowa)
- zależne od NAD+: ligaza DNA E. coli (nie liguje RNA, łączy tępe końce tylko w obecności
PEGu lub Ficollu)
Ligazy DNA:
- w komórce dochodzi do pęknięć nici i wtedy ligazy odtwarzają wiązanie fosforanu z cukrem
- w probówce wykorzystuje się je do połączenia dwóch dowolnych nici w jedną
Łatwiej jest złączyć lepkie końce DNA bo wiązania wodorowe „ przytrzymują” nici DNA które
chcemy zligować.
Dlatego niekiedy warto najpierw doczepić (ligować) krótkie odcinki łącznikowe zawierające
sekwencje palindromowe a potem je przeciąć restrykcyjnie i otrzymać lepkie końce.
Zalecane warunki reakcji:
1.optymalna temperatura ligacji:
- 16oC przez noc najwyższa efektywność (tępe)
- RT – temp. pokojowa 30min.- 2h – do szybkiego klonowania (lepkie)
- 4oC przez 24h (lepkie)
Inaktywacja ligazy:
- 10-15min. 65oC może zwiększyć wyjściową ilość transformantów nawet 100x
Lista enzymów modyfikujących niezbędnych do klonowania:
- zestaw enzymów restrykcyjnych
- fragment Klenowa polimerazy DNA I- tworzenie tępych końców przez wypełnianie cofniętych
końców 3’
- polimeraza DNA T4- tworzenie tępych końców przez usuwanie jednoniciowych końców 3’ lub
wypełnianie cofniętych końców 3’
- alkaliczna fosfataza – usuwanie grup fosforanowych z końców 5’
- kinaza polinukleotydowe T4 – fosforylacja końców 5’
- termostabilnej polimerazy – synteza DNA
- nukleaza mung bean i nukleaza S1 – tworzenie tępych końców przez usuwanie jednoniciowych
lepkich końców
- RNAzaA i RNAzaH – degradacja RNA
Fragment Klenowa:
- jest dużym fragmentem polimerazy DNA I;
- posiada aktywność polimeryzacyjną 5’3’ oraz aktywność egzonukleolityczną 3’5’
(aktywność naprawcza). Do przeprowadzenia syntezy DNA w kierunku 5’3’ wymagana jest
obecność jednoniciowej matrycy oraz startera.
- niezbędnym kofaktorem reakcji są jony Mg2+
- wykorzystanie: wypełniania 5’ lepkich końcóe powstałych po trawieniu enzymami
restrykcyjnymi. Synteza zachodzi w kierunku 5’ -> 3’ do momentu, aż wystający lepki koniec
zostanie wypełniony całkowicie.
Polimeraza DNA bakteriofaga T4
- posiada aktywność polimeryzacyjną 5’3’ oraz aktywność egzonukleolityczną 3’5’; nie
posiada aktywności egzonukleolitycznej 5’3’
- wykorzystywana do: wytępiania 3’ lepkich końców, które powstały po trawieniu enzymami
restrykcyjnymi zostawiającymi wystające końce 3’. Aktywność egzonukleolityczna w stosunku
do dwuniciowego DNA blokowana jest przez aktywność polomeryzacyjna 5’-> 3’.
- wypełniania 5’ lepkich końców. Aktywność polimeryzacyjna 5’ -> 3’ wymaga obecności
matrycy, startera, dNTP oraz jonów Mg2+
Alkaliczna fosfataza jest enzymem odpowiedzialnym za usuwanie reszt 5’ fosforanowych z
DNA, RNA oraz nukleotydów.

Proces usuwania grup fosforanowych nazywany jest defosforylacją. Enzym tan wykazuje
najwyższą aktywność w środowisku alkalicznym.
Możemy wyróżnić kilka rodzajów alkalicznej fosfatazy, które odróżnia między innymi
możliwość inaktywacji.
Schemat klonowania powstałego po trawieniu enzymem restrykcyjnym inseratu do
defosforylowanego wektora
Wektor niepoddany działaniu alkalicznej fosfatazy może ulegać ponownej cyrkularyzacji, co
prowadzi do otrzymania dużej ilości „pustych” wektorów. Defosforylowany wektor nie może
ulec cyrkularyzacji, bez inseratu.
Polinukleotydowa kineza bakteriofagi T4
Katalizuje przeniesienie y-fosforanu z ATP na 5’ OH (nukleotyd po defosforylacji) koniec jedno-
lub dwuniciowego DNA, RNA lub oligonukletydów.

Aktywność T4 PNK wykorzystywana jest głównie w dwóch typach reakcji:
-podstawiania – w tej reakcji y-fosforan przenoszony jest z ATP na DNA/RNA. Docelowy
nukleotyd nie posiada reszty fosforanowej na końcu 5’. Reakcja ta jest odwracalna.
-wymiany – w reakcji tej nadmiar ADP powoduje, że T4 PNK najpierw przenosi 5’-fosforan z
ufosforylowanego DNA, a następnie DNA jest ponownie fosforyzowany przez przeniesienie y-
fosforanu z ATP. Ponadto enzym posiada aktywność 3’ fosfatazy.
Termostabilne polimerazy DNA
- przeprowadzają zależną od matrycy syntezę DNA z triosfonukleozydów w kierunku 5’3’.
- do rozpoczęcia reakcji wymagany jest starter z wolną grupą 3’-OH oraz jony Mg2+
- maksymalna aktywność katalityczna w temperaturze 75-80oC
- w 37oC osiągają jedynie ok. 10% aktywności maksymalnej
Rybonukleaza A
źródłem jest trzustka wołowa. Jest to bardzo aktywna i stabilna. Większość preparatów jest
zanieczyszczona DNazami, które mogą być inaktywowane przez gotowanie w 100oC przez
15min.
Właściwości: Endorybonukleaza, przecinająca fosfodiestrowe wiązanie 3’ przy pirymidynach w
RAN. Nie wykazuje żadnej aktywności w stosunku do DNA.
Zastosowanie:
-usuwanie RNA z preparatów DNA
-mapowanie punktowych mutacji w DNA i RNA
WYKŁAD 5
Wektor to cząsteczka DNA (np. wirus, plazmid), która służy do wprowadzenia obcego materiału
genetycznego di innego gospodarza. Wektor, w którym umieszcze się DNA, nazywany jest
rekombinowanym DNA.
Plazmidy są to autonomiczne, pozachromosomowe elementy genetyczne. Charakterystyczną ich
cechą jest: fizyczna odrębność od chromosomu, zdolność do trwałego utrzymywania i
replikowania się w komórce.
Cechy przenoszone przez plazmidy:
- odporności na antybiotyki
- odporności na jony metali ciężkich
- produkcje antybiotyków i bakteriocyn
- katabolizm toksycznych związków
- chorobotwórczość bakterii
- interakcje z roślinami
- zdolność do koniugacji
Wektory plazmidowe zawierają następujące, podstawowe elementy:
-Ori – miejsce inicjacji replikacji. Miejsce inicjacji replikacji jest specyficzne dla danej komórki
gospodarza.
- Marker I – znajdujący się na wektorze gen pozwalający odróżnić bakterie posiadające plazmid
od takich, które go nie zawierają
-Marker II – ten marker pozwala odróżnić bakterie, które pobrały plazmid bez wstawki, od
takich, które otrzymały plazmid zrekombinowany, czyli zawierający wstawkę.
Schemat klonowania fragmentu DNA na plazmidzie:

1.trawienie (restryktaza)
2.ligacja
3.transformacja bakterii i selekcja
4.selekcja pojedynczego klonu
ad.1. DNA trawi się ER.
-ligacja z wektorem
-transformacja komórek bakterii
-selekcja i identyfikacja zrekombinowanych wektorów
DNA poddaje się trawieniu enzymem restrykcyjnym (niekoniecznie). Tym samym enzymem
restrykcyjnym lub enzymem zostawiającym identyczne lepkie końce przecina się wektor (ważne
żeby końce wektora pasowały do końców inseratu).
2. przeprowadza się ligację wektora z fragmentami donorowego DNA. Usunięcie grupy
fosforanowej na końcach 5’ liniowego plazmidu aby zapobiec cyrkularyzacji wektora. Enzym
fosfataza.
3. transformacja, czyli wprowadzenie DNA do komórek bakterii.
Transformacja jest procesem wprowadzenia DNA do komórki.
Komórki bakteryjne muszą być kompetentne.
Bakterie naturalnie kompetentne np. bacillus subtillis.
Większość bakterii musi osiągnąć stan kompetencji. Są poddawane działaniu czynników
chemicznych lub fizycznych np. escherichia coli.
Metody transformacji:
1.metoda chemiczna (Heat shock) – metoda transformacji komórek bakteryjnych podlegająca
trawieniu bakterii zimnym CaCl2 na lodzie i szybkim podgrzaniu do 42°C.
2.elektroporacja – metoda transformacji komórek bakteryjnych polegająca na odwracalnej
destabilizacji błony komórkowej z wytworzeniem w niej porów, zachodzącej pod wpływem pola
elektrycznego o wysokim napięciu.
- po transformacji bakterie wysiewa się na odpowiednie podłoże selekcyjne, czyli przeprowadza
się selekcję.
Transformaty rosnące na podłożu selekcyjnym będą zawierały: pusty wektor albo wektor ze
wstawką, czyli zrekombinowany.
Identyfikacja zrekombinowanych plazmidów – podwójna odporność na antybiotyki
Plazmid z dwoma opornościami na antybiotyk → klonowanie w obrębie jednego z genów
odporności → transformacja bakterii + wysiew na pożywkę selekcyjną z ampicyliną → robienie
repliki na pożywkę z tetracykliną → klonowanie bakteryjne, które wyrosły zawierają
nierekombinowany plazmid
Do analizy bierze się komórki bakteryjne, które rosły na pożywce z ampicyliną a nie rosły
na pożywce z tetracykliną.

Identyfikacja zrekombinowanych plazmidów – alfa – komplementacja
Beta-galaktozydaza
1.plazmid (N-koniec genu lacZ kodujący 148 AA)
2.bakterie (C-koniec genu lacZ)
-osobno są nieaktywne
-plazmid zostanie wprowadzony do bakterii to aktywny enzym rozkłada substrat X-Gal:
niebieskie kolonie
-zrekombinowany plazmid zostanie wprowadzony do bakterii (nieaktywny gen lacZ) to kolonie
białe
Biblioteki (banki) DNA
Biblioteka DNA stanowi zbiór fragmentów DNA danego organizmu włączonych do cząsteczek
wektorów i wprowadzonych do komórek bakterii przy wykorzystaniu zjawiska transformacji.
Wyróżniamy dwa rodzaje bibliotek: genomowe i cDNA.
Biblioteki DNA
Cel tworzenia: przechowywanie DNA, aby móc je w przyszłości badać i wykorzystywać do
różnych celów. Biblioteki umożliwiają dostęp do różnych sekwencji DNA. W jednej probówce
zebrany jest cały genom.

Biblioteka genomowa – jest reprezentacją całego DNA danego organizmu. Fragmentacji
poddaje się genomowe DNA, które następnie łączy się z cząsteczkami określonego wektora.
Każda cząsteczka wektora zawiera jeden wbudowany fragment DNA.
Przygotowanie biblioteki obejmuje następujące etapy:
-izolacja genomowego DNA
-trawienie DNA enzymem restrykcyjnym
-klonowanie fragmentów DNA do wektora
-transformacja bakterii
Biblioteka cDNA – zawiera fragmenty cDNA powstałe na matrycy mRNA w wyniku odwrotnej
transkrypcji. Jest to reprezentacja tylko aktywnych genów występujących w tkance, z której
został wyizolowany mRNA.
Biblioteka cDNA:
-izolacja mRNA
-synteza cDNA
-klonowanie do wektora
-transformacja do bakterii
Co to jest GMO?
Organizmy modyfikowane genetycznie – GMO. Są to organizmy, które zawierają w swoim
genomie obce geny, pochodzące z innego organizmu.
Zakres manipulacji genetycznej:
- zmiana aktywności genów występujących w danym organizmie np. pomidor ze zmniejszoną
aktywnością genu odpowiedzialnego za dojrzewanie i mięknięcie
- wprowadzenie do organizmu dodatkowego jego własnego genu np. dodatkowe geny
odpowiedzialne za produkcję mleka u krów i owiec, co zwiększa ich mleczność
- wprowadzenie do organizmu nowego genu – połączenie: genów roślinnych z roślinnymi,
genów zwierzęcych ze zwierzęcymi i genów roślinnych ze zwierzęcymi lub ludzkimi
Strategia postępowania przy modyfikacji genetycznej roślin

Wytypowanie cechy przeznaczonej do modyfikacji

Ustalenie szlaku przemian biochemicznych związanych z daną cechą

Określenie enzymów katalizujących kluczowe ogniwa szlaku metabolicznego

Identyfikacja genów kodujących główne enzymy kontrolujące dany szlak metaboliczny

Przeprowadzenie modyfikacji genetycznej

Analiza ekspresji nowej cechy

Potwierdzenie przydatności technologicznej nowego surowca

Badania związane z biotechnologią – ryzykiem i bezpieczeństwem konsumentów

Charakterystyka wprowadzanych konstrukcji genowych
Konstrukcja genowa powinna zawierać:
-gen lub fragment genu
- promotor (najczęściej 35S z wirusa mozaiki kalafiora (CaMV)- jest to promotor konstytutywny
ulegający ekspresji we wszystkich tkankach, organach)
- terminator (najczęściej nos z genu kodującego syntezę nopali nową u Agrobacterium
tumefaciens)
- gen selekcyjny (np. oporność na antybiotyki lub herbicydy)
- gen reporterowy (wizualizujący np. gen uidA, GFP, gen lucyferazy)

Konstrukcja genowa

promoto
r

Gen

selekcyjny
(markerowi)

Gen struktury

Gen

reporterowy
(wizualizacyjny
)

terminat

Co to są rośliny transgeniczne?
Roślina transgeniczna zawiera w swych komórkach włączony do chromosomów gen obcego
organizmu (innej rośliny, bakterii, zwierzęcia) lub zmodyfikowany własny gen.
Transformacja genetyczna – proces przenoszenia obcych fragmentów DNA do genomu biorcy
oraz integracja z tym genomem.
Wprowadzone fragmenty DNA ulegają ekspresji w genomie gospodarza przez co możemy
uzyskać rośliny o nowych lub ulepszonych cechach.
Transformacja roślin
- rośliny należą do najłatwiej transformowalnych wśród organizmów wyższych
- do ich transformacji używane są metody fizyczne i biologiczne
- do niedawna rośliny były jedynymi transgenicznymi organizmami dopuszczonymi do
powszechnego użytku
Transformacja komórek roślinnych
Genetyczna transformacja roślin polega na wprowadzeniu do komórki roślinnej egzogennego
DNA, a następnie jego integrację z genomem roślinnym.
Komórki przeznaczone do transformacji powinny być:
- kompetentne (zdolne do transformacji)
- totipotentne (zdolne do regeneracji całych organizmów)
Metody otrzymywania transgenicznych roślin
- wektorowe – wykorzystanie bakterii Agrobacterium tumefaciens. Plazmid Ti posiada naturalną
zdolność wbudowywania swojego DNA do genomu roślin.
Transfekcja – proces wprowadzenia obcego DNA lub RNA do komórki.
Infekcja Agrobacterium tumefaciens
Zranione komórki wydzielają związki (pochodne fenolu np. acetosyringon), które stymulują
geny vir w bakteriach. Następuje aktywacja genów odpowiedzialnych za infekcję rośliny
dwuliściennej. Gdy Agrobacterium zaatakuje roślinę tworzy się guz. Zachodzą niekontrolowane
podziały komórkowe.
Budowa plazmidu Ti:
-LB – lewa sekwencja graniczna poprawia efektywność transformacji
-RB- prawa sekwencja graniczna wymagana do rozpoznania i przeniesienia T-DNA
*T-DNA- rozwój guza, synteza opin, katabolizm opin, automatyczna replikacja, region
wirulencji
Odcinki graniczne: prawy i lewy odpowiadają za wycinanie i integrację odcinka T – DNA
T – DNA: geny odpowiedzialne za syntezę auksyn i cytokinin, geny warunkujące syntezę
Opin
Region wirulencji: geny odpowiedzialne za wycinanie T – DNA
Etapy procesu transformacji:
- bakterie przyczepiają się do komórek roślinnych – do 200 bakterii może się przyczepić do 1
komórki roślinnej
- przeniesienie DNA do komórki roślinnej – kilka obszarów T –DNA może być przeniesione do
1 komórki roślinnej
Transformacja za pośrednictwem Agrobacterium
1.Inokulacja
2.Odpłukanie bakterii
3.Umieszczenie eksplantantów na pożywce stymulującej regenerację
4.Selekcja
5.Regeneracja roślin
Metody bezwektorowe
Bezpośrednia transformacja protoplastów
- elektroporacja – chwilowa dezintegracja błony komórkowej za pomocą pola elektrycznego
podczas inkubacji komórek z egzogennym DNA

- transformacja indukowana chemicznie - chwilowa dezintegracja błony komórkowej następuje
pod wpływem środków chemicznych. Najczęściej stosowany jest PEG (glikol polietylenowy)
Mikrowstrzeliwanie – wstrzeliwanie do komórek kulek ze złota lub wolframu opłaszczonych
DNA, które chcemy wprowadzić
Schemat działania aparatu do transformacji metodą mikrowstrzeliwania
Metodyka transformacji
- przygotowanie mikronośników
- przygotowanie tkanki roślinnej
- strzał (prędkość pocisku kilkaset m/s)
- selekcja i regeneracja
1 strzał to:
-500 µg pocisków,
-1 µg DNA
-1 pocisk: 0,01 – 0,1 pg
Lipofekcja – spłaszczanie egzogennego DNA lipidami, które spontanicznie wnikają przez błonę
komórkową do cytoplazmy
Mikroiniekcja – wprowadzenie fragmentu DNA za pomocą mikropipety
Po wprowadzeniu nowego genu do komórki roślinnej kolejnym etapem jest selekcja. Należy
wyeliminować komórki, które nie uległy transformacji.
-Najczęściej razem z trans genem wprowadza się gen oporności na antybiotyk.
-Komórki typu dzikiego obumierają na pożywce z antybiotykiem.
Rozpoznanie i identyfikacja roślin transgenicznych
W genom rośliny zostaje wbudowana tylko część konstrukcji genowej zawarta wewnątrz
krótkich fragmentów T-DNA, składa się ona z:
- promotora
- sekwencji kodującej
- terminatora
- markera selekcyjnego, reporterowego
Kontrolę jakościową i ilościową:
- PCR – analiza kwasów nukleinowych
- immunodetekcja – analiza produktów białkowych
Opracowano metody detekcji dla:
- pomidora – z obniżonym poziomem poligalakturonazy
- ziemniaka – z drożdżową inwertazą
- soi, kukurydzy tytoniu, bawełny – z odpornością na choroby wirusowe
Cele modyfikacji roślin GMO:
Zmodyfikowane zostało większość roślin mających znaczenie dla człowieka. Cele modyfikacji
to:
- odporność na herbicydy – chemiczne środki ochrony roślin (soja, rzepak)
- odporność na szkodniki – modyfikacja Bt (np. kukurydza, bawełna)
- odporność na choroby wirusowe, grzybowe, bakteryjne
- odporność na niekorzystne warunki środowiska (zasolenie gleby, mróz, susza, metale ciężkie)
- poprawa lub nadanie nowych cech jakościowych (pomidor Flar Savr, Golden Rice, szczepionki
w warzywach)
Delta – endotoksyna (Bt)
- najczęściej stosowaną toksyną jest delta – endotoksyna (Bt) z bakterii Bacillus thuringensis
- B. thuringensis występuje naturalnie w glebie, wodzie i powietrzu. Jeden z
najbezpieczniejszych znanych insektycydów.
- odkryta w 1911r jako patogen moli mącznych w prowincji Thuringia w Niemczech
- zastosowanie jako komercyjnego pestycydu rozpoczęło się w 1938r we Francji, potem w latach
50-tych w USA
- pierwotnie używana tylko jako środek przeciwko Lepidiptera
Działanie Bt:
- delta- toksyna jest produkowana w postaci protoksyny. Do aktywacji wymaga wysokiego pH –
ok. 9,5 – pH

- u larw z rodziny Lepidopterae w środkowym odcinku jelita pierwotnego występuje pH ok. 9,5
oraz odpowiednie proteazy
- po rozpuszczeniu w wysokim pH, protoksyna ulega rozcięciu w specyficznym miejscu.
Powstaje aktywna toksyna
- forma ta wiąże się do receptorów na komórkach jelita tworząc pory w błonie komórek jelita i
powodując wypływ jonów – destabilizacja i śmierć owada
-jelito ulega zniszczeniu poprzez Lizę komórek jelita, następuje obumarcie larwy
Sposoby pobierania toksyny przez organizmy:
-bezpośrednie zjadanie części rośliny
-zjadanie owadów, które zjadły wcześniej tą roślinę
Pomidor Flar Savr
- pierwsze GMO wprowadzone do obrotu
- dopuszczony do sprzedaży tylko w USA w 1994r
- wprowadzony odwrócony gen poligalakturonazy (PG) w orientacji antysensownej (w
konstrukcji genowej był gen kodujący poligalatkuronazę, ale został wprowadzony obrócony o
180o)
- RNA powstałe po transkrypcji odwróconego genu łączyło się komplementarnie z mRNA
prawidłowego genu PG
- rybosom nie mógł się przyłączyć – brak syntezy białka
Złoty ryż
- 20 razy więcej beta- karotenu
- wprowadzono dwa geny: syntezę fitoenu (psy) i desaturazę karotenu (crtl)
- zwiększona zawartość żelaza – wprowadzono gen ferrytyny (przyswajanie żelaza)
Potencjalny negatywny wpływ na środowisko:
- wpływ na organizmy niedocelowe: potencjalnym zagrożeniem mogą być odmiany typu Bt
odporne na szkodniki; stosuje się odpowiednio zmienione białka Cry tak, aby działały w
przewodach pokarmowych konkretnych owadów
- presja selekcyjna – pojawienie się super chwastów i super patogenów. Należy często zmieniać
środki ochrony roślin oraz stosować płodozmian, zmniejszając w ten sposób presję selekcyjną.
- czy nowe geny mogą być przenoszone na inne rośliny? Wprowadzone do roślin uprawnych
nowe geny mogą przenosić się przez krzyżowanie na inne rośliny uprawne i gatunki blisko
spokrewnione występujące w przyrodzie. W takim wypadku mogą powstać w przyrodzie rośliny
(często nazywane super chwastami) tolerujące np. herbicydy
Żywność GM
co jest znakowane:
- żywność
- składniki żywności
- dodatki do żywności
- pasza
- dodatki do paszy
- substancje smakowe
Zwierzęta modyfikowane genetycznie:
Terminem transgeniczne zwierzę określa się takie zwierzę, które w swoim genomie posiada
egzogenny DNA w postaci
- losowo zintegrowanego fragmentu DNA
- zmodyfikowanego własnego genu w wyniku wprowadzenia egzogennego DNA (technologia
knock-out)
- wprowadzonej całej jednostki genetycznej, np. sztucznego chromosomu bakteryjnego BAC lub
sztucznego chromosomu drożdżowego YAC
Metody otrzymywanie zwierząt GM:
- mikroinekcja DNA do zygoty
- modyfikacja pierwotnych komórek zarodkowych ES (Embryonic Stem Cells)
- transplantacja jąder komórkowych
- transfer DNA przy pomocy wirusów
Mikroinekcja:
- przeżywa 50% zarodków

- rodzi się ok., 30% przetransferowanych myszy, z czego 15% posiada zintegrowany transgen
- z 1000 zarodków – 22 sztuki
Modyfikacja pierwotnych komórek zarodkowych
Embryonic Stem Cells (ES) – komórki uzyskane z węzła zarodkowego blastocysty. Można je
hodować in vitro przez dłuższy czas i ponownie wprowadzać do blastocysty po uprzednim
wprowadzeniu transgenu.
- otrzymujemy często organizmy chimeryczne – organizmy te zawierają komórki genetycznie
zmodyfikowane i nie modyfikowane
Transplantacja jąder komórkowych:
- polega na usunięciu jądra komórkowego z niezapłodnionego oocytu (komórki jajowej) i
wszczepieniu jądra z innej komórki – pochodzącej z organizmu jaki chcemy klonować. Jądro
można pobierać z komórek zarodka, z komórek hodowanych in vitro, a także z dorosłych
osobników.
Transfer DNA przy pomocy wirusów
- po wprowadzeniu obcego genu do genomu retrowirusa infekuje się nim komórki embrionalne
we wczesnym etapie rozwoju. Uzyskane embriony z transgenem wprowadza się do matki
zastępczej i otrzymujemy najczęściej potomstwo mozaikowe. Tą metodą można wprowadzać
niewielkie fragmenty DNA
- infekcje jednokomórkowych zarodków
- infekcje pierwotnych komórek zarodkowych ES
Knock-out genu
- celem jest usunięcie określonego genu pozostawiając pozostałe geny nienaruszone, aby móc
określić konsekwencje dla organizmu pozbawionego tylko jednego badanego genu
Cechy produkcyjne zwierząt transgenicznych:
Modyfikacje genetyczne mogą poprawiać niektóre cechy produkcyjne zwierząt gospodarskich
takich jak:
-tempo wzrostu i produkcja mięsa
- wydajność i jakość mleka
- ilość i jakość wełny
- odporność na choroby
- szybsze lub kontrolowane rozmnażanie
- lepsze wykorzystanie paszy
Celowość modyfikacji zwierząt:
Wykorzystanie zwierząt jako bioreaktorów:
Modyfikowane przede wszystkim krowy, owce, kozy – wytwarzane białka wydzielane z
mlekiem np. produkcja antytrombiny (czynnik odpowiedzialny za krzepliwość krwi),
antytrypsyny (leczenie rozedmy płuc), erytropoetyny (leczenie anemii), laktoferytyny (niedobór
żelaza)
Większa wydajność mleczna
Dodatkowe kopie genów kodujących beta i kappa- kazeinę
odporność na choroby
Wytwarzanie przez zwierzęta swoistych immunoglobulin, co zwiększa odporność na choroby,
np. kury odporne na wirus ptasiej grypy – prace prowadzone w Chinach; krowy odporne na
choroby powodowane przez priony np. BSE zwaną chorobą szalonych krów.
Modyfikowane świnie jako dawcy narządów
TG 1154 ma wbudowany gen, który może znieść immunologiczną barierę międzygatunkową
pomiędzy świnią i człowiekiem.
Do celów naukowych:
Badanie funkcji genów, terapia genowa, układy modelowe chorób ludzkich, np. zablokowanie
funkcjonowania badanego genu u myszy, a następnie obserwacja cech fenotypowych osobnika w
celu poznania funkcji badanego genu.